Name: 대두 공생 결절에서 폴리솜 정제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 배우세요 대두 공생 결절에서 폴리솜 정제 방법을. 원심분리 기반 기술로 복잡한 조직에서 유전자 발현과 번역체 수준을 연구할 수 있습니다. RNA-Seq와 결합하여 전사체와 번역체의 관계를 분석하는 새로운 프로토콜입니다.

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이 연구는 CSIC I+D 2020 보조금 번호 282, FVF 2017 보조금 번호 210 및 PEDECIBA(마리아 마사 사인즈)의 자금 지원을 받았습니다.

1. 식물 생장 및 뿌리 줄기 접종
<ol><li>필요한 결절을 생성하려면 통제 된 조건에서 성장 챔버에서 선택한 기질에 선택한 대두 종자를 뿌립니다. 참고 :이 프로토콜에서 씨앗은 모래 : 질석 (1 : 1)의 혼합물로 채워진 0.5L 플라스틱 병에 뿌려졌습니다. 성장 챔버는 각각 28°C/20°C의 주야간 사이클 온도 및 각각 16h/8h의 명암/어둠 광주기로 설정되었습니다. 광합성 활성 방사선 강도는 620 μmol·m−2·s−1이었다.</li>
	<li>액체 효모 추출물 만니톨 (YEM) 배지를 미리 준비하십시오 ( 재료 표 참조). 매체를 오토 클레이브하십시오.</li>
	<li>종자 파종 당일에 100mL의 YEM이 들어있는 플라스크 1 개에 Bradyrhizobium elkanii U1302 균주를 접종합니다. 플라스크를 28°C에서 100 rpm의 오비탈 쉐이커 상에서 인큐베이션한다.<ol><li>뿌리 줄기를 2 일 동안 자라게하고 묘목에 2mL의 배양 물을 접종하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 물 부족 처리 (선택 사항)
참고: 이 프로토콜은 콩 식물의 물 부족 처리를 간략하게 설명합니다. 이 부분은 당면한 실험 질문에 따라 완전히 변경되거나 생략 될 수 있습니다.
<ol><li>물 제한없이 19 일 (V2-3 발달 단계) 동안 콩 묘목을 재배하십시오. 기판을 0.5 mMKNO3로 보충된 B&D-배지17로 현장 용량으로 유지한다.</li>
	<li>20 일째에 급수를 철회하십시오. 참고: 여기에서 수분 함량은 성장 및 물 부족 기간 동안 중량 측정(물 중량 함량)으로 매일 측정되었습니다.</li>
	<li>20 일부터 물 부족 기간이 끝날 때까지 제조업체의 지시에 따라 ( 재료 표 참조) 기공 측정기를 사용하여 축 방향 잎 표면에서 매일 3 회 기공 전도도를 측정하십시오. 참고 : 물 부족 기간의 끝은 기공 전도도 값이 파종 20 일째에 얻은 값의 약 50 % 일 때 각 식물에 대해 개별적으로 결정되었습니다.</li>
</ol>3. 결절 수확
<ol><li>깨끗한 용기에 액체 질소를 수집하고 15mL 튜브에 라벨을 붙입니다 (각 식물에 하나씩). 주의 : 냉동 장갑, 안면 보호대 및 보안경을 착용하고 액체 질소를 취급하십시오.</li>
	<li>각 플랜트를 개별적으로 검색합니다. 공중 부분을 잘라내어 폐기하십시오. 뿌리를 물로 철저히 씻어 남아있는 기질을 제거하십시오.</li>
	<li>뿌리에서 각 결절을 분리하고 미리 냉각 된 15mL 튜브에 모으십시오. 튜브를 스냅 동결하고 -80 ° C에서 보관하십시오.</li>
</ol>4. 세포질 추출물의 제조
참고: 이 프로토콜의 최종 목표는 고품질 총 RNA(TOTAL) 및 폴리솜 관련 RNA(PAR)를 얻는 것입니다. 따라서 RNA 분해를 방지하는 조건에서 작업하고 항상 샘플을 4 ° C로 유지하고 RNase가없는 실험실 장비 및 용액을 사용하십시오. 명시되지 않는 한, 모든 용액은 멸균 초순수로 준비됩니다.
<ol><li>완충 원액의 준비<ol><li>표 1에 나열된 오토클레이브 가능한 스톡 용액을 준비하고 15분 동안 오토클레이브한 다음 RT에 보관합니다.</li>
		<li>표 1에 나열된 필터 멸균 가능한 스톡 용액을 준비하고 필터 멸균 한 다음 -20 ° C에서 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>폴리솜 추출 완충액(PEB, 표 1 참조)을 준비하고 얼음 위에 보관합니다. 참고: 주어진 볼륨은 6개의 샘플에 대한 것입니다.</li>
