Name: 합성 mRNA transfection 후 종양 세포 이동 및 침습의 실시간 정량 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T13:10:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 배우세요 합성 mRNA 전이와 임피던스 기반 실시간 측정을 결합하여 종양 세포 이동 및 침습을 정량 분석하는 방법입니다. 이 프로토콜은 암 전이 억제를 위한 치료 표적을 식별하는 데 활용됩니다.

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저자들은 이 원고를 편집해 준 Children's Mercy Kansas City의 Medical Writing Center에 감사를 표합니다. 이 작업은 Natalie's A.R.T. Foundation(T.P.)과 Children's Mercy Hospital(CMH) 및 University of Kansas Cancer Center(KUCC)의 MCA Partners Advisory Board 보조금(T.P.)의 지원을 받았습니다.

1. mRNA의 합성
참고: mRNA 합성을 위해 모든 시약과 장비는 사용하기 전에 RNase를 비활성화하도록 특수 처리해야 합니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 기기 및 시약에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
<ol><li>DNA의 선형화 참고: CrkI 및 CrkL의 마우스 cDNA를 pFLAG-CMV-5a 발현 벡터로 클로닝하여 C-말단에 FLAG 에피토프 태그를 추가하고, 이전에 기술된 바와 같이, T7 프로모터를 통합하기 위해 pcDNA3.1/myc-His 벡터로 서브클로닝하였다(18,19).<ol><li>10 μL의 10x 반응 완충액, 1.5 μL의 PmeI(10,000 units/mL) 및 10 μg의 플라스미드 DNA를 마이크로 원심분리 튜브에 추가하여 플라스미드 DNA를 제한 효소로 선형화합니다. 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 반응 부피를 100μL로 만듭니다.</li>
		<li>두드려서 혼합하고, 스핀 다운하고, 반응 혼합물을 37°C에서 밤새 배양합니다.</li>
		<li>스핀 다운하고 반응 혼합물에 5μL의 10% 도데실 황산나트륨(SDS)과 1μL의 proteinase K(20mg/mL, RNA 등급)를 추가합니다. 두드려서 혼합하고 탈수한 후 50°C에서 30분 동안 배양합니다.</li>
		<li>흄 후드 아래에서 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올의 바닥상 100μL를 추출을 위해 플라스미드 반응 혼합물에 첨가합니다. 와류를 가열한 다음 실온에서 18,800× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상부 위상을 새 튜브로 이동합니다.</li>
		<li>클로로포름:이소아밀 알코올로 1.1.4:24 단계를 반복합니다.</li>
		<li>새 튜브에 200μL의 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 반응 부피를 300μL로 만든 다음 3M 아세트산나트륨 30μL와 100% 에탄올 600μL를 추가합니다.</li>
		<li>와류에 의해 혼합하고, DNA의 에탄올 침전을 위해 30-60 분 동안 -20 °C에 두십시오.</li>
		<li>4°C에서 20분 동안 18,800× g 으로 원심분리하고 상층액을 버리고 펠릿을 70% 에탄올 1mL로 헹굽니다. 10분 동안 원심분리를 반복한 다음 상층액을 완전히 제거합니다.</li>
		<li>뚜껑을 열고 2분 동안 건조시킨 후 30μL의 뉴클레아제가 없는 물을 넣고 DNA 펠릿을 재현탁시킵니다.</li>
		<li>분광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다.</li>
		<li>아가로스 겔 전기영동을 사용하여 선형화된 DNA의 크기와 양을 확인합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>T7 RNA 중합효소를 이용한 RNA 합성<ol><li>10x 전사 완충액, ATP, GTP, UTP, CTP 및 T7 각각 2μL와 선형화된 DNA 1μg을 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다. 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 반응 부피를 20μL로 만듭니다.</li>
		<li>탭핑하여 혼합하고, 스핀 다운하고, RNA 합성을 위해 반응 혼합물을 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>스핀 다운하고 1μL의 DNase(2U/μL)를 추가하고 37°C에서 15분 동안 배양하여 템플릿 DNA를 제거합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>RNA의 염화 리튬 침전<ol><li>반응 혼합물에 10μL의 염화 리튬(7.5M)을 추가합니다. 탭핑하여 혼합하고, 스핀 다운하고, 반응 혼합물을 -20°C에서 30분 동안 배양합니다.</li>
		<li>4°C에서 20분 동안 18,800× g 의 원심분리기를 하고 상층액을 버리고 펠릿을 500μL의 70% 에탄올로 헹굽니다. 10분 동안 원심분리를 반복한 다음 상층액을 완전히 제거합니다.</li>
		<li>뚜껑을 열고 2분 동안 건조시키고, 뉴클레아제가 없는 물 30μL를 첨가하고, RNA 펠릿을 재현탁시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>상한<ol><li>RNA 샘플을 65°C에서 10분 동안 가열한 다음 얼음 위에 올려 냉각합니다.</li>
		<li>10x 캡핑 완충액 각각 5μL, 10mM GTP 및 1mM(10x) S-아데노실메티오닌(SAM), 캡핑 효소 믹스 및 O-메틸전이효소 믹스 각각 2μL, RNase 억제제 1.25μL를 추가합니다. 탭핑하여 혼합하고, 스핀 다운하고, 반응 혼합물을 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>폴리(A) 테일링<ol><li>샘플을 스핀다운한 다음 6μL의 뉴클레아제가 없는 물, 20μL의 5x E-PAP 완충액, 10μL의 25mMMnCl2, 10μL의 10mM ATP 및 4μL의 E-PAP 폴리(A) 테일링 효소를 추가합니다. 탭핑하여 혼합하고, 스핀 다운하고, 반응 혼합물을 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>합성 mRNA의 염화 리튬 침전 및 정량<ol><li>50μL의 염화 리튬(7.5M)을 추가하고 1.3.1-1.3.3단계에 설명된 대로 염화 리튬 침전을 수행합니다.</li>
		<li>분광광도계를 사용하여 mRNA의 농도를 측정합니다.</li>
		<li>포름알데히드(1%-2%) 아가로스(1%) 겔 전기영동을 사용하여 mRNA의 크기와 양을 확인합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 세포 침습 및 이동(CIM) 플레이트의 세포외 기질(ECM) 겔 코팅
참고: CIM(Cell Invasion and Migration) 플레이트는 임피던스 기반 실시간 세포 분석을 위해 상업적으로 제조된 16웰 플레이트입니다. 세포 침습 분석의 경우, 앞서 설명한 대로 CIM 플레이트를 ECM 겔로 코팅하되 일부 수정을 가한다11.
<ol><li>냉동실에서 ECM 겔 스톡의 부분 표본을 꺼내 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	<li>마이크로 원심분리 튜브에 990μL의 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)(혈청 또는 항생제 없음)과 10μL의 ECM 겔을 혼합하여 ECM 겔(10mg/mL)을 작동 농도(100μg/mL)로 희석합니다. 부드러운 피펫팅으로 혼합합니다.</li>
	<li>희석된 ECM 겔 60μL를 CIM 플레이트 상부 챔버의 16개 웰 각각에 추가합니다. 기포를 피하면서 역 피펫팅 방법을 적용하십시오20,21. 참고: 각 세포주에 대한 ECM 겔의 농도를 최적화합니다. 교모세포종 세포주의 경우 최적화를 위해 0.1μg/μL - 1μg/μL ECM 겔을 사용했습니다.</li>
