Name: ImageJ를 이용한 살모넬라균 의 세포내 표현형 자동 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 학습하세요 ImageJ를 이용한 살모넬라균의 장 상피세포 내 세포내 표현형 자동 정량 분석 방법을. 이 고해상도 형광 현미경 기법은 다양한 균주의 병원성 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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저자는 pCHAR-Duo 플라스미드를 공유해 주신 Olivia Steele-Mortimer 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 이탈리아 보건부의 자금 지원을 받아 PRC2019014 및 PRC2021004를 지원합니다.

<ol><li>European Food Safety Authority & European Centre for Disease Prevention and Control. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+European+Union+One+Health+2020+Zoonoses+Report%5BTitle%5D)+AND+%22EFSA+Journal%22%5BJournal%5D)">The European Union One Health 2020 Zoonoses Report.</a> EFSA Journal. 19 (12), 6971(2021).</li>
<li>Fattinger, S. A., Sellin, M. E., Hardt, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+effector+driven+invasion+of+the+gut+epithelium%3A+breaking+in+and+setting+the+house+on+fire%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Salmonella effector driven invasion of the gut epithelium: breaking in and setting the house on fire.</a> Current Opinion in Microbiology. 64, 9-18 (2021).</li>
<li>Knodler, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+invasive+Salmonella+via+bacterial-induced+extrusion+of+mucosal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dissemination of invasive Salmonella via bacterial-induced extrusion of mucosal epithelia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17733-17738 (2010).</li>
<li>Fulde, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+SPI2+T3SS+mediates+transcytosis+in+polarized+enterocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Salmonella SPI2 T3SS mediates transcytosis in polarized enterocytes in vivo.</a> Cell Host & Microbe. , (2019).</li>
<li>Cooper, K. G., Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictable%2C+tunable+protein+production+in+Salmonella+for+studying+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Predictable, tunable protein production in Salmonella for studying host-pathogen interactions.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 475(2017).</li>
<li>Klein, J. A., Grenz, J. R., Slauch, J. M., Knodler, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+activity+of+the+Salmonella+invasion-associated+injectisome+reveals+its+intracellular+role+in+the+cytosolic+population%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Controlled activity of the Salmonella invasion-associated injectisome reveals its intracellular role in the cytosolic population.</a> mBio. 8 (6), 01931(2017).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Ibarra, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Salmonella+pathogenicity+island+1+under+different+growth+conditions+can+affect+Salmonella-host+cell+interactions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Induction of Salmonella pathogenicity island 1 under different growth conditions can affect Salmonella-host cell interactions in vitro.</a> Microbiology. 156 (4), 1120-1133 (2010).</li>
<li>Tambassi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+hilD+in+a+Salmonella+Derby+lineage+linked+to+swine+adaptation+and+reduced+risk+to+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mutation of hilD in a Salmonella Derby lineage linked to swine adaptation and reduced risk to human health.</a> Scientific Reports. 10 (1), 21539(2020).</li>
<li>Finn, C. E., Chong, A., Cooper, K. G., Starr, T., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second+wave+of+Salmonella+T3SS1+activity+prolongs+the+lifespan+of+infected+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A second wave of Salmonella T3SS1 activity prolongs the lifespan of infected epithelial cells.</a> PLoS Pathogens. 13 (4), 1006354(2017).</li>
<li>Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+cytosolic+Salmonella+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells.</a> PLoS One. 9 (1), 84681(2014).</li>
<li>Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+Salmonella+Type+III+Secretion+System+1+in+bacterial+adaptation+to+the+cytosol+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A role for the Salmonella Type III Secretion System 1 in bacterial adaptation to the cytosol of epithelial cells.</a> Molecular Microbiology. 112 (4), 1270-1283 (2019).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