	<li>원심분리기를 4°C로 냉각하고 2mL 미세 원심분리기 튜브를 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>칭량 접시에서 손상되지 않은 결절 약 0.2g을 칭량하고 이를 사전 냉각된 2mL 튜브로 옮깁니다. 알림: 샘플이 해동되지 않도록 이 단계를 빠르게 수행하십시오. 대안적으로, 0.2 g 대신에 0.4-0.5 mL의 추정된 결절 부피가 사용될 수 있다.</li>
	<li>1.2mL의 PEB를 추가하고 샘플을 2분 동안 해동시킨 다음 결절이 완전히 파괴되고 균질화될 때까지 조직 분쇄기로 균질화합니다. 알림: 해동된 결절은 미세 원심분리기 튜브의 조직 분쇄기( 재료 표 참조)로 쉽게 파손될 수 있을 만큼 충분히 부드러워지므로 반드시 연마하십시오. 얼어 붙은 결절은 갈기가 어렵습니다. 또한 샘플을 시원하게 유지하면서 적절한 균질화를 위해 튜브를 벤치탑 냉각기(0°C)에 배치하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>10분 동안 또는 모든 샘플이 처리될 때까지 부드럽게 교반하면서 얼음 위에서 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>16,000 ×g에서 4 ° C에서 15 분 동안 원 심 분리하여 파편을 펠릿합니다. 상청액을 회수하고 원심분리 단계를 반복한다.</li>
	<li>정화된 세포질 추출물을 조심스럽게 회수하고 200μL 분취량을 깨끗한 1.5mL 미세원심분리 튜브로 옮겨 TOTAL 분리합니다(TOTAL 샘플, 섹션 7 참조).</li>
</ol>5. 자당 쿠션의 제조
알림: 이 프로토콜은 12mL 초원심분리 튜브에 33.5겹 자당 쿠션(13.2% 및 13.2%)을 사용합니다( 재료 표 참조). 모든 용액은 멸균 초순수로 준비됩니다.
<ol><li>자당과 소금 원액을 준비하십시오.<ol><li>2M 자당 용액 100mL를 준비합니다(68.5%, 표 1).</li>
		<li>10x 소금 용액을 준비하십시오 (표 1).</li>
	</ol></li>
	<li>수크로스 쿠션의 2층을 표 2에 기재된 바와 같이 준비한다. 항생제(CHX 및 CHL) 스톡 용액의 조성에 대해서는 표 1 을 참조하십시오. 알림: 주어진 볼륨은 6개의 쿠션용입니다.</li>
	<li>4.5mL의 33.5% 자당 층을 원심분리 튜브에 붓습니다. 그런 다음 P1000 마이크로피펫으로 12% 층 4.5mL를 조심스럽게 천천히 추가합니다. 정화 된 세포질 추출물이 첨가 될 때까지 튜브를 얼음 위에 올려 놓으십시오.</li>
</ol>6. 폴리솜 정제
<ol><li>정화된 세포질 추출물 1mL(단계 4.8)를 튜브의 측벽에 조심스럽게 피펫팅하여 자당 쿠션 위에 놓습니다.</li>
	<li>초원심분리 튜브를 4°C에서 2시간 동안 217,874×g(기준 로터에서 35,000rpm)의 예냉식 버킷과 원심분리기로 옮깁니다.</li>
	<li>남아 있는 시토졸 추출물 및 슈크로스 쿠션을 버리고, 폴리좀 펠렛을 200 μL의 예냉된 RB( 표 1에 따라 미리 제조됨)로 재현탁시킨다.</li>
	<li>얼음 위에서 30분 동안 배양한 다음 폴리솜 재현탁액을 1.5mL 예냉된 튜브로 옮깁니다. RNA 추출 (PAR 샘플)을 진행하십시오.</li>
</ol>7. RNA 추출 및 품질 관리
참고 :이 단계는 TOTAL (4.8 단계) 및 PAR 샘플 (6.4 단계)에 대해 수행됩니다.
<ol><li>멸균 초순수로 75 % EtOH를 준비하고 -20 ° C로 냉각시킵니다. 또한 클로로포름과 이소프로판올을 -20 ° C로 냉각하십시오.</li>