	<li>플레이트 덮개가 벗겨진 CIM 플레이트의 상부 챔버를 CO2 인큐베이터 내부의 보호 플라스틱 시트에 약 4시간 동안 놓아 겔 층을 형성합니다. 주의 : CIM 플레이트를 ECM 겔로 코팅하는 동안 CIM 플레이트 상부 챔버의 전극은 실험자의 손이나 생물 안전 캐비닛 또는CO2 인큐베이터를 포함한 장비 표면과 직접 접촉하지 않아야 합니다.</li>
</ol>3. 종양세포의 준비
알림: 모든 세포 배양 물질은 멸균 상태로 유지해야 합니다. 앞서 설명한 바와 같이 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용하여 생물 안전 캐비닛 아래에서 종양 세포를 채취하고 전기포가하지만 일부 수정을 가합니다11.
<ol><li>종양 세포의 배양<ol><li>5%CO2 인큐베이터(배양 조건)에서 37°C에서 100mm x 20mm 폴리스티렌 조직 배양 접시당 5% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 항생제를 포함하는 10mL의 DMEM에 U-118MG 세포를 배양합니다(배양 조건).</li>
	</ol></li>
	<li>종양 세포의 혈청 고갈 참고: FBS에 존재하는 화학 유인제에 대한 세포의 노출은 고농도의 FBS를 사용하여 세포 이동 및 침입 분석 전에 최소화해야 합니다.<ol><li>기존 배지를 제거하고 접시당 0.5% FBS 및 1% 항생제가 포함된 예열된 DMEM 10mL를 추가합니다(저혈청 배지).</li>
		<li>3.2.1단계를 반복합니다.</li>
		<li>세포를 37°C의 5% CO2 인큐베이터에서 4시간 이상 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>종양 세포 채취<ol><li>기존 배지를 제거하고, 접시당 예열된 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 8mL를 추가하고, DPBS를 제거하고, 예열된 0.05% 트립신-EDTA(2mL/접시)를 추가하여 표면을 덮고, CO2 인큐베이터에서 30초 동안 배양합니다.</li>
		<li>트립신-EDTA를 조심스럽게 흡입하고 저혈청 배지(접시당 7mL)를 추가한 다음 세포를 50mL 또는 15mL 원심분리 튜브에 수집합니다.</li>
		<li>소량의 세포를 분취하고 휴대용 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다.</li>
		<li>총 세포 수와 10,000 cells/μL에 필요한 부피를 계산합니다.</li>
		<li>실온에서 100× g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 회전시키고, 상층액을 흡인하고, 0.5% FBS(항생제 없음)를 포함하는 DMEM의 계산된 부피를 추가하고, 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁시킵니다.</li>
		<li>110만 개의 세포가 들어 있는 세포 현탁액 110μL를 각 처리를 위해 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>3.3.6단계를 반복하여 4가지 다른 처리를 위해 세포를 4개의 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 참고: CIM 플레이트에는 총 16개의 웰이 있습니다. 각 처리에 대해 CIM 플레이트의 웰 4개를 할당할 수 있도록 비교를 위해 4개의 서로 다른 처리를 설계합니다. 각 처리에 대해 웨스턴 블롯 분석(35mm 조직 배양 접시당 30만 개의 세포), 4개의 실시간 세포 이동 분석 웰(10만 개 세포/웰) 및 4개의 실시간 세포 침습 분석 웰(10만 세포/웰)과 같은 실험에 전기 천공 셀을 사용합니다. 실험 설계가 변경되는 경우 전기천공해야 하는 셀의 수를 조정합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 종양 세포의 전기천공법
<ol><li>배지를 제거하려면 각 튜브의 세포 현탁액에 1mL의 DPBS를 추가하고, 미니 원심분리기를 사용하여 10초마다 튜브를 180° 회전시키면서 세포 현탁액을 매번 10초 동안 3회 회전시킨 다음, 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다. 알림: 작지만 쉽게 재현탁할 수 있는 셀 펠릿을 형성하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>110μL의 재현탁 완충액 R을 세포 펠릿에 첨가하여 10μL에서 10만 개의 세포를 얻습니다.</li>
	<li>세포 펠릿에 합성 mRNA를 첨가하여 원하는 발현 수준에 따라 0.2-20ng/μL의 농도를 얻습니다. 세포 펠릿을 가볍게 혼합하고 두드리거나 부드러운 피펫팅으로 재현탁합니다. 참고: 단백질 발현과 생물학적 효과 사이의 특정 상관 관계를 조사하기 위해 다양한 농도의 합성 mRNA를 사용하고, 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 단백질 발현을 검사하고, 원하는 발현 수준으로 이어지는 합성 mRNA의 농도를 결정합니다.</li>
	<li>1,350V에서 전기천공법 시스템을 사용하여 10μL의 셀 현탁액을 매번 3개의 펄스로 10ms 동안 전기포레이션합니다.</li>
	<li>전기천공된 세포를 0.5% FBS가 포함된 1.1mL의 DMEM이 있는 새로운 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>나머지 셀 현탁액이 전기천공될 때까지 전기천공법을 반복합니다. 마이크로 원심분리 튜브에 전기 천공된 세포를 결합하여 1.1mL에서 110만 개의 세포를 얻습니다. 참고: 100 μL 및 10 μL 전기천공법 팁은 모두 많은 양의 셀을 전기포레이션하는 데 사용할 수 있지만 10 μL 및 100 μL용 전기천공법 팁은 두 개의 별도 키트에 포함되어 있으며 별도로 구매해야 합니다. 재현탁 버퍼 R은 두 키트 모두에 포함되어 있습니다.</li>
	<li>각각의 전기천공법이 모두 완료되면 풀링된 셀을 부드럽게 재현탁합니다.</li>
	<li>5% FBS가 함유된 2mL의 DMEM이 포함된 35mm x 10mm 폴리스티렌 조직 배양 접시에 30만 개의 세포를 플레이트하고 전체 세포 용해물 준비 및 웨스턴 블롯 분석을 위해 배양 조건에서 1일 동안 세포를 배양합니다.</li>
	<li>나머지 전기천공 셀은 실시간 셀 분석 시스템이 준비될 때까지 실온에 보관합니다.</li>
</ol>5. 실시간 셀 분석기, 프로그램 및 CIM 플레이트 설정
참고: 앞에서 설명한 대로 Real-Time Cell 분석기와 두 개의 CIM 플레이트를 준비합니다11.
<ol><li>Real-Time Cell 분석기의 평형<ol><li>사용하기 몇 시간 전에 Real-Time 세포 분석기를CO2 인큐베이터로 이동하여 배양 조건에서 시스템을 평형화합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>분석 프로그램 설정<ol><li>바탕 화면에서 실시간 세포 분석 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 분석 프로그램을 엽니다.</li>
		<li>기본 실험 패턴 설정 옵션이 열리면 세 가지 실험을 별도로 실행하는 옵션을 선택합니다. 알림: 각 크래들에는 별도의 창이 있습니다. 측정 간격 및 기간, 데이터 분석 및 기타 실험 조건을 설정하는 다양한 탭이 있습니다.</li>
		<li>번호 탭을 클릭하여 각 크래들을 엽니다.</li>
		<li>실험 노트 탭을 클릭하고, 데이터를 저장할 폴더를 선택하고, 실험의 이름을 입력합니다.</li>
		<li>레이아웃(Layout) 탭을 클릭하고 한 번에 4개의 웰을 선택하고 샘플 정보를 입력하여 각 처리 조건에 대해 4개의 웰을 설정한 다음 적용(Apply)을 클릭합니다.</li>
		<li>Schedule(일정) 탭 | 셀 임피던스 측정의 2단계 모드를 설정하는 단계를 추가합니다. 그런 다음 적용을 클릭하여 첫 번째 단계를 설정합니다.</li>
		<li>단계 추가를 다시 클릭하고, 간격에 10분, 이동 및 침입 기간에 48시간을 입력한 다음, 적용을 클릭하여 두 번째 단계를 설정합니다. 알림: 첫 번째 단계는 일회성 기준선 측정(1분 간격으로 한 번의 스윕)을 수행합니다. 두 번째 단계는 크래들에서 실험에 대한 셀 임피던스를 측정합니다(예: 48시간 동안 10분 간격으로 289회 스윕). 실험 설계에 따라 간격과 기간을 조정합니다.</li>
