Name: 온테더 설포늄 중심을 사용한 순환 펩타이드 구성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: 배우세요 온테더 설포늄 중심을 활용한 순환 펩타이드 합성 방법으로, 시스테인과 메티오닌의 비스알킬레이션 및 티올-알킨 반응을 통해 효율적으로 펩타이드를 고정화하는 기술입니다.

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우리는 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2021YFC2103900)의 재정 지원을 인정합니다. 중국 자연 과학 재단 보조금 (21778009 및 21977010); 광동성 자연 과학 재단(2022A1515010996 및 2020A1515010521): 선전 과학 기술 혁신 위원회, (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 및 JCYJ20200109140406047); 및 심천-홍콩 뇌 과학 연구소-심천 기초 연구 기관 보조금(2019SHIBS0004). 저자는 화학 과학, 왕립 화학 학회 (Royal Society of Chemistry)의 참고 문헌 30 및 유기 화학 저널 (The Journal of Organic Chemistry, American Chemical Society)의 참고 문헌 31을 인정합니다.

1. 장비 준비
주의 : 모르폴린, N, N- 디메틸 포름 아미드 (DMF), 디클로로 메탄 (DCM), N, N- 디 이소 프로필 에틸 아민 (DIPEA), TFA, 모르 폴린, 피 페리 딘, 디 에틸 에테르 및 메탄올은 독성, 휘발성 및 부식성이 있습니다. 이러한 시약은 흡입, 섭취 또는 피부 접촉을 통해 인체에 해를 끼칠 수 있습니다. 모든 화학 실험에는 일회용 장갑, 실험 코트 및 보호 안경을 포함한 보호 장비를 사용하십시오.
<ol><li>그림 1과 같이 표준 수동 Fmoc 기반 고체상 펩타이드 합성(SPPS)29로 링크-아미드 4-메틸벤즈하이드릴아민(MBHA) 수지에 모든 펩타이드 기질을 구성합니다.</li>
	<li>선형 펩타이드를 구성하기위한 두 가지 옵션 중 하나를 사용하십시오 : 하나, 축합제 2- (7- 아자 벤조 트리아 졸 -1- 일) -N, N, N', N'- 테트라 메틸 우로 늄 헥사 플루오로 포스페이트 (HATU) 및 DIPEA 시약을 사용하여 펩타이드를 합성합니다. 또는 2, 아미드 축합 시약으로 1- 하이드 록시 벤조 트리 아졸 (HOBT) 및 N, N'- 디 이소 프로필 카르 보디 이미드 (DIC)를 사용하여 합성합니다. 펩티드의 서열에 따라 펩티드 합성을 위한 적절한 프로토콜을 선택한다.</li>
	<li>수동 펩타이드 합성 장치를 설정하려면 흄 후드에 수정 된 진공 고체상 추출 장비를 설치하고 3 방향 스톱 콕과 연결하십시오. 그런 다음 질소 (N2) 가스에 연결된 상태에서 장비에 폴리 프로필렌 필터 카트리지 또는 유리 반응기를 놓습니다. 알림: 진공 고체상 추출 장비를 수정하려면 추출 튜브를 제거하고 진공 밀봉 시스템을 유지하십시오.</li>
	<li>MBHA 수지를 수지로 채워진 컬럼에 넣고 DMF에 용해시킵니다. N2 버블 링을위한 3 방향 스톱 콕의 스위치를 조정 한 다음 진공 시스템에 연결된 작동 펌프를 사용하여 컬럼의 용매를 제거하십시오. 다음 공식을 사용하여 필요한 아미노산 또는 응축제의 양을 계산하십시오. 아미노산 (g) 및 응축제 (g) = 수지 규모 (g) × 수지 로딩 용량 (mM / g) × 당량 (5 당량) × 분자량 (g / M) 참고: 커플링 펩타이드의 길이에 따라 로드된 수지의 양을 선택하십시오. 아미노산의 다중 당량(eq)은 보다 완전히 반응하는 데 사용됩니다. 액체 용매는 밀도에 따라 부피로 변환되어야 합니다. 5 eq는 계산된 화합물의 투입량이 5배로 증폭되었음을 나타낸다.</li>
</ol>2. 수지 준비
참고: 커플링 펩타이드의 길이에 따라 로드된 수지의 양을 선택하십시오.
<ol><li>302mg의 링크-아미드 MBHA 수지(0.331mM/g 로딩)를 컬럼(20mL 저장소)에 칭량합니다. 5-10mL의 DCM 또는 DMF를 컬럼에 추가하여N2 버블링 하에서 수지를 30분 동안 팽창시킵니다.</li>
	<li>그런 다음 N2 스위치를 닫은 다음 진공 펌프 흡입 스위치를 켜서 용매를 제거합니다. 이어서, 수지를 DCM (5-10 mL) 및 DMF (5-10 mL) 5x로 순차적으로 세척한다.</li>
</ol>3. N 단자 Fmoc 탈보호
알림: 모르폴린에 의한 탈보호는 30분이 필요하고 피페리딘에 의한 탈보호는 5분이 걸립니다.
