Name: 조직을 통한 X선 여기 발광 화학 이미징을 통한 임플란트 관련 감염의 높은 공간 분해능 화학 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 학습하세요 XELCI를 활용한 임플란트 관련 감염의 고해상도 화학 이미징 방법을 통해 뼈와 조직을 통한 생화학적 변화를 실시간으로 모니터링하고 감염 관리 전략을 개선하는 기술을 탐색하세요.

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저자는 Clemson University, COMSET 및 Clemson SC BioCRAFT에 감사드립니다. XELCI 설정은 처음에 NSF CAREER CHE 12255535의 자금으로 개발되었으며 이후 NIH NIAMS R01 AR070305-01에서 개발되었습니다.

이 절차는 Clemson University Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)에서 승인한 동물 사용 프로토콜을 따릅니다. 실험은 클렘슨 대학교 생물 안전위원회 (IBC) 및 방사선 안전위원회 (RSC)에 따라 관련 지침 및 규정에 따라 수행됩니다.
참고: XELCI 스캔을 완료하기 위한 흐름도는 아래 그림 5 에 나와 있으며 이미징 절차에 대한 자세한 단계별 설명이 나와 있습니다.
1. 시스템 초기화 및 일반 방사선 사진 획득
<ol><li>PMT 쿨러를 켜면 일반적으로 설정값(예: 15°C)에 도달하는 데 ~4분이 걸립니다. PMT를 켜기 전에 나머지 초기화 단계를 수행합니다.</li>
	<li>이미징 시스템 제어 소프트웨어를 엽니다. 제어 소프트웨어 프로그램은 x-y-z 축 전동 스테이지를 통신하고 초기화합니다. 스테이지 x축과 y축을 원하는 시작 위치로 이동합니다.</li>
	<li>샘플을 이동식 x-y-z 스테이지에 놓습니다. 샘플 높이(z축)를 배치하여 방사선 발광 장치가 X선 소스 및/또는 스테이지를 올리거나 내려 다모세관 초점 광학 장치보다 5-5.5cm 아래에 있도록 합니다. 또한 레이저 크로스헤드(X선 초점 모세관에 부착되고 X선이 초점을 맞출 위치와 교차하도록 서로 90°에 배치된 두 개의 빨간색 선 모양의 레이저 포인터)를 사용하여 xy 평면에 표본을 배치합니다. X선과 PMT를 켜기 전에 레이저를 끄십시오.</li>
	<li>이미징 인클로저의 전면 도어에 푸시 버튼 인터록을 고정합니다. 광선 소스의 전원을 켭니다. 샘플의 일반 방사선 사진을 얻기 위해 초점 광학 장치를 제거합니다.</li>
	<li>X선 제어 소프트웨어를 열고 X선 전력을 설정합니다(전압 및 전류 조정). X선 제어 소프트웨어로 X선 셔터를 엽니다.</li>
	<li>엑스레이 사진기를 위한 소프트웨어를 엽니다. 노출 버튼을 눌러 일반 방사선 사진을 찍습니다. 노출을 끄고 X-ray를 끕니다. 알림: 필요한 경우 s를 이동ample 위치를 개선하거나 다른 위치에서 일련의 X선을 획득하여 더 큰 방사선 사진을 얻기 위해 대조할 수 있습니다. 별도의 시스템에서 방사선 사진을 촬영할 수도 있지만, 검체가 움직이면 XELCI와 방사선 촬영의 공동 등록이 더 어려워집니다.</li>
	<li>인클로저 도어를 엽니다.</li>
</ol>2. 선택적으로 X-ray를 끈 상태에서 백그라운드 스캔을 수행합니다
<ol><li>다모세관 광학 장치를 X선 소스에 다시 연결합니다.</li>
	<li>인클로저를 닫고 인터록을 고정합니다. PMT 전원 공급 장치를 켭니다. 알림: PMT 전원 공급 장치는 빛에 과다 노출되지 않도록 문이 열리거나 열리려고 할 때마다 항상 꺼야 합니다.</li>
	<li>이미징 시스템 제어 소프트웨어를 열고 스텝 크기, 스캔 속도 및 스캔 영역을 지정합니다. 모든 매개변수가 설정되면 실행 버튼을 눌러 스캔을 시작합니다. 참고: 고해상도 스캔의 경우 스텝 크기는 1000μm이고 저해상도 스캔의 경우 스텝 크기는 250μm입니다. 스캔 속도는 5mm/s에서 1mm/s까지 선택할 수 있습니다. 스캔 영역은 샘플의 크기에 따라 다릅니다.</li>
	<li>X-ray를 끈 상태에서 백그라운드 스캔을 실행하여 샘플 이외의 인클로저에 있는 모든 빛의 어두운 수를 확인합니다.</li>
</ol>3. X-ray를 켠 상태에서 샘플 스캔 수행