		<li>다음 크래들로 이동하고 5.2.3-5.2.7단계를 반복하여 설정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>CIM 플레이트 준비<ol><li>세포 임피던스 측정이 시작되기 1시간 전에 CIM 플레이트의 하부 챔버 웰을 10% 혈청 또는 기타 화학 유인제가 포함된 160μL의 DMEM으로 채웁니다.</li>
		<li>ECM 겔 코팅된 웰(침습용) 또는 코팅되지 않은 웰(이동용)이 포함된 상부 챔버를 하부 챔버와 함께 조립합니다.</li>
		<li>세포 이동 분석을 위해 CIM 플레이트의 상부 챔버 웰에 50μL의 저혈청 배지를 추가하고 CIM 플레이트를 시스템의 크래들에 놓습니다.</li>
		<li>메시지 탭을 클릭하고 연결 확인 메시지가 표시되는지 확인합니다. 이제 CIM 플레이트를 실험할 준비가 되었습니다.</li>
		<li>CIM 플레이트를 배양 조건에 적응시키기 위해 실시간 세포 분석 전에CO2 인큐베이터에서 30-60분 동안 조립된 CIM 플레이트를 사전 배양합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>6. 실시간 세포 분석 및 데이터 내보내기
알림: 앞서 설명한 대로 기준선 판독, 셀 시드, 셀 임피던스 측정 및 데이터 내보내기를 수행합니다11.
<ol><li>기준선 판독값 알림: 기준선은 CIM 플레이트가 적응된 후 셀이 상부 챔버의 웰에 추가되기 전에 판독해야 합니다.<ol><li>각 크래들의 시작 버튼을 클릭합니다. 다른 이름으로 저장 창이 나타나면 실험 파일을 저장하여 기준선 읽기를 수행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포 시딩(Cell seeding)<ol><li>크래들에서 CIM 플레이트를 제거하고 플레이트 홀더의 생물 안전 캐비닛에 넣습니다.</li>
		<li>제어 장치의 프로그램에 따라 100μL(100,000개 세포 포함)의 전기 천공된 셀을 CIM 플레이트의 상부 챔버 웰에 추가합니다. 기포를 피하면서 역 피펫팅 방법을 적용하십시오.</li>
		<li>CIM 플레이트를 생물 안전 캐비닛 아래에 실온에서 30분 동안 그대로 두어 세포가 웰 바닥에 고르게 퍼지도록 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>셀 임피던스 측정<ol><li>완전히 조립된 CIM 플레이트를 해당 크래들로 다시 이동합니다. 크래들 시작 버튼을 클릭하여 두 번째 단계의 셀 임피던스 측정을 시작합니다.</li>
		<li>플롯 탭을 클릭한 다음 모두 추가 버튼을 클릭하고 평균 및 STD DEV 상자를 선택하여 데이터를 실시간으로 시각화합니다. 참고: 기본 플로팅 옵션은 x축의 경우 시간 이고 y축의 경우 셀 색인 입니다. 플롯 선택 섹션에서는 사용자가 y축에 대한 대체 옵션( 정규화된 셀 인덱스 또는 델타 셀 인덱스)을 선택할 수 있습니다. 최종 스윕이 완료되면 실험이 완료되고 결과가 자동으로 저장됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>분석을 위한 데이터 내보내기<ol><li>플롯 탭을 클릭하고 평균 및 STD DEV 상자를 선택하여 각 웰에 대한 데이터를 개별적으로 복사합니다.</li>
		<li>플롯 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 목록 형식으로 데이터 복사를 선택합니다.</li>
		<li>빈 스프레드시트 파일을 열고 데이터를 붙여 넣은 다음 파일을 저장합니다.</li>
		<li>분석 프로그램으로 돌아가서 각 크래들에 대한 플레이트 탭을 클릭하고 해제 를 선택하여 크래들에 대한 실험을 닫습니다.</li>
		<li>스프레드시트 파일로 돌아가서 두 번째 단계의 시작 시간이 실제 측정 시작 시간이 되도록 원시 데이터의 시간을 조정합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRK+proteins+selectively+regulate+T+cell+migration+into+inflamed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).</li>
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<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+Abl+kinase+by+Crk+Y251+and+Abi1+controls+invasive+phenotypes+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma.</a> Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+tyrosine+phosphorylation+regulates+PDGF-BB-inducible+Src+activation+and+breast+tumorigenicity+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis.</a> Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).</li>
<li>Raudenska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engine+shutdown%3A+Migrastatic+strategies+and+prevention+of+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases.</a> Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).</li>
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<li>Mosca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+S-adenosyl-L-methionine+on+the+invasion+and+migration+of+head+and+neck+squamous+cancer+cells+and+analysis+of+the+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms.</a> International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).</li>
<li>Zhao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGI174+protein+and+its+functional+domain+peptides+exert+antitumour+effects+on+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma.</a> International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).</li>
<li>Witte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta1-induced+cell+migration+in+pancreatic+carcinoma+cells+is+RAC1+and+NOX4-dependent+and+requires+RAC1+and+NOX4-dependent+activation+of+p38+MAPK%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK.</a> Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).</li>
<li>Bui, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aquaporin+3+expression+by+the+AhR+pathway+is+critical+to+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration.</a> Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li>
<li>Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+in+membrane+repair+capacity+between+cancer+cell+lines+and+a+normal+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line.</a> The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