<ol><li>N- 말단 9- 플루 오레 닐 메틸 옥시 카르 보닐 (Fmoc) 탈보호 용액 준비 : Fmoc 그룹 탈보호를 위해 유리 용기에 DMF에 20 % (v / v) 피 페리 딘 또는 50 % (v / v) 모르 폴린의 충분한 부피 (500mL)를 준비하십시오.</li>
	<li>10mL의 탈보호 용액을 컬럼에 첨가하고, 용액에N2 를 30분 또는 5분 동안 2x 버블링하고, 탈보호 절차를 2x 반복한다.</li>
	<li>진공 펌프로 용액을 배출하고 DCM (5-10 mL) 및 DMF (5-10 mL) 5x로 수지를 순차적으로 세척합니다.</li>
	<li>커플링 단계 전에 Fmoc 그룹의 부재를 확인하기 위해 매 탈보호 후에 5% 닌히드린(Kaiser test)에 의해 수지를 5% 짙은 황색 용액으로 검출한다. 구체적으로는 소량의 수지에 DMF 1mL를 넣고 130°C에서 3분간 가열한 유리관에 5% 닌히드린 200μL를 넣어 수지 색상의 변화를 평가한다.</li>
	<li>진공 펌프로 용액을 배출하고 DCM (5-10 mL) 및 DMF (5-10 mL) 5x로 수지를 순차적으로 세척합니다.</li>
</ol>4. 선형 펩타이드 결합(그림 2)
참고: 합성 펩타이드 서열에 두 개 이상의 반복 단위가 포함된 경우 Fmoc-AA-OH 또는 Fmoc-AAA-OH 등과 같은 아미노산 유형을 선택하여 결합 절차를 직접 수행할 수 있습니다. 입체 장애가있는 일부 특수 아미노산과 더 긴 아미노산 서열을 가진 펩타이드는 커플 링을위한 반응 시간을 적절하게 연장하는 데 필요합니다.
<ol><li>단일 커플링 단계의 경우 Cys 잔기의 커플링을 예로 들어 보겠습니다(300mg 수지 스케일 합성). 폴리프로필렌 튜브에 Fmoc-Cys(Trt)-OH(5당량, 292mg)와 HATU(5당량, 206mg) 또는 Fmoc-Cys(Trt)-OH(5당량, 292mg) 및 HOBT(5당량, 106mg)를 포함하는 혼합용액을 제조하고 DMF 3mL에 녹인다.</li>
	<li>173 μL의 DIPEA (10 당량) 또는 154 μL의 DIC (10 당량)를 Cys 용액에 첨가하여 아미노산을 활성화시킨다. 혼합물을 1분 동안 미리 활성화시킵니다. 혼합물을 수지가 있는 컬럼에 넣고N2 로 2시간 동안 거품을 냅니다. 참고: 필요한 특정 반응 시간은 5% 닌히드린을 검출하기 위해 표준화되어야 합니다.</li>
	<li>커플링 후 소량의 수지에 DMF 1mL를 넣고 130°C에서 3분간 가열된 유리관에 5% 닌히드린 200μL를 첨가합니다. 탈보호 단계 전에 유리 아미노기가 없음을 확인하기 위해 수지가 무색으로 변하는 것을 관찰한다.</li>
	<li>진공 펌프를 사용하여 용액을 배출하고 DCM (5-10 mL) 및 DMF (5-10 mL) 5x로 수지를 순차적으로 세척합니다.</li>
	<li>10mL의 탈보호 용액을 컬럼에 추가하고, 30분 또는 5분 동안N2 로 버블링하고, 2배 동안 새로운 용액을 첨가하고, 탈보호 절차를 2배 반복합니다.</li>
	<li>다음 단계를 반복하십시오 : Fmoc 그룹의 보호 해제; 수지 탈보호 검출; 수지 세척; 아미노산을 커플링하는 단계; 결합 반응을 감지합니다. 모든 펩티드가 합성될 때까지 커플링 단계를 반복한다. 알림: Kaiser 테스트를 사용하여 모든 보호 해제 단계가 완료되었는지 또는 아미노산 결합의 각 단계가 철저한지 모니터링하십시오. 또는 소량의 펩타이드를 수지에서 절단하고 성공적인 커플링을 위해 LC-MS로 확인할 수 있습니다.</li>
</ol>5. Met와 Cys 사이의 비스알킬화(그림 3)
<ol><li>단계 4.1-4.6을 반복하여 Met 및 Cys로 선형 펩티드를 구축한다. 탈수용 수지가 있는 컬럼에 무수 메탄올 10mL를 넣고 선형 펩타이드 커플링 후 다음 사용(2x 반복)을 위해N2 로 건조합니다.</li>
	<li>이전 단계에서 얻은 수지 100mg을 컬럼(20mL 저장소)에 넣고 커플링 단계 전에 DCM(5-10mL) 및 DMF(5-10mL)로 수지를 세척합니다.</li>
	<li>Cys trt(trityl) 보호기를 제거하기 위한 용액을 준비한다. 보호 그룹을 제거하기 위해 유리 용기에 충분한 부피(100mL)의 TFA/TIS/DCM(3:5:92) 혼합물을 준비합니다.</li>
	<li>TFA/TIS/DCM(3:5:92) 용액 5-10mL를 컬럼에 추가하여 10분 동안 보호 그룹을 제거합니다. 노란색이 완전히 사라질 때까지 N2 버블 링으로 6 번 반복하십시오.</li>
	<li>진공 펌프로 용액을 배출하고 DCM (5-10 mL) 및 DMF (5-10 mL) 5x로 수지를 순차적으로 세척합니다.</li>
	<li>보호 해제 된 Cys와 반응하기위한 솔루션을 준비하십시오. 탈보호된 Cys와 반응하기에 충분한 부피의 혼합물 용액(DMF)을 디할로겐화 링커(2당량) 및 DIPEA(4당량)를 포함한다.</li>