<ol><li>샘플을 확인하십시오.amp스캔을 시작하기 위해 레이저 크로스 헤드로 여전히 올바른 위치에 있습니다.</li>
	<li>인클로저를 닫고 인터록을 고정합니다. PMT가 꺼져 있는 경우(예: 문을 열기 전에 꺼진 경우) PMT 전원 공급 장치를 켭니다.</li>
	<li>이미징 시스템 제어 소프트웨어를 엽니다. 단계 크기, 스캔 속도 및 스캔 영역에 대한 값을 입력합니다. 모든 매개변수가 설정되면 실행 버튼을 눌러 스캔을 시작합니다. 참고: 고해상도 스캔의 경우 스텝 크기는 1000μm이고 저해상도 스캔의 경우 스텝 크기는 250μm입니다. 스캔 속도는 5mm/s에서 1mm/s까지 선택할 수 있습니다. 스캔 영역은 샘플의 크기에 따라 다릅니다.</li>
	<li>X-ray를 켠 상태에서 샘플에 대한 스캔을 얻습니다.</li>
	<li>먼저 더 큰 스텝 크기와 더 빠른 스캔 속도로 저해상도 스캔을 수행하여 대상의 예비 이미지를 얻습니다. 샘플의 원하는 영역에 대한 저해상도 스캔을 얻은 후 더 작은 스텝 크기와 더 낮은 스캔 속도로 더 높은 해상도의 스캔을 얻습니다.</li>
	<li>문을 열기 전에 PMT 전원 공급 장치를 끄십시오.</li>
</ol>4. 이미지 형성
<ol><li>현재 스캔이 대상의 관심 영역을 이미징하고 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 중지 버튼을 눌러 현재 스캔을 중지 합니다.</li>
	<li>제어 소프트웨어에서 스캔 위치를 다시 조정하고 실행 버튼을 다시 누르십시오. 참고: y축은 스캔의 첫 번째 행부터 계속 기록됩니다. 스캔을 수행하는 동안 각 파장당 카운트 수와 마지막으로 업데이트된 모터 위치 이후의 시간이 기록됩니다. 기록된 시간은 모터 속도의 변화, 즉 노출 시간을 고려합니다. 각 픽셀에 대해 counts/second가 정규화됩니다. y축 모터는 y축의 현재 행 끝을 스캔하기 위해 이동하고 모터는 시작 위치로 돌아갑니다. 그런 다음 x축 모터는 사용자가 정의한 스텝 크기만큼 위치를 늘리고 y축의 두 번째 행을 스캔합니다. 이 프로세스는 x축 모터가 x-방향에 대해 지정된 너비에 도달할 때까지 순환됩니다. 사용자는 스캔 크기, 모터 속도 및 모터 시작 위치를 제어할 수 있습니다. 단계 크기는 y축의 최종 이미지에서 픽셀의 크기를 결정합니다.</li>
</ol>5. 무균 상태에서 이미징을 위한 박테리아 배양(박테리아 성장 센서가 이미징되는 경우)
<ol><li>황색포도상구균 1945(ATCC 25923)의 신선한 배양액을 준비하려면 1주일 이내에 줄무늬가 있는 TSA(트립틴 대두 한천) 플레이트에서 콜로니 하나를 사용하여 멸균 트립신 대두 브로스(TSB) 5mL를 접종합니다.</li>
	<li>박테리아 배양액을 37°C에서 16-18시간 동안 정지 상태가 될 때까지 부드럽게 흔든다.</li>
	<li>다음으로, 실온(RT)에서 10분 동안 4000 x g 에서 원심분리를 통해 TSB로부터 배양된 펠렛을 펠렛화하고, 펠렛을 인산염 완충용액(PBS)으로 두 번 세척하고, 펠렛을 멸균된 PBS 5mL에 재현탁시킨다.</li>
	<li>Beer-Lambert 법칙이 확인되는 OD 범위인 선형 범위를 사용하여 600nm에서 광학 밀도를 사용하여 박테리아 농도를 정량합니다(OD = kN, k 는 분자 소멸 및 광학 경로의 길이에 대한 계수, N 은 박테리아 농도)16. 그런 다음 멸균 PBS를 사용하여 샘플을 105 cells/mL로 희석합니다.</li>
	<li>트립신 대두 한천(TSA)을 고압증기멸균으로 멸균한 다음 온도가 45°C에 도달할 때까지 혼합하여 냉각합니다. 박테리아를 TSA에 접종하십시오.</li>
	<li>희석된 박테리아 배양액(100 μL)을 이식형 센서의 표면에 피펫팅합니다. 참고: 임플란트를 70% 에탄올에 5분 동안 담가 멸균하고 멸균 PBS에 보관했습니다.</li>
	<li>대조군으로 다른 멸균 임플란트 위에 접종되지 않은 TSA 100μL를 피펫으로 주입합니다.</li>
	<li>이식 전 37°C에서 48시간 동안 배양하기 전에 이식형 센서 위에 접종되지 않은 TSA 100μL를 추가합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 주장합니다.

