Name: 펩티드-폴록사민 나노입자를 사용하여 배양된 세포에서 시험관내 트랜스크립션된 mRNA의 효율적인 형질감염 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 배우세요 펩티드-폴록사민 나노입자를 이용한 mRNA 형질감염 기술로 인간 기관지 상피 세포에서 효율적인 유전자 전달을 수행하는 방법. 이 기술은 점막 백신 개발과 폐 질환 치료 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (NSFC, 보조금 번호 82041045 및 82173764), 중국 과학 기술부의 병인 및 전염병 예방 기술 시스템 연구 (2021YFC2302500), 충칭 인재 : 탁월한 젊은 인재 프로젝트 (CQYC202005027) 및 충칭 자연 과학 재단 (cstc2021jcyj-msxmX0136)의 지원을 받았다. 저자들은 유체역학적 직경 (nm)과 다분산 지수 (PDI)를 측정 한 Xiaoyan Ding 박사에게 감사드립니다.

1. 화학적으로 변형된 mRNA의 시험관내 전사
참고 : RNases는 실험실 솔루션, 기기 표면, 머리카락, 피부, 먼지 등과 같은 환경에서 유비쿼터스이기 때문에 뉴클레아제가없는 튜브, 시약, 유리 제품, 피펫 팁 등을 사용해야합니다. 사용하기 전에 벤치 표면과 피펫을 철저히 청소하고 RNase 오염을 피하기 위해 장갑을 착용하십시오.
<ol><li>DNA 주형의 선형화를 수행합니다.<ol><li>T7 중합효소 프로모터, 5' 비번역 영역(UTR), 3'UTR, 및 폴리(A) 꼬리에 의해 측면된 메트리디아 루시퍼라제(MetLuc)의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 합성하고, 이를 박테리아에서 발현되는 PUC57 벡터 내로 클로닝한다( 표 참조). 참고: DNA 주형의 코딩 서열은 보충 파일 1에 제공된다.</li>
		<li>박테리아를 배양하고, 박테리아를 용해시키고, 상응하는 컬럼에 의해 플라스미드 DNA를 정제한다( 물질 표의 플라스미드 DNA 추출 키트 참조).</li>
		<li>2 μL의 BamHI, 2 μL의 KpnI ( 물질의 표 참조) 및 2 μg의 플라스미드 DNA를 포함하는 단일 50 μL 반응을 37°C에서 1시간 동안 수행하고, DNA 주형의 선형화를 달성한다.</li>
	</ol></li>
	<li> 시험관내 전사를 수행하여 비캡핑된 IVT mRNA를 생성한다.<ol><li>T7 전사 키트 및 슈도우리딘을 사용하여 단일 20 μL 반응에 의해 mRNA 합성을 수행한다 ( 물질 표 참조): 10 μL (0.8-1 μg)의 선형화된 DNA 주형, 1.5 μL (150 mM)의 ATP, pseudo-UTP, GTP 및 CTP, 2 μL의 10x 전사 완충액, 1 μL의 T7 효소, 및 1 μL의 뉴클레아제-프리 물(NF-water). 상기 언급된 성분들을 완전히 혼합하고 37°C에서 3시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	</ol></li>
	<li>주형 DNA를 제거합니다.<ol><li>전사 과정 후에 1 μL(1 U)의 DNase(RNase-free)를 첨가하고, 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.</li>
	</ol></li>
	<li>염화리튬 침전을 사용하여 캡핑되지 않은 IVT mRNA 정제를 수행한다.<ol><li>10 mM의 작동 농도로 염화리튬 ( 물질 표 참조)을 사용하여 캡핑되지 않은 IVT mRNA를 정제하십시오. 50 μL의 10 mM 염화리튬을 20 μL의 비캡핑된 IVT mRNA 용액에 첨가한다.</li>
		<li>전체 부피를 완전히 혼합하고 -20 °C에서 1 시간 동안 차갑게하십시오. 비캡핑된 IVT mRNA를 12,000 x g에서 12분 동안 수집하고, 이는 각각의 단일 20 μL 반응으로부터 80-120 μg의 비캡핑된 IVT mRNA를 일상적으로 생성한다.</li>
	</ol></li>
	<li>IVT mRNA 캡핑을 수행한다.<ol><li>캡 1 캡핑 시스템을 사용하여 IVT mRNA 캡핑을 수행 한다(표 문헌 참조). 간략하게, 50 μg의 비캡핑된 IVT mRNA의 이차 구조를 65°C에서 10분 동안 가열하여 제거하고, 이어서 비캡핑된 IVT mRNA의 5' 말단을 캡 1과 연결시키고, 이는 2.5 μL의 s-아데노실메티오닌(SAM)(20 mM) 및 4 μL의 2'-O-메틸트랜스퍼라제(100 U)를 사용하여 m7G 캡 구조를 변형시킴으로써 제조되고 100 μL의 2'-O-메틸트랜스퍼라제(100 U)를 30-60분 동안 반응시켰다.</li>
		<li>250 μL의 10 mM 염화리튬을 사용하여 캡핑된 IVT mRNA의 100 μL를 정제하고, 50 μL의 NF-물에 희석한다.</li>
	</ol></li>
	<li>캡핑된 IVT mRNA의 순도 및 분자 크기를 결정한다.<ol><li>캡핑된 IVT mRNA의 농도를 UV-가시 분광광도계로 측정한다. RNA 마커 (표 표 참조)를 사용하여, 18% 포름알데히드를 함유하는 1% 포름알데히드 변성 아가로스 겔에서 캡핑된 IVT mRNA 의 분자 크기를 분석한다(전압은 120 V이다). 비캡핑된 IVT mRNA 및 캡핑된 IVT mRNA가 -80°C에서 저장되도록 보장한다. 참고: IVT mRNA는 1.8-2.1의 A260/A280 비율 및 2.0 또는 약간 더 높은A260/A230 비율에서 양호한 순도를 갖는 것으로 간주되었다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. IVT mRNA/PP-sNp의 생성
<ol><li>T704( 물질표 참조)를 NF-water에 가용화하여 폴록사민 704(T704) 원액을 준비하여 10mg/mL 원액을 얻었다. 제조된 용액을 4°C에서 보관한다. 참고: T704는 폴리(프로필렌 옥사이드) (PPO) 블록 및 폴리(에틸렌 옥사이드) (PEO) 블록(24)의 네 개의 사슬에 결합된 에틸렌디아민 중심기로 이루어진 X자형 구조를 함유한다. T704의 분자량(Mw)은 5500이다.</li>
	<li>합성 펩타이드(sPep, 표 참조) 원액을 sPep를 가용화하여 제조한다(서열: KETWWETWWTEWWTEWKKKKKKRRRRRKKKACSE RSMNFCG)를 NF-water에 2 mg/mL 원액을 수득하고 4°C에서 저장하였다.</li>
	<li>IVT mRNA를 얼음 상에서 해동시키고(단계 1), 튜브를 열기 전에 실온에서 300 x g 에서 3초 동안 바로 원심분리하여 IVT mRNA 용액을 제조하였다. IVT mRNA 용액을 NF-물로 0.04 μg/μL로 희석한다. 참고: 가능하면 IVT mRNA로 생물안전 캐비닛에서 작업하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>sPep 용액을 0.555 μg/μL로, T704 용액을 NF-물로 8 μg/μL로 희석하여 T704 및 sPep 혼합 용액을 준비합니다. 혼합 용액을 추가 사용 전에 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다. 참고: 원하는 N/P 비율에 따라 필요한 sPep 구성 요소를 계산합니다. N/P 비는 sPep 내의 질소 잔기(N)의 총 수와 IVT mRNA 내의 음전하를 띤 포스페이트 그룹(P)의 총 수이다. T704와 IVT mRNA 사이의 중량/중량(w/w) 비를 기준으로 필요한 T704를 계산하십시오. N / P 비율은 5이고 w / w 비율은 100이어야합니다.</li>