살모넬라 균이 장 상피 세포를 식민지화하는 방식은 감염 결과에 영향을 미칩니다. 침윤시, 세포질 과잉 복제는 장의 염증을 유도하는반면, 액포 복제는 전신 확산4을 유발할 수 있습니다. 살모넬라 균주는 장 상피 세포 내부를 침범하고 복제하는 능력이 다양 할 수 있습니다9. 실제로 살모넬라 균은 질병을 일으키는 능력이 다른 2,500 개 이상의 혈청 형으로 구성된 매우 다양한 속입니다. 또한 살모넬라 균은 유럽 연합에서 식 인성 발병의 가장 빈번하게보고되는 원인으로 인간 인구의 큰 확산을 나타냅니다1. 따라서 살모넬라균의 세포내 표현형을 정량화하기 위한 신뢰할 수 있는 고처리량 방법의 가용성은 많은 수의 살모넬라 균주 간의 병독성 차이를 평가하고 궁극적으로 이 병원균의 정확하고 균주 특이적 위험 평가를 허용하는 데 매우 중요합니다.
여기에 설명된 프로토콜은 상피 세포 내부의 살모넬라균 거동을 빠르고 자동화된 방식으로 측정합니다. 상피 세포의 감염은 96웰 이미징 마이크로플레이트에서 수행되며 이미지 획득에는 자동 형광 현미경이 사용되므로 이 프로토콜은 고처리량 애플리케이션에 적합합니다. 이 프로토콜은 pCHAR-Duo 플라스미드를 이용하며, 이는 2개의 형광 리포터5의 차등 발현을 통해 액포와 세포질 살모넬라균 을 구별할 수 있게한다. 살모넬라균 의 세포 내 표현형은 종종 수동 스코어링으로 분석되는데, 이는 균주당 많은 수의 균주 및 세포 배양을 분석하는 데 적합하지 않고 작업자의 오류 및 작업자 간 변동이 발생하기 쉬운 시간 소모적인 절차입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 영역 분석과 단일 세포 분석이라는 두 가지 보완적이고 자동화된 이미지 분석이 개발되었습니다. 무료로 사용할 수 있는 소프트웨어인 ImageJ를 사용하여 두 가지 분석을 개발했습니다. 프로토콜 실행을 가속화하기 위해 운영자 개입 없이 여러 수집 파일의 배치 분석을 위한 ImageJ 스크립트가 보조 파일로 제공됩니다.
면적 분석은 상피 세포의 핵이 특이적으로 차지하는 영역과 GFP와 함께 mCherry 또는 mCherry를 발현하는 살모넬라균 의 측정을 통해 상피 세포의 전체 집락화(감염 비율)와 과복제 수준(hyper-replication ratio)을 몇 단계로 정량화하도록 설계되었습니다. 영역 분석은 저배율에서 획득한 이미지에 적용되며, 액포와 과복제 살모넬라균 이 동일한 z-평면에 초점이 맞춰지고 현미경 필드당 많은 수의 상피 세포가 표시되어 획득 파일의 크기와 수가 줄어듭니다. 면적 분석을 통해 많은 수의 샘플에 대해 자동화되고 빠르며 계산적으로 가벼운 분석이 가능하므로 스크리닝 실험과 같은 고처리량 분석에 적합합니다.
단일 세포 분석은 세포 분할 및 세포 영역의 측정과 액포 및 세포질 과복제 살모넬라가 차지하는 면적의 백분율을 통해 얻은 단일 세포 분해능으로 상피 세포 내부의 살모넬라 표현형을 정량화하도록 설계되었습니다. 면적 분석을 통해 특징 지어지는 상피 세포의 전체 집락화는 감염된 세포의 백분율, 평균 액포 부하 및과 복제 속도의 세 가지 정량적 매개 변수로 분해되어 전체 식민지화에 대한 각 표현형의 기여도를 평가하고 정량화 할 수 있으므로 면적 분석 결과를 보완합니다. 단일 세포 분석이 제공하는 더 많은 세부 사항은 이미지 획득 및 분석 속도가 느려집니다. 실제로, 단일 셀 해상도를 달성하기 위해, 이미지 획득은 고배율에서 수행된다. 이는 초점이 맞춰진 액포 및 세포질 살모넬라균을 모두 관찰하기 위해 여러 z-평면이 필요하고 많은 수의 상피 세포를 채점하기 위해 샘플당 많은 수의 필드를 획득해야 하므로 면적 분석과 비교하여 획득 시간이 연장됨을 의미합니다. 또한 여러 개의 대용량 수집 파일을 분석하는 것은 계산적으로 까다롭기 때문에 적절한 워크스테이션이 필요합니다(6코어, 32GB RAM 워크스테이션 사용). 따라서 단일 세포 분석은 제한된 처리량 조건에서 독립형으로 사용하거나 상피 세포 내부의 살모넬라 표현형을 더 깊이 이해하기 위해 영역 분석에 결합된 두 번째 수준 방법으로 사용할 수 있습니다.
두 가지 보완 분석은 S를 사용하여 검증되었습니다. Tm, S. 더비 wt, 그리고 S. Derby ΔsipA는 상피 세포 내부의 그들의 행동이 침습 또는 복제 측면에서 이미 다른 것으로 알려져 있기 때문에 선택되었습니다 9,10. 영역 및 단세포 분석의 결과는 프로토콜이 시험된 균주의 특성에 따라 세포내 살모넬라 표현형의 차이를 정량적으로 구별할 수 있음을 보여준다. 더욱이, 이들 결과는 단일-세포 분석이 면적 분석을 사용하여 점수화된 전체 콜로니제이션에 대한 각각의 세포내 표현형(침윤, 액포 부하 및 세포질 복제)의 기여도의 정량화를 허용한다는 것을 입증한다.
이 프로토콜은 살모넬라균의 다양한 균주의 시험관 내 병원성을 연구하기 위해 여기에 적용되었지만 상피 세포 내부의 침입 및/또는 복제에 관여하는 유전자를 식별하기 위한 무작위 돌연변이 연구와 같은 다른 응용 프로그램을 가질 수 있습니다. 또한, 상기 프로토콜은 INT407 세포 이외의 다른 세포주 내부의 살모넬라균의 거동을 분석하도록 조정될 수 있다. 또한 다른 세포 내 미생물의 세포 - 병원체 상호 작용을 연구하기위한 유사한 방법을 개발하기위한 출발점으로 사용될 수 있습니다.