정형외과용 임플란트 관련 감염을 조기에 발견하고 연구하여 골수염 및 2차 수술로 인한 합병증을 예방할 수 있도록, XELCI를 새로운 기능적 영상 기술로 도입했습니다. 조직을 통한 pH 모니터링을 위해 현재 사용 가능한 기술과 비슷합니다.
이미징을 위해 샘플을 배치하는 동안 90° 각도로 교차하는 두 개의 선 모양 레이저 포인터가 있는 다모세관 초점 광학 장치에 연결된 레이저 크로스 헤드를 사용하여 그 아래에 엘보를 정확하게 정렬합니다. 이 레이저는 섬광체에서 생성된 빛 외에 감지기에 도달하는 원치 않는 빛을 제거하기 위해 스캔을 시작하기 전에 꺼야 합니다. 거리 측면에서 사용자는 실험을 시작하기 전에 초점 광학 장치의 끝에서 샘플 상단까지의 거리를 약 5-5.5cm로 측정합니다. 이것은 X선 소스를 수동으로 올리거나 스테이지를 위아래로 움직여 달성할 수 있습니다. 동물을 마취시키고 이소플루란 가스관을 작동시켜 잠들었다고 말하는 것을 제외하고는 살아있는 동물이나 조직을 통한 측정...