	<li>샘플을 750μL의 RNA 분리 시약으로 균질화하고 RT에서 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>차가운 클로로포름 200μL를 넣고 튜브를 15초 동안 세게 흔듭니다. RT에서 10 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>상 분리를 위해 4°C에서 15 분 동안 12,000×g의 원심분리. 분홍색 유기상을 방해하지 않고 상부 수성상 500μL를 깨끗한 튜브로 옮기고 375μL의 차가운 이소프로판올과 0.5μL의 RNase가 없는 글리코겐을 추가합니다( 재료 표 참조). 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합합니다. 참고: 글리코겐은 알코올 침전으로부터 핵산 회수를 증가시키기 위해 공침제로 사용되는 운반체입니다.</li>
	<li>혼합물을 4°C에서 10분 동안 배양하고 12,000× g 에서 15분 동안 원심분리합니다. 상청액을 폐기하십시오.</li>
	<li>RNA 침전물을 차가운 75 % EtOH 1mL로 세척한다. 간단한 소용돌이로 혼합하십시오. 참고: 이 시점에서 샘플은 -20°C에서 밤새 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>4°C에서 5 분 동안 7,500×g으로 원심분리하고, 마이크로피펫으로 상청액을 조심스럽게 제거하고, RNA 펠릿을 자연 건조시킨다.</li>
	<li>펠릿을 RNase가 없는 물 50μL에 녹이고 65°C에서 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>고감도 모세관 전기영동18(재료 표 참조) 및/또는 2% RNase가 없는 아가로스 겔(19)에 대한 전기영동으로 RNA 농도 및 무결성을 평가합니다(재료 표 참조). 참고: RNA 샘플을 즉시 사용하지 않거나 RNA-seq 라이브러리 준비를 위해 시퀀싱 시설로 보내려는 경우 EtOH를 사용하여 침전시키는 것이 좋습니다.</li>
</ol>8. RNA 침전
<ol><li>원심분리기 및 EtOH를 4°C로 냉각시킨다.</li>
	<li>3M 아세트산 나트륨을 준비하십시오.</li>
	<li>멸균 초순수로 70 % EtOH를 준비하고 -20 ° C로 냉각시킵니다.</li>
	<li>샘플 부피를 추정합니다. 0.1 부피의 3M 아세트산 나트륨, 3 부피의 차가운 EtOH 및 0.5 μL의 RNase가없는 글리코겐을 추가하십시오. 철저히 섞는다.</li>
	<li>필요할 때까지 -20 ° C에서 그대로 두십시오. 참고: RNA 침전 샘플은 -1°C에서 최대 80년 동안 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>9. 유전자 발현 분석을 위한 표준 파이프라인
<ol><li>신뢰할 수 있는 트랜스크립톰 및 트랜스라톰 데이터 분석을 위해 판독 길이가 >100bp인 평균 40M Illumina 쌍단 판독을 수행합니다. 참고: 표준 RNA-seq 데이터 분석에는 다음 단계 9.2-9.5가 포함됩니다.</li>
	<li>FastQC(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) 또는 멀티샘플 MultiQC20을 사용하여 판독 품질 검사를 수행합니다.</li>
	<li>Trimmomatic 21, BBDuk (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/), cutadapt22, 낫23 또는 Trim Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)를 사용하여 어댑터 및 저품질 시퀀스를 제거합니다.</li>
	<li>종에 대한 참조 게놈을 사용할 수 있는 경우 참조에 대한 읽기 매핑을 수행한 다음 다른 오픈 소스 도구 외에도 Bowtie224, TopHat2 25 또는 Salmon 26 및 featureCounts27을 사용하여 풍부도 정량화를 수행합니다.</li>
	<li>edgeR28, DESeq229 또는 limma30을 사용하여 차등 발현 유전자 식별을 위한 통계 분석을 수행합니다. 참고: 이러한 오픈 소스 소프트웨어는 명령줄을 통해 로컬로 사용할 수 있습니다. 대안적으로, 이들은 그래픽 사용자 인터페이스를 제공하는 은하계(31 ) 또는 지오익스플로러(32)와 같은 공개 서버의 웹 브라우저를 통해 작동될 수 있어서, 그것들을 사용하기 위해 커맨드 라인 지식이 필요하지 않다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없습니다.