살모넬라 균은 유럽 연합1에서 식 인성 질환의 발병을 일으키는 가장 빈번하게보고되는 박테리아 인자입니다. 살모넬라 감염의 주요 병리학 적 증상은 장염이며, 이는 섭취 후 장내 병원체 행동과 그에 따른 국소 염증 반응의 결과입니다2. 그러나 살모넬라 균은 또한 장 외 부위로 전파되어 특히 면역 저하 된 개인에게 전신 감염을 일으킬 수 있습니다. 살모넬라와 장 상피 사이의 상호 작용 유형은 감염의 결과를 결정합니다. 일단 장 내강에 들어가면 살모넬라 균은 장 상피 세포 내부로 침입하여 복제합니다. 세포 내 수준에서 살모넬라 균은 살모넬라 함유 액포 (SCV) 내에서 세포질 과복제와 액포 내 느린 복제의 두 가지 다른 복제 표현형을 나타낼 수 있습니다. 세포질 과복제는 염증성 숙주 세포 사멸 및 장 내강으로의 살모넬라 압출을 유도합니다3; 액포 복제는 상피 횡단 침투 및 전신 확산으로 이어집니다4. 따라서 침입 및 액포 대 세포질 복제의 정도가 감염 과정에 영향을 미칩니다.
살모넬라 균 속은 숙주 범위와 질병을 일으키는 능력이 다른 수천 개의 혈청 형을 포함하여 매우 다양합니다. 예를 들어 S입니다. Typhimurium은 관련없는 여러 숙주를 감염시키고 인간 살모넬라증의 주요 원인 중 하나를 나타 내기 때문에 일반 혈청으로 정의됩니다. 다르게, S. Derby는 대부분 돼지로부터 분리되기 때문에 돼지 적응 혈청 형으로 간주되지만 인간 감염을 담당하는 혈청 형의 상위 5 위에도보고됩니다1. 그러나 상피 세포 내부의 박테리아 행동에 대한 지식은 본질적으로 S와 같은 몇 가지 참조 균주에 대한 연구로 제한됩니다. Typhimurium SL1344, 이는 살모넬라 병원성의 광대 한 자연 다양성을 나타내지 않습니다. 살모넬라균의 다양한 균주와 상피 세포의 상호 작용을 특성화하는 것은 다양한 병원성을 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 이러한 이유로 많은 균주의 세포 내 거동을 빠르고 대부분 자동화된 방식으로 분석하기 위해 고처리량 형광 현미경 기반 프로토콜이 개발되었습니다. 이 프로토콜에서는 96웰 이미징 플레이트에서 상피 세포의 감염을 수행하고 자동 형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득했습니다. pCHAR-Duo 플라스미드를 형광현미경을 통해 상피세포 내부의 살모넬라균의 침윤 및 복제 표현형을 관찰하기 위해 사용하였다5. 이 플라스미드는 모든 형질전환된 박테리아 세포에 의해 구성적으로 발현되는 적색 형광 리포터 mCherry를 코딩하는 유전자와 녹색 형광 리포터 GFP를 코딩하는 유전자를 운반하며, 그의 발현은 진핵 세포의 세포질에만 존재하고 SCV에는 없는 포도당-6-인산에 의해 활성화됩니다. 따라서 플라스미드는 mCherry 및 GFP 리포터의 차별적 발현에 의해 액포와 세포질 박테리아를 구별할 수 있습니다.
현미경 이미지의 액포 및 세포질 박테리아는 일반적으로 수동 스코어링6으로 정량화되지만 이는 분석을 소수의 샘플로 제한하는 시간 소모적인 방법입니다. 따라서 무료로 제공되는 이미지 분석 소프트웨어인 ImageJ7을 사용하여 영역 분석과 단일 셀 분석이라는 두 가지 보완적이고 자동화된 이미지 분석이 개발되었습니다. 면적 분석은 획득 한 각 현미경 이미지에서 상피 세포, 적색 및 녹색 살모넬라 균이 차지하는 영역의 데이터를 사용하여 전체 세포 내 박테리아 부하와 세포질 과다 복제 정도를 측정합니다. 이 방법은 저배율에서 획득한 이미지에 적용할 수 있습니다. 따라서 적은 이미지로 많은 수의 상피 세포를 채점할 수 있어 획득 시간이 단축됩니다. 단일 세포 분석은 세포 분할을 사용하여 감염된 세포의 백분율, 평균 액포 부하 및 단일 세포 분해능으로 세포질 과복제를 받는 감염된 세포의 백분율을 결정합니다.
이 프로토콜에서는 이미지 분석의 모든 단계를 수동으로 수행하도록 자세히 설명하지만 특별히 설계된 ImageJ 스크립트로 동일한 분석을 자동화할 수 있습니다. 또한 이러한 스크립트를 사용하면 배치 분석을 실행하여 여러 이미지를 자동으로 분석하여 메서드 실행 속도를 높일 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>96-well 이미징 마이크로플레이트</td>, <td>Eppendorf</td><td>30741030</td><td>세포 배양 및 감염</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59349</td><td>박테리아 배양</td></tr><tr><td>Axio observer 도립 현미경</td><td>ZEISS</td><td></td><td>자동 형광 현미경</td></tr><tr><td>Axiocam 305 Mono</td><td>ZEISS</td><td></td><td>현미경 카메라</td></tr><tr><td>통기성 밀봉 멤브레인</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z380059</td><td>감염 분석</td></tr><tr><td>Colibr&igrave; 5/7</td><td>ZEISS</td><td></td><td>Led 광원</td></tr><tr><td>콜라겐 I 랫 테일</td><td>Life Technologies</td><td>A1048301</td><td>콜라겐 코팅</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>세포 염색</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td>세포 배양 및 감염</td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G12664</td><td>감염 분석</td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>Carlo Erba</td><td>401391</td><td>콜라겐 코팅</td></tr><tr><td>HCS CellMask Blue</td><td>Invitrogen</td><td>H32720</td><td>세포 염색</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin)</td><td></td><td>이미지 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>최소 필수 Eagle's Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5650-500ML</td><td>세포 배양 및 감염</td></tr><tr><td>파라포름알데히드 4%</td><td>Invitrogen</td><td>FB002</td><td>세포 고정</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>PanReac AppliChem</td><td>131494.1211</td><td>PBS 준비</td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td><td>성 Sigma-Aldrich</td><td>60220</td><td>PBS 준비</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131659.1214</td><td>박테리아 배양 및 PBS 준비</td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71640</td><td>PBS 준비</td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크 25 cm2 플러그 씰 나사 캡</td><td>Euroclone</td><td>ET7025</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Biorad</td><td>1610407</td><td>세포 염색</td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>세포 배양 및 감염</td></tr><tr><td>트립톤</td><td>옥소이드</td><td>LP0042B</td><td>박테리아 배양</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Biolife</td><td>4122202</td><td>박테리아 배양</td></tr></tbody></table>