	<li>5-10mL의 반응 용액을 컬럼에 추가하여 N2 버블 링으로 최소 3 시간 동안 탈보호 된 Cys와 반응시킵니다. 무수 메탄올로 탈수하고 다음 사용을 위해 N2 로 건조시킵니다.</li>
	<li>진공 펌프로 용액을 배출하고 DCM (5-10 mL) 및 DMF (5-10 mL) 5x로 수지를 순차적으로 세척합니다.</li>
	<li>펩티드 고리화를 위한 용액 준비: 펩티드 고리화를 위해 흄 후드의 유리 용기에 충분한 부피(20mL)의 TFA 혼합물(TFA:TIS:H2O= 95:2.5:2.5)을 준비합니다.</li>
	<li>5-10mL의 TFA 혼합 용액을 폴리프로필렌 튜브에 넣고 TFA 칵테일 아래에서 수지를 3시간 동안 절단합니다. 주의 : TFA는 부식성이 높고 자극적입니다. 펩타이드 절단 공정은 흄 후드에서 수행되어야합니다.</li>
	<li>단계 7.1 내지 7.5를 수행하여 역상 액상 정제(HPLC)에 의해 선형 펩티드 용액을 수득한다. 다음 사용을 위해 용액을 동결 건조하십시오.</li>
</ol>6. 프로파길 설포늄염 고리화(그림 4)
<ol><li>단계 4.1-4.6을 반복하여 Met 및 Cys로 선형 펩티드를 구축한다. 탈수용 수지가 있는 컬럼에 무수 메탄올 10mL를 넣고 선형 펩타이드 커플링 후 다음 사용(2회 반복)을 위해N2 로 건조시킨다.</li>
	<li>이전 단계에서 얻은 수지 100mg을 컬럼(20mL 저장소)에 넣고 커플링 단계 전에 DCM(5-10mL) 및 DMF(5-10mL)로 수지를 세척합니다.</li>
	<li>단계 7.1 내지 7.5를 수행하여 HPLC에 의해 선형 펩티드 용액을 수득하고, 다음 사용을 위해 언급된 바와 같이 샘플을 동결건조시킨다.</li>
	<li>1% HCOOH 수용액(부피) 및 1.0mM 프로파르길 브로마이드(5당량)를 준비하고 Met 펩티드 용액(0.2mM, 1당량; 0.2mL의 MeCN/H2O[1:1, v/v])을 첨가한다.</li>
	<li>다음에, Met와 프로파길 브로마이드의 커플링 반응을 실온에서 12시간 동안 흔들어 준다.</li>
	<li>반응 후, 생성물을 아세토니트릴의 폴리프로필렌 튜브에 녹이고 0.22 μm필터 멤브레인을 통해 여과한다. 그런 다음 즉시 역상 HPLC로 용액을 정제하고 다음 사용을 위해 분말로 동결 건조하십시오.</li>
	<li>마지막 단계에서, 프로파길 브로마이드가 포함된 펩티드를 폴리프로필렌 튜브에 첨가하고, (NH4)2CO3용액을 첨가하여 반응 용액 pH를 8.0으로 유지하고, 반응 혼합물을 37°C에서 12시간 동안 진탕한다. 이 단계는 프로파길 설포늄 염의 고리형 펩티드를 얻는다.</li>
	<li>마지막 반응 혼합물을 수집하십시오 : 아세토 니트릴의 폴리 프로필렌 튜브에 녹이고 0.22 μm 필터 멤브레인을 통해 여과하십시오. 그런 다음 즉시 역상 HPLC로 용액을 정제하고 다음 사용을 위해 분말로 동결 건조하십시오.</li>
</ol>7. 고리형 펩타이드의 정제
<ol><li>4.1-4.6단계를 반복하여 링크-아미드 MBHA 수지 상에 선형 펩타이드 기질을 구축한다. 탈수용 수지가 있는 컬럼에 무수 메탄올 10mL를 넣고 선형 펩타이드 커플링 후 다음 사용(2회 반복)을 위해N2 로 건조합니다.</li>
	<li>흄 후드에 충분한 양의 절단 칵테일(TFA/H 2 O/TIS, v/v/v, 95:2.5:2.5)을 준비합니다. 1-5mL의 TFA 혼합 용액을 폴리프로필렌 튜브에 넣고 TFA 칵테일 아래에서 수지를 3시간 동안 절단합니다.</li>
	<li>다음으로, 수지를 컬럼 내의N2 의 증기 하에서 순차적으로 건조시킨다. 또는 필터 장치를 사용하여 수지를 여과하고 펩타이드 용액을 수집하십시오. 그런 다음 펩티드 용액에 에테르 20mL를 첨가하여 펩티드를 침전시키고 3,500 x g에서 5분 동안 원심분리한 후 두 번 반복합니다. 조 펩티드 침전물을 수집하고 다음 단계를 위해N2 의 스트림 하에서 건조시킨다.</li>
	<li>폴리프로필렌 튜브에 있는 미정제 펩타이드 200mg을 아세토니트릴-물 용액 4mL에 녹이고 0.22μm 필터로 여과합니다. 펩타이드를 HPLC 바이알 삽입물로 옮깁니다. C18 5μm, 4.6mm x 250mm 컬럼 및 1mL 주입 루프가 장착된 반분취용 역상 HPLC 시스템의 자동 시료 주입기에 삽입물을 놓습니다.</li>
	<li>254nm에서 UV를 사용하여 HPLC 스펙트럼을 모니터링하면서 30 분 동안 0.1 % TFA로 물에서 5 % -95 % 아세토 니트릴의 그래디언트 프로그램을 사용하여 펩타이드를 정제하고 분리합니다. LC-MS로 펩타이드 분자량을 확인하고 펩타이드 용액을 모아 동결건조하여 다음 사용을 위해 분말로 만듭니다.</li>
</ol>