미국에서는 매년 약 200만 개의 골절 고정 장치가 삽입되며, 그 중 5%-10%가 임플란트 관련 감염을 유발한다1. 이러한 감염은 생물막의 이질성과 항생제 내성 특성으로 인해 후기 단계에서 항생제로 치료하기가 더 어렵습니다 2,3. 조기에 진단되면 항생제와 외과적 괴사조직 제거술로 감염을 치료하여 치료된 골절 부위의 하드웨어를 교체하기 위한 두 번째 수술에 대한 추가 의료 비용을 방지할 수 있습니다. 일반 방사선 촬영 및 기타 고급 방사선 촬영 기술은 정형외과 임플란트 관련 감염, 불유합 및 관련 합병증의 진단에 적용됩니다. 이러한 기술은 정형외과 임플란트에서 주변 뼈와 조직의 구조적 정보를 획득하는 데 자주 사용되지만 특정 환경에서 생화학적 정보를 제공할 수 없습니다. 따라서 우리는 임플란트 부위에서 비침습적으로 생화학 정보를 고해상도 이미징하기 위한 새로운 X선 여기 발광 화학 이미징(XELCI) 기술을 개발했습니다. 정형 외과 임플란트 관련 감염의 진단은 일반적으로 하나 또는 다른 수단의 조합에 의해 수행됩니다. 임상 관찰 (통증, 부기, 발적, 상처 분비물 등)은 감염의 첫 징후를 시사합니다. 나중에, 뼈 치유 진행의 실패를 확인하고 병원성 유기체 4,5를 확인하기 위해 방사선 및 실험실 실험이 수행된다. 컴퓨터 단층 촬영 (CT), 자기 공명 영상 (MRI)과 같은 핵 의약 기술 및 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT) 및 양전자 방출 단층 촬영 (PET)과 같은 방사성 뉴클레오티드 방법은 감염된 임플란트 및 관련 감염의 더 나은 시각화를 위해 사용됩니다 6,7. CT와 MRI는 각각 골 괴사와 연조직 이상을 판별하는 데 유리하지만, 금속 임플란트에 가까운 거리에서 간섭을 일으킨다8. 임플란트 관련 골수염을 진단하기 위해 생체 내 영상 조영제로서 방사성 동위원소 표지 분석물과 결합된 SPECT 및 PET와 같은 다양한 X선 방법론이 널리 활용되고 있다2. 현재 응용 분야는 CT 스캐닝 데이터와 SPECT 또는 PET의 라벨링 데이터를 결합하여 해부학적 정보를 생성합니다9. 이러한 이미징 양식 중 하나 이상이 감염 진단을 돕기 위해 사용되지만 추가 의료 및 수술 비용을 피하기 위해 항생제 치료를 시작하기 위해 감염과 관련된 pH 변화를 조기에 감지할 수 없습니다.
임플란트 관련 감염을 모니터링하기 위해 이 연구에 사용된 이미징 시스템을 활용하는 주요 이점은 스펙트럼 참조를 통해 생물막 미세 환경에 대한 생화학적 정보를 밝힐 수 있다는 것입니다. 주요 초점은 감염된 부위의 이미징 및 pH 매핑에 있지만 이 방법은 임플란트 관련 감염에 특이적인 다른 바이오마커를 모니터링하도록 변경할 수 있습니다. 따라서 XELCI를 통해 감염의 병태생리학을 이해할 수 있습니다. 높은 공간 해상도 이미징을 통해 감염이 증가함에 따라 이질성을 매핑할 수 있습니다. 생물막 형성이 일어나는 표면의 pH는 생화학적 변화를 이해하는 데 매우 중요합니다. 또한, 박테리아10,11에 의한 항생제 관련 스트레스 반응으로 인해 다른 미세 환경 변화가 발생할 수 있다. 표면 특이적 및 높은 공간 분해능 이미징으로 인해 생물막 미세 환경에 대한 항생제 효과를 모니터링할 수 있습니다. 이 기술은 표적 약물 전달 실험을 위한 생물막 환경을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 우리는 표적 낮은 pH 약물 방출 또는 pH를 높여 더 높은 pH에서 작용하기 쉽게 만들 수 있습니다.
이 이미징 기술의 세 가지 특정 특성은 X선 해상도, 임플란트 표면 특이성 및 화학적 민감도입니다(그림 1A). 이러한 특성은 정형외과 임플란트 관련 감염을 이미징하기 위해 현재 사용 가능한 이미징 기술과 비교할 수 있습니다(그림 1B). X선이 조사되면 임플란트 표면에 코팅된 형광체 입자는 조직의 몇 센티미터를 통과할 수 있는 적색 및 근적외선(NIR) 빛을 생성합니다(약간의 감쇠가 있긴 하지만)12,13. 표 1은 생물막 또는 조직을 통해 pH를 측정하는 데 사용된 다른 방법과 비교하여 개발된 이미징 시스템의 일부 기능을 보여줍니다.
XELCI는 그림 2와 같이 X선 여기와 결합하여 이식된 의료 기기 근처에서 광학적으로 높은 공간 분해능의 화학 정보를 획득하는 새로운 이미징 기술입니다. 여기서는 X선 여기성 형광체 입자의 선택적 여기 및 광학 검출이 활용됩니다. 임플란트는 신틸레이터 입자 층 위에 pH 민감성 염료가 포함된 폴리머 층인 두 개의 층으로 코팅됩니다. 일련의 집속 X선 빔이 임플란트를 조사하면 섬광체 층이 가시광선(620nm 및 700nm)을 생성합니다. 이렇게 생성된 빛은 pH 민감층을 통과하여 주변 환경의 pH에 따라 발광 스펙트럼을 조절합니다. 낮은 pH는 일반적으로 감염 및 생물막 형성과 관련이 있습니다. 감염이 진행됨에 따라 pH는 생리학적 pH(pH 7.2)에서 산성(pH 7 미만)으로 변하고 센서의 pH 염료는 색상과 흡광도를 변화시킵니다. 발광 스펙트럼의 변화는 pH 7 및 pH 4에서 브로모크레졸 녹색 pH 염료에 대한 그림 2E에 나와 있습니다. 조직과 뼈를 통해 투과된 빛이 수집되고 스펙트럼 비율이 pH를 결정합니다. pH 이미지를 생성하기 위해 집속된 X선 빔은 신틸레이터 필름에 한 번에 한 지점씩 조사하고 샘플 전체에 걸쳐 빔을 포인트별로 스캔합니다. 이전에는, 이 기술이 정형외과용 임플란트14,15의 표면의 이미지 pH 변화에 적용되었고, 뼈 및 조직을 통한 골수내 관내의 pH 변화를 모니터링하기 위해 이를 시험하였다.
아래 그림 3은 이미징 시스템의 개략도를 보여줍니다. 이미징 시스템의 기본 구성 요소는 폴리 모세관 광학 장치가 있는 X선 여기 소스, 두 개의 광전자 증배관에 연결되는 일체형 아크릴 광 가이드, X, Y 및 Z 전동 스테이지(30cm x 15cm x 6cm 이동) 및 데이터 수집을 위해 연결된 컴퓨터입니다. X선 소스, x, y, z 스테이지 및 수집 광학 장치(엘보우, 라이트 가이드, 광전자 증배관(PMT))는 X선 방지 인클로저에 있으며, X선 컨트롤러, PMT용 전원, 데이터 수집(DAQ) 보드 및 컴퓨터에 연결된 함수 발생기는 외부에 보관됩니다. 인클로저와 도어 전면 사이에 배치된 푸시 버튼(상시 개방 스위치)은 인터록 역할을 합니다. 도어가 완전히 닫히지 않은 경우(인터록 스위치가 열려 있는 경우) X선 소스가 켜지지 않고 작동 중에 열리면 X선 소스가 자동으로 꺼집니다. 모터는 연속 스캔을 실행할 수 있을 뿐만 아니라 개별 위치로 이동할 수 있습니다. y축의 스캔 속도는 일반적으로 1-5mm/s인 반면 x축의 스텝 크기는 일반적으로 150-2000μm에서 선택할 수 있습니다. 매개변수는 필요한 공간 분해능에 따라 선택할 수 있습니다. 연속 스캔을 통해 일정한 속도로 균일한 노출 시간을 확인할 수 있습니다.