imagej를 이용한 살모넬라균 의 세포내 표현형 자동 분석

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

살모넬 라 균은 장 상피를 침범하고 살모넬라 균 특이 적 액포 내부와 세포질에서 자유 (세포질 과잉 복제) 모두에서 장 세포에서 복제 할 수있는 장 병원체입니다. 이러한 세포 내 복제의 이러한 다양한 표현형은 병인의 다른 경로, 즉 세포질 과복제는 염증성 세포 사멸 및 장 내강으로의 압출을 유도하는 반면, 액포 복제는 상피 횡단 침투 및 전신 확산을 유도합니다. mCherry와 GFP의 차별적 발현에 의해 액포와 세포질 박테리아를 구별할 수 있는 pCHAR-Duo 형광 리포터 플라스미드와 같은 침범된 세포 내에서 살모넬라 균의 거동을 연구하기 위한 현미경 도구를 만들기 위해 상당한 노력을 기울였습니다. 그러나 세포 내 표현형은 종종 수동으로 점수를 매기므로 분석을 소수의 샘플과 세포로 제한하는 시간 소모적 인 절차입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 무료로 제공되는 이미지 분석 소프트웨어인 ImageJ를 사용하여 두 가지 보완적이고 자동화된 이미지 분석이 개발되었습니다. 고처리량 프로토콜에서, 상피 세포는 96-웰 플레이트를 사용하여 pCHAR-Duo를 운반하는 살모넬라균 에 감염되었다. 이미징은 자동화된 형광 현미경을 사용하여 수행하였다. 그런 다음 두 가지 이미지 분석 방법을 적용하여 서로 다른 세부 수준에서 살모넬라균 의 세포 내 거동을 측정했습니다. 첫 번째 방법은 전체 세포 내 박테리아 부하와 세포질 과복제의 정도를 측정합니다. 빠르고 많은 수의 세포와 샘플의 스코어링이 가능하여 스크리닝 실험과 같은 고처리량 분석에 적합합니다. 두 번째 방법은 단일 세포 분석을 수행하여 감염된 세포의 비율, 살모 넬라균 의 평균 액포 부하 및 상피 세포 내부의 살모넬라균 행동에 대한 자세한 정보를 제공하는 세포질 과복제율을 결정합니다. 프로토콜은 살모넬라-장 세포 상호 작용의 주요 단계에 대한 배치 분석을 자동으로 실행하기 위해 특별히 설계된 ImageJ 스크립트로 수행 할 수 있습니다.

