Name: 단일 분자 FRET를 사용한 막 수용체의 구조적 역학 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 학습하세요 단일 분자 FRET를 활용한 mGluR2 막 수용체의 구조적 역학 시각화 방법을. 비천연 아미노산 삽입을 통한 특이적 표지로 단백질 구조를 변형하지 않고 실시간으로 운동을 관찰할 수 있습니다.

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토론을 위해 Reza Vafabakhsh 연구소 회원들에게 감사드립니다. 이 작업은 국립 보건원 보조금 R01GM140272 (RV), 노스 웨스턴 대학의 생명 과학을위한 Searle 리더십 기금 및 시카고 커뮤니티 트러스트의 Searle Funds의 지원을 받아 시카고 생물 의학 컨소시엄 (RV). BWL은 국립 일반 의학 연구소 (NIGMS) 교육 보조금 T32GM-008061의 지원을 받았습니다.

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저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

GPCR은 신호 전달을 시작하기 위해 세포막에서 작동하는 단백질입니다. 많은 GPCR은 여러 도메인으로 구성되며 신호는 도메인 간의 협력 상호 작용에 의존합니다. 이러한 막 수용체의 특성을 조절하려면 여러 도메인의 동적 거동을 이해하는 것이 필수적입니다. 단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET)은 단백질 형태 및 역학을 실시간으로 측정할 수 있는 형광 기술입니다(11,32). 여기에서는 smFRET, 단일 분자 풀다운(SiMPull) 및 전반사 형광(TIRF) 현미경을 결합하여 부동태화 표면에 고정된 개별 단백질의 재배열을 직접 시각화하는 접근방식이 5,11,33에 설명되어 있습니다. FRET는 거리에 매우 민감하며 분자 내 변화(3-8nm)를 조사하는...

