Plasmodiophora brassicae에 대한 유전자 발현 및 생리적 반응의 변화를 시각화하기 위해 투명화와 형광 현미경을 결합

Plasmodiophora brassicae는 Brassicaceae 계통의 식물을 공격하는 토양 매개 필수 생물 영양 병원체입니다. 감염되면 병원균은 식물의 지하 부분에 담즙의 발달을 유발하므로 질병 뿌리 줄기의 이름입니다. 담즙의 개발에는 매우 복잡한 재 프로그래밍이 수반됩니다.

따라서 질병 중 내부 변화를 추적 할 수있는 가능성은이 식물 병원체 상호 작용을 이해하는 데 중요합니다. 우리의 프로토콜은 복잡하고 두꺼운 담즙의 이미징을 향상시킵니다. 유전자 발현, 생리적 반응, 식물 호르몬 균형, 질병 진행, 포자 분포 및 국소 존화의 변화를 쉽게 시각화합니다.

이 프로토콜은 샘플 내에서 형광 단백질을 보존하여 장기간에 걸쳐 물체를 저장하고 처리할 수 있습니다. 또한 질병 진행에 수반되는 생화학 적 및 구조적 변화를 추적 할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 그룹의 박사후 연구원 인 Sara Blicharz, 우리 실험실의 박사 과정 학생 인 Deeksha Singh, Adam Mickiewicz University의 Agnieszka Bagniewska-Zadworna 교수 그룹의 박사 과정 학생 인 Kornel Michalak입니다.

식물 조직을 준비하는 것으로 시작하십시오. 뿌리 감염 및 감염되지 않은 식물의 뿌리 시스템에서 토양을 조심스럽게 제거하십시오. 물로 철저히 청소하고 배축과 담즙을 미세 원심 분리기 튜브에 모으십시오.

샘플을 200 내지 500 마이크로리터의 파라포름알데히드 고정액에 고정하고 진공 펌프를 사용하여 700 밀리바의 일정한 진공을 인가하여 실온에서 1시간 동안 고정한다. 물체가 파라포름알데히드 용액에 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오. 감염되지 않은 배축과 감염된 담낭을 삽입하려면 4%아가로스를 사용하십시오.

용액을 끓여서 아가 로스를 녹이고 점성이있는 동안 식을 때 붓습니다. 과도한 파라포름알데히드를 제거하기 위해 티슈에서 물체를 몇 초 동안 약간 건조시킵니다. 이쑤시개 또는 집게를 사용하여 식물 물체를 조심스럽게 아가 로스에 넣고 방향을 잡으십시오.

비스듬한 단면을 방지하려면 축이 비브라톰 블레이드의 평면에 수직이 되도록 물체의 방향과 성형이 올바른지 확인하십시오. 아가 로스 응고를 가속화하려면 페트리 또는 다배양 플레이트를 섭씨 4도에서 10 분 동안 놓습니다. 블레이드를 사용하여 아가 로스 블록 내에서 물체를 조심스럽게 자르고 성형하여 절단에 선호되는 방향을 확인합니다.

아가로스 블록 또는 큰 담즙을 붙여서 시아노아크릴레이트 또는 인스턴트 접착제 및 마스킹 테이프를 사용하여 시편 홀더에 적절하게 장착합니다. 단면의 두께, 속도 및 진동 진폭을 갤의 두께와 크기에 따라 조정합니다. 수조에 증류수를 넣고 절편을 시작하십시오.

집게나 브러시를 사용하여 섹션을 조심스럽게 수집하고 1X PBS 버퍼 1밀리리터가 포함된 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 마이크로 원심분리 튜브에서 1X PBS를 제거하고 200 내지 500 마이크로리터의 투명화 용액을 첨가한다. 샘플 처리 중 일정 시간 후에 색상이 변하는 경우 투명화 용액을 새 용액으로 교체하십시오.

클리어링 용액에 5%의 칼코플루오르-화이트 염색을 준비하여 외출 식물 세포의 세포벽에 대해 칼코플루오르-화이트 염색을 수행합니다. 그런 다음 적어도 5 분 동안 어둠 속에서 세포를 염색하십시오. 텍스트 원고에 설명된 대로 나일 레드로 지질을 염색하고 기본 Fuchsin 리그닌 염색으로 리그닌을 염색하고 현미경 슬라이드에 깨끗한 부분을 장착합니다.

그런 다음 에피형광 또는 컨포칼 현미경으로 세포를 관찰합니다. 여러 획득 모드를 사용하여 둘 이상의 형광 스펙트럼을 동시에 이미징할 수 있습니다. 질병 역학 및 병원체 축적은 Plasmodiophora brassicae에 의해 식민지화 된 담즙에서 추적되었으며, 나일 적색 염색 후 P.brassicae 휴지 포자가있는 큰 세포가 관찰되었습니다.

P.brassicae 감염에 따른 목부 분화의 변화는 Basic Fuchsin 염색을 사용하여 시각화하였다. pHCA2 : erRFP 구조를 보유하고있는 애기장대 식물은 클럽 뿌리 담즙 내의 체관 조직에서 HCA2 유전자 발현을 시각화하는 데 활용되었습니다. HCA2는 P.brassicae 구동 담즙 발달의 후기 단계에서 체관부와 공동 국소화되었으며 유전자 활성은 P.brassicae가 체관부 복잡성을 증가시키는 메커니즘을 반영했습니다.

접종 후 16일째에 개발 담즙에서 TCS:GFP 마커의 발현을 확인하여 감염된 식물과 감염되지 않은 식물 간의 차별적인 사이토키닌 반응을 평가했습니다. 사이토 키닌 반응은 감염된 담즙에서 현저하게 감소한 것으로 보이며, 특히 체관 풀에서는 감염되지 않은 식물에서 강하게 유지되었습니다. 가장 중요한 단계는 PFA 고정, 임베딩 및 단면화입니다.

비브라톰 단면화의 경우 속도, 진폭 및 두께 매개변수를 최적화하고 신중하게 조정하여 양질의 단면을 얻어야 합니다. 비브라톰 절편 및 조직 제거 기술은 식물-미생물 상호 작용 및 복잡한 세포 해부학으로 2차 성장을 나타내는 조직 동안 생리적 반응에 대한 현미경 분석을 향상시키는 길을 열었습니다.