살모넬라 균주에 의한 상피 세포의 감염 이 프로토콜은 상피 세포 내 살모넬라균의 세포 침습 및 세포질 복제(그림 1A) 대 액포 부하(그림 1B)를 분석하기 위해 개발되었습니다. 프로토콜은 다음의 3가지 살모넬라 균주 S를 사용하여 검증되었습니다. 티피뮤리움 SL1344 기준 균주(S. Tm), S. 더비 ER1175 와일드타입(S. Derby wt) 및 S의 동종 돌연변이. sipA 유전자가 없는 더비 ER1175(S. 더비 ΔsipA). S. Derby ER1175 균주는 돼지로부터 분리되었고, 살모넬라 분리물의 IZSLER 감시 수집에 속한다. 균주는 프로토콜에 의해 커버되는 표현형 다양성을 나타내기 위해 선택되었다. 특히, 이러한 균주는 상피 세포 내부의 행동이 침윤 또는 복제 측면에서 이미 다른 것으로 알려져 있기 때문에 선택되었습니다9; 따라서 프로토콜이 세포 내 살모넬라 표현형의 차이를 정량적으로 구별 할 수 있는지 여부를 테스트하는 데 유용한 대조군이었습니다. 특히, S. Tm 및 S. Derby wt는 이전에 S. Tm은 S보다 침습 및 세포 내 복제 효율이 높습니다. 더비 wt9 동안 S. Derby ΔsipA는 독성 이펙터 SipA가 하이퍼복제10,11의 발병에 결정적인 역할을 하기 때문에 하이퍼복제 손상 균주로서 첨가되었다. 이전에 S에 대해보고되었습니다. 세포질 복제가 침습 후 4 시간 후에 시작되고, 세포질 집단이 빠르게 과다 복제되어 8 시간11,12 분까지 상피 세포를 채 웁니다. 일관되게, 8 시간 긴 감염은 또한 S에서 세포질 과복제 표현형을 관찰하고 정량화하기에 적합하였다. 더비 wt 및 S. 더비 ΔsipA.
면적 분석 단계 4.1의 면적 분석은 하이퍼 복제 (hyper-replication ratio)의 측정과 함께 살모넬라 균에 의한 상피 세포의 전체 집락화 (감염 비율)의 측정을 제공합니다. 그림 2에 설명된 영역 분석 워크플로우에서는 랜덤 노이즈가 감소한 다음 채널이 독립적으로 분할 및 처리됩니다. 영역 측정에서 배경을 제외하기 위해 각 채널에 대해 임계값이 설정됩니다. 그런 다음 임계 픽셀이 차지하는 영역이 각 채널에 대해 측정됩니다. 면적 분석의 결과는 각 획득 파일에 대해 상피 세포핵(파란색 채널), 세포 내 mCherry 발현 살모넬라균(빨간색 채널) 및 mCherry와 함께 GFP(녹색 채널)를 발현하는 세포질 과복제 살모넬라가 차지하는 영역의 확장을 보고하는 테이블입니다. 감염 비율은 mCherry 발현 살모넬라가 차지하는 면적을 숙주 세포 핵이 차지하는 영역으로 나누어 계산합니다. 시험된 균주의 결과는 S. Tm은 두 S 모두에 비해 상당히 높은 감염률을 나타냅니다. 예상대로 더비 균주(그림 3A). 따라서 이러한 결과는 상피 세포를 식민지화하는 살모넬라 균주의 능력의 차이를 검출하는 면적 분석의 효능을 입증합니다. 살모넬라 과복제율은 GFP-발현 살모넬라가 차지하는 면적을 세포내 mCherry-발현 살모넬라가 차지하는 면적으로 나누어 측정한다. 하이퍼 복제를 결정하는 SipA의 역할과 일관되게 S의 하이퍼 복제 비율이 크게 감소했습니다. 더비 ΔsipA 균주는 S와 비교하여 측정되었다. 더비 중량, (그림 3B). S 간에 하이퍼복제 차이는 관찰되지 않았다. Tm 및 S. 더비 wt. 전반적으로, 영역 분석은 분석된 균주 간에 서로 다른 하이퍼복제 수준을 효과적으로 밝혀냈습니다.
단일 세포 분석 단일 세포 분석을 통해 단일 세포 분해능으로 상피 세포 내부의 살모넬라 침습 및 액포 부하 대 세포질 복제를 정량화할 수 있습니다. 4.2단계에서 설명한 대로 각 수집 파일에 대해 파란색, 빨간색 및 녹색 채널을 독립적으로 처리했습니다(그림 4). 구체적으로, 상피 세포에 해당하는 청색 채널을 단계 4.2.3에서 처리하여 세포 분할을 얻었다. 그런 다음 분할된 셀을 관심 영역(ROI) 관리자에 추가하여 y-x 좌표로 고유하게 레이블이 지정된 모든 세그먼트화된 셀에 해당하는 ROI 목록을 얻었습니다. GFP-발현 과복제성 살모넬라균의 초점이 맞지 않는 픽셀을 제거하기 위해, 녹색 채널의 픽셀을 적색 채널의 픽셀로부터 뺐다. 단일 세포 분석의 출력 표는 각 ROI에 대해, mCherry 구성 리포터 또는 GFP 세포질 반응성 리포터만을 발현하는 살모넬라가 차지하는 ROI 영역의 면적 및 백분율을 보고합니다. mCherry 만 발현하는 살모넬라 균이 차지하는 세포 면적의 백분율을 4.2.4 단계에서 처리하여 감염된 세포의 백분율과 평균 액포 부하를 계산했습니다 (그림 5A). 액포 부하의 분석은 S. Derby 균주는 S보다 훨씬 낮은 평균 액포 부하를 생성합니다. Tm(그림 5B). 반대로, S에서 감염된 세포의 백분율의 약간이고 유의하지 않은 감소 만이 관찰되었다. 더비 균주는 S와 비교됩니다. Tm(그림 5A). GFP 발현 살모넬라균 이 차지하는 세포 면적의 백분율을 4.2.5단계에서 처리하여 하이퍼복제율을 얻었다. S 간에 차이는 관찰되지 않았다. Tm 및 S. 더비 wt, 동안 S. Derby ΔsipA 는 면적 분석 결과(그림 5C) 및 과복제를 유도하는 SipA의 역할과 일치하는 과복제의 현저한 감소를 나타냈다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64263/64263fig1v2.jpg"> 그림 1: 살모넬라 세포질 과복제 및 액포 부하. (A) 살모넬라 과복제 및 (B) 고배율(40x)에서 획득한 액포 부하의 대표 이미지가 표시됩니다. 