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이 논문에 기술된 합성 접근법은 펩티드 서열에서 Cys 및 Met를 사용하여 고리형 펩티드를 합성하는 방법을 제공하며, 여기서 기본 선형 펩티드는 일반적인 고체상 펩티드 합성 기술에 의해 구축된다. Cys와 Met 사이의 사이클릭 펩타이드의 비스알킬화를 위해, 전체 합성 경로는 세 가지 주요 공정으로 나눌 수 있다: 수지 상의 Cys의 탈보호, 링커의 커플링, 및 트리플루오로아세트산 절단 용액에서의 Cys와 Met 사이의 고리화. 특히, Cys의 보호기의 제거는 후속 폐환 반응에 중요한 단계인 것으로 밝혀졌다. 따라서 trt-Cys는 탈보호되었으며 용액에 명백한 노란색이 없을 때까지 수행되었습니다. 추가 연구에 따르면 Cys와 Met 방법론 간의 비스알킬화에 의해 개발된 고리형 펩타이드는 펩타이드가 아미노산 Cys 및 Met를 포함하는 조건으로 다양한 펩타이드에서 루프 클로저로 확장될 수 있습니다. 또한, 펩티드 서열 및 링커도 실험 설계에 따라 추가로 조정될 수 있었다(도 5</strong...