	<li>아래 단계에 따라 IVT mRNA/PP-sNp 제제를 준비한다.<ol><li>IVT mRNA 용액 (단계 3)을 1 mL 주사기에 끌어당겨 주사기 팁에 공극이나 기포가 없도록 한다. 주사기를 카트리지의 한쪽 면에 회전 블록 옆에 로드합니다.</li>
		<li>1 mL 주사기를 T704 및 sPep 혼합 용액으로 채운다(단계 4). 주사기 팁의 기포 또는 공극을 제거하고 주사기를 펌프의 다른 입구에 넣습니다 ( 재료 표 참조).</li>
		<li>펌프를 1:1의 유량과 4-10 mL/min의 총 유량으로 설정하십시오. 참고: 6 mL/min의 총 유속은 여기에 제시된 연구에서 최적입니다.</li>
		<li>10 mL RNase-free 원뿔형 튜브 ( 재료 표 참조)를 배치하여 혼합 장치의 유로 끝에 혼합 IVT-mRNA/PP-sNp 용액을 수집합니다.</li>
		<li>펌프를 실행하여 믹싱을 시작하여 매개변수가 올바르게 입력되었는지 확인합니다. 펌프가 6초 동안 작동을 마친 후 원뿔형 튜브에서 IVT-mRNA/PP-sNp 샘플을 수집합니다. 주: PP-sNp는 미세유체 혼합기를 사용하여 생성되었다(보충 그림 1). 상기 장치는 정수 유동 펌프, 링크 장치, 칩, 및 고정 장치를 포함한다. 혼합 공정에서 칩에 연결된 정수 유량 펌프는 미리 설정된 유량에 따라 칩에 액체를 전달합니다. 연결된 정수 유량 펌프는 단일 출력 채널로 칩의 여러 입력 채널에 연결할 수 있습니다. 칩을 포함한 장치의 구성 요소는 상업적 소스에서 얻어지고 합리적으로 조립되었습니다 ( 재료 표 참조). IVT mRNA 용액 및 T704-sPep 혼합 용액의 유량 및 부피와 같은 파라미터는 일부 다른 설정이 사용되는 경우 현재 프로토콜에 표시된 것과 다를 수 있으며 그에 따라 최적화되어야 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. IVT-mRNA/PP-sNp의 유체역학적 직경 및 다분산도 측정
<ol><li>IVT mRNA/PP-sNp 용액(단계 2)의 분취량을 NF-물로 희석하여 1mL의 최종 부피를 얻는다.</li>
	<li>세미 마이크로 큐벳(25)을 이용하여 유체역학적 크기 및 다분산 지수(PDI)를 측정한다. IVT mRNA/PP-sNp 용액을 큐벳에 넣고 입자 크기 측정기에 넣습니다( 재료 표 참조). 표준 운영 절차를 설정하고 시작 을 클릭하여 데이터 수집을 시작하십시오.</li>
</ol>4. 형질감염용 세포의 제조
<ol><li>인간 기관지 상피 세포 (16HBE) 및 수지상 세포주 (DC2.4)를 형질감염 전에 3.5 x 10 4 세포 / 웰24 시간의 밀도로 96 웰 플레이트에 플레이트. 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 배지에서 세포를 성장시킨다. 주: 세포는 상업적 공급원으로부터 수득되었다( 물질의 표 참조).</li>
	<li>세포를 인큐베이터(37°C 및 5%CO2 분위기)에서 24시간 동안 인큐베이션하여 형질감염 전에 세포가 60%-80% 컨플루언트되도록 한다.</li>
</ol>5. 배양된 세포의 형질감염
<ol><li>성장 배지를 제거한 후, 플레이팅된 세포를 0.2 mL/웰 1x PBS로 세척한다.</li>
	<li>170 μL의 무혈청 배지를 플레이팅된 세포 배양물을 함유하는 각 웰에 첨가한다.</li>
	<li>0.4 μg의 MetLuc mRNA (단계 2에서 제조됨)를 함유하는 IVT mRNA/PP-sNp 제제를 30 μL/웰의 양으로 적가한다.</li>
	<li>세포를 IVT mRNA/PP-sNp 제형과 함께 37°C에서 4시간 동안 가습된 5%CO2-풍부 분위기에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>형질감염 배지를 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청과 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 0.2mL의 신선한 배지로 교체하십시오. 주: 소 태아 혈청을 불활성화를 위해 56°C에서 30분 동안 가열하였다.</li>
	<li>형질감염된 세포를 37°C에서 24시간 동안 5%CO2-농축 분위기에서 인큐베이션하고, 각 웰로부터 검출될 상청액을 수집한다.</li>
</ol>6. Metridia luciferase (MetLuc) 분석을 이용한 세포 형질감염 효능 분석
<ol><li>아래 단계에 따라 코엘엔테라진 기질( 표 참조)을 사용하여 MetLuc 활성에 대해 각 웰로부터의 상청액을 분석한다.<ol><li>코엘엔테라진 기질에 1x PBS를 첨가하여 신선한 분석 용액을 제조하였다 (코엘엔테라진의 농도는 15 mM이다).</li>
		<li>철저한 혼합을 위해 10 초 동안 coelenterazine 용액을 소용돌이 치십시오.</li>
		<li>50 μL의 상청액(단계 5에서 수집됨)을 96-웰 플레이트에 첨가한다.</li>
		<li>30μL의 코엘엔테라진 용액(15mM)을 각 웰에 수동으로 또는 자동 주입하여 첨가하기 전에 1,000ms의 판독 시간으로 마이크로플레이트 리더( 재료 표 참조)를 설치하십시오.</li>
		<li>시작을 클릭하여 상청액에 코엘렌테라진 용액을 첨가한 직후에 발광 신호를 측정합니다. 참고: 발광 신호는 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정되며, 그 활성은 상대 광 단위로 표현됩니다. PBS-형질감염된 웰로부터 수득된 값은 블랭크 대조군으로서 사용될 것이다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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여기에 기술된 프로토콜은 정의된 특성을 갖는 IVT mRNA 백신 제형의 비용 효율적이고 신속한 생산을 가능하게 할 뿐만 아니라, 유전자 요법과 같은 특정 치료 목적에 따라 PP-sNp 제형을 맞춤화할 수 있는 가능성을 제공한다. IVT mRNA/PP-sNp의 성공적인 생성을 보장하기 위해, 몇 가지 중요한 단계에 각별한 주의를 기울이는 것이 좋습니다. mRNA와 함께 작업할 때, IVT mRNA가 화학적 변형으로 제조되었더라도 IVT mRNA가 RNase에 의한 분해와 관련하여 매우 민감하기 때문에 RNase-free 조건이 프로세스 전반에 걸쳐 유지되어야 한다는 것을 항상 기억해야 한다. 한편, 제형을 저장할 때 RNase가 없는 환경도 보장되어야 한다. IVT mRNA/PP-sNp를 2-8°C에서 최대 1주일 동안 보관하는 것이 좋습니다. 제시된 결과는 뉴클레아제가없는 물이 높은 형질감염 효율로 PP-sNp를 성공적으로 형성하는데 효과적이라는 것을 입증합니다. 다른 완충제, 예컨대 PBS, 식염수, OptiMEM 등이 원하...