패널 B는 비-하이퍼-복제 살모넬라균(z:4/8)과 비교하여 과복제 살모넬라균(z:7/8)을 함유하는 세포의 상이한 초점 평면을 나타낸다. 흰색 스케일 바는 10μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64263/64263fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64263/64263fig02.jpg"> 그림 2: 면적 분석의 워크플로우. 면적 분석의 워크플로우는 pCHAR-Duo 플라스미드(MOI 100)를 운반하는 살모넬라균으로 8시간 동안 감염된 INT407 세포의 대표적인 저배율(10x) 획득에 대해 표시됩니다. 먼저 랜덤 노이즈를 줄인 다음 채널을 C1, C2 및 C3으로 분할하여 독립적으로 처리합니다. 측정 영역에서 배경을 제외하기 위해 각 채널에 대해 임계값이 설정됩니다. 이어서, C1의 세포핵, C2의 모든 세포내 살모넬라, 및 C3의 시토졸 살모넬라에 상응하는 임계치화된 픽셀들에 의해서만 점유되는 영역을 각 채널에 대해 측정한다. 여기에서 분석된 이미지는 10배 배율로 획득한 4개의 타일을 스티칭하여 융합한 결과입니다. 흰색 스케일 바는 100μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64263/64263fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64263/64263fig03.jpg"> 그림 3: 면적 분석 결과. 면적 분석 결과가 표시됩니다. (A) 감염률은 모든 세포내 세균을 대표하는 mCherry 발현 살모넬라균(C2 채널)이 차지하는 면적을 숙주 세포핵이 차지하는 면적(C1 채널)로 나누어 계산합니다. (B) 하이퍼-복제 비율은 세포질 하이퍼-복제 박테리아만을 나타내는 GFP-발현 살모넬라균(C3 채널)이 차지하는 면적을 모든 세포내 mCherry-발현 살모넬라균이 차지하는 면적으로 나누어 측정하였다. 각 점은 반복실험을 나타냅니다. 분석은 3 개의 생물학적 복제물에 대해 수행되었으며, 각각은 3 배로 테스트되었습니다. 검은색 선은 평균값을 나타냅니다. 유의성은 양측 t-검정을 사용하여 계산되었으며 p 값이 보고됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64263/64263fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64263/64263fig04.jpg"> 그림 4: 단일 세포 분석의 워크플로우. 단일 세포 분석의 워크플로우는 pCHAR-Duo 플라스미드 (MOI 100)를 운반하는 살모넬라로 8시간 동안 감염된 INT407 세포의 대표적인 고배율 획득(40x)에 대해 도시된다. 먼저 채널은 C1, C2 및 C3로 분할되어 독립적으로 처리됩니다. 상피 세포에 해당하는 청색 채널(C1)을 처리하여 세포 분할을 얻은 다음, 분할된 각 세포를 y-x 좌표로 고유하게 표지된 관심 영역(ROI)으로 정의합니다. 적색 채널(C2)은 녹색 채널(C3)을 빼서 처리하여 초점이 맞지 않는 세포질 과복제 살모넬라균을 제거하고 mCherry만 발현하는 모든 액포 살모넬라균을 남긴 다음 랜덤 노이즈를 줄이고 임계값은 측정에서 배경을 제외하도록 설정됩니다. 마지막으로, 각 ROI에 대해 액포 살모넬라가 차지하는 면적을 측정합니다. 총 세포질 GFP 발현 살모넬라균에 해당하는 녹색 채널(C3)도 유사하게 처리됩니다. 여기에서 분석 된 이미지는 16 개의 타일을 바느질로 융합 한 결과입니다. 흰색 스케일 바는 100μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64263/64263fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64263/64263fig05.jpg"> 그림 5: 단일 세포 분석 결과. 단일세포 분석의 결과를 나타내었다. (A) 감염된 세포의 백분율은 세포 수를 살모넬라 균만을 발현하는 mCherry 만 차지하는 면적의 백분율로 나눈 것이고&gt; 0.2를 총 세포 수로 나눔으로써 얻어진다. (B) 평균 액포 부하는 감염된 세포에서 살모넬라균 만을 발현하는 mCherry가 차지하는 평균 퍼센트 면적을 계산함으로써 얻어졌다. (C) 과복제율은 GFP 발현 살모넬라균이 차지하는 면적의 백분율로 세포 수를 총 감염된 세포 수≥20%로 나누어 계산하였다. 삼중 시험된 3-4개의 생물학적 복제물의 데이터가 보고됩니다. 막대는 측정의 표준 오차를 나타냅니다. 유의성은 양측 t-검정을 사용하여 계산되었으며 p 값이 보고됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64263/64263fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 영역 분석 스크립트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64263/REVIEWED_Area%20analysis%20script.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: 단일 세포 분석 스크립트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64263/REVIEWED_Single-cell%20analysis%20script.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