집속된 X선 빔이 X선 발광 입자에 조사되면 생성된 빛은 주변 pH에 따라 빛을 변조하여 pH 감응막을 통과합니다. 투과된 빛은 조직과 상호 작용(부분적으로 산란 및 흡수)하는 반면, 산란 및 흡수에 의한 광 감쇠는 조직 두께가 증가함에 따라 증가합니다. 컬렉션 광학 장치에는 시작 부분에 반사 알루미늄 엘보우(90° 굽힘 및 광택 반사 내부 표면 포함)가 장착된 일체형 분기 아크릴 라이트 가이드가 포함됩니다. 이는 빛이 라이트 가이드에 도달하자마자 빛이 시준되도록 하기 위한 것입니다. 이러한 추가는 집광 효율을 크게 향상시켰습니다. 자세한 내용은 그림 4 에 엘보우와 라이트 가이드의 기계 도면이 나와 있습니다. 90° 엘보는 알루미늄으로 가공되었으며 내부 표면은 경면 마감 처리되었으며 라이트 가이드는 아크릴로 가공되었습니다. 또한 팔꿈치 시작 부분에 광범위한 장거리 통과 청색광 필터(350-450nm 빛 차단)를 부착하여 적색광만 통과하도록 했습니다. 일체형 아크릴 라이트 가이드의 끝은 두 개의 다른 PMT로 이어지는 두 개의 스트림으로 분기됩니다. PMT는 PMT를 ~5°C로 냉각하기 위해 열전 냉각기와 접촉하는 작은 기밀 금속 상자에 들어 있습니다. PMT 중 하나의 시작 부분에는 700nm 빛만 측정하기 위해 협범위 롱패스 필터(570-640nm 광 차단 및 640-740nm 광 통과)가 부착됩니다. 따라서 620nm 및 700nm 빛은 별도로 계산할 수 있습니다. PMT는 광자 계수 모드로 설정되며 검출된 각 광자에 대해 TTL(트랜지스터-트랜지스터 로직) 펄스를 생성합니다. DAQ 시스템은 USB 통신을 사용하여 펄스(포화점 2,000만 펄스/초)를 계산합니다. 데이터를 처리한 후 두 개의 개별 강도 맵이 생성되고 신호 파장 강도(620nm)와 기준 파장 강도(700nm)의 비율을 고려하여 최종 이미지가 생성됩니다. 이 비율은 전체 집광 효율의 차이를 설명하며, 이는 집광 광학 장치의 위치, X선 조사 강도 및 조직 두께에 따라 크게 달라집니다. 또한, pH 지시약 염료 없이 공간적으로 분리된 기준 영역은 파장 의존적 조직 침투로 인한 스펙트럼 왜곡을 설명합니다. 이미징 시스템을 제어하기 위해 그래픽 기반 프로그래밍 언어가 사용되며 작업의 기본 순서도가 아래에 나와 있습니다. 컴퓨터, X선 컨트롤러 및 DAQ 유닛을 제외한 이미징 설정은 방사선 노출을 최소화하기 위해 안전한 X선 인클로저에 포함되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>90도 엘보우</td><td>Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bromo Cresol Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45ZW10</td><td></td></tr><tr><td>Bromo Thymol Blue</td><td>Sigma</td><td>76-59-5</td><td></td></tr><tr><td>ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate</td><td>Pollock industries, White River, VT, USA</td><td>TCP 50</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road Hudson, NH 03051</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>가돌리늄 옥시설파이드 유로퓸 도핑(Gd2O2S:Eu) 입자-~8.0 &마이크로; m</td><td>Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England</td><td>UKL63/N-R1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>LabVIEW National Instruments, Austin, TX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis)</td><td>모션 컨트롤, Smithtown, NY, USA</td><td>AT10-60</td><td></td></tr><tr><td>National instruments c-DAQ 9171</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td>NI cDAQ&trade;-9171</td><td></td></tr><tr><td>원피스 아크릴 광 가이드</td><td>Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 4 버퍼</td><td>VWR BDH 화학 물질</td><td>BDH5024</td><td></td></tr><tr><td>pH 8 버퍼</td><td>VWR BDH 화학 물질</td><td>BDH5060</td><td></td></tr><tr><td>인산염 버퍼 용액</td><td>MP Biomedicals, Irvine, CA. USA</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>사진 승수 튜브 모델 P25PC-16</td><td>SensTech, Surrey, UK</td><td>모델 P25PC-16</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach</td><td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td><td>ATCC 25923</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Agar</td><td>Teknova, Hollister, CA, USA</td><td>&nbsp; T0520</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic soy Broth</td><td>EMD Millipore, Burlington, MA, USA</td><td>1005255000</td><td></td></tr><tr><td>X-ray source-iMOXS</td><td>Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X,Y 전동 스테이지-30 cm x 15 cm x 6 cm travel</td><td>Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA</td><td>LTS300 및 LTS150</td><td></td></tr></tbody></table>