번역 수준에서 유전자 발현 조절을 연구하는 것은 세포 유전자 발현의 종말점이 단백질 풍부도이기 때문에 다양한 생물학적 과정을 더 잘 이해하는 데 중요합니다13,14. 이것은 다염색체 분획을 정제해야하는 관심 조직 또는 유기체의 트랜스 라톰을 분석하고 관련 mRNA를 분석 한 3,4,34,35,36을 분석하여 평가할 수 있습니다.
자당 쿠션을 통해 대두 공생 결절 폴리솜을 정제한 다음 TOTAL 및 PAR 추출을 수행하는 방법이 여기에 제시됩니다. 두 RNA 분획을 모두 얻는 것은 RNA-...

콩 (Glycine max)과 같은 콩과 식물은 뿌리 줄기라고하는 특정 토양 박테리아와 공생 할 수 있습니다. 이 상호 주의적 관계는 식물 뿌리에 새로운 기관인 공생 결절의 형성을 유도합니다. 결절은 박테리아를 숙주하는 식물 기관이며 세포질이 박테로이드라는 특수한 형태의 뿌리 줄기로 식민지화 된 숙주 세포로 구성됩니다. 이 박테로이드는 대기 질소 (N 2)의 암모니아로의 환원을 촉매하며, 암모니아는 탄수화물 1,2에 대한 대가로 식물로 옮겨집니다.
이 질소 고정 공생은 가장 잘 연구 된 식물-미생물 공생 중 하나이지만, 다양한 비 생물 적 스트레스 조건을받는 식물이 공생 파트너와의 상호 작용을 조절하는 방법과 이것이 결절 대사에 미치는 영향과 같은 많은 측면이 더 잘 이해되어야합니다. 이러한 과정은 결절 번역체 (즉, 활발히 번역 된 메신저 RNA [mRNA]의 하위 집합)를 분석함으로써 더 잘 이해 될 수있다. 폴리리보솜 또는 폴리솜은 mRNA와 관련된 여러 리보솜의 복합체로, 일반적으로 번역3을 연구하는 데 사용됩니다. 폴리솜 프로파일링 방법은 폴리솜과 관련된 mRNA의 분석으로 구성되며 다양한생물학적 과정에서 발생하는 유전자 발현을 제어하는 전사 후 메커니즘을 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다4,5.
역사적으로 게놈 발현 분석은 주로 mRNA 풍부도 6,7,8,9를 결정하는 데 중점을 두었습니다. 그러나, 유전자 발현, 특히 번역10,11,12의 전사 후 조절의 상이한 단계로 인해 전사체와 단백질 수준 사이의 상관 관계가 부족하다. 더욱이, 전사체 수준에서의 변화와 트랜스 라톰13의 수준에서 발생하는 변화 사이에는 의존성이 관찰되지 않았다. 번역되는 mRNA 세트의 직접 분석을 통해 mRNA 수준 만 분석 할 때 얻은 것보다 세포 유전자 발현 (종말점이 단백질 풍부도)을보다 정확하고 완벽하게 측정 할 수 있습니다 14,15,16.
이 프로토콜은 식물 유래 폴리솜이 2층 자당 쿠션을 통한 차등 원심분리를 통해 온전한 대두 결절에서 정제되는 방법을 설명합니다(그림 1). 그러나 박테로이드 유래 리보솜도 결절에 존재하기 때문에 진핵 생물이 주요 분획 (90 % -95 %)을 나타내더라도 리보솜과 RNA 종의 혼합이 정제됩니다. 후속 RNA 분리, 정량화 및 품질 관리도 설명합니다(그림 1). 이 프로토콜은 RNA-seq와 함께 공생 결절과 같은 복잡한 조직에서 진핵 mRNA의 번역 조절에 대한 실험 결과를 제공해야합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64269/64269fig01.jpg"> 그림 1: 공생 결절로부터 진핵 폴리솜 정제를 위해 제안된 방법론의 개략적인 개요. 이 계획은 (1) 식물 성장 및 (2) 결절 수확에서 (3) 세포질 추출물의 준비, (3) TOTAL 샘플 및 (4) PAR 샘플 획득, (5) RNA 추출 및 품질 관리에 이르기까지 프로토콜에서 따르는 단계에 대한 개요를 제공합니다. 약어: PEB = 폴리솜 추출 완충액; RB = 재현탁 완충액; 합계 = 총 RNA; PAR = 폴리솜 관련 mRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64269/64269fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>식물 생장 및 rhizobia 접종</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Daihan Scientific</td><td></td><td>Model SHO-1D</td></tr><tr><td>YEM-medium</td><td>Amresco</td><td>J850 (효모 추출물) 0122 (만니톨)</td><td></td></tr> <tr><td>수분 결핍 치료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KNO3</td><td>Merck</td><td></td><td></td>221295</tr><tr><td>포로미터</td><td>십각형 장치</td><td></td><td>모델 SC-1</td></tr><tr><td>메스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><강>세포질 추출물 준비</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brij L23</td><td>시그마-알드리치</td><td>P1254</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>시그마</td><td></td><td>모델 