예방 접종은 전염병으로 인한 이환률 및 사망률을 줄이기위한 가장 효율적인 의료 개입 중 하나로 예고되었습니다1. 백신의 중요성은 2019 년 코로나 바이러스 질병 (COVID-19)이 발병 한 이래로 입증되었습니다. 불활성화 또는 약독화된 병원체를 주입하는 전통적인 개념과는 달리, 핵산 기반 백신과 같은 최첨단 백신 접근법은 기존의 전체 미생물 바이러스 또는 박테리아 기반 백신과 관련된 잠재적 안전성 문제를 피하면서 표적 병원체의 면역 자극 특성을 보존하는 데 집중한다. DNA- 및 RNA (즉, 시험관내 전사된 메신저 RNA, IVT mRNA) 둘 다-기반 백신은 감염성 질환 및 암을 포함하는 다양한 질병에 대한 치료 잠재력에 대한 예방적 잠재력을 나타낸다 2,3. 원칙적으로, 핵산 기반 백신의 잠재력은 그들의 생산, 효능 및 안전성과 관련된다4. 이러한 백신은 비용 효율적이고 확장 가능하며 신속한 생산을 가능하게하기 위해 무세포 방식으로 제조 될 수 있습니다.
단일 핵산 기반 백신은 다중 항원을 인코딩하여 수많은 바이러스 변이체 또는 박테리아의 표적을 접종 횟수를 줄이고 탄력적 인 병원체에 대한 면역 반응을 강화할 수 있습니다 5,6. 게다가, 핵산 기반 백신은 바이러스 또는 박테리아 감염의 자연 침입 과정을 모방하여 B 세포 및 T 세포 매개 면역 반응을 가져올 수 있습니다. 일부 바이러스 또는 DNA 기반 백신과 달리 IVT mRNA 기반 백신은 안전성 측면에서 큰 이점을 제공합니다. 이들은 시토졸에서 원하는 항원을 신속하게 발현할 수 있고 숙주 게놈에 통합되지 않아 삽입 돌연변이유발에 대한 우려를 없애고7. IVT-mRNA는 성공적인 번역 후 자동으로 분해되므로 단백질 발현 동역학을 쉽게 조절할 수 있습니다 8,9. 심각한 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2) 전염병에 의해 촉매 된 전 세계 기업 / 기관의 노력으로 많은 유형의 백신 시장에 출시 될 수있었습니다. IVT mRNA 기반 백신 기술은 큰 잠재력을 보여 주며, 몇 달 내에 모든 표적 항원에 적응할 수있는 신속한 설계와 유연한 능력으로 인해 이전에 예상 된 성공을 처음으로 입증했습니다. 임상 응용 분야에서 COVID-19에 대한 IVT mRNA 백신의 성공은 IVT mRNA 백신 연구 개발의 새로운 시대를 열었을 뿐만 아니라 전염병10,11의 발생을 다루기위한 효과적인 백신의 신속한 개발을위한 귀중한 경험을 축적했습니다.
IVT mRNA 백신의 유망한 잠재성에도 불구하고, 작용 부위(즉, 세포질)로의 IVT mRNA의 효율적인 세포내 전달은 특히 기도(4)를 통해 투여되는 사람들에게 계속해서 주요한 장애물(12)을 제기한다. IVT mRNA는 본질적으로 매우 짧은 반감기 (∼7 h)13을 갖는 불안정한 분자이며, 이는 IVT mRNA가 유비쿼터스 RNase14에 의해 분해되기 매우 쉽다. 선천적 면역계의 림프구는 생체내 적용의 경우에 인식된 IVT mRNA를 삼키는 경향이 있다. 더욱이, IVT mRNA의 높은 음전하 밀도 및 큰 분자량 (1 x 104-1 x 106 Da)은 세포막(15)의 음이온성 지질 이중층을 가로 지르는 그의 효과적인 투과를 손상시킨다. 따라서, IVT mRNA 분자의 분해를 억제하고 세포 흡수(16)를 촉진하기 위해 특정 생체기능성 물질을 갖는 전달 시스템이 요구된다.
네이키드 IVT mRNA가 생체내 조사를 위해 직접 활용된 몇 가지 예외적인 경우와는 별개로, 다양한 전달 시스템이 IVT mRNA를 작용부위 17,18로 운반하는데 사용된다. 이전의 연구들은 단지 몇몇 IVT mRNA들이 전달 시스템(19)의 도움 없이 시토졸에서 검출된다는 것을 밝혀냈다. 프로타민 축합에서 지질 캡슐화(20)에 이르기까지 현장에서 지속적인 노력으로 RNA 전달을 개선하기 위한 수많은 전략이 개발되었다. 지질 나노입자(LNPs)는 mRNA 전달 비히클 중에서 가장 임상적으로 진보된 것으로, 임상적으로 사용하기 위해 승인된 모든 mRNA COVID-19 백신이 LNP 기반 전달 시스템(21)을 사용한다는 사실에 의해 입증되었다. 그러나, LNPs는 제형이 호흡 경로(22)를 통해 전달될 때 효과적인 mRNA 형질감염을 매개할 수 없으며, 이는 점막 면역 반응을 유도하거나 낭포성 섬유증 또는 α1-안티트립신 결핍과 같은 폐 관련 질환을 해결하는 데 이들 제형의 적용을 현저하게 제한한다. 따라서, 이러한 미충족 문제를 해결하기 위해 기도 관련 세포에서 IVT mRNA의 효율적인 전달 및 형질감염을 용이하게 하기 위한 신규한 전달 시스템의 개발이 요구된다.
펩티드-폴록사민 자기조립된 나노입자(PP-sNp) 전달 시스템이 마우스23의 호흡기에서 핵산의 효율적인 형질감염을 매개할 수 있음이 확인되었다. PP-sNp는 다기능 모듈식 설계 접근 방식을 채택하여 다양한 기능 모듈을 나노 입자에 통합하여 신속한 스크리닝 및 최적화(23)를 수행 할 수 있습니다. PP-sNp 내의 합성 펩티드 및 전기적으로 중성인 양친매성 블록 코폴리머(폴록사민)는 IVT mRNA와 자발적으로 상호작용하여 조밀한 구조 및 매끄러운 표면(23)을 갖는 균일하게 분포된 나노입자를 생성할 수 있다. PP-sNip은 마우스(23)의 배양된 세포 및 호흡기에서 IVT mRNA 분자의 유전자 형질감염 효과를 향상시킬 수 있다. 본 연구는 Metridia luciferase (MetLuc-mRNA)를 인코딩하는 IVT mRNA를 함유하는 PP-sNp를 생성하기 위한 프로토콜을 기술한다(도 1). 비틀거리는 헤링본 혼합 설계를 사용하는 미세유체 혼합 장치를 통한 제어 및 신속한 혼합이 이 프로토콜에 활용됩니다. 이 절차는 실행하기 쉽고 더 균일 한 크기의 PP-sNp를 생성 할 수 있습니다. 미세유체 혼합기를 이용한 PP-sNp 생산의 일반적인 목표는 잘 조절된 방식으로 mRNA 복합체화를 위한 PP-sNp를 생성하고, 따라서 시험관내에서 효율적이고 재현 가능한 세포 형질감염을 가능하게 하는 것이다. 본 프로토콜은 MetLuc-mRNA를 함유하는 PP-sNp의 제조, 조립 및 특성화를 기술한다.