단백질-단백질 상호작용(PPI)1은 약물 연구 및 개발에서 중추적인 역할을 합니다. 화학적 수단에 의해 고정된 형태를 갖는 안정화된 펩티드를 구축하는 것은 PPIs2의 모방 모티프를 개발하기 위한 가장 중요한 방법 중 하나이다. 현재까지 PPI를 표적으로 하는 여러 고리형 펩타이드가 임상용으로 개발되었습니다3. 대부분의 펩타이드는 구조적 엔트로피를 감소시키고 대사 안정성, 표적 결합 친화도 및 세포 투과성 4,5를 개선하기 위해 α 나선 형태로 제한됩니다. 지난 2 년 동안 Cys 6,7, 라이신8,9, 트립토판 10, 아르기닌 11 및 Met12,13의 측쇄가 비천연 아미노산에 삽입되어 펩타이드를 순환 형태로 고정했습니다. 이러한 고리형 펩티드는 독특한 화학적 공간 또는 특수 부위를 표적화할 수 있고, 이에 따라 공유 반응을 촉발하여 단백질-펩티드 공유 결합14,15,16,17을 형성할 수 있다. Yu et al.의 최근 보고서에서, 클로로아세트아미드는 펩티드 리간드의 도메인에 고정되어 우수한 단백질 특이성을 갖는 공유 접합 반응을 보장하였다18. 더욱이, 아크릴아미드 및 아릴 설포닐 플루오라이드 (ArSO2F)와 같은 친전자성 탄두를 Walensky et al.19에 의해 펩티드에 추가로 통합하여 안정화된 펩티드 공유 억제제를 형성하고 펩티드 억제제의 항종양 효과를 개선하였다. 따라서, 단백질-펩타이드 리간드(20)를 공유적으로 변형시키기 위해 추가적인 작용기를 도입하는 것이 매우 중요하다. 이들 그룹은 측쇄 상의 단백질과 반응할 뿐만 아니라 펩티드(21)의 2차 구조를 안정화시킨다. 그러나, 펩티드 리간드에 의해 유도 된 공유 변형 단백질의 적용은 복잡한 합성 경로 및 화학 그룹22,23의 비특이적 결합으로 인해 제한된다. 따라서, 순환 펩티드의 합성을 위한 효과적인 전략이 시급히 요구된다.
순환 펩타이드 2,24,25,26의 다양한 전략에서 영감을 받은 이 프로토콜은 펩타이드를 안정화하기 위한 간단하고 효율적인 방법을 개발하려고 시도합니다. 또한, 안정한 펩타이드의 측쇄기가 펩타이드 리간드에 공간적으로 가까울 때 표적 단백질과 공유 결합 반응 할 수 있음을 주목했다. 화학적으로 변형 된 Met의 부족은 선택적으로 변형 된 펩티드 메티오닌27을 생산하기위한 새로운 방법을 개발함으로써 2013 년 Deming 그룹에 의해 채워졌습니다. 이러한 배경을 바탕으로 Shi 등은 술포늄 염 중심을 형성하기 위해 측쇄의 고리 폐쇄 개발에 중점을 두었습니다. 펩타이드 리간드가 표적 단백질과 결합하면 술포늄 염 그룹은 공간적으로 가까운 Cys 단백질과 공유 적으로 반응합니다. 최근에, Shi 등은 고리형 펩티드28을 안정화시키기 위한 새로운 방법을 설계하였다. 고리형 펩티드 상의 술포늄염은 Met로 가역적으로 환원된 술프하이드릴 기를 갖는 환원제에 의해 환원되었다. 그러나, 반응은 효율이 낮았으며, 이는 후속 생물학적 응용 연구에 해롭다. 현재 연구에서, Met-Cys 및 프로파길 브로마이드-Cys 고리-폐쇄 반응이 설계되었으며, 고리형 펩티드의 측쇄에 단일 설포늄 염이 남아 있습니다. 술포늄염은 공간적 근접성 하에서 단백질 Cys와 공유 적으로 반응하는 새로운 탄두로 작용했습니다. 간략하게, Cys 및 Met 돌연변이 펩티드는 분자내 알킬화에 의해 고리화되어, 온-테더 설포늄 중심의 생성을 초래하였다. 이 과정에서 측쇄 브리지의 형성은 고리형 펩타이드에 매우 중요했습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 간단한 반응 조건 및 조작을 사용하여 달성되는 상세한 술포늄 기반 펩타이드 고리화를 설명합니다. 목표는 더 광범위한 생물학적 응용을위한 잠재적 인 방법을 개발하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>1,3-bis(bromomethyl)-benzen</td><td>Energy</td><td>D0215</td><td></td></tr><tr><td>1,3-Dimethylbarbituric acid</td><td>Energy</td><td>A46873</td><td></td></tr><tr><td>1H NMR 및 HSQC</td><td>Bruker</td><td>&nbsp; AVANCE-III 400</td><td></td></tr><tr><td>1-하이드록시벤조트리아졸 수화물</td><td>에너지</td><td>E020543</td><td></td></tr><tr><td>2-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU)</td><td>에너지</td><td>A1797</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토피리딘</td><td>에너지</td><td>Y31130</td><td></td></tr><tr><td>6-아미노카프로산</td><td>에너지</td><td>A010678</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 무수물</td><td>에너지</td><td>A01021454</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 카보네이</td>트 <td>Energy</td><td>12980</td><td></td></tr><tr><td>디클로로메탄 (DCM)</td><td>에너지</td><td>W330229</td><td></td></tr><tr><td>디지털 난방 냉각 드라이 배</td><td>스&nbsp; Thermo Scientific</td><td>88880029</td><td></td></tr><tr><td>Diisopropylethylamine (DIPEA)</td> <td>에너지</td><td>W320014</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl formamide (DMF)</td> <td>B020051</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Energy</td><td>A10027</td><td></td></tr><tr><td>Electrospray Ionization Mass</td><td>SHIMADZU2020</td><td>&nbsp; LC-MS2020</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ala-OH</td><td>난징 펩타이드 생명공학 주식 회사</td><td>R30101</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td><td>난징 펩타이드 생명공학 주식 회사</td><td>R30201</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>난징 펩타이드 생명공학 주식 회사</td><td>R30501</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Gln(Trt)-OH</td><td>난징 펩타이드 생명 공학 주식 회사</td><td>R30601</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Glu(OtBu)-OH</td><td>난징 펩타이드 생명 공학 주식 회사</td><td>R30701</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-His(Boc)-OH</td><td>난징 펩타이드 생명공학 주식 회사</td><td>R30902</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ile-OH</td><td>난징 펩타이드 생명공학 주식 회사</td><td>R31001</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>난징 펩타이드 생명공학 주식 회사</td><td>R31201</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Met-OH</td><td>난징 펩타이드 생명공학 주식 회사</td><td>R31301</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Pro-OH</td><td>난징 펩타이드 생명공학 주식 회사</td><td>R31501</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ser(tBu)-OH</td><td>난징 펩타이드 생명공학 주식 회사</td><td>R31601</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Thr(tBu)-OH</td><td>난징 펩타이드 생명공학 주식 회사</td><td>R31701</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Trp (Boc)-OH</td><td>난징 펩타이드 생명 공학 주식 회사</td><td>R31801</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Tyr(tBu)-OH</td><td>난징 펩타이드 생명 공학 주식 회사</td><td>R31901</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Val-OH</td><td>난징 펩타이드 생명 공학 주식 회사</td><td>R32001</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>에너지</td><td>W810042</td><td></td></tr><tr><td>고성능 액체 크로마토그래</td>피 <td>SHIMADZU</td><td>LC-2030</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>알드리치</td><td>9758</td><td></td></tr><tr><td>모르폴린</td><td>알드리치</td><td>M109062</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-디이소프로필카르보디이미드</td><td>에너지</td><td>B010023</td><td></td></tr><tr><td>닌히드린 시약</td><td>에너지</td><td>N7285</td><td></td></tr><tr><td>프로파르길 브로마이드</td><td>에너지</td><td>W320293</td><td></td></tr><tr><td>링크 아미드 MBHA 수지</td><td>난징 펩타이드 생명공학 주식 회사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>고체상 추출(SPE) 샘플 수집 플레이트&</td><td>nbsp; Thermo Scientific</td><td>60300-403</td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis (triphenylphosphine) 팔라듐</td><td>에너지</td><td>T1350</td><td></td></tr><tr><td>3 방향 마개</td><td>Bio-Rad</td><td>7328107</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Energy</td><td>B010737</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td> <td>J & K</td><td>101398</td><td></td></tr><tr><td>트리이소프로필실란(TIS)</td><td>에너지</td><td>T1533</td><td></td></tr></tbody></table>