2K15</td></tr><tr><td>클로란페니콜</td><td>시그마-알드리치</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>시클로헥시미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>DOC</td><td>시그마-알드리치</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>시그마-알드리치</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>시그마-알드리치</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>이그팔 CA 360</td><td>시그마-알드리치</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>머크</td><td>1.04936</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 티슈 그라인더</td><td>Fisher Scientific</td><td>12649595</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>PTE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2393</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>계량 접시&nbsp;</td><td>Deltalab</td><td>1911103</td><td></td></tr><tr><td>Preparation of sucrose cushions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Invitrogen</td><td>15503022</td><td></td></tr><tr><td>SW 40 Ti rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td>Optima L-100K</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tubes</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344059</td><td>13.2 mL 튜브</td></tr><tr><td>RNA 추출 및 품질 관리</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo scientific</td><td>R0492</td><td></td></tr><tr><td>바이오분석기</td><td>애질런트</td><td></td><td>모델 2100. 진핵생물 총 RNA 나노 분석</td></tr><tr><td>클로로포</td>름 <td>DI</td><td>41191</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Dorwil</td><td>UN1170</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Mallinckrodt</td><td>3032-06</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐</td><td>시그마</td><td>10814-010</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol LS</td><td>Ambion</td><td>102960028</td><td></td></tr><tr><td>Miscellaneous</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon 튜브 15 mL</td><td>Biologix</td><td>10-0152</td><td></td></tr><tr><td>필터 팁 10 &마이크로; L</td><td>BioPointe Scientific</td><td>321-4050</td><td></td></tr><tr><td>필터 팁 1000 &마이크로; L</td><td>BioPointe Scientific</td><td>361-1050</td><td></td></tr><tr><td>필터 팁 20 &마이크로; L</td><td>BioPointe Scientific</td><td>341-4050</td><td></td></tr><tr><td>필터 팁 200 &마이크로; L</td><td>Tarsons</td><td>528104</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mL</td><td>Tarsons</td><td>500010-N</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 2.0 mL</td><td>Tarsons</td><td>500020-N</td><td></td></tr><tr><td>염기서열분석 회사</td><td>Macrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile 250 mL 플라스크</td><td>Marienfeld</td><td>4110207</td><td></td></tr></tbody></table>