이동과 침입은 종양 세포의 중요한 특징입니다. 종양 세포의 운동성을 측정하고 종양 세포 운동성을 조절하는 근본적인 메커니즘을 이해하면 치료 개입에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다 2,27. 세포 이동을 연구하기 위해 몇 가지 방법이 개발되었다7. 스크래치 또는 배양 삽입물을 사용하는 상처 치유 분석은 간극 봉합의 대조 이미지를 제공하는 간단하고 자주 사용되는 방법입니다. 개별 세포 추적 분석은 세포에 형광 염료를 태깅할 수 있는 타임 랩스 이미징으로 개별 세포를 모니터링해야 합니다. 상처 치유 분석과 개별 세포 추적 분석은 모두 세포의 자발적인 움직임을 측정합니다.
타임랩스 이미징 및 집중적인 요청 후 데이터 처리의 도움으로, 두 분석 모두 샘플 간의 정량적 비교를 제공할 수 있다28...

종양 세포 운동성은 전이 1,2에 중요한 역할을 합니다. 종양 세포가 인접 및 원격 건강 조직으로 퍼지면 암 치료가 어려워지고 재발에 기여합니다 3,4. 따라서 종양 세포 운동성의 메커니즘을 이해하고 관련 치료 전략을 개발하는 것이 필수적입니다. 많은 종양 세포가 유전자 발현 프로파일을 변경했기 때문에 유전자 발현 프로파일의 어떤 변화가 종양 세포 운동성의 변화로 이어지는지 이해하는 것이 중요합니다 5,6.
in vitro에서 세포 이동을 측정하기 위해 여러 분석법이 개발되었습니다. 일부 분석법은 특정 시점에서만 측정이 가능하기 때문에 제한된 정보만 제공하는 반면, 다른 분석법은 종양 세포 운동성에 대한 포괄적인 정보를 실시간으로 제공한다7. 이러한 세포 운동성 분석의 대부분은 주어진 시간 또는 종말점에서 정량적 결과를 제공할 수 있지만 실험 기간 동안 세포 이동 속도의 동적 변화에 대한 충분히 자세한 정보를 제공하지 못합니다. 또한 실험 설계, 세포 유형 및 세포 수에 따라 세포 이동 속도의 잠재적 변화를 조사하기 어려울 수 있습니다. 또한, 복잡하지 않은 치료의 효과는 전통적인 운동성 분석의 간단한 정량화로 조사할 수 있지만, 다양한 복합 치료의 복잡한 효과를 연구하기 위해서는 보다 정교한 정량화가 필요할 수 있다8.
미세전극으로 덮인 마이크로타이터 플레이트 웰 바닥의 전류를 모니터링하는 기기가 개발되었다9. 우물 표면에 대한 세포의 접착은 전자 흐름을 방해하고 임피던스는 세포의 양적 및 질적 결합과 관련이 있습니다. 웰 바닥에 미세 전극이 있으면 세포 접착, 확산 및 증식을 측정할 수 있습니다. 상부 챔버의 미세 다공성 막 아래에 미세 전극이 존재하면 하부 챔버로의 세포 이동 및 침범을 측정할 수 있으며, 상부 챔버는 침범을 허용하기 위해 세포외 기질(ECM) 단백질로 코팅되어 있다10.
이전에는 종양 세포 이동 및 침습에 대한 임피던스 기반 실시간 측정이 전체 실험 동안 실시간 데이터를 제공할 뿐만 아니라 다양한 실험 조건 하에서 즉각적인 비교 및 정량화를 제공한다는 것이 입증되었습니다11. 이 방법 논문에서는 종양 세포 이동 및 침입에서 관심 단백질의 역할을 테스트하기 위해 유전자 녹다운을 유도했습니다. 테스트된 실험 조건에서 완전한 유전자 녹다운 효과는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 사용한 전기천공법 후 3-4일이 걸렸기 때문에8, 전기천공법 후 세포를 다시 도금하고 3일 후에 종양 세포 이동 및 침습의 임피던스 기반 실시간 측정을 위해 재수확했습니다.
키나아제(Crk) 및 Crk-유사(CrkL)의 CT10 조절자는 다양한 성장 인자 수용체 키나아제 경로 및 비수용체 티로신 키나아제 경로의 다운스트림에서 단백질-단백질 상호작용을 매개하는 어댑터 단백질이다12. Crk 및 CrkL 단백질의 수치가 높아지면 교모세포종을 포함한 여러 인간 암의 예후가 좋지 않습니다13. 그러나 Crk 및 CrkL 단백질의 증가가 어떻게 나쁜 예후로 이어지는지는 불분명합니다. 따라서 Crk 및 CrkL 과발현이 종양 세포 기능에 미치는 영향을 정의하는 것이 중요합니다. 이전에는 Crk 및 CrkL 단백질의 내인성 수준이 교모세포종 세포 이동 및 침습에 필요하다는 것을 입증하기 위해 유전자 knockdown 연구가 수행되었습니다8. 여기에서 종양 세포 이동 및 침습에 대한 Crk 및 CrkL 과발현의 영향을 해결하기 위해 수정된 분석 시스템이 개발되었습니다.
최근 SARS-CoV-2에 대한 mRNA 백신의 개발로 인해 mRNA의 체외 합성 및 치료 응용 분야가 다시 주목을 받고 있습니다(Verbeke et al.14 검토). 또한 암 및 기타 질병에서 합성 mRNA를 사용하는 데 있어 놀라운 발전이 이루어졌습니다15,16. 세포의 전기천공법은 합성 mRNA를 전달하고 일시적인 유전자 변형을 유도하는 효과적인 방법이며(Campillo-Davo et al.17에 의해 검토됨), 합성 mRNA의 사용은 불멸화된 섬유아세포에서 빠르고 효율적인 유전자 발현을 가능하게 한다 18. 이 방법 논문은 합성 mRNA를 사용한 유전자 과발현과 실시간 세포 분석을 결합하여 종양 세포 이동 및 침입을 연구합니다. 그러나, siRNA에 사용되는 실험 방식은 합성 mRNA 형질주입 시 외인성 단백질의 수준이 급격히 증가하고 점차적으로 감소하기 때문에 합성 mRNA 형질주입에는 효과가 없다18. 따라서, 세포를 추가로 배양하지 않고 형질주입 직후 세포 이동 및 침습에 대한 실시간 분석을 수행할 수 있도록 방법을 수정하였다.
이 분석법 논문은 임피던스 기반 실시간 측정과 종양 세포의 합성 mRNA의 transfection을 결합하면 종양 세포 이동 및 침습에 대한 유전자 상향 조절의 효과에 대한 빠르고 포괄적인 분석을 제공한다는 것을 보여줍니다. 이 분석법 논문은 교모세포종 세포의 이동 및 침습이 Crk 및 CrkL의 과발현에 의해 어떻게 영향을 받는지 측정하기 위한 자세한 절차를 설명합니다. 이 논문은 종양 세포 이동에 대한 합성 mRNA의 농도 의존적 효과를 조사함으로써 단백질 수준의 증가가 종양 세포 이동을 어떻게 자극하는지 명확하게 설명합니다. 또한, 종양 세포 침범에 대한 유전자 발현 변화의 영향을 평가하기 위해 ECM 겔의 농도를 변화시키는 접근법을 제시합니다.