원형질막을 통한 정보의 전달은 막 수용체1의 기능에 크게 의존합니다. 수용체에 대한 리간드 결합은 구조적 변화 및 수용체 활성화를 유도한다. 이 과정은 종종 자연에서 알로 스테 릭입니다2. 800명 이상의 구성원을 보유한 G 단백질 결합 수용체(GPCR)는 인간에서 가장 큰 막 수용체 계열입니다3. 거의 모든 세포 과정에서의 역할로 인해 GPCR은 치료 개발의 중요한 표적이되었습니다. GPCR 신호전달의 표준 모델에서, 작용제 활성화는 G α의 뉴클레오티드 결합 포켓에서 GDP를 GTP로 교환함으로써 이종 삼량 체 G 단백질 복합체를 활성화시키는 수용체의 구조적 변화를 초래한다. 활성화 된 Gα-GTP 및 Gβγ 서브 유닛은 다운 스트림 이펙터 단백질의 활성을 제어하고 신호 전달 캐스케이드 4,5를 전파합니다. 이 신호 전달 과정은 본질적으로 수용체의 3 차원 모양을 변경하는 리간드의 능력에 의존합니다. 리간드가 이를 달성하는 방법에 대한 기계론적 이해는 새로운 치료제를 개발하고 합성 수용체 및 센서를 설계하는 데 중요합니다.
대사성 글루타메이트 수용체 (mGluRs)는 클래스 C GPCR 계열의 구성원이며 글루타메이트의 느린 신경 조절 효과 및 신경 흥분성 튜닝에 중요합니다 6,7. 모든 GPCR 중에서 클래스 C GPCR은 절대 이량체로 기능한다는 점에서 구조적으로 독특합니다. mGluR은 금성 파리 통 (VFT) 도메인, 시스테인이 풍부한 도메인 (CRD) 및 막 횡단 도메인 (TMD)의 세 가지 구조 도메인을 포함합니다 8. 활성화 과정 동안의 구조적 변화는 복잡하며 12nm 거리에 걸쳐 전파되는 국소 및 글로벌 구조적 결합과 이량체 협력성을 포함합니다. 중간 형태, 상태의 시간적 순서 및 상태 간의 전환 속도는 알려져 있지 않습니다. 개별 수용체의 형태를 실시간으로 추적함으로써 일시적인 중간 상태와 활성화 중 구조적 변화의 순서를 식별 할 수 있습니다. 이는 mGluR2 11의 활성화 동안 구조적 변화의 전파를 시각화하기 위해 최근에 적용된 것처럼 단일 분자 형광 공명 에너지 전달 9,10(smFRET)을 적용하여 달성할 수 있습니다. FRET 실험의 핵심 단계는 공여체 및 수용체 형광단을 관심 단백질에 부위 특이적으로 삽입하여 FRET 센서를 생성하는 것입니다. 비천연 아미노산(UAA) 혼입 전략이 채택되었습니다 12,13,14,15 시스테인이 없는 돌연변이를 생성하거나 유전적으로 암호화된 큰 태그를 삽입해야 하는 일반적인 부위 특이적 형광 표지 기술의 한계를 극복하기 위해. 이를 통해 mGluR2의 리간드 결합 및 신호 전달 도메인에 합류하는 필수 콤팩트 알로스테릭 링커의 구조적 재배열을 관찰할 수 있었습니다. 이 프로토콜에서는 구리 촉매 아지드 고리화 반응을 사용하여 형광단을 부착하기 위해 UAA로 mGluR2의 부위별 라벨링에 대한 접근 방식을 포함하여 mGluR2에 대한 smFRET 실험을 수행하기 위한 단계별 가이드가 제시됩니다. 또한, 이 프로토콜은 막 단백질의 직접 포획 및 데이터 분석을 위한 방법론을 설명합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 다른 막 단백질의 구조적 역학을 연구하는 데에도 적용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>(+)-나트륨 L-아스코르브산염</td><td>시그마 Aldrich</td><td>Cat # 11140-250G</td><td></td></tr><tr><td>4-azido-L-페닐알라닌</td><td>Chem-Impex International</td><td>Cat # 06162</td><td></td></tr><tr><td>548UAA</td><td>Liauw et al. 2021</td><td></td><td>형질주입 구성</td></tr>물 <tr><td>아세트산</td><td>Fisher Chemical</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>Fisher Chemical</td><td>67-64-1</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator (2022)</td><td>https://www.adobe.com/</td> <td>RRID:SCR_010279</td><td>소프트웨어, 알고리즘</td></tr><tr><td>아미노구아니딘(염산염)</td><td>케이맨 화학</td><td>81530</td><td></td></tr><tr><td>아미노실란</td><td>Aldrich</td><td>919-30-2</td><td></td></tr><tr><td>Bath Sonicator 2.8 L</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>초음파 수조 2.8 L</td></tr><tr><td>비오틴-PEG</td>, <td>Laysan Bio Inc</td><td>항목# 비오틴-PEG-SVA-5000-100mg</td><td></td></tr><tr><td>BTTES</td><td>클릭 화학 도구</td><td>1237-500</td><td></td></tr><tr><td>구리(II) 황산염</td><td>시그마 알드리치</td><td>고양이 # 451657-10G</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>VWR</td><td>16004-306</td><td>샘플 챔버</td></tr><tr><td>Cy3 알킨</td><td>클릭 화학 도구</td><td>TA117-5</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 알킨</td><td>클릭 화학 도구</td><td>TA116-5</td><td></td></tr><tr><td>DDM</td><td>Anatrace</td><td>Part# D310 1 GM</td><td>세제</td></tr><tr><td>DDM-CHS (10:1)</td><td>Anatrace</td><td>Part# D310-CH210 1 ML</td><td>세제 with cholecterol</td></tr><tr><td>Defined Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Di01-R405/488/561/635</td><td>Semrock</td><td></td><td>노치 필터</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD</td><td>Andor</td><td>DU-897U</td><td>카메라</td></tr><tr><td>ET542lp</td><td>크로마</td><td></td><td>장역 통과 방출 필터</td></tr><tr><td>FF640-FDi01</td><td>Semrock</td><td></td><td>방출 이색성 필터</td></tr><tr><td>FLAG 태그 항체</td><td>Genscript</td><td>A01429</td><td></td></tr><tr><td>형광 비드</td><td>Invitrogen T7279</td><td>TetraSpeck 미세구</td><td>구형 비드</td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Fisherfinest</td><td>12-544-4</td><td>샘플 챔버</td></tr><tr><td>글루타메이트</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat # 6106-04-3</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat # 12022001</td><td>세포주</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>FisherBioReagents</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>이미지 스플리터</td><td>OptoSplit II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fluka</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>Oxxius</td><td></td><td>4라인 레이저 결합기</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 형질주입 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000015</td><td>형질주입 시약</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 화학 물질</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>올림푸스</td><td>올림푸스 IX83</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 물</td><td>Barnstead</td><td></td><td>물 탈이온기</td></tr><tr><td>m-PEG</td><td>Laysan Bio Inc</td><td>항목# MPEG-SIL-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>NF03-405/488/532/635</td><td>Semrock</td><td></td><td>이색성 거울</td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51985091</td><td>저혈청 매체</td></tr><tr><td>OptiMEM/감소된 혈청 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OriginPro (2020b)</td><td>https://www.originlab.com/</td> <td>RRID:SCR_014212</td><td>데이터 분석 및 그래프 작성 소프트웨어</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pIRE4-Azi</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #</td><td>105829 Transfected construct</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine hydrobromide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat # P2636</td><td></td></tr><tr><td>Protocatechuic acid (PCA)</td><td>HWI group</td><td>99-50-3</td><td></td></tr><tr><td>smCamera (Version 1.0)</td><td>http://ha.med.jhmi.edu/resources/</td><td></td> <td>Camera 소프트웨어</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>FisherBioReagents</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨(NaOH)</td><td>Sigma</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>Whatman UNIFLO</td><td>Cat#9914-2502</td><td>액체 여과</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma</td><td>53188-07</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 분자 fret를 사용한 막 수용체의 구조적 역학 시각화

Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET

외부 신호에 반응하는 세포의 능력은 세포 발달, 성장 및 생존에 필수적입니다. 환경의 신호에 응답하려면 세포가이를 인식하고 처리 할 수 있어야합니다. 이 작업은 주로 신호를 세포의 생화학 적 언어로 변환하는 역할을하는 막 수용체의 기능에 의존합니다. G 단백질 결합 수용체 (GPCR)는 인간에서 가장 큰 막 수용체 단백질 계열을 구성합니다. GPCR 중에서 대사성 글루타메이트 수용체 (mGluRs)는 절대 이량 체로 기능하고 리간드 결합 부위를 포함하는 큰 세포 외 도메인을 보유하는 고유 한 하위 클래스입니다. mGluR의 구조 연구의 최근 발전은 활성화 과정에 대한 이해를 향상 시켰습니다. 그러나 활성화 및 변조 중에 mGluR을 통한 대규모 구조적 변화의 전파는 제대로 이해되지 않습니다. 단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET)은 단일 단백질 수준에서 생체 분자의 구조 역학을 시각화하고 정량화하는 강력한 기술입니다. mGluR2 활성화의 동적 과정을 시각화하기 위해 비천연 아미노산(UAA) 통합을 기반으로 하는 형광 입체 추적 센서가 개발되어 수용체의 고유 구조를 교란하지 않고 부위 특이적 단백질 표지를 수행할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 새로운 UAA 라벨링 접근법, 샘플 준비, smFRET 데이터 수집 및 분석을 포함하여 이러한 실험을 수행하는 방법을 설명합니다. 이러한 전략은 일반화 가능하며 다양한 막 단백질의 구조적 역학을 조사하기 위해 확장 될 수 있습니다.

UAA 기반 FRET 센서의 발현 및 형광 표지 본원에서, mGluR2(548UAA)의 CRD 내 UAA(AZP)의 삽입 및 형광 표지의 예시적인 결과가 논의된다 도11에 논의된다. 앞서 언급했듯이 AZP를 mGluR2에 삽입하려면 변형된 tRNA 신테타제 및 상보성 tRNA(pIRE4-Azi)와 돌연변이 유발을 사용하여 생성된 위치 548에 호박색 코돈을 포함하는 mGluR2를 포함하는 조작된 번역 기계의 동시 발현이 필요합니다(그림 2A,B). 시아닌 염료에 의한 AZP의 라벨링은 구리 촉매 고리 첨가 반응 (그림 2C)에 의해 달성되며 548UAA의 효과적인 원형질막 라벨링 (그림 2D)을 초래합니다. 전장 548UAA의 번역 및 이량체 수용체의 완전성을 확...

이 연구는 비천연 아미노산(UAA) 통합을 통한 부위 특이적 표지를 사용하여 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에 대한 단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET) 실험을 수행하는 자세한 절차를 제시합니다. 이 프로토콜은 smFRET 샘플 준비, 실험 및 데이터 분석을 위한 단계별 가이드를 제공합니다.

단일 분자 FRET를 사용한 막 수용체의 구조적 역학 시각화

The ability of cells to respond to external signals is essential for cellular development, growth, and survival. To respond to a signal from the ...