온테더 설포늄 중심을 사용한 순환 펩타이드 구성

Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center

최근 몇 년 동안 고리형 펩타이드는 우수한 생물학적 활성으로 인해 약물 발견 분야에서 점점 더 많은 관심을 끌고 있으며 그 결과 현재 임상적으로 사용되고 있습니다. 따라서 약물 발견 분야에서의 적용을 촉진하기 위해 순환 펩타이드를 합성하기 위한 효과적인 전략을 찾는 것이 중요합니다. 이 논문은 온레진 또는 분자내(분자간) 비스알킬화를 사용하여 고리형 펩타이드의 효율적인 합성을 위한 자세한 프로토콜을 보고합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 선형 펩티드는 수지에 동시에 결합 된 시스테인 (Cys) 및 메티오닌 (Met)과의 고체상 펩티드 합성을 이용하여 합성되었다. 또한, 환형 펩티드는 조정 가능한 테더 및 온테더 설포늄 센터를 사용하여 Met와 Cys 사이의 비스알킬화를 통해 합성되었습니다. 전체 합성 경로는 세 가지 주요 공정으로 나눌 수 있습니다 : 수지에 대한 Cys의 탈보호, 링커의 커플 링, 트리 플루오로 아세트산 (TFA) 절단 용액에서 Cys와 Met 간의 고리 화. 또한, 설포늄 중심의 반응성에서 영감을 받아 프로파길 그룹을 Met에 부착하여 티올-인 첨가를 유발하고 고리형 펩타이드를 형성했습니다. 그 후, 조 펩티드를 건조 및 아세토니트릴에 용해시키고, 분리한 다음, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다. 고리형 펩타이드의 분자량은 액체크로마토그래피-질량분석법(LC-MS)으로 확인하였고, 고리형 펩타이드와 환원제의 결합의 안정성은 HPLC를 이용하여 추가로 확인하였다. 또한, 고리형 펩타이드의 화학적 이동을 1H 핵자기 공명(1HNMR) 스펙트럼으로 분석하였다. 전반적으로, 이 프로토콜은 고리형 펩타이드를 합성하기 위한 효과적인 전략을 수립하는 것을 목표로 했습니다.

모든 선형 펩티드는 표준 수동 Fmoc 고체상 합성에 의해 링크아미드 MBHA 수지 상에서 합성하였다. 모델 사이클릭 헥사펩타이드 (Ac(cyclo-I)-WMAAAC-NH2)를 도 5A에 기재된 바와 같이 구축하였다. 특히, 새로운 온테더 키랄 중심이 Met 알킬화에 의해 생성되었으며, 고리형 펩타이드(Ia, Ib)의 두 에피머가 역상 HPLC에 의해 확인되었습니다. 또한, 에피머의 전환 및 비율은 역상 HPLC의 적분을 이용하여 결정하였다. 헥사펩타이드 Ac-WMAAAC-NH2로부터 생성된 고리형 Ac-(씨클로-I)-WMAAAC-NH2 펩티드 1-Ia 및 1-Ib는 뚜렷한 머무름 시간 및 동일한 분자량을 나타내었다(도 5B). 다음으로, 상이한 작용기에 대한 고리형 펩티드의 내성을 도 5C에 나타낸 바와 같이 ...

이 프로토콜은 시스테인과 메티오닌 사이의 비스알킬화와 프로파길 설포늄 중심에 의해 유발되는 용이한 티올-인 반응을 통한 고리형 펩타이드의 합성을 제시합니다.

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as ...