<table><tbody><tr><td>AlphaImager HP</td><td>ProteinSimple</td><td>92-13823-00</td><td>Agarose gel imaging system</td></tr><tr><td>&alpha;-Tubulin 항체</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>&alpha;-tubulin protein (dilution 1:3,000)을 검출하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>CIM-plate 16</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>5665825001</td><td>세포 침입 및 이동 플레이트</td></tr><tr><td>Crk 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>610035</td><td>CrkI 및 CrkII 단백질 검출에 사용 (희석 1:1,500)</td></tr><tr><td>CrkL 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-319</td><td>CrkL 단백질 검출에 사용 (희석 1:1,500)</td></tr><tr><td>Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 배지 (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>302002</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>세포 세척에 사용되는 버퍼</td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td>배양 배지 보충제</td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>51030285</td><td>CO2 인큐베이터</td></tr><tr><td>IRDye 800CW 염소 항-마우스 IgG 2차 항체</td><td>Li-Cor</td><td>926-32210</td><td>웨스턴 블롯 분석을 위한 2차 항체 (희석 1:10,000)</td></tr><tr><td>IRDye 800CW 염소 안티-토끼 IgG 2차 항체</td><td>Li-Cor</td><td>926-32211</td><td>웨스턴 블롯 분석을 위한 2차 항체&nbsp; (희석 1:10,000)</td></tr><tr><td>염화리튬&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM9480</td><td>RNA 침전에 사용</td></tr><tr><td>Matrigel 매트릭스</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>세포외 기질(ECM) 젤</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 전사 키트</td><td>Invitrogen</td><td>AM1334</td><td>RNA 합성에 사용</td></tr><tr><td>Millennium RNA 마커</td><td>Invitrogen</td><td>AM7150</td><td>포름알데히드 아가로스 젤 전기영동에 사용</td></tr><tr><td>미니 원심분리기</td><td>ISC BioExpress</td><td>C1301P-ISC</td><td>세포를 스핀다운하는 데 사용됩니다</td></tr><tr>.<td>마우스 뇌 QUICK-Clone cDNA</td><td>TaKaRa</td><td>637301</td> NanoQuant Tecan M200PRO 핵산 정량화 시스템 네온 전기천공법 시스템 클로<td>닝을 위한 유전자(삽입물)의 출처</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>Electroporation system1</td></tr><tr><td>Neon transfection system 10 &micro; L kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1025</td><td>Electroporation kit</td></tr><tr><td>Neon transfection system 100 &micro; L kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK10096</td><td>Electroporation kit</td></tr><tr><td>NorthernMax 변성 겔 버퍼</td><td>Invitrogen</td><td>AM8676</td><td>포름알데히드 아가로스 젤 전기영동에 사용</td></tr><tr><td>NorthernMax 포름알데히드 로드 염료</td><td>Invitrogen</td><td>AM8552</td><td>포름알데히드 아가로스 젤 전기영동에 사용</td></tr><tr><td>NorthernMax 러닝 버퍼</td><td>Invitrogen</td><td>AM8671</td><td>포름알데히드 아가로스 겔 전기영동에 사용</td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td><td>Teknova</td><td>W3331</td><td>mRNA 합성 중 다양한 반응에 사용</td></tr><tr><td>Odyssey CLx Imager</td><td>Li-Cor</td><td></td><td>Imager 웨스턴 블롯 분석용</td></tr><tr><td>pcDNA3.1/myc-His</td><td>Invitrogen</td><td>V80020</td><td>삽입물(마우스 CrkI 및 CrkL cDNA)이 복제된 벡터</td></tr><tr><td>pFLAG-CMV-5a</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7523</td><td>FLAG 에피토프 태그의 출처</td></tr><tr><td>페놀:클로로포름:이소아밀 알코올&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P2069</td><td>DNA 추출에 사용됨</td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0560L</td><td>mRNA 합성을 위한 플라스미드를 선형화하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>Poly(A) tailing kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td>poly(A) tail reaction에 사용됨</td></tr><tr><td>폴리스티렌 조직 배양 접시(100 x 20mm 스타일)</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>transfection</td></tr> <tr><td>전 세포 배양에 사용됨폴리스티렌 조직 배양 접시 (35 x 10 mm 스타일)</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>형질주입된 세포를 배양하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td>반응 혼합물에서 단백질을 제거하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>Purifier Axiom Class II, Type C1</td><td>Labconco Corporation</td><td>304410001</td><td>세포의 멸균 처리를 위한 Biosafety cabinet</td></tr><tr><td>Resuspension Buffer R</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>electroporation 키트, MPK1025 및 MPK10096에 포함된 버퍼. 완충액은 electroporation 전에 세포를 재생하는 데 사용되며 그 구성은 독점 정보입니다.</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>RNA 오염 제거 솔루션</td></tr><tr><td>Scepter</td><td>Millipore</td><td>C85360</td><td>휴대용 자동 세포 카운터&nbsp;</td></tr><tr><td>ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit</td><td>Cellscript</td><td>C-SCMT0625</td><td>캡핑 반응에 사용</td></tr><tr><td>ScriptCap m7G 캡핑 시스템</td><td>Cellscript</td><td>C-SCCE0625</td><td>캡핑 반응에 사용</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate 용액</td><td>Invitrogen</td><td>15553-035</td><td>proteinase K 반응에 사용되는</td></tr><tr><td>세제 Sorvall Legend XT 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004532</td><td>세포를 스핀다운시키기 위한 벤치탑 원심분리기</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>세포 U-118MG의 해리에 사용됩니다&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB15</td><td>인간 교모세포종 환자에서 유래한 부착 세포주</td></tr><tr><td>Vinculin 항체</td><td>Sigma</td><td>V9131</td><td>빈쿨린 단백질(희석 1:100,000) 검출에 사용</td></tr><tr><td>xCELLigence RTCA DP</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>380601050</td><td>실시간 세포 분석</td></tr><tr><td>에 사용되는 기기다양한 세포주에 대한 1Electroporation 파라미터 및 기타 관련 정보는 제조업체의 홈페이지에서 확인할 수 있습니다(https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