여기에서는 단일 분자 FRET와 천연 아미노산 통합을 통한 부위 특이적 단백질 표지를 사용하여 mGluR2의 구조적 역학을 연구했습니다. 이를 통해 단백질 구조를 교란하지 않고 단백질 역학을 연구 할 수 있습니다. 원자 구조는 단백질의 정적 이미지를 제공합니다.그러나 단일 분자 FRET를 사용하면 전체 범위의 단백질 움직임을 실시간으로 시각화할 수 있습니다. 이 방법은 모든 단백질의 역학을 연구하는 데 적용될 수 있습니다. 또한, 천연 아미노산 혼입은 단백질-단백질 상호 작용 및 합성 수용체의 공학을 연구하는 데 사용될 수 있습니다.샘플 로딩 및 이미징 최적화에는 인내와 연습이 필요합니다. 시작하려면 마커로 유리 슬라이드에 뚫을 구멍을 표시하십시오. Dremel을 사용하여 슬라이드를 물에 담그는 동안 슬라이드에 작은 구멍을 뚫습니다.슬라이드를 초음파 처리하고 섭씨 23도의 목욕 초음파 처리기에서 30분 동안 아세톤으로 슬립을 덮습니다. 슬라이드에서 아세톤을 폐기하고 슬립 병을 덮으십시오. 물로 철저히 헹구고 5 몰 수산화 칼륨에서 30 분 동안 초음파 처리합니다.다음으로, 슬라이드를 헹구고 슬립을 물로 덮고 메탄올에서 2 분 동안 초음파 처리한다. 아미노 염화 단계까지 메탄올로 채워진 항아리를 그대로 두십시오. 새로 준비한 아미노 염화 혼합물을 슬라이드에 붓고 슬립 병을 덮습니다.인큐베이션하고, 초음파 처리하고, 용액을 버리기 전에 슬라이드를 배양하고 아미노 염화 혼합물에서 슬립을 덮는다. 다음으로, 항아리를 물로 채우기 전에 메탄올로 씻으십시오. 그런 다음 슬라이드를 물로 헹굽니다.송풍으로 말리고 조립 상자에 넣으십시오. 슬라이드에 60ml의 PEGylation 용액을 바르고 그 위에 커버 슬립을 놓습니다. 보관하기 전에 PEG화되지 않은 면을 표시하십시오.배양 후 부드럽게 분해하고 슬라이드를 헹구고 슬립을 물로 덮으십시오. 그런 다음 공기를 불어 건조시키고 PEG화 된 표면이 서로 마주 보도록 멸균 된 50 밀리리터 튜브에 넣습니다. HEK 293T 세포를 0.05% 트립신-EDTA로 계대배양한 후, 세포를 폴리-L/D-라이신 커버 슬립에 시드합니다.세포 성장 및 대사성 글루타메이트 수용체 2 또는 mGluR2 발현을 위해 AZP 보충 배지와 함께 표준 배지를 놓습니다. 이어서, 세포를 형질감염 시약으로 형질감염시키고, 새로운 AZP 보충 배지로 배지를 변경하기 전에 24시간 동안 인큐베이션한다. 알킨 시아닌 염료로 라벨링하기 20분 전에 커버 슬립을 따뜻한 레코딩 버퍼(RB)로 두 번 세척하고 AZP가 없는 따뜻한 표준 배지에 넣습니다.그런 다음 새로 준비된 라벨링 용액을 추가하기 전에 표준 배지를 제거하고 RB로 셀을 세척하십시오. 어둠 속에서 섭씨 37도에서 15 분 동안 배양하십시오. 배양 후, 표지 용액을 제거한다.형질감염된 세포를 함유하는 커버 슬립을 RB로 2회 세척하고, 동일한 배지에 재현탁시킨다. 다음에, 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 1, 000 g으로 방사하여 세포를 펠렛하고, 펠렛을 80 내지 130 마이크로리터의 용해 용액에 재현탁시키기 전에 상층액을 제거한다. 피펫팅으로 펠릿을 깨뜨립니다.그런 다음 호일로 싸서 섭씨 4도의 로커에 30분에서 1시간 동안 놓아 세포를 용해시킵니다. 불용성 분획을 20, 000 g 및 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리하여 펠렛화한다. 그런 다음 상청액을 신선한 차가운 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관하십시오.냉동실에서 슬라이드와 커버 슬립을 제거하고 어두운 곳에서 실온에서 따뜻하게 합니다. 