조직을 통한 x선 여기 발광 화학 이미징을 통한 임플란트 관련 감염의 높은 공간 분해능 화학 이미징

High Spatial Resolution Chemical Imaging of Implant-Associated Infections with X-ray Excited Luminescence Chemical Imaging Through Tissue

이식형 의료 기기와 관련된 미생물 감염은 골절 고정 실패의 주요 관심사입니다. 이러한 감염의 조기 진단은 두 번째 수술에 대한 추가 비용없이 항생제로 성공적으로 박멸 할 수 있습니다. 여기에서 XELCI는 높은 X선 해상도, 임플란트 특이성 및 이식된 의료 기기 표면 근처의 비침습적 이미지 화학 농도에 대한 화학적 민감성을 가진 기술로 설명합니다. 장치는 화학적으로 보고되는 표면으로 코팅되어 있습니다. 이 화학적으로 반응하는 표면은 이식 가능한 의료 기기에 코팅 된 두 개의 층으로 구성됩니다. 모니터링을 위해 적색 발광 섬광체(Gd2O2S:Eu) 층 위에 코팅되는 pH 민감성 층(브로모티몰 블루 또는 브로모크레졸 그린 혼입 하이드로겔)을 포함한다. 집속된 X선 빔이 임플란트의 한 지점을 조사하고 섬광체에서 생성된 적색광(620nm 및 700nm 피크 포함)이 감지층을 통과하여 pH에 따라 스펙트럼 비율이 변경됩니다. 임플란트를 가로질러 X선 빔을 스캔하고 조직을 통과하는 빛의 스펙트럼 비율을 점별로 측정하여 이미지를 생성합니다. 우리는 수정된 이식형 플레이트 센서로 이전에 대퇴골의 뼈 표면에서 임플란트 관련 감염을 모니터링하기 위해 이 이미징 기술을 사용했습니다. 이제 우리는 경골 골수내 막대 감염으로 인해 발생하는 pH 변화를 연구하고 있습니다. 파일럿 전 토끼 연구에는 두 가지 유형의 골수내 막대 디자인이 사용되었으며, XELCI 기술을 사용하여 뼈 표면뿐만 아니라 뼈 내부에서도 발생하는 화학적 변화를 모니터링할 수 있다는 것을 알게 되었습니다. 따라서 이를 통해 비침습적이고 높은 공간 분해능, 낮은 배경 국소 pH 이미징을 통해 임플란트 관련 감염 생화학을 연구할 수 있습니다.

예비 연구로서, 우리는 토끼 사체14의 경골에서 골수내 막대 센서를 이미지화했습니다. 센서에는 기준 영역, pH 8 영역(염기성 pH) 및 pH 4 영역(산성 pH)의 세 가지 영역이 있습니다. 기준 영역은 거친 에폭시 필름에 통합된 섬광체(Gd 2 O2S:Eu) 입자입니다. 독특한 산성 및 염기성 pH 영역은 골수내관 내부의 감염 및 비감염 상황을 나타냅니다(그림 6A,B)14.
스캔을 완료한 후 각각 620nm, 700nm 및 비율(그림 7A-C)의 이미지를 MATLAB에서 생성했습니다. 색상의 변화는 pH의 변화를 나타냅니다. 염기성 pH 영역의 브로모티몰...

여기에서는 X선 여기 발광 화학 이미징(XELCI)을 사용하여 이식된 의료 기기 주변의 화학 정보를 고분해능 광학 검출하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 새로운 이미징 기술은 임플란트 관련 감염 생화학을 연구할 수 있는 실험실에서 개발되었습니다.

조직을 통한 X선 여기 발광 화학 이미징을 통한 임플란트 관련 감염의 높은 공간 분해능 화학 이미징

Microbial infections associated with implantable medical devices are a major concern in fracture fixation failure. Early diagnosis of such infection will ...

