대두 공생 결절에서 폴리솜 정제
July 1st, 2022
이 프로토콜은 온전한 대두 결절로부터 진핵 폴리솜 정제를 위한 방법을 기술한다. 시퀀싱 후, 유전자 발현 분석을 위한 표준 파이프라인을 사용하여 전사체 및 트랜스라톰 수준에서 차등적으로 발현된 유전자를 식별할 수 있습니다.
이 프로토콜은 우리가 아는 한 대두 공생 결절에서 키네틱 폴리솜 정제를 위한 새로운 원심분리기 기반 금속을 설명하는 최초의 프로토콜이기 때문에 중요합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 RNA-Seq와 결합하여 공생 결절과 같은 복잡한 조직으로 조직화되고 관계를 연구 할 수 있다는 것입니다. 시작하려면 칭량 접시에서 손상되지 않은 결절 약 0.2g의 무게를 측정하고 사전 냉각된 2밀리리터 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 1.2ml의 폴리솜 추출 버퍼를 추가하고 샘플을 2분 동안 해동한 다음 결절이 완전히 파괴되고 균질화될 때까지 조직 분쇄기로 균질화합니다. 다음으로, 10 분 동안 또는 모든 샘플이 처리 될 때까지 부드러운 교반으로 얼음 위에서 샘플을 배양하고 섭씨 4도에서 15 분 동안 16, 000 배 G에서 원심 분리하여 파편을 펠릿화합니다. 이어서, 상청액을 회수하고, 원심분리 단계를 반복한다.
정화된 세포질 추출물을 조심스럽게 회수한 후, 200 마이크로리터 분취량을 깨끗한 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 완전히 분리합니다. 그런 다음 4.5 밀리리터의 33.5 % 자당 층을 원심 분리기 튜브에 붓고 P-1000 마이크로 피펫으로 12 % 층의 4.5 밀리리터를 조심스럽게 천천히 첨가합니다. 다음으로, 정화 된 세포질 추출물이 첨가 될 때까지 튜브를 얼음 위에 올려 놓으십시오.
정화된 세포질 추출물 1밀리리터를 튜브의 측벽에 조심스럽게 피펫팅하여 자당 쿠션 위에 놓습니다. 그런 다음 초 원심 분리 튜브를 사전 냉각 된 버킷으로 옮기고 섭씨 4도에서 2 시간 동안 217, 874G에서 원심 분리합니다. 남아 있는 시토졸 추출물 및 슈크로스 쿠션을 버린 후, 200 마이크로리터의 미리 냉각된 재현탁 완충액으로 폴리좀 펠릿을 재현탁시킨다.
다음으로, 얼음 위에서 30분 동안 배양한 다음, 폴리솜 재현탁액을 1.5밀리리터 예냉관으로 옮겨 RNA 추출을 진행한다. 샘플을 750 마이크로리터의 RNA 분리 시약으로 균질화한 후 실온에서 5분 동안 배양한다. 그런 다음 200 마이크로 리터의 차가운 클로로포름을 넣고 튜브를 15 초 동안 세게 흔 듭니다.
다음으로, 실온에서 10 분 동안 배양한다. 상 분리를 위해 섭씨 4도에서 15 분 동안 12, 000 회 G에서 원심 분리하고, 분홍색 유기 상을 방해하지 않고 상부 수성 상 500 마이크로 리터를 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 375 마이크로 리터의 차가운 이소프로판올과 0.5 마이크로 리터의 RNA가없는 글리코겐을 첨가하십시오.
그런 다음 위아래로 피펫팅하여 완전히 혼합합니다. 혼합물을 섭씨 4도에서 10 분 동안 배양하고 15 분 동안 12, 000 회 G에서 원심 분리합니다. 이어서, 상청액을 버리고, RNA 침전물을 1 밀리리터의 차가운 75% 에탄올로 세척한다.
간단한 소용돌이로 혼합하십시오. 다음으로, 섭씨 4도에서 5 분 동안 7, 500G에서 원심 분리하십시오. 상청액을 버리고 RNA 펠릿을 자연 건조시킵니다.
이어서, 펠릿을 50 마이크로리터의 RNA 자유수에 녹이고, 섭씨 65도에서 5분 동안 배양한다. 고감도 모세관 전기영동 및, 또는 2%RNAs 유리 아가로스 겔에 대한 전기영동으로 RNA 농도와 무결성을 평가합니다. 샘플 부피를 추정 한 후 0.1 부피의 3 몰 아세트산 나트륨, 3 부피의 차가운 에탄올 및 0.5 마이크로 리터의 RNA (유리 글리코겐)를 첨가하십시오.