대두 공생 결절에서 폴리솜 정제

Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules

이 프로토콜의 목적은 대두의 진핵생물 번역(Glycine max) 공생 결절을 연구하기 위한 전략을 제공하는 것입니다. 이 논문은 RNA 시퀀싱을 사용하여 분석할 식물 유래 폴리리보솜 및 관련 mRNA를 분리하는 데 최적화된 방법을 설명합니다. 첫째, 세포질 용해물은 전체 냉동 대두 결절로부터 폴리솜 및 RNA 보존 조건에서 균질화를 통해 얻어진다. 그런 다음 저속 원심분리에 의해 용해물을 제거하고 상청액의 15%를 총 RNA(TOTAL) 분리에 사용합니다. 나머지 투명화된 용해물은 2층 슈크로스 쿠션(12% 및 33.5%)을 통한 초원심분리에 의해 폴리좀을 분리하는 데 사용됩니다. 폴리솜 관련 mRNA (PAR)는 재현탁 후 폴리솜 펠릿으로부터 정제된다. TOTAL과 PAR은 모두 RNA-seq에 대한 시퀀싱 라이브러리의 품질 표준을 충족하기 위해 고감도 모세관 전기영동으로 평가됩니다. 다운스트림 적용의 예로서, 시퀀싱 후, 유전자 발현 분석을 위한 표준 파이프라인을 사용하여 전사체 및 트랜스플라톰 수준에서 차등적으로 발현된 유전자를 수득할 수 있다. 요약하면,이 방법은 RNA-seq와 함께 공생 결절과 같은 복잡한 조직에서 진핵 mRNA의 번역 조절을 연구 할 수있게합니다.

RNA 시퀀싱과 같은 대부분의 다운스트림 응용 분야에서 고품질 샘플이 라이브러리 준비 및 시퀀싱의 기본이기 때문에 위에서 언급한 절차로 정제된 TOTAL 및 PAR 분획의 양 및 품질 평가는 성공 여부를 결정하는 데 중요합니다. 더욱이, RNA 분자의 완전성은 샘플 수집순간 (18)에서 유전자 발현 프로파일의 스냅 샷의 캡처를 허용한다. 이러한 맥락에서 RNA 무결성 번호(RIN)는 바이오분석기를 사용하여 이러한 측정을 수행할 때 얻어집니다. RIN은 10(온전)에서 1(완전 저하)18 범위의 강력하고 안정적이며 사용자 독립적인 방식으로 무결성 값을 할당하는 데 사용됩니다.
그림 2A, B 는 여러 TOTAL 및 PAR 샘플 분획에 대한 고감도 모세관 전기 영동 시스템 (Bioanalyzer)의 표준 출력을 보여...

이 프로토콜은 온전한 대두 결절로부터 진핵 폴리솜 정제를 위한 방법을 기술한다. 시퀀싱 후, 유전자 발현 분석을 위한 표준 파이프라인을 사용하여 전사체 및 트랜스라톰 수준에서 차등적으로 발현된 유전자를 식별할 수 있습니다.

The aim of this protocol is to provide a strategy for studying the eukaryotic translatome of the soybean (Glycine max) symbiotic nodule. This paper ...