합성 mrna transfection 후 종양 세포 이동 및 침습의 실시간 정량 측정

Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection

종양 세포는 운동성이 높고 침습적이며 변형된 유전자 발현 패턴을 나타냅니다. 유전자 발현의 변화가 종양 세포의 이동과 침입을 어떻게 조절하는지에 대한 지식은 종양 세포가 인접한 건강한 조직으로 침투하여 전이되는 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다. 이전에는 유전자 녹다운(knockdown)에 이은 임피던스 기반 종양 세포 이동 및 침습 실시간 측정을 통해 종양 세포 이동 및 침습에 필요한 유전자를 식별할 수 있음을 입증했습니다. 최근 SARS-CoV-2에 대한 mRNA 백신은 치료 목적으로 합성 mRNA를 사용하는 것에 대한 관심이 높아졌습니다. 여기서는 유전자 과발현이 종양 세포 이동 및 침습에 미치는 영향을 연구하기 위해 합성 mRNA를 이용한 방법을 수정하였다. 이 연구는 합성 mRNA transfection을 통한 유전자 발현 증가 후 임피던스 기반 실시간 측정이 종양 세포 이동 및 침입을 자극하는 유전자를 식별하는 데 도움이 될 수 있음을 보여줍니다. 이 방법 논문은 종양 세포 이동 및 침습에 대한 변경된 유전자 발현의 영향을 조사하는 절차에 대한 중요한 세부 정보를 제공합니다.

Crk 및 CrkL 단백질은 뉴런22, T 세포23, 섬유아세포 18,19 및 다양한 종양 세포13를 포함한 많은 세포 유형의 운동성에 중요한 역할을 한다. Crk 및 CrkL 단백질이 교모세포종24,25,26에서 상승하는 것으로 보고되었기 때문에 Crk의 접합 변이체인 CrkI의 과발현이 교모세포종 세포 이동에 미치는 영향을 이 연구에서 연구했습니다. U-118MG 세포를 다양한 농도의 합성 CrkI mRNA로 전기천공하고 단백질 수준 및 세포 이동을 분석했습니다. 다양한 농도의 합성 CrkI mRNA를 사용한 U-...

상향 조절된 많은 유전자는 종양 세포의 이동과 침입을 자극하여 예후를 악화시킵니다. 어떤 유전자가 종양 세포의 이동과 침입을 조절하는지 알아내는 것은 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 종양 세포의 이동 및 침입에 대한 유전자 발현 증가의 효과를 실시간으로 조사하는 방법을 제시합니다.

합성 mRNA transfection 후 종양 세포 이동 및 침습의 실시간 정량 측정

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell ...