<table><tbody><tr><td>BamHI</td><td>Takara</td><td>1010</td><td></td></tr><tr><td>cap 1 캡핑 시스템</td><td>Jinan</td><td>M082</td><td></td></tr><tr><td>수지상 세포주</td><td>Sigma</td><td>SCC142</td><td></td></tr><tr><td>DNA 서열</td><td>Genescript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인간 기관지 상피 세포</td><td>Sigma</td><td>SCC150</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>Takara</td><td>1068</td><td></td></tr><tr><td>LP</td><td>Beyotime</td><td>C0533</td><td></td></tr><tr><td>리튬 클로라이드</td><td>APEXBio</td><td>B6083</td><td></td></tr><tr><td>Malvern Zetasizer Nano ZS90</td><td>Malvern</td><td>NB007605</td><td></td></tr><tr><td>미세유체 칩</td><td>ZHONGXINQIHENG</td><td>표준 PDMS 칩</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>ThermoFisher</td><td>Varioskan lux</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-ONE-W(A30221)</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pseudouridine</td><td>APE&times; Bio</td><td>B7972</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep 스핀 Miniprep 키트</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Quanti-Luc</td><td>InvivoGen</td><td>Rep-qlc2</td><td></td></tr><tr><td>RiboRuler High Range RNA Ladder</td><td>ThermoFisher</td><td>SM1821</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free 원뿔형 튜브</td><td>Biosharp</td><td>BS-100-M</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>ThermoFisher</td><td>C11875500BT</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>Chemyx</td><td>Fusion 101</td><td></td></tr><tr><td>T7 전사 키트</td><td>지난</td><td>E131</td><td></td></tr></tbody></table>