이 프로토콜에서, 술 포늄 염은 특별한 근접성에서 단백질 시스테인과 반응하는 새로운 손으로 작용할 수있는 것으로 구성되었다. 이 기술의 장점은 이 반응이 빠르고 효율적이며 Met-촉매가 없고 펩티드를 안정화시키는 간단하고 효율적인 방법을 개발했다는 것입니다. 시작하려면 500 밀리리터 비커 또는 플라스크에서 20 % 피 페리 딘 또는 50 % 모르 폴린 및 DMF의 N- 말단 9- 플루 오리 닐-메틸 옥시 카르 보닐 탈보호 용액을 준비하십시오.그런 다음 10 밀리리터의 탈보호 용액을 컬럼에 첨가하고 질소를 버블링하여 용액에 30 분 동안 또는 5 분 동안 두 번 첨가합니다. 진공 펌프로 용액을 배출하고 디클로로메탄과 N,N-디메틸포름아미드로 5회 순차적으로 수지를 세척한다. 수지를 짙은 황색 용액으로 감지하려면 소량의 수지에 1 밀리리터의 N, N- 디메틸 포름 아미드를 첨가하고 유리관에 200 마이크로 리터의 5 % 닌히 드린을 첨가하십시오.수지 색상의 변화를 평가하기 위해 섭씨 130도에서 3분 동안 가열합니다. 펩티드의 커플 링을 위해, 폴리 프로필렌 튜브에 원고에 설명 된대로 혼합 용액을 준비하고 3 밀리리터의 N, N- 디메틸 포름 아미드에 용해시킨다. 이어서, 173 마이크로리터의 N,N-디이소프로필에틸아민 또는 154 마이크로리터의 N,N'디이소프로필카르보디이미드를 용액에 첨가하여 아미노산을 불활성화시킨다.다음으로, 혼합물을 수지와 함께 컬럼에 첨가하고 질소로 2 시간 동안 거품을 낸다. 커플 링 후 소량의 수지에 1 밀리리터의 N, N- 디메틸 포름 아미드를 첨가하고 유리관에 200 마이크로 리터의 5 % 닌히 드린을 첨가합니다. 수지가 무색으로 변하는 동안 섭씨 130도에서 3 분 동안 가열하여 탈보호 단계 전에 유리 아미노기가 없음을 확인합니다.용액을 배출 한 후, 이전에 설명 된대로 수지를 세척하고 10 밀리리터의 탈보호 용액을 컬럼에 첨가한다. 그런 다음 질소로 30 분 동안 거품을 내거나 5 분 동안 두 번 거품을 일으 킵니다. 그리고 다시, 신선한 솔루션을 추가하십시오.탈수 용 수지가있는 컬럼에 무수 메탄올 10 밀리리터를 넣고 다음 사용을 위해 질소로 건조시킵니다. 수지 100 밀리그램의 무게를 컬럼에 넣고 커플 링 단계 전에 디클로로 메탄과 N, N- 디메틸 포름 아미드로 수지를 세척하십시오. 보호기를 제거하기 위한 100밀리리터 비커 또는 플라스크에 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실란 및 디클로로메탄 혼합물을 첨가하여 트리틸-L-시스테인 보호기를 제거하기 위한 용액을 제조한다.준비된 용액 5 내지 10 밀리리터를 컬럼에 첨가하여 10분 동안 보호기를 제거하였다. 노란색이 완전히 사라질 때까지 질소 버블 링으로 6 번 반복하십시오. 진공 펌프로 용액을 배출한 후 앞에서 설명한 대로 수지를 세척합니다.이어서, 50 밀리리터 비커 또는 플라스크에 디 할로겐화 링커 및 N, N- 디 이소 프로필 에틸 아민을 N, N- 디메틸 포름 아미드로 첨가하여 탈 보호 된 시스테인과 반응하기위한 용액을 제조한다. 5 내지 10 밀리리터의 반응 용액을 컬럼에 첨가하여 질소 버블 링으로 적어도 3 시간 동안 보호 된 시스테인과 반응시킨다. 다시 진공 펌프로 용액을 배출하고 앞에서 설명한 대로 수지를 순차적으로 세척합니다.펩티드 고리화 용액을 준비하려면 트리플루오로아세트산 혼합물을 20밀리리터 비커 또는 펩티드 고리화를 위한 흄 후드의 플라스크에 추가합니다. 그런 다음 5-10 밀리리터의 혼합 용액을 폴리 프로필렌 튜브에 넣고 트리플루오로 아세트산 칵테일 아래에서 수지를 3 시간 동안 절단합니다. 커플링 단계가 이전에 입증되기 전에 수지를 탈수 및 세척한 후, 1%포름산 수용액과 1밀리몰 프로파길 브로마이드를 제조하고 메티오닌 펩타이드 용액에 첨가한다.다음으로, 메티오닌과 프로파길 브로마이드의 커플링 반응을 실온에서 12시간 동안 흔들어 준다. 반응 후, 생성물을 폴리 프로필렌 튜브와 아세토 니트릴에 녹이고 0.22 마이크로 미터 필터 멤브레인을 통해 여과한다. 그런 다음 즉시 역상 HPLC로 용액을 정제하고 다음 사용을 위해 분말로 동결 건조합니다.시스테인과 메티오닌 사이의 비스-알킬화를 사용하여 합성된 사이클릭 펩티드는 HPLC 및 LCMS 스펙트럼에 의해 특성화되었으며, 이는 에피머가 뚜렷한 머무름 시간 및 동일한 분자량을 나타냄을 보여준다. 에피머와 그 접합 생성물의 HPLC 트레이스는 고리형 펩타이드와 그 생성물 사이의 시간 의존적 전환을 입증했습니다. 티올-인형 반응을 이용하여 합성된 고리형 펩타이드의 분자량은 LCMS에 의해 결정하고, 펩타이드는 HPLC에 의해 분리 및 정제하였다.펩타이드는 양성자 NMR 및 이종 핵 단일 양자 간섭 스펙트럼에 의해 추가로 특성화되어 화학적 이동을 나타냅니다. 고리형 펩타이드와 디티오트레이톨 및 산화중수소 사이의 시간 의존적 전환의 양성자 NMR 스펙트럼을 얻어 술포늄 고리의 개방에 의한 펩타이드의 안정성을 탐색하였다. 결과는 24시간 후에 첨가 또는 개환 생성물이 형성되지 않았음을 보여주었다.이 절차는 고리 형 펩타이드를 합성하기위한 효과적인 전략을 수립했습니다. 상기 반응은 고리화 펩티드를 안정화시킨다는 것을 형성함으로써 선택성도 향상되었다고 말하며, 이는 고리형 펩티드가 유망한 약물 촉매임을 나타낸다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

HMBA 수지에서 절단 절차를 "안전 잡는 '활용하는 작용 비스 - 펩티드 trimer의 효율적인 고체 상 펩타이드 합성이 설명되어 있습니다.