그런 다음 철저히 섞으십시오. 모세관 전기 영동은 여러 개의 전체 및 다염색체 관련 RNA 샘플 분획에 대해 수행되었으며, 이는 번진 모양없이 날카로운 리보솜 RNA 밴드를 보여주었습니다. 그러나 RIN 값은 손상되지 않은 샘플에 해당하는 5.9에서 7.5 사이이므로 RIN 값에 반영되지 않습니다.
바이오 분석기는 전체 및 폴리 솜 관련 RNA 샘플 모두에 대해 전기 페로 그램에서 볼 수있는 18S 및 25S 피크를 식별하지 못했습니다. 샘플 분해의 시각적 징후는 없었습니다. 그러나 비교를 위해 거의 완전히 분해 된 샘플의 결과를 시각화하기 위해 샘플을 분석했습니다.
가장 중요한 것은 전체 프로토콜 동안 폴리솜 및 RNA 보존 조건에서 작업하는 것입니다. 전체 및 par RNA 분획을 시퀀싱한 후 유전자 발현 분석을 위한 표준 패턴은 전사 및 번역 수준에서 차등 발현 유전자를 확인하는데 사용될 수 있다.
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개요
이 프로토콜은 완전한 콩 결절에서 진핵생물 폴리솜 정제 방법을 설명합니다. 이 기술은 전사체 및 번역체 수준에서 유전자 발현 연구를 가능하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 식물 생물학
- 유전자 발현 분석
배경
- 폴리솜 정제는 번역 조절을 연구하는 데 필수적입니다.
- 공생 결절에서 유전자 발현을 이해하면 식물-미생물 상호작용에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
- 이 방법은 콩 결절에서 동적 폴리솜 정제를 위한 원심분리기 기반 접근법을 최초로 활용한 방법입니다.
- RNA-Seq는 이 기술과 결합하여 포괄적인 분석을 할 수 있습니다.
연구 목적
- 콩 결절에서 폴리솜 정제를 위한 신뢰성 있는 방법을 개발합니다.
- 복합 조직에서 유전자 발현 연구를 용이하게 합니다.
- 전사체와 번역체 간의 관계에 대한 이해를 향상시킵니다.
사용된 방법
- 완전한 콩 결절을 무게로 측정하고 튜브로 옮깁니다.
- 폴리솜 추출 버퍼에서 조직 그라인더로 결절을 균질화합니다.
- 얼음 위에서 샘플을 배양하고 잔류물을 펠렛화하기 위해 원심분리합니다.
- 상청을 회수하고 정제를 위해 원심분리를 반복합니다.
주요 결과
- 이 방법은 콩 결절에서 폴리솜을 성공적으로 정제합니다.
- 차별적으로 발현된 유전자를 식별하기 위한 후속 RNA-Seq 분석을 가능하게 합니다.
- 복합 조직 상호작용을 연구할 가능성을 보여줍니다.
- 식물 생물학의 미래 연구를 위한 새로운 프로토콜을 수립합니다.
결론
- 이 프로토콜은 폴리솜 정제를 위한 새로운 접근법을 제공합니다.
- 공생 관계에서 유전자 발현을 이해하는 새로운 방법을 개척합니다.
- 미래 연구는 이 방법을 활용하여 식물 생물학에 대한 더 깊은 통찰력을 얻을 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Polysome purification from soybean symbiotic nodules enables direct interrogation of translational regulation in complex plant tissues, supporting mechanistic de-risking in early discovery. By isolating both total and polysome-associated mRNA for RNA-seq, this method provides quantitative insight into gene expression at both transcriptome and translatome levels. These capabilities enhance predictive confidence for target validation and pathway analysis in plant biotechnology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional assessment of translational control in disease-relevant plant systems.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing transcriptional from translational regulation.
- Facilitates target validation through quantitative comparison of mRNA pools.
Screening & Assay Development
- Prepares high-quality, reproducible RNA samples for downstream RNA-seq workflows.
- Standardizes sample integrity assessment using capillary electrophoresis for sequencing readiness.
- Enables robust differential gene expression analysis at both transcriptional and translational levels.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene expression outputs with translational biomarker discovery in plant-microbe interaction models.
- Provides continuity from molecular discovery to functional validation in complex tissues.
- Supports risk-adjusted advancement of candidate targets based on translational evidence.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and translational research in plant biotechnology.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven analysis of translational regulation in symbiotic nodules.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNA outputs for comparative analysis.
- Analytics: Provides high-quality mRNA fractions for differential expression and pathway analysis.
- Translational Research: Connects molecular findings to functional outcomes in complex plant tissues.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable to other plant systems requiring translational profiling.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving translational regulation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable RNA purification for high-throughput sequencing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by integrating transcriptome and translatome data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on translational evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant tissue handling and RNA integrity assessment.
- Demands access to ultracentrifugation and capillary electrophoresis instrumentation.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible RNA quality.
- May require adaptation for other plant species or tissue types.
- Sample integrity must be preserved throughout to ensure reliable downstream analysis.