펩티드-폴록사민 나노입자를 사용하여 배양된 세포에서 시험관내 트랜스크립션된 mrna의 효율적인 형질감염

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

시험관 내 전사 메신저 RNA (mRNA) 백신은 코로나 바이러스 질병 2019 (COVID-19) 전염병에 맞서 싸울 수있는 엄청난 잠재력을 보여주었습니다. 효율적이고 안전한 전달 시스템은 mRNA의 깨지기 쉬운 특성으로 인해 mRNA 백신에 포함되어야 한다. 자체 조립된 펩타이드-폴록사민 나노입자(PP-sNp) 유전자 전달 시스템은 핵산의 폐 전달을 위해 특별히 설계되었으며 성공적인 mRNA 트랜스펙션을 매개하는 데 유망한 능력을 표시합니다. 여기서, PP-sNap을 제조하기 위한 개선된 방법이 PP-sNap이 어떻게 메트리디아 루시퍼라제(MetLuc) mRNA를 캡슐화하고 배양된 세포를 성공적으로 형질감염시키는지에 대해 상세히 설명한다. MetLuc-mRNA는 선형 DNA 주형으로부터 시험관내 전사 과정에 의해 수득된다. PP-sNp는 미세 유체 혼합기를 사용하여 합성 펩타이드 / 폴록사민과 mRNA 용액을 혼합하여 PP-sNp의 자체 조립을 가능하게하여 생산됩니다. PP-sNp의 전하는 후속적으로 제타 전위를 측정함으로써 평가된다. 한편, PP-sNp 나노입자의 다분산도 및 유체역학적 크기는 동적 광산란을 이용하여 측정된다. mRNA/PP-sNp 나노입자는 배양된 세포로 형질감염되고, 세포 배양물로부터의 상청액은 루시퍼라제 활성에 대해 분석된다. 대표적인 결과는 시험관내 형질감염에 대한 그들의 능력을 입증한다. 이 프로토콜은 차세대 mRNA 백신 전달 시스템 개발에 빛을 비출 수 있습니다.