슬라이드와 커버 슬립 사이에 양면 테이프 스트립을 끼워 챔버를 조립하여 PEG화된 표면이 유동 챔버의 내부를 형성하도록 합니다. 피펫 팁을 사용하여 커버 슬립을 눌러 테이프가 커버 슬립 및 슬라이드에 접촉하는지 확인합니다.슬라이드 가장자리에 에폭시를 바르십시오. 40 마이크로 리터의 500 나노 몰 NeutrAvidin을 각 레인에 적용하고 가습 된 다크 박스 안에서 배양하십시오. 2분 후, 각 챔버 레인을 100 마이크로리터의 T50 완충액으로 세척한다.이어서, 20 나노몰 비오티닐화 항체 용액을 첨가하고, 레인당 200 마이크로리터의 T50 완충액으로 세척하기 전에 30분 동안 배양한다. 컴퓨터와 현미경을 켭니다. 그런 다음 레이저를 켜서 예열하십시오.그런 다음 EMCCD 카메라를 켜고 소프트웨어를 엽니다. 샘플 챔버를 현미경 스테이지에 장착하고 단백질 샘플을 점진적으로 추가하여 시야당 약 400개의 분자를 달성합니다. 0.3 단위의 프로토 카테 추 에이트 3, 4- 디 옥시 게나 제가 보충 된 100 마이크로 리터의 이미징 버퍼로 챔버를 세척하십시오.게인, 획득 속도 및 레이저 출력을 조정하여 공여체 및 수용체 채널 모두에서 단일 분자 형광 신호를 검출합니다. 그런 다음 기증자를 흥분시키고 시야에있는 기증자 분자의 80 %가 광 표백 될 때까지 시간 흔적을 얻습니다. 영화가 끝나면 640 나노 미터 레이저를 켜서 일부 분자가 광 표백 될 때까지 수용자를 직접 자극합니다.시야를 변경하고 기증자와 수락자의 여기 단계를 반복하여 조건당 3개의 영화를 수집합니다. 입자 피킹의 단일 분자 FRET 트레이스를 선택하려면 공여체 및 수용체 트레이스의 총 강도가 시간이 지남에 따라 안정적인 트레이스를 선택하십시오. 그런 다음 기증자 및 수용자 강도의 상관 관계 변화가 없는 추적을 선택합니다.단일 단계 광퇴색을 보여주는 기증자 및 수용자 분자를 선택하고 5초 이상 추적합니다. FRET 결핍을 계산하십시오. 마지막으로, 원고에 설명 된 단계에 따라 숨겨진 마르코프 모델링 (HMM)으로 구조적 상태를 식별하십시오.시아닌 염료에 의한 AZP의 표지는 구리 촉매 고리 첨가 반응에 의해 달성되었으며, 그 결과 548UAA의 효과적인 원형질막 표지가 세포 표면 집단이 공여체 및 수용체 형광단으로 표지되었습니다. SDS-PAGE 전기영동에서, 548UAA를 발현하는 HEK 293T 세포에서 250킬로달톤에서의 단일 밴드가 관찰되었으며, 이는 전장 이량체 mGluR2와 일치하였다. 기증자 및 수용자 표백 이벤트에 대한 여러 단기 및 장기 수명에 대한 대표적인 선택적 추적이 여기에 표시됩니다.구조적 상태는 HMM 분석을 사용하여 확인되었습니다. 이산 FRET 상태 간의 전환은 이상적인 피팅에서 추출되어 전이 밀도 히트 맵으로 플로팅되었습니다. 이상적인 FRET 추적은 식별된 각 확인에 대한 체류 시간에 대한 정보도 제공합니다.기증자 및 수용자 채널이 있는 단일 분자의 흔적이 여기에 표시됩니다. 또한, 단일 분자 FRET는 mGluR2 시스테인이 풍부한 도메인의 4 가지 구조적 상태를 나타냅니다. 효율적인 피크 보존은 단일 분자 풀다운에 필수적이며 이 과정에서 주의를 기울여야 합니다.또한 산소 제거제는 이미징 직전에 첨가해야합니다. 이 표지 방법과 단일 분자 FRET 실험은 여러 수용체에 적용되었으며 수용체 활성화 및 수용체 기능 조절 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리는 하나의 세포에서 형광을 사용하여 conformational 변화의 특정 사이트 분석과 함께 막 단백질의 이온 전달의 속도론을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 이온 채널 전송기 및 이온 펌프에 적응하고 단백질 subunits 사이의 거리 제한을 결정하기 위해 이용하실 수 있습니다.