살모넬라 균 은 살모넬라 특이 적 액포와 세포질에서 자유 (과다 복제) 모두에서 장 상피 세포 내부를 침범하고 복제합니다. 고처리량 형광 현미경 기반 프로토콜은 ImageJ를 통한 두 가지 보완 이미지 분석을 통해 살모넬라균 의 세포 내 표현형을 정량화하여 단일 세포 분해능 및 스코어링에 도달하기 위해 여기에 설명되어 있습니다.

ImageJ를 이용한 살모넬라균 의 세포내 표현형 자동 분석

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free ...

이 형광 현미경 방법은 장 상피 세포 내부의 살모넬라 표현형을 자동화된 방식으로 정량화하여 확장 가능한 분해능으로 많은 수의 균주에서 살모넬라균을 연구할 수 있습니다. 우리의 방법은 정량적이고 처리량이 높으며 동시에 자동화되어 면적과 단일 세포 분석에 모두 의존한다는 장점이 있습니다. 세포 내 행동은 많은 박테리아의 숙주-병원체 상호 작용의 중심입니다.우리의 방법은 살모넬라 이외의 박테리아 병원체에 쉽게 적응할 수있어 발병 기전을 이해하는 데 기여합니다. 이미지를 획득한 후 획득을 열어 단일 셀 분석을 수행합니다. 이미지 J의 czi 파일입니다.이미지를 클릭하고 색상을 선택한 다음 채널 분할을 선택하여 채널을 분할합니다. 셀 분할의 경우 C1 획득 제목 창에서 Z 평면 이미지를 선택합니다. C1 획득 제목 창을 선택하고 이미지를 클릭한 다음 복제본을 클릭합니다.그런 다음 선택한 Z 평면의 번호를 씁니다. 제목 상자에 C1Zplane을 작성하고 스택 복제를 선택 취소 한 다음 확인을 클릭하여 선택한 Z 평면 이미지 만 복제합니다. 선택한 Z 평면 이미지를 보여주는 C1Zplane이라는 창이 열립니다.이제 프로세스를 선택하고 대비 향상을 클릭하여 얻은 C1Zplane 이미지의 이미지 대비를 향상시킵니다. 포화 픽셀을 조정하고 표준화를 선택한 다음 확인을 클릭하여 대비 향상 기술을 적용하여 대비 정규화된 C1Z평면 이미지를 얻습니다. 프로세스로 이동하고 최대값 찾기를 클릭하여 대비 정규화된 C1Z평면 이미지에서 상피 세포를 분할합니다.그런 다음 모든 상피 세포에 하나의 최대값만 부여하려면 미리 보기 점 선택에 플래그를 지정하고 잡음 허용 오차를 설정합니다. 표시된 최대점당 분할된 각 입자를 표시하는 새로운 이진 마스크형 이미지인 C1Z평면 분할 이미지를 가져오려면 가장자리 최대값 제외에 플래그를 지정하고 분할된 입자를 출력 유형으로 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 다음으로, C1Z평면 세그먼트 영상에서 세그먼트화된 셀의 마스크를 만듭니다. 분석, 입자 분석을 차례로 클릭한 다음 마스크 표시 및 가장자리에 제외 옵션을 선택합니다.크기 간격을 설정하고 확인을 클릭하여 C1Zplane 세그먼트 이진 마스크의 마스크를 가져옵니다. 코드 체계표를 클릭하고 도구 모음에서 표 반전을 선택합니다. 대비 정규화된 C1Zplane 이미지를 임계값으로 지정하려면 이미지로 이동하여 조정, 임계값을 차례로 선택하고 어두운 배경을 확인합니다.자동 임계값 설정을 기본값으로 설정하고 빨간색 옵션을 선택합니다. 셀이 완전히 빨간색으로 표시되어 어두운 배경이 남을 때까지 최소 컷오프 값을 조정합니다. 적용을 클릭하여 대비 정규화된 C1Zplane 이미지를 셀이 흰색이고 배경이 검은색인 이진 이미지로 변환합니다.또한 C1Zplane 세그먼트 이진 마스크의 마스크에서 셀 분할을 수정하려면 프로세스를 선택하고 이미지 계산기를 클릭합니다. 그런 다음 이미지 1로 분할된 C1Zplane의 마스크를 선택하고 드롭다운 목록에서 연산 AND를 선택한 다음 임계값이 있는 대비 정규화된 C1Z평면을 이미지 2로 선택합니다. 확인을 클릭하면 ImageJ가 자동으로 출력 이미지의 이름을 C1Z평면 분할 마스크의 결과로 지정합니다.C1Z평면의 모든 세그먼트 셀에 관심 영역으로 레이블을 지정하려면 분석을 클릭한 다음 입자 분석을 클릭합니다. 앞에서 설명한 대로 크기를 조정하고 아무 것도 표시 옵션을 선택합니다. 관리자에 추가를 선택하여 ROI 관리자 도구에 모든 파티클을 추가합니다.또한 가장자리에서 제외를 선택하고 확인을 클릭합니다. ROI 데이터를 ROI-셀-획득 제목으로 저장합니다. 더보기 를 클릭하고 저장을 선택하여 ROI 관리자 메뉴를 탐색합니다. 세포 분할을 완료한 후 C2 획득 제목 창에서 작업하여 액포 살모넬라균을 분석합니다.먼저 프로세스로 이동하여 이미지 계산기를 클릭하고 C2 획득 타이틀을 이미지 1로 선택한 다음 드롭다운 목록에서 빼기 작업을 선택합니다. 그런 다음 C3 획득 타이틀을 이미지 2로 선택하고 새 창 만들기를 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 프로세스 스택 창에서 Yes(예)를 클릭하여 전체 Z 스택에 빼기를 적용합니다. 이미지 메뉴를 클릭하고 복제를 선택하여 C2 획득 타이틀 창의 결과를 복제합니다.그런 다음 중복 스택을 확인하고 확인을 눌러 C2 획득 타이틀 하나의 창에서 결과를 얻습니다. 프로세스로 이동하여 필터를 클릭하고 가우스 흐림 효과를 선택하여 C2 획득 제목 하나의 창에 가우스 흐림 효과를 적용합니다. Sigma 값을 2로 두거나 사용자 지정합니다.확인을 클릭하고 프로세스 스택 창에서 예를 클릭하여 전체 Z 스택에 가우스 흐림 효과를 적용합니다. 처리를 클릭하고 이미지 계산기를 선택하여 C2 획득 제목 1의 가우스 필터링 결과를 C2 획득 제목 1의 결과로 뺍니다. 이제 C2 획득 제목의 결과를 이미지 1로 선택하고, 드롭다운 목록에서 빼기 작업을 선택하고, C2 획득 제목 1의 결과를 이미지 2로 선택하고, 확인을 클릭합니다. 프로세스 스택 창에서 예를 클릭하여 전체 Z 스택에 빼기를 적용하면 C2 획득 제목의 결과로 ImageJ가 자동으로 이름을 지정한 창을 얻을 수 있습니다.C2 획득 결과 제목의 결과 배경에서 살모넬라균을 분리하려면 이미지를 클릭하고 조정을 선택한 다음 임계값을 클릭합니다. 그런 다음 어두운 배경을 확인하고 자동 임계값을 Otsu로 설정합니다. 살모넬라균이 완전히 빨간색으로 나타나 어두운 배경이 남을 때까지 최소 컷오프 값을 조정합니다.적용을 클릭하면 바이너리로 변환이라는 창이 열립니다. 검은 색 배경을 확인하고 확인을 클릭하십시오. C2 획득 결과 제목 이진 윈도우의 결과에서 세포내 살모넬라 초점 평면에 대응하는 중간 Z 평면을 선택한다. 이미지를 클릭한 다음 스택을 클릭한 다음 슬라이스 설정을 선택합니다.이제 선택한 Z 평면의 번호를 쓰고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 분석을 클릭하고 측정 설정을 선택하여 각 ROI에 대해 기록할 측정값을 설정합니다. 그런 다음 각 ROI의 전체 면적에 해당하는 영역을 확인하십시오. 각 ROI에 대해 임계값 픽셀이 차지하는 면적 분율을 기록하려면 면적 분수 및 임계값 제한을 확인합니다.디스플레이 레이블을 확인하여 모든 단일 ROI에 이미지 제목, 채널, Z 평면 및 X/Y 좌표를 지정합니다. 세포 내 살모넬라균의 선택된 Z 평면을 사용하여 모든 단일 세포에 대해 살모넬라균이 차지하는 레이블, 면적 및 백분율 영역을 기록합니다. ROI-셀-획득 제목을 엽니다.zip 파일을 클릭하여 파일 메뉴를 클릭하고 열기를 선택합니다. 그런 다음 ROI 관리자 메뉴에서 측정을 클릭합니다. 출력은 선택한 측정값을 보고하는 테이블입니다.마지막으로 파일을 선택하고 결과 창에서 다른 이름으로 저장을 클릭하여 결과 테이블을 저장합니다. 세포 침습, 액포 부하 및 살모넬라균의 세포질 과복제가 상피 세포 내부에서 시각화되었습니다. 면적 분석 결과 두 살모넬라 더비 균주에 비해 살모넬라 티피뮤리움의 감염률이 유의하게 높았으며, 이는 상피 세포를 식민지화하는 살모넬라 균주의 능력 차이를 감지하는 면적 분석의 효능을 입증했습니다.살모넬라 더비 sipA-결실된 돌연변이 균주는 살모넬라 더비 야생형에 비해 감소된 과복제 비율을 나타냈으며, 이는 과복제를 유도하는 sipA의 역할과 일치한다. 살모넬라 티피뮤리움과 살모넬라 더비 야생형 사이에 과복제 차이는 관찰되지 않았습니다. 단일 세포 분석은 살모넬라 티피뮤리움과 비교하여 살모넬라 더비 균주에서 감염된 세포의 비율에 유의미한 차이가 없음을 보여주었습니다.그렇지 않으면, 살모넬라 더비 균주는 살모넬라 티피뮤리움보다 유의하게 낮은 평균 액포 부하를 생성하였다. 살모넬라 티피뮤리움과 살모넬라 더비 야생형 간에 차이가 관찰되지 않은 반면, 살모넬라 더비 sipA는 면적 분석 결과와 일치하는 과복제의 유의한 감소를 나타냈습니다. 살모넬라 균에는 다양한 독성을 가진 여러 혈청 형이 포함됩니다.이 빠르고 자동화된 방법으로 많은 수의 균주를 조사하는 것은 이 병원체의 실제 독성 잠재력을 이해하는 데 크게 기여합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 multiwell 플레이트에 zebrafish 배아 유전자 변형의 자동 이미징 및 분석을위한 시스템의 개발을보고합니다. 이것은 Fibroblast 성장 팩터 리포터 유전자의 표현에 작은 분자, BCI의 복용 부양 효과를 측정하고 높은 처리량 zebrafish 화학 화면 설립을위한 기술을 제공하는 능력을 보여줍니다.