재조합 플라스미드를 분해하여 선형화된 DNA 주형을 생성하였다(도 2A). 기술된 프로토콜을 사용하여, T7 시험관내 전사 키트는 20 μL 반응 당 최대 80-120 μg의 캡핑되지 않은 MetLuc-mRNA 및 100 μL 반응 당 50-60 μg의 캡핑된 MetLuc-mRNA를 생산할 수 있다. 전기영동으로 분석할 때, 고품질의 무손상 MetLuc-mRNA는 도 2B에 표시된 바와 같이 단일하고 명확한 밴드를 나타내야 한다. DNA 주형으로부터 반응에 도입된 오염물질은 RNA 분해와 더 낮은 수율을 초래할 수 있다.
MetLuc-mRNA(MetLuc-mRNA/PP-sNp)를 포함하는 PP-sNp는 미세유체 혼합 방법을 사용하여 제조하였다(도 1). 표 1 은 MetLuc...

자체 조립된 펩타이드-폴록사민 나노입자(PP-sNp)는 미세유체 혼합 장치를 사용하여 개발 되어 시험관 내 전사된 메신저 RNA를 캡슐화하고 전달합니다. 기술된 mRNA/PP-sNip는 배양된 세포를 시험관내에서 효율적으로 형질감염시킬 수 있었다.

펩티드-폴록사민 나노입자를 사용하여 배양된 세포에서 시험관내 트랜스크립션된 mRNA의 효율적인 형질감염

In vitro transcribed messenger RNA (mRNA) vaccines have displayed enormous potential in fighting against the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. ...