기능화 비스 - 펩타이드의 고상 합성은 방법론 &quot;을 안전 잡아라&quot;사용

마이크로파 조사를 사용하여 고리형 펩타이드를 합성하는 간단하고 일반적인 방법이 설명되어 있습니다. 이 절차는 곁사슬과 약전 부분을 유지하면서 서로 다른 형태의 집합체를 가진 backbone cyclic peptides의 합성을 가능하게 하며, 따라서 생체 활성 형태를 스크리닝할 수 있습니다.

마이크로 웨이브 조사를 사용하여 잠재적 인 기생충 치료제로 백본 순환 펩타이드 라이브러리 개발

동일한 순서로 양이온 기능이 혼합된 펩토이드를 합성하는 프로토콜이 제시됩니다(라이신 및 아르기닌 유형 단량체). 피부 리슈마니아증을 일으키는 원생동물 기생충인 Leishmania mexicana에 대한 이러한 화합물의 후속 테스트도 설명됩니다.

이들 안티 leishmanial 역가의 혼합 리신 형 / 아르기닌 형 단량체 및 평가를 펩 토이 드의 합성을위한 효과적인 방법

선물이 thioether/비닐의 건설에 대 한 프로토콜 황화 닿는 헬리컬 펩 티 드 사진 유도 thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation를 사용 하 여.

헬리컬 펩 티 드를 통해 사진 유도 Thiol-ene 또는 yne Hydrothiolation Thioether/비닐 황 화물-곁에 건설

Polyamine 기반 펩타이드 amphiphiles (PPAs)의 합성은 이러한 반응 기능 마스크 그룹 보호의 사리 분별이 사용 여러 아민 nitrogens의 존재로 인해 중요 한 도전 이다. 이 문서에서 우리는 자기 조립 분자의 이러한 새로운 클래스의 준비에 대 한 손쉬운 방법을 설명합니다.

Polyamine 기반 펩타이드 Amphiphiles (PPAs) 및 관련된 생체 자기 조립의 합성에 대 한 손쉬운 프로토콜

1, 2-dithiolane의 합성에 대 한 프로토콜 펩 티 드와 펩 티 드에서 자기 조립 결과 supramolecular 구조의 특성 수정.

합성 및 특성 1, 2-Dithiolane의 수정 자가 조립 펩 티 드

시스테인 부유한 펩 티 드 그들의 이황화 연결에 따라 고유한 3 차원 구조로 접어. 개별 이황화가 성체의 타겟된 합성 필요한 때 버퍼 산화 원하는 이황화 연결 리드 하지 않습니다. 프로토콜 선택 합성 펩 티 드 3 이황화 결합 그리고 NMR 및 MS/MS를 사용 하 여 그들의 구조 분석을 다루고 있다.

합성 및 다른 아 황산 연결 된 μ-Conotoxin PIIIA이 성체의 구조 결정

Enantiomerically 농축된 bispiro [γ-butyrolactone-pyrrolidin-4, 4'-pyrazolone] 해골 비대칭으로 간단한 organocatalytic 1, 3 배위 cycloaddition 반응을 통해 합성 됩니다.

Α-Imino γ-Lactones의 Organocatalytic Cycloadditions 및 Alkylidene Pyrazolones 통해 마약 같은 Bispirocyclic 장비의 효율적인 건설

정보 부호화 된 펩토이드 올리고머의 합성과 동적 공유 반응체 쌍 및 루이스 산성 희토류로 아민과 알데히드를 사용하여 분자 사다리로 이러한 펩토이드의 시퀀스 지시자가 조립하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 다중 역할 시약으로 금속 triflates.

정보 베어링 펩토이드의 합성과 시퀀스 지향 동적 공유자 자체 조립

이 프로토콜은 방향족 가교를 갖는 고리형 세포 침투 펩타이드의 합성과 생물학적 장벽을 통한 투과성 평가를 설명합니다.

생물학적 장벽의 침투 강화를 위한 순환 세포 침투 펩타이드의 구성

상업용 마이크로파 반응기에서 고체상 펩타이드 합성을 수행하기 위한 간단하고 저렴하며 새로운 장치가 제시됩니다.

고체상 펩타이드 합성을 위한 상업용 마이크로파 반응기의 저렴한 적응

배우세요 온테더 설포늄 중심을 활용한 순환 펩타이드 합성 방법으로, 시스테인과 메티오닌의 비스알킬레이션 및 티올-알킨 반응을 통해 효율적으로 펩타이드를 고정화하는 기술입니다.

온테더 설포늄 중심을 사용한 순환 펩타이드 구성

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