막 단백질의 Conformational 역학 검사 현장에서 사이트 이동 형광 라벨링과

포스터 공명 에너지 전달은 (걱정) 현미경 기자 등 다양한 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 강력한 기술이다. 여기 어떻게 사용자 정의 epifluorescence를 구축하는 것은 상업적으로 이용 가능한 구성 요소와 방법을 실험을 안달을 위해 사용하는 방법에서 영상 시스템을 초조해 설명합니다.

Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달

이 프로토콜은 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 표면의 단일 수용체를 시각화 및 추적하여 수용체 측면 이동성, 수용체 복합체의 크기를 분석하고 일시적인 수용체-수용체 상호 작용을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 막 단백질로 확장될 수 있습니다.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

G 단백질 결합 수용체에 의한 G 단백질의 선택적 활성화를 감지하는 간단한 방법은 세포 신호 전달에서 뛰어난 과제로 남아 있습니다. Fӧrster 공명 에너지 전달(FRET) 바이오센서는 GPCR을 G 단백질 펩타이드에 쌍으로 연결하여 살아있는 세포의 제어된 농도에서 구조적 변화를 조사하는 방식으로 개발되었습니다.

G 단백질 선택적 G​​PCR의 입체는 라이브 셀 서스펜션 형광 분석에서 FRET 센서를 사용하여 측정

단일 분자 수준에서 고정밀 FRET 실험을위한 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 또한,이 방법론은 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA) 수용체의 리간드 결합 도메인에서 3 개의 구조 상태를 확인하는데 사용될 수있다. 정확한 거리를 결정하는 것은 FRET 실험에 기반한 구조 모델을 구축하기위한 첫 번째 단계입니다.

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

여기, 선물이 포스터 공명의 동시 사용에 대 한 프로토콜 에너지 전송 기반 긴장 센서 측정 단백질 역학 힘 민감한 측정을 사용 하는 photobleaching 후 단백질 부하 및 형광 복구를 측정 하 살아있는 세포 내 단백질 역학입니다.

살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

이 문서는 와이드필드 형광 현미경 검사를 사용하여 모바일, 단일 분자 Förster 공명 에너지 전송 (smFRET) 기반 프로브의 현면 분석을위한 방법을 제시한다. 새로 개발된 소프트웨어 툴킷을 사용하면 정확한 FRET 효율과 분자 위치를 포함한 움직이는 프로브의 smFRET 시간 추적을 시간의 함수로 판단할 수 있습니다.

모바일 단일 분자 FRET 프로브의 자동화된 2차원 스파티오 측량 분석

이 연구는 라벨링 사이트 선택, 염료 선택, 수집 및 데이터 분석을 포함한 FRET 매핑의 방법론을 자세히 설명합니다. 이 방법론은 단백질 시스템에서 결합 부위, 형태 변화 및 동적 운동을 결정하는 데 효과적이며 기존 3-D 구조 정보와 함께 수행 할 때 가장 유용합니다.

Förster 공명 에너지 전달 매핑: 글로벌 구조적 특징을 밝히기 위한 새로운 방법론

이 프로토콜은 TIRF 현미경을 사용하여 개별 이온 채널을 추적하고 지지된 지질막에서 그 활성을 결정하여 측면 막 이동과 채널 기능 간의 상호 작용을 정의하는 방법을 설명합니다. 멤브레인을 준비하고, 데이터를 기록하고, 결과를 분석하는 방법을 설명합니다.

TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용한 지질 이중층의 측면 이동성 및 이온 채널 활성에 대한 단일 분자 이미징

다이나민 슈퍼패밀리 단백질의 기능은 GTP 가수분해와 결합된 구조적 변화에 의존합니다. 시스템은 다양한 뉴클레오티드 로딩 상태에서 dynamin-like GTPase atlastin의 구조적 역학을 모니터링하기 위해 smFRET(single-molecule FRET) 기술을 사용하여 설명됩니다.

Dynamin-like GTPase Atlastin의 구조적 역학을 관찰하기 위한 Single-molecule FRET 이미징

학습하세요 단일 분자 FRET를 활용한 mGluR2 막 수용체의 구조적 역학 시각화 방법을. 비천연 아미노산 삽입을 통한 특이적 표지로 단백질 구조를 변형하지 않고 실시간으로 운동을 관찰할 수 있습니다.

단일 분자 FRET를 사용한 막 수용체의 구조적 역학 시각화

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