펩티드-폴록사민 나노입자는 잠재적인 폐 mRNA 전달 시스템 중 하나이다. 우리의 프로토콜은 펩타이드-폴록사민 나노 입자를 더 높은 생산성과 효율로 만들어 점막 mRNA 백신의 개발을 용이하게합니다. 이 기술에 필요한 재료는 저렴하며 짧은 시간에 프로토콜을 완료 할 수 있습니다.상기 펩타이드-폴록사민 나노입자는 효율적인 mRNA 형질감염을 매개하는 능력을 갖는다. 펩타이드-폴록사민 나노입자는 인간 기관지 상피 세포에서 성공적인 mRNA 형질감염을 나타냈으며, 이는 점막 COVID-19 백신, 폐암 치료 및 낭포성 섬유증 유전자 치료에 대한 추가 적용을 의미합니다. 나는 개인이 실험을 시작하기 전에 관련 분야와 프로토콜 및 많은 기술에 대한 기본 지식을 가질 것으로 기대합니다.메트리디아 루시퍼라아제의 개방 판독 프레임을 합성하고 pUC57 벡터에 클로닝한 후, 섭씨 37도에서 1시간 동안 BamHI 및 KpnI를 사용하여 선형화된 DNA 주형을 제조하였다. 원고에 기재된 바와 같이 T7 전사 키트 및 슈두리딘을 사용하여 mRNA 합성을 위한 20-마이크로리터 부피의 반응을 준비한다. 성분을 철저히 혼합하고 섭씨 37도에서 3 시간 동안 배양하십시오.이어서, 캡핑되지 않은 IVT mRNA 50 마이크로그램의 2차 구조를 섭씨 65도에서 10분 동안 가열하여 제거한다. IVT mRNA 캡핑에 Cap 1 캡핑 시스템을 사용하고, 섭씨 37도에서 30-60분 동안 S-아데노실메티오닌 및 2'O-메틸트랜스퍼라제를 사용하여 7-메틸구아노신 캡 구조를 변형하여 Cap 1을 제조합니다. 캡핑된 IVT mRNA의 농도를 UV-가시광선 분광광도계로 측정합니다.RNA 마커를 사용하여 18% 포름알데히드를 포함하는 1% 포름알데히드 변성 아가로스 겔에서 캡핑된 IVT mRNA의 분자 크기를 분석합니다. T704를 뉴클레아제가 없는 물에 가용화하여 폴록사민 704의 밀리리터당 10 밀리그램 스톡 용액을 준비합니다. 펩티드를 뉴클레아제가 없는 물에 가용화하여 펩티드의 밀리리터 원액당 2 밀리그램을 준비한다.준비된 용액을 섭씨 4도에서 보관하십시오. IVT mRNA를 얼음에서 해동합니다. 튜브를 열기 전에 튜브를 실온에서 3 초 동안 300 배 G로 원심 분리하고 IVT mRNA 용액을 뉴 클레아 제가없는 물로 희석하십시오.T704 용액을 마이크로리터당 8마이크로그램으로 희석하고 합성 펩타이드 용액을 마이크로리터당 0.555마이크로그램으로 각각 뉴클레아제가 없는 물로 희석하여 T704 및 합성 펩타이드 혼합 용액을 준비합니다. 추가 사용 전에 혼합 용액을 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다. IVT mRNA 용액을 1 밀리리터 주사기에 넣고 주사기 팁의 공극이나 기포를 피하십시오.주사기를 회전 블록 옆에있는 카트리지의 한쪽면에 넣습니다. 그런 다음 1 밀리리터 주사기에 T704 및 합성 펩타이드 혼합 용액을 채우고 주사기 끝의 기포 또는 에어 갭을 제거합니다. 주사기를 펌프의 다른 입구에 놓고 분당 4-10 밀리리터의 총 유량으로 펌프를 설정하십시오.혼합 장치의 유로 끝에 혼합 IVT mRNA / PP-sNp 용액을 수집하기 위해 10 밀리리터 RNase가없는 원추형 튜브를 놓습니다. 펌프를 실행하여 혼합을 시작하고 매개 변수가 올바르게 입력되었는지 확인하십시오. 6초 동안 펌프를 가동한 후 원뿔형 튜브에서 IVT mRNA/PP-sNp 샘플을 수집합니다.인간 기관지 상피 세포 및 수지상 세포주를 형질감염 24시간 전에 96-웰 플레이트에 플레이트시켰다. 10% 열 불활성화 태아 소 혈청과 1% 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 배양 배지에서 세포를 성장시킵니다. 성장 배지를 제거한 후, 플레이팅된 세포를 웰당 0.2 밀리리터 PBS로 세척한다.170 마이크로리터의 무혈청 배양 배지를 플레이팅된 세포 배양물을 포함하는 각 웰에 첨가한다. 그런 다음 0.4마이크로그램의 메트리디아 루시퍼라아제 mRNA를 포함하는 30마이크로리터의 IVT mRNA/PP-sNp 제형을 각 웰에 현명하게 추가합니다. IVT mRNA / PP-sNp 제형으로 세포를 섭씨 37 도의 가습 된 5 % 이산화탄소가 풍부한 분위기에서 4 시간 동안 배양합니다.형질주입 배지를 흡인하고 10% 열 불활성화 태아 소 혈청과 1% 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 신선한 배양 배지 0.2밀리리터를 추가합니다. 앞서 입증된 바와 같이 형질감염된 세포를 24시간 동안 인큐베이션하고, 각 웰로부터 검출될 상청액을 수집한다. 코엘렌테라진 기질에 PBS를 첨가하여 새로운 분석 용액을 준비합니다.10 초 동안 와동하여 용액을 완전히 혼합하십시오. 수집된 상청액 50 마이크로리터를 96-웰 플레이트에 첨가한다. 1, 000 밀리 초의 판독 시간으로 마이크로 플레이트 리더를 설정하고 수동 또는 자동 주입으로 각 웰에 30 마이크로 리터의 콜렌 테라 진 용액을 첨가하십시오.상청액에 코엘렌테라진 용액을 첨가한 직후, 시작을 클릭하여 발광 신호를 측정합니다. 재조합 플라스미드를 단리하고 소화시켜 선형화된 DNA 주형을 생성하였다. 시험관내 전사는 상향 캡핑되고 캡핑된 MetLuc mRNA를 생성하였다.메트리디아 루시퍼라아제 mRNA/PP-sNp로 형질감염된 세포는 시판되는 지질 기반 형질주입 시약, 네이키드 메트리디아 루시퍼라아제 mRNA, PBS 또는 T7044 합성 펩타이드, 인간 기관지 상피 세포의 혼합 용액, 16 HBE 및 수지상 세포주 DC2.4로 형질감염된 세포에 비해 유의하게 더 높은 루시퍼라아제 발현을 나타냈습니다. MetLuc mRNA를 분해로부터 보호하고 외인성 메트리디아 루시퍼라제 mRNA의 형질감염 효율을 촉진합니다. 캡이 없는 Met-mRNA의 합성 구조가 성공적으로 제거되었는지 확인하십시오. Met-mRNA T704와 펩타이드 화합물을 신중하게 계산하고 다운로드하여 폴록사민 나노입자를 준비하고 압축합니다.투과전자현미경을 수행하여 펩타이드-폴록사민 나노입자의 형태를 관찰할 수 있다. 이 기술은 연구자들이 점막 mRNA 백신을 개발하고 모든 관련 세포에 대한 유전자 치료 제형의 고처리량 스크리닝을 가능하게 하는 데 도움이 됩니다.

efficient-transfection-vitro-transcribed-mrna-cultured-cells-using

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

B 타입 젤라틴 기반 공학 nanovectors 시스템 (GENS)은 췌장암의 치료 체계 유전자 전달 및 transfection을 위해 개발되었습니다. 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) nanparticles의 표면에 특정 펩타이드와 수정함으로써, 그들은 EGFR 수용체에서 대상 수와 같은 높은 세포내 글루타티온의 농도로, 환경을 감소 밑에 플라스미드 놓습니다.