이 프로토콜은 감각 메신저 RNA 트랜잭션과 임피던스 기반 세포 이동 및 침습 실시간 측정을 결합하면 종양 세포 이동 및 침입을 자극하는 유전자의 식별을 용이하게 할 수 있음을 보여줍니다. 임피던스 기반 실시간 세포 분석 시스템은 유전자 발현 변화에 따른 종양 세포 이동을 정량적이고 연속적이며 포괄적으로 모니터링할 수 있습니다. 종양을 과도하게 발현하고 종양 세포 이동을 자극하는 유전자는 암 치료에서 전이를 억제하는 잠재적 표적이 될 수 있습니다.먼저, 10x 반응 완충액 10마이크로리터, PNE 원 1.5마이크로리터, 플라스미드 DNA 10마이크로그램을 마이크로 원심분리 튜브에 첨가하여 플라스미드 DNA를 제한효소로 선형화합니다. 뉴클레아제 유리수를 첨가하여 반응 부피를 100마이크로리터로 만듭니다. 섭씨 37도에서 밤새 반응 혼합물을 배양하기 전에 두드려서 회전시켜 혼합합니다.다시, 스핀 다운하고 10 % SDS의 5 마이크로 리터와 RNA 등급 proteinase K의 밀리 리터 당 20 밀리그램의 1 마이크로 리터를 반응 혼합물에 첨가하여 혼합하고 스핀 다운합니다. 섭씨 50도에서 30분 동안 배양한 후 10x 전사 완충액, ATP, GTP, UTP, CTP 및 T7 각각 2마이크로리터와 선형화된 DNA 1마이크로그램을 T7 RNA 중합효소 매개 RNA 합성을 위한 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다. 뉴클레아제 유리수를 첨가하여 반응 부피를 20마이크로리터로 만듭니다.스핀 다운 후 RNA 합성을 위해 반응 혼합물을 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 스핀다운하여 1마이크로리터의 DNA를 추가하고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하기 전에 탭하여 템플릿 DNA를 제거합니다. 반응 혼합물에 10마이크로리터의 7.5몰 염화 리튬을 첨가하여 RNA의 염화 리튬 침전을 시작합니다.탭하고 회전시킨 후 반응 혼합물을 섭씨 영하 20도에서 30분 동안 배양합니다. 캡핑을 위해 RNA 샘플을 섭씨 65도에서 10분 동안 가열한 다음 얼음 위에 올려 냉각합니다. 다음으로, 캡핑 반응 성분을 추가하고 탭하여 혼합합니다.반응 혼합물을 회전시키고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. poly-A tailing의 경우 샘플을 스핀 다운하고 poly-A tailing 반응 성분을 추가합니다. 그런 다음 탭하고 회전시킨 다음 반응 혼합물을 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.염화 리튬 침전 및 합성 mRNA의 정량화를 위해 50 마이크로 리터의 7.5 몰 염화 리튬을 첨가하고 염화 리튬 침전을 수행한다. 냉동실에서 ECM 겔 스톡의 부분 표본을 꺼내 얼음 위에 보관하십시오. 마이크로 원심분리기 튜브에 990마이크로리터의 DMEM과 10마이크로리터의 ECM 겔을 혼합하여 리터당 10밀리그램의 ECM 겔을 작동 농도로 희석합니다.부드러운 피펫팅으로 혼합합니다. 희석된 ECM 겔 60마이크로리터를 CIM 플레이트 상부 챔버의 16개 웰 각각에 추가합니다. 플레이트 커버가 벗겨진 CIM 플레이트의 상부 챔버를 이산화탄소 인큐베이터 내부의 보호 플라스틱 시트에 약 4시간 동안 놓아 겔 층을 형성합니다.전기천공법의 경우 각 튜브의 종양 세포 현탁액에 1mL의 DPBS를 추가합니다. 셀 서스펜션을 탭하고 10초 동안 세 번 회전합니다. 마이크로 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다.110 마이크로리터의 재현탁 완충액 R을 세포 펠릿에 첨가하여 10 마이크로리터에 0.1백만 개의 세포를 얻습니다. 세포 펠릿에 합성 mRNA를 첨가하여 원하는 발현 수준에 따라 마이크로리터 농도당 0.2 내지 20 나노그램을 얻는다. 세포 펠릿을 가볍게 혼합하고 두드려 재현탁시킵니다.다음으로, 3 개의 펄스로 10 밀리 초 동안 10 밀리 초 동안 electroporation 시스템으로 셀 현탁액의 10 마이크로 리터를 전기 천공법으로 매번 전기 포레이션합니다. 완료되면 전기 천공된 셀을 0.5%FBS를 포함하는 1.1밀리리터의 DMEM이 있는 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 실시간 세포 분석 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 분석 프로그램을 엽니다.기본 실험 패턴 설정 옵션을 연 후 세 가지 실험을 개별적으로 실행하는 옵션을 선택합니다. 번호 탭을 클릭하여 각 크래들을 엽니다. 그런 다음 실험 노트 탭을 클릭합니다.폴더를 선택하고 실험 이름을 입력하여 데이터를 저장합니다. 레이아웃 탭을 클릭하고 한 번에 4개의 웰을 선택하여 각 처리 조건에 대해 쿼드 중복 웰을 설정합니다. 샘플 정보를 입력하고 적용을 클릭합니다.일정 탭을 클릭한 다음 단계를 추가하여 셀 임피던스 측정의 2단계 모드를 설정합니다. 그런 다음 적용을 클릭하여 첫 번째 단계를 설정합니다. 단계 추가를 다시 클릭하고 간격에 10분, 이동 및 침입 기간에 48시간을 입력합니다.그런 다음 적용을 클릭하여 두 번째 단계를 설정합니다. 세포 임피던스 측정 1시간 전에 10% 혈청 또는 기타 화학 유인 물질이 포함된 160마이크로리터의 DMEM을 CIM 플레이트의 하부 챔버 웰에 추가합니다. 침습을 위한 ECM 겔 코팅 웰 또는 하부 챔버와의 이동을 위한 코팅되지 않은 웰이 포함된 상부 챔버를 조립합니다.세포 이동 분석을 위해 50마이크로리터의 저혈청 배지를 CIM 플레이트의 상부 챔버 웰에 추가합니다. CIM 플레이트와 시스템의 크래들을 CO2 인큐베이터에 놓습니다. 메시지 탭을 클릭합니다.연결이 정상이면 CIM 플레이트를 실험할 준비가 되었다는 메시지가 표시됩니다. CIM 플레이트를 배양 조건에 적응시키기 위해 실시간 세포 분석 전에 조립된 CIM 플레이트를 이산화탄소 인큐베이터에서 30-60분 동안 사전 배양합니다. 기준선 판독값을 보려면 각 크래들의 시작 버튼을 클릭합니다.다른 이름으로 저장 창이 나타나면 실험 파일을 저장하여 기준 읽기를 수행합니다. 셀 안착의 경우 크래들에서 CIM 플레이트를 제거하고 플레이트 홀더의 생물 안전 캐비닛에 놓습니다. 그런 다음 100, 000 세포를 포함하는 전기 천공 셀의 100 마이크로 리터를 CIM 플레이트의 상부 챔버의 우물에 추가하고 CIM 플레이트를 실온에서 30 분 동안 생물 안전 캐비닛에 남겨 둡니다.완전히 조립된 CIM 플레이트를 해당 크래들로 다시 이동하여 셀 임피던스를 측정합니다. 크래들 시작 버튼과 플롯 탭을 클릭하여 두 번째 단계의 셀 임피던스 측정을 시작합니다. 그런 다음 모두 추가 버튼을 클릭하고 평균 및 표준 편차 상자를 선택하여 데이터를 실시간으로 시각화합니다.다양한 농도의 합성 크랙 1 mRNA를 사용한 U 118 mg 교모세포종 세포의 전기천공법은 형질주입 1일 후 플래그 태그 크랙 1 단백질의 농도 의존적 증가를 초래했습니다. 마이크로리터 mRNA 당 0.2 및 2 나노그램은 외인성 균열 1 단백질의 검출 불가능하거나 겸손한 발현을 유도했습니다. 마이크로리터 mRNA 당 20 나노그램은 내인성 균열 1 단백질보다 발현 수준이 높았습니다.세포 이동 분석은 electroporation이 마이크로리터 균열 당 0.2 또는 2 나노그램이었다는 것을 나타냈고, 1개의 mRNA는 세포 이동에 크게 영향을 미치지 않았다. 그러나, 마이크로리터 균열 당 20 nanograms 1 mRNA를 가진 electroporation는 교모세포종 세포 이동이 균열 하나 단백질 수준에 있는 증가에 의해 자극되었다는 것을 계시하는 2 그리고 13 시간 사이 이동하는 세포를 더를 가진 세포 이동의 명확한 자극으로 이끌어 냈습니다. 합성 크랙 L mRNA를 사용한 전기천공법은 형질주입 1일 후 플래그 태그가 붙은 크랙 L 단백질의 강력한 발현을 유도했습니다.대조 세포의 침입은 ECM 단백질 농도가 증가함에 따라 느려졌습니다. 발현 세포에 대한 균열 L은 세포 침습에서 ECM 겔 농도 의존적 감소를 보여주었습니다. 서로 다른 ECM 겔 농도에서 발현하는 세포에 대한 대조군과 크랙 L의 비교는 크랙 L 과발현이 일반적으로 ECM 겔 층을 통한 세포 침입을 자극한다는 것을 나타냈습니다.결과는 또한 두 세포 집단이 서로 다른 시점에서 ECM 겔 농도를 증가시킴으로써 차별적으로 영향을 받는다는 것을 시사했습니다. 재부유된 기포 R에서 세포를 오래 배양하면 세포가 건강하지 않기 때문에 세포는 재부유된 기포 R 사람들 전기천공법에서 빠르고 부드럽게, 완전하게 재현탁되어야 합니다. 빠르게 이동하는 종양 세포와 느리게 이동하는 종양 세포를 분리하여 두 세포 집단 간의 차이를 특성화할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