이 기술을 통해 뼈와 조직을 통한 임플란트 관련 감염의 생화학적 변화를 이미지화하고 매핑할 수 있습니다. 임플란트 표면 근처의 화학 물질 농도 변화에 대한 고해상도 이미지를 얻을 수 있습니다. 이를 통해 임플란트 관련 감염 근처의 지역 화학 환경을 모니터링 할 수 있습니다.박테리아 배양 절차를 시연하는 것은 생물 과학과의 대학원생 인 Erin Levon이 될 것입니다. 시작하려면 PMT 쿨러를 켜고 PMT를 켜기 전에 나머지 초기화 단계를 수행하십시오. 그런 다음 이미징 시스템 제어 소프트웨어를 열고 스테이지 x축과 y축을 원하는 시작 위치로 이동합니다.샘플을 움직일 수 있는 xyz 스테이지에 배치하고, x선 소스 및/또는 스테이지를 올리거나 내려서 전파 발광 장치가 폴리 모세관 초점 광학 장치 아래 5 내지 5.5 센티미터가 되도록 샘플 높이를 위치시킨다. 또한 레이저 크로스헤드를 사용하여 xy 평면에 표본을 배치하고 샘플의 일반 방사선 사진을 얻기 위한 초점 광학 장치를 제거합니다. 이미징 인클로저의 전면 도어에 푸시 버튼 인터록을 고정합니다.그런 다음 X선 소스의 전원을 켭니다. 그런 다음 X선 제어 소프트웨어를 엽니다. 엑스레이 힘을 놓고 엑스레이 통제 소프트웨어를 가진 엑스레이 셔터를 여십시오.그런 다음 엑스레이 카메라용 소프트웨어를 열고 노출 버튼을 눌러 일반 방사선 사진을 찍습니다. 노출과 엑스레이를 끈 다음 인클로저 도어를 엽니다. 폴리 모세관 광학 장치를 X선 소스에 다시 연결합니다.그런 다음 인클로저를 닫고 인터록을 고정한 다음 PMT 전원 공급 장치를 켭니다. 그런 다음 이미징 시스템 제어 소프트웨어를 열고 스텝 크기, 스캔 속도 및 스캔 영역을 지정합니다. 모든 매개변수가 설정되면 실행 버튼을 눌러 스캔을 시작합니다.X-ray를 끈 상태에서 백그라운드 스캔을 실행하여 샘플 이외의 인클로저에 있는 모든 조명의 어두운 개수를 확인합니다. 샘플을 확인한 후 레이저 크로스헤드로 올바른 위치에 있으면 인클로저를 닫고 인터록을 고정합니다. 그런 다음 이미징 시스템 제어 소프트웨어를 열고 스텝 크기, 스캔 속도 및 스캔 영역에 대한 값을 입력합니다.모든 매개변수가 설정되면 실행 버튼을 눌러 스캔을 시작하고 엑스레이가 켜진 상태에서 샘플에 대한 스캔을 얻습니다. 먼저 더 큰 스텝 크기와 더 빠른 스캔 속도로 저해상도 스캔을 수행하여 대상의 예비 이미지를 얻습니다. 샘플의 원하는 영역에 대한 저해상도 스캔을 얻은 후 더 작은 스텝 크기와 더 낮은 스캔 속도로 더 높은 해상도의 스캔을 얻습니다.1945년 황색포도상구균의 신선한 배양액을 준비하려면 트립신 대두 한천 플레이트에서 한 콜로니를 사용하고 1주일 이내에 줄무늬를 만들어 멸균 트립신 콩 국물 3밀리리터를 접종합니다. 그런 다음 박테리아 배양액을 섭씨 37도에서 정지 단계까지 16-18 시간 동안 부드럽게 흔든다. 다음으로, 트립신 대두 액체배지로부터 배양된 펠렛을 4, 000 g에서 상온에서 10분 동안 원심분리를 통해 펠렛을 PBS로 2회 세척하였다.Beer-Lambert 법칙이 검증되는 광학 밀도 범위인 선형 범위를 사용하여 600나노미터에서 광학 밀도를 사용하여 박테리아 농도를 정량화합니다. 그런 다음 멸균 PBS를 사용하여 밀리리터당 샘플 200, 000 세포를 희석하십시오. 트립신 콩 한천을 오토클레이빙으로 살균한 다음 온도가 섭씨 45도에 도달할 때까지 혼합하여 냉각합니다.다음으로, 박테리아를 트립신 콩 한천에 접종합니다. 다음에, 희석된 박테리아 배양물을 이식형 센서의 표면 상에 피펫팅하고, 대조군으로서 또 다른 멸균 임플란트 위에 100 마이크로리터의 미접종 트립신 대두 한천을 접종한다. 이식 전 섭씨 37도에서 48시간 동안 배양하기 전에 이식형 센서 위에 접종되지 않은 트립신 대두 한천 100마이크로리터를 추가합니다.스캔 완료 후, 620 나노미터, 700 나노미터, 및 비율에서의 이미지를 MatLab에서 각각 생성하였고, 색상의 변화는 pH의 변화를 나타내었다. 염기성 pH 영역은 산성 pH 영역보다 방출된 빛을 상당히 흡수하기 때문에 낮은 pH 영역은 620나노미터에서 더 밝은 신호로 나타납니다. 700 나노미터에서의 신틸레이터 방출은 신틸레이터 필름의 불일치, 조직 조성 변화 및 스캔에서 스캔까지 검출 광학 위치에서 발생하는 모든 변화에 대한 스펙트럼 기준 역할을 합니다.샘플을 스테이지에 올바르게 배치해야 합니다. 실내 조명을 켜거나 인클로저를 열기 전에 PMT 전원 공급 장치를 꺼야 하며 고해상도 이미징 전에 저해상도 스캔을 수행해야 합니다. X선 소스 대신 초음파 소스를 사용하여 이식된 의료 기기와 관련된 pH 변화를 모니터링하기 위한 초음파 발광 화학 이미징을 수행할 수 있습니다.예, 시스템을 최적화한 후 골수염 연구에 사용할 수 있는 뼈 표면과 비교하여 뼈의 골수내강의 pH 변화를 감지할 수 있었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

생활 동물 세균성 감염의 bioluminescence 이미징을위한 방법은 설명되어 있습니다. 병원균은 살아있는 동물에 감염 광학 온 몸이 이미징을 허용 루시페라제 표현을 수정합니다. 동물 모델은 루시페라제 표현 병원균에 감염과 질병의 발생 과정은 bioluminescence 이미징에 의해 실시간으로 시각하실 수 있습니다.