이 프로토콜은 우리가 아는 한 대두 공생 결절에서 키네틱 폴리솜 정제를 위한 새로운 원심분리기 기반 금속을 설명하는 최초의 프로토콜이기 때문에 중요합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 RNA-Seq와 결합하여 공생 결절과 같은 복잡한 조직으로 조직화되고 관계를 연구 할 수 있다는 것입니다. 시작하려면 칭량 접시에서 손상되지 않은 결절 약 0.2g의 무게를 측정하고 사전 냉각된 2밀리리터 튜브로 옮깁니다.그런 다음 1.2ml의 폴리솜 추출 버퍼를 추가하고 샘플을 2분 동안 해동한 다음 결절이 완전히 파괴되고 균질화될 때까지 조직 분쇄기로 균질화합니다. 다음으로, 10 분 동안 또는 모든 샘플이 처리 될 때까지 부드러운 교반으로 얼음 위에서 샘플을 배양하고 섭씨 4도에서 15 분 동안 16, 000 배 G에서 원심 분리하여 파편을 펠릿화합니다. 이어서, 상청액을 회수하고, 원심분리 단계를 반복한다.정화된 세포질 추출물을 조심스럽게 회수한 후, 200 마이크로리터 분취량을 깨끗한 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 완전히 분리합니다. 그런 다음 4.5 밀리리터의 33.5 % 자당 층을 원심 분리기 튜브에 붓고 P-1000 마이크로 피펫으로 12 % 층의 4.5 밀리리터를 조심스럽게 천천히 첨가합니다. 다음으로, 정화 된 세포질 추출물이 첨가 될 때까지 튜브를 얼음 위에 올려 놓으십시오.정화된 세포질 추출물 1밀리리터를 튜브의 측벽에 조심스럽게 피펫팅하여 자당 쿠션 위에 놓습니다. 그런 다음 초 원심 분리 튜브를 사전 냉각 된 버킷으로 옮기고 섭씨 4도에서 2 시간 동안 217, 874G에서 원심 분리합니다. 남아 있는 시토졸 추출물 및 슈크로스 쿠션을 버린 후, 200 마이크로리터의 미리 냉각된 재현탁 완충액으로 폴리좀 펠릿을 재현탁시킨다.다음으로, 얼음 위에서 30분 동안 배양한 다음, 폴리솜 재현탁액을 1.5밀리리터 예냉관으로 옮겨 RNA 추출을 진행한다. 샘플을 750 마이크로리터의 RNA 분리 시약으로 균질화한 후 실온에서 5분 동안 배양한다. 그런 다음 200 마이크로 리터의 차가운 클로로포름을 넣고 튜브를 15 초 동안 세게 흔 듭니다.다음으로, 실온에서 10 분 동안 배양한다. 상 분리를 위해 섭씨 4도에서 15 분 동안 12, 000 회 G에서 원심 분리하고, 분홍색 유기 상을 방해하지 않고 상부 수성 상 500 마이크로 리터를 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 375 마이크로 리터의 차가운 이소프로판올과 0.5 마이크로 리터의 RNA가없는 글리코겐을 첨가하십시오.그런 다음 위아래로 피펫팅하여 완전히 혼합합니다. 혼합물을 섭씨 4도에서 10 분 동안 배양하고 15 분 동안 12, 000 회 G에서 원심 분리합니다. 이어서, 상청액을 버리고, RNA 침전물을 1 밀리리터의 차가운 75% 에탄올로 세척한다.간단한 소용돌이로 혼합하십시오. 다음으로, 섭씨 4도에서 5 분 동안 7, 500G에서 원심 분리하십시오. 상청액을 버리고 RNA 펠릿을 자연 건조시킵니다.이어서, 펠릿을 50 마이크로리터의 RNA 자유수에 녹이고, 섭씨 65도에서 5분 동안 배양한다. 고감도 모세관 전기영동 및, 또는 2%RNAs 유리 아가로스 겔에 대한 전기영동으로 RNA 농도와 무결성을 평가합니다. 샘플 부피를 추정 한 후 0.1 부피의 3 몰 아세트산 나트륨, 3 부피의 차가운 에탄올 및 0.5 마이크로 리터의 RNA (유리 글리코겐)를 첨가하십시오.그런 다음 철저히 섞으십시오. 모세관 전기 영동은 여러 개의 전체 및 다염색체 관련 RNA 샘플 분획에 대해 수행되었으며, 이는 번진 모양없이 날카로운 리보솜 RNA 밴드를 보여주었습니다. 그러나 RIN 값은 손상되지 않은 샘플에 해당하는 5.9에서 7.5 사이이므로 RIN 값에 반영되지 않습니다.바이오 분석기는 전체 및 폴리 솜 관련 RNA 샘플 모두에 대해 전기 페로 그램에서 볼 수있는 18S 및 25S 피크를 식별하지 못했습니다. 샘플 분해의 시각적 징후는 없었습니다. 그러나 비교를 위해 거의 완전히 분해 된 샘플의 결과를 시각화하기 위해 샘플을 분석했습니다.가장 중요한 것은 전체 프로토콜 동안 폴리솜 및 RNA 보존 조건에서 작업하는 것입니다. 전체 및 par RNA 분획을 시퀀싱한 후 유전자 발현 분석을 위한 표준 패턴은 전사 및 번역 수준에서 차등 발현 유전자를 확인하는데 사용될 수 있다.

polysome-purification-from-soybean-symbiotic-nodules

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

높은 품질의 효모 세포 추출물의 준비를 개별 단백질 또는 전체 프로테옴의 분석에 필요한 첫 번째 단계입니다. 여기에서 우리는 단백질의 기능, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정 사항을 보존하기 위해 최적화 된 신진 효모 세포에 대한 빠르고, 효율적이며 신뢰성있는 균질화 프로토콜을 설명합니다.

함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제

이 원고는 신진 효모 사카로 마이 세스 세레 비지에, sumoylation 및 동원체 단백질, Ndc10 및 Ndc80의 유비퀴틴의 검출에 대해 설명합니다.