양적 성장 인자 (TGF) - β - 유도 3 차원 콜라겐 젤의 침공을 변형 측정하는 분석이 설명되어 있습니다. 이 분석은 유방암 개발의 다른 단계를 나타내는 세포 라인의 MCF10A 시리즈의 활용합니다. 이 방법은 다른 세포 라인과 함께 사용하는 다른 가능성 activators 또는 침해의 억제제를 조사하기 위해 사용될 수 채택 수 있습니다.

TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

입체 세포외 매트릭스에 종양 세포 침공의 모델이 더...

모델링 및 3 차원 이미징 단체 셀 침략

이 방법은 실제 시간과 같은 속도, 변위와 속도 등 다양한 세포 이주 매개 변수의 양적 측정에 세포의 모니터링이 가능합니다. 전통적인 방법과는 달리,이 실시간 접근법 끝점 양적 마이 그 레이션 측정에 기초하지 않고 대신 그것은 모니터링하고 지속적으로 서로 다른 매개 변수를 계산할 수 있습니다.

시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포의 무작위 마이 그 레이션의 정량 분석

침입형 유체의 흐름은 고체 종양에서 상승되며 종양 세포 침공을 조절하실 수 있습니다. 여기에서 우리는 매트릭스에 포함된 세포에 침입형 유체 흐름을 적용한 다음 세포 침입에 미치는 영향을 측정할 수있는 기법을 설명합니다. 이 기술은 쉽게 다른 시스템을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

종양 세포 침략에 중간 유체 흐름의 효과를 측정하는 세 가지 차원 세포 배양 모델

phagokinetic 운동성 트랙 분석은 세포의 움직임을 평가하는 데 사용되는 방법입니다. 특히, 분석은 양적 방식으로 시간이 지남에 chemokinesis (임의의 셀 운동성)을 측정합니다. 검정은 콜로이드 골드 코팅 coverslips에 미치는 운동의 측정 트랙을 만들 수있는 세포의 능력을 활용합니다.

Phagokinetic 트랙 운동성 분석에 의한 세포 마이그레이션의 수량 평가

일반적으로 사용되는 체외에서 세포의 이동 및 침윤을 조사하기위한 고도의 접근 방법이 설명되어 있습니다. 첫 번째 방법은 세포 운동성을 측정하는 세포 상처 폐쇄 분석이다. 두 번째 방법은 화성과 세포의 침략적인 능력을 평가하는 트랜스 웰 마이그레이션 및 침입 분석이다.

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

이 프로토콜 셀 셀 microenvironment를 유지 하면서 3 차원 설정의 마이그레이션 및 침입 기능을 계량 하는 데 사용할 수 있는 반전된 세로 침공 분석 결과를 설명 합니다. 이 분석 결과 희소 한 또는 민감한 세포에 적합 합니다.

위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜

여기, 양적 측정 마이그레이션 및 시간이 지남에 조건 하에서 여러 치료 세포종 뇌 종양 줄기 세포의 내 습을 라이브 세포 이미징 기술을 설명 합니다.

라이브 셀 이미징 분석 실험 연구 세포종 뇌 종양 줄기 세포 이동과 내 습을

현재 프로토콜 암 세포 마이그레이션 및 실시간으로 단일 플랫폼에서 침입을 조사 하 고, 세포 이동성 및 형태학 연구를 쉽게 재현할 수 및 시간 효율적인 옵션을 제공 하는 통합된 방법을 설명 합니다.

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

시험관내 세포 침습 분석기는 단백질 매트릭스를 함유하는 세포 배양 삽입을 사용하여 침입 및 이동을 위한 세포 전이를 정량화함으로써 암 전이의 잠재력을 측정하는데 사용된다. 세포는 단백질 매트릭스와 다공성 막을 통해, 화학유도제를 향해, 그 때 가벼운 현미경 검사법에 의해 정량화되기 위하여 도전됩니다.

종양 발생 세포 행동의 척도로 시험관 내 침략 분석에서 마우스 유방 종양 세포의 사용

암은 다른 장기로 전이하는 능력으로 인한 치명적인 질병입니다. 다양한 치료 조건하에서 암세포가 이동하고 침입하는 능력을 결정하는 것은 치료 전략을 평가하는 데 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 교모세포종 암 세포주들의 실시간 전이성 능력을 평가하는 방법을 제시한다.

암세포 이동 및 침입에 대한 임피던스 기반 실시간 측정

배우세요 합성 mRNA 전이와 임피던스 기반 실시간 측정을 결합하여 종양 세포 이동 및 침습을 정량 분석하는 방법입니다. 이 프로토콜은 암 전이 억제를 위한 치료 표적을 식별하는 데 활용됩니다.

합성 mRNA transfection 후 종양 세포 이동 및 침습의 실시간 정량 측정

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