표피 성장 인자를 사용하여 인간의 췌장 암 세포의 유전자 전달 및 Transfection은 다행 기반 엔지니어링된 Nanovectors를 수용체 타겟

식물 수정을 위한 기존 방법은 적용 가능성이 제한적입니다. 여기에서 제안된 새로운 펩타이드 유래 기술은 온전한 식물의 원하는 세포 내 구획에 외인성 단백질 또는 유전자를 도입하는 데 있어 단순성과 효율성을 모두 약속합니다.

펩타이드 유래의 방법은 식물의 유전자와 단백질 세포 간 및 Organellar 장벽을 수송하는

이 원고는 PEI / MNP 벡터와 자신의 자화에 의해 내피 세포 수 미르 효율적인 비 바이러스 성 전달을 설명합니다. 따라서, 유전자 변형뿐만 아니라,이 방법은 자기 세포 안내와 MRI의 검출 능력 수 있습니다. 이 기술은 치료 세포 제품의 특성을 개선하는 데 사용할 수 있습니다.

준비 및<em&gt; 체외</em&gt; 자화 특성의 내피 세포를 미르 변성

이 프로토콜에서는 안전 하 고 효율적인 절차 CD133 수정+ 조 혈 줄기 세포. 제시 비 바이러스 성, 자기 polyplex 기반 접근 자기 공명 화상 진 찰을 통해 관리 셀 제품 모니터링에 관해서는 뿐만 아니라 치료 줄기 세포 효과의 최적화를 위한 기반을 제공할 수 있습니다.

성인 골 수 유래 조 혈 줄기 세포로 세포 공학 자기 대상으로 함께 있도록 예측에 관한 전송을 위한 프로토콜

여기 우리가 드라이 필름 방식에 기반 하 고 안전에 대 한 사용할 수 있습니다 양이온 nanoliposomes의 생성에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 효율적인 전달 체 외에 문자 메신저 RNA.

체 외에서 의 효율적인 배달 양이온 Nanoliposomes의 세대 문자 메신저 RNA

Polyethyleneimine (페이)를 사용 하는 방법 설명-siRNA와 transfecting 세포에 대 한 superparamagnetic 산화 철 나노 입자를 코팅. 이러한 나노 입자 세포 생체 외에서 그리고 vivo에서 및 침묵 대상 유전자 발현을 효율적으로 siRNA를 제공할 수 있습니다.

Polyethyleneimine 코팅 된 산화 철 나노 입자 작은 간섭 RNA의 세포에 배달 하는 수단으로 생체 외에서 그리고 Vivo에서

대식세포, 특히 1차 대식세포는 비자기 기원의 분자를 검출하는 것을 전문으로 하기 때문에 트랜스펙트에 도전하고 있습니다. 우리는 플라스미드와 같은 DNA 템플릿에서 생성된 mRNA를 가진 1 차적인 대식세포의 고도로 능률적인 형질혈을 허용하는 프로토콜을 기술합니다.

체외 전사 mRNA를 가진 1 차적인 대식세포의 고효율 형질감염

여기서, 폴리(베타 아미노에스) 폴리머를 기반으로 mRNA 나노입자를 제조하기 위한 간단한 프로토콜이 제시되고, 캡슐화된 mRNA를 변경하여 맞춤화되기 쉽다. 중합체, 나노입자 및 체외 필수 특성화를 합성하기 위한 워크플로우도 설명되어 있습니다. 예방 접종에 관한 개념 증명도 추가됩니다.

mRNA로 로드된 폴리(베타 아미노에스) 나노입자의 합성 및 특성화

저가의 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 H9 인간 배아줄기세포(hESCs)에서 shRNA의 안정적인 발현을 위한 렌티바이러스 입자를 생산하고 H9 유래 신경전구세포(NPC)를 고효율로 일시적으로 형질도입했습니다.

저비용 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 hESC 및 NPC에 대한 shRNA의 렌티바이러스 매개 전달

본 프로토콜은 2i 및 LIF 배지를 사용한 배양 중 마우스 배아 줄기 세포의 역 다중-transfection 방법을 설명합니다. 이 방법은 기존의 forward transfection 프로토콜보다 더 높은 생존력과 효율성을 제공하는 동시에 plasmid 비율의 one-pot 최적화를 가능하게 합니다.

핵산 비율의 신속한 탐색을 위해 최적화된 마우스 배아 줄기 세포 기반 역 Poly-transfection 기술

배우세요 펩티드-폴록사민 나노입자를 이용한 mRNA 형질감염 기술로 인간 기관지 상피 세포에서 효율적인 유전자 전달을 수행하는 방법. 이 기술은 점막 백신 개발과 폐 질환 치료 연구에 활용됩니다.

펩티드-폴록사민 나노입자를 사용하여 배양된 세포에서 시험관내 트랜스크립션된 mRNA의 효율적인 형질감염

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