zebrafish 화학 화면을위한 자동화 이미징 및 분석의 개발.

이 문서에서는 RAW 264.7 세포에 의한 polyanhydride의 nanoparticles이나 박테리아의 내면화를 수치 멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법을 활용한 방법을 설명합니다.

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

여기서는 작은 간섭 합성 RNA(siRNA), 화학 화합물 및 진균 결핵 돌연변이 라이브러리의 고처리량/고함량 스크린에 적용되는 표현성 분석을 설명합니다. 이 방법은 자동 공초점 현미경 검사를 사용하여 형광으로 표지된 숙주 세포 내의 형광표지 진균 결핵의 검출에 의존합니다.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

체외 표현형 살모넬라 또는 다른 세균성 협회, 침윤 및 높은 처리량과 식세포에서 복제에 높은 처리량 분석이 개발되었다. 방법은 호스트 병원체 상호 작용에서의 침범 위해 살모넬라 유전자 녹아웃 돌연변이 균주를 평가하기 위해 사용 하였다.

표현형 높은 처리량 분석 살모넬라 엔테 티피 뮤 리움 협회, 침략, 그리고 대 식세포에서의 복제

이 문서에서는 합성 및 나노 입자의 형광 라벨 NPS ()하는 방법을 설명합니다. NPS는 진핵 세포의 엔도 - 리소좀 시스템에 레이블을 펄스 - 체이스 실험에 적용되었다. 세포 내 병원균 살모넬라 엔테의 활동에 의한 엔도 - 리소좀 시스템의 조작은 라이브 세포 이미징 및 정량화 따랐다.

형광 나노 입자의 응용 프로그램은 세포 내 세균에 의해 엔도 - 리소좀 시스템의 리모델링을 연구하기 위해

우리는 차등 디지토닌 투과화를 사용하여 골수 유래 대식세포에서 세포질 및 액포 Salmonella typhimurium의 정량화를 설명합니다.

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