마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

뼈 전이의 실험 마우스 모델은 루시페라제 내유 종양 세포를 표현 intracardiac 배달 아래 설립되었습니다. 종양 개발 및 osteolytic 병변을 발생은 bioluminescence과 마이크로 중부 표준시 이미징과 길이 방향 감시했다.

Bioluminescence 및 마이크로 중부 표준시 이미징과 함께 종양의 Metastases 및 Osteolytic 조직 손상을 모니터링

발광 생물 세균 이미징<em&gt; 생체 내</em

출처: de Vries, C. R. 외, 만성 Pseudomonas aeruginosa 상처 감염의 지연 접종 모델. J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 생체 마우스 모델에서 박테리아 감염 진행을 모니터링하는 생물발광 영상 기법을 시연합니다. luxABCDE 리포터 시스템으로 설계된 병원성 박테리아는 감염 부위에서 빛을 방출하여 대사적으로 활발한 박테리아를 시각화할 수 있게 합니다. 쥐를 시간에 따라 영상화함으로써 연구자들은 비침습적으로 감염 역학을 추적하고 생물발광 신호 강도를 정량화할 수 있습니다.

쥐 박테리아 감염의 생물발광 영상

멀티 양상 이미징 작은 동물 모델에서 세균성 식민지 공부를위한 유용한 방법입니다. 이 프로토콜은 생물 발광과 생쥐의 감염을...

의 4D 좌석 Multimodality 이미징<em&gt; Citrobacter rodentium</em마우스에서&gt; 감염

우리는 염증 단계를 구별하기위한 비 침습 이미징 방법을 설명합니다. 루미놀의 전신 배달 호중구의 MPO 활동에 의존 급성 염증의 영역을 보여준다. 대조적으로, lucigenin의 주입은 대 식세포에서 Phox 활동에 의존 만성 염증으로 시각화 할 수 있습니다.

생체 내 이미징 방법에 급성 및 만성 염증을 구별하는

황색 포도상 구균의 발광 생물 공학적 변형을 이용하여, 정형 외과 임플란트 감염 마우스 모델에서 광과 μCT 화상을 결합하여, 비 침습적으로 및 종 방향에서의 세균 감염의 역학뿐만 아니라 대응하는 염증 반응 및 해부학 적 변화를 모니터 할 수있는 기능을 구비 뼈.

결합<em&gt; 생체</em&gt; 광학 및 μCT 이미징 마우스의 정형 외과 임플란트 감염에 감염, 염증 및 뼈 해부학을 모니터링

치과 복합 재료의 생체 적합성 연구의 대부분의 측면은 형광 신호의 정량화와 결합 된 세포 독성 3D CLSM 시간 경과 영상은 시간이 지남에 따라 세포의 운명의 민감한 평가할 수있다. 이 방법을 활용하여 치과 복합 재료의 cytocompatibility을 평가하는 효율적인 도구가 될 수 있습니다.

치과 복합 재료의 Cytocompatibility 평가하기위한 효율적인 방법으로 공 촛점 시간 경과 영상

이 프로토콜은 루테늄 복합체를 화학발광 발광원으로 사용하여 생체 내 이미징 중에 높은 신호 대 잡음비를 생성하는 새로운 수술 중 이미징 기술을 설명합니다. 수술 중 영상은 수술 절차가 수행되는 방식에 혁명을 일으킬 수 있는 확장 분야입니다.

생물학적 설정에서 생성 및 관측 화학 발광위한 새로운 기술

아 밀 로이드 증 착 다른 질병의 특징은 고 고생 많은 다른 기관. 이 문서에서는 발광 활용된 oligothiophene 형광 형광 현미경 검사 법 기술 함께에서 얼룩의 응용 프로그램을 설명 합니다. 이 얼룩 메서드 검색 및 임상과 과학적인 설정에 단백질의 탐사를 위한 강력한 도구를 나타냅니다.

Confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 일생 화상 진 찰 Hyperspectral에 의해 발광 활용된 Oligothiophenes로 물 녹말 체 조직 이미징

X선 컴퓨터 단층 촬영을 위해 설계된 X선 특이적 염색 방법을 사용하여 현미경 조직 구조의 3D 시각화프로토콜이 제시된다.

X선 특이적 염색 방법 및 나노스코픽 컴퓨터 단층 촬영을 사용한 연조직 시료의 3D 이미징

학습하세요 XELCI를 활용한 임플란트 관련 감염의 고해상도 화학 이미징 방법을 통해 뼈와 조직을 통한 생화학적 변화를 실시간으로 모니터링하고 감염 관리 전략을 개선하는 기술을 탐색하세요.

조직을 통한 X선 여기 발광 화학 이미징을 통한 임플란트 관련 감염의 높은 공간 분해능 화학 이미징

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