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

수성 시스템에서 금의 흡착 및 재활용에 대한 기본 정보를 얻기 위해 S층 단백질에서 Au(III) 및 Au(0) 나노 입자의 상호 작용을 조사했습니다. 단백질 고분자의 흡착은 ICP-MS에 의해, 단백질성 단층의 흡착은 QCM-D에 의해 조사되었습니다. 후속 AFM은 나노 구조의 이미징을 가능하게 합니다.

Slp1 중합체 및 단층의 AU-상호 작용<em&gt; Lysinibacillus 스패 리 쿠스</em&gt; JG-B53 - QCM-D, 생체 분자 - 금속 연구 도구로서 ICP-MS와 AFM

이 프로토콜은 결합된 리보솜의 수를 기준으로 식물 조직에서 전사체를 추출하고 분획하는 쉬운 방법을 설명합니다. 이를 통해 translation activity의 전반적인 추정치와 특정 mRNA의 translational status 결정을 수행할 수 있습니다.

공장 Polysom​​e 프로파일 링을위한 쉬운 방법

여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형체에 적용된 상호 작용 캡처 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합에 비판적으로 의존하며 생리 환경으로부터 식물 mRNA 결합 단백질의 분리 및 동정을 허용합니다.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

우리는 라이브 셀에 복잡 한 규제 및 신호 메커니즘을 연구를 많은 양의 콩 protoplasts의 준비를 위한 간단 하 고 효율적인 프로토콜을 개발.

콩 Protoplasts 및 변이 유전자 표정 분석 응용 프로그램의 격리에 대 한 간단한 방법

단백질 대사 산물 및 단백질-단백질 상호 작용은 모든 세포 기능에 중요 한. 여기, 우리는 선택의 이러한 상호 작용 단백질으로의 병렬 분석을 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 식물 세포 배양에 대 한 최적화 되었습니다 및 질량 분석 기반 단백질 및 대사 산물 검출 친 화력 정화를 결합 했다.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

Endogenously 구성 된 mRNA 단백질 복합물의 복구에 대 한 협동 RNA 격리 절차 (여행) 설명 되어 있습니다. 특히, RNA-단백질 복합물 가교 된에서 vivo에서, polyadenylated RNAs는 격리 oligo(dT) 구슬, 추출 물 이며 특정 한 mRNAs와 수정 된 RNA 센스 oligonucleotides 캡처됩니다. 단백질 mRNAs에 바인딩된 immunoblot 분석에 의해 검색 됩니다.

진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차

여기서, 우리는 식물 병원체에서 RNA 침묵 억제제를 신속하게 스크리닝하는 데 광범위하게 사용될 수 있는 변형된 스크리닝 방법을 제시한다.

식물 병원균의 분비 이펙터에서 RNA 침묵 억제제의 스크리닝 및 식별

리보솜 친화도 정제(TRAP)를 번역하면 장기와 조직의 최소한의 처리로 개발 프로그램을 해부할 수 있습니다. 이 프로토콜은 녹색 형광 단백질(GFP)으로 표적화된 세포로부터 고품질의 RNA를 산출합니다. qRT-PCR 또는 RNA-seq와 같은 다운스트림 분석 도구는 조직 및 세포 유형별 발현 프로파일을 밝힙습니다.

세포 유형 별 척도에서 애기장대 뿌리 개발을 조사하기 위해 리보솜 친화성 정제 (TRAP) 번역

이 프로토콜은 엔지니어링 가뭄 내성 작물을 돕기 위해 잠재적 후성 유전학 마커역할을 할 수 있는 번역 후 변형 후 프로파일링을 위해 사탕수잎 재료로부터 손상되지 않은 히스톤을 효과적으로 추출하기 위해 개발되었습니다.

잠재적 인 후성 유전학 마커의 하향 식 질량 분광프로파일링을위한 수줌 잎 조직에서 히스톤의 격리

배우세요 대두 공생 결절에서 폴리솜 정제 방법을. 원심분리 기반 기술로 복잡한 조직에서 유전자 발현과 번역체 수준을 연구할 수 있습니다. RNA-Seq와 결합하여 전사체와 번역체의 관계를 분석하는 새로운 프로토콜입니다.

대두 공생 결절에서 폴리솜 정제

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