Name: 초파리 마이크로바이옴에 적용된 96웰 플레이트 형식의 빠른 콜로니 형성 단위 계수 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 배우세요 96웰 플레이트 형식의 빠른 콜로니 형성 단위 계수법을 Drosophila 초파리 장내 마이크로바이옴 분석에 적용하는 방법입니다. 자동화된 이미지 분석 소프트웨어와 DIY 장비를 활용하여 기존 방법 대비 100배 빠른 효율성을 제공합니다.

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Kerwyn Casey Huang 박사, Andrés Aranda-Díaz 박사, Ted Cooper 및 Ludington 연구소 구성원은이 프로토콜의 개발에 귀중한 정보를 제공했습니다. 자금은 NSF IOS 보조금 2032985, NIH 보조금 DP5OD017851, 캐나다 카네기 연구소 보조금 및 카네기 과학 연구소 기부금에서 제공했습니다.

1. 비행 식민지화
참고: 이 방법은 CFU의 성장 도금에 의한 배양 가능한 장내 마이크로바이옴이 있는 파리의 정량 분석에 적합합니다. gnotobiotic 파리를 사육하기위한 자세한 프로토콜은 이전에 발표되었습니다12.
<ol><li>공생 박테리아 종에 의한 안정적인 식민지화를 확립합니다.<ol><li>새로운 박테리아 배양물을 준비하고, 실온에서 3분 동안 400 x g에서 원심분리하여 펠릿을 만들고, 세포 펠렛을 PBS 중에 1.0의 OD600으로 재현탁시킨다. 이 프로토콜을 위해, 락티플란티바실러스 플란타룸(이전에는 락토바실러스 플란타룸으로 알려짐)을 하룻밤 사이에 OD600 2.0으로 성장시켰다. </li>
		<li>플라이 바이알의 음식에 100 μL를 피펫팅합니다( 재료 표 참조). 고르게 펴 바르고 액체가 15-30 분 동안 흡수되도록하십시오.</li>
		<li>20개의 무균 파리를 표준 바이알 대 바이알 뒤집기 기술34를 사용하여 이 바이알 내로 옮깁니다. 각 파리는 대략 동일한 양의 박테리아 용량35를 먹습니다. 또는 무균 계란을 추가할 수 있습니다.</li>
		<li>파리를 매일 3 일 동안 신선한 멸균 식품으로 옮깁니다. 이 모든 것을 생물안전 캐비닛에서 수행하고 멸균 기술을 사용하십시오(그림 1A-1).</li>
	</ol></li>
	<li>CFU 부하를 측정하기 전에 파리를 멸균 한천 물이 들어있는 바이알로 4 시간 동안 옮겨 장에서 일시적인 박테리아를 제거합니다. 한천 물 바이알은 파리에게 수분 공급원을 제공하지만 파리나 표면의 박테리아에는 영양을 공급하지 않습니다. 그들은 표준 식품과 동일한 멸균 플라이 바이알에서 준비되지만 탈 이온수와 1.5 % 한천 만 포함합니다.</li>
</ol>2. 96웰 PCR 플레이트에서 개별적으로 파리를 균질화
<ol><li>비드 비터 플레이트를 미리 준비하십시오.<ol><li>0.5μm 유리 비드( 재료 표 참조)를 비드 측정 트레이( 보충 코딩 파일 1 S1-bead-measurer.stl의 도움으로 3D 프린팅)에 붓습니다. 모든 우물이 가득 차고 수평이 되도록 트레이에 구슬을 펼친 다음 여분의 구슬을 원추형 튜브에 털어 회수합니다.</li>
		<li>세미 스커트 PCR 플레이트( 재료 표 참조)를 측정 트레이에 거꾸로 놓고 측정 트레이의 움푹 들어간 곳에 끼워 웰과 맞춥니다. 그런 다음 빠르게 뒤집어 구슬을 옮깁니다.</li>
		<li>PCR 플레이트 표면에서 과도한 비드를 제거하고 호일로 덮습니다. PCR 플레이트를 검사하여 모든 웰에 구슬이 포함되어 있는지 확인합니다. 단일 웰에 비드를 추가하기 위해 필요한 경우 계량 스쿱을 사용하십시오. 정전기로 인해 플레이트 표면에 비드가 달라붙는 경우 측정 트레이와 PCR 플레이트 뒷면을 70% 에탄올로 닦거나 스프레이합니다.</li>
		<li>알루미늄 호일로 덮으십시오. 이러한 방식으로 많은 플레이트를 준비한 다음 나중에 사용하기 위해 고압멸균 및 보관할 수 있습니다. 사용할 준비가 되면 96채널 피펫터를 사용하여 각 웰에 100μL의 PBS를 추가합니다( 재료 표 참조).</li>
	</ol></li>
	<li>균질화 전에 미생물 군락화 된 파리 (1 단계 참조)를 70 % 에탄올로 표면 살균하십시오.<ol><li>파리를 100 % CO2로 5 초 동안 마취하십시오. 작은 깔때기를 사용하여 바이알에서 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 마취된 파리를 옮깁니다(그림 1A-2). 이 연구에서는 일반적으로 튜브 당 25 마리의 파리가 추가되었습니다.</li>
		<li>즉시 ~1mL의 70% 에탄올을 튜브에 뿌리고 튜브를 닫고 10초 동안 뒤집어 혼합합니다. 그런 다음 파리를 흡인하지 않도록 주의하면서 P1000 피펫으로 에탄올을 흡입합니다. 에탄올로 다시 한 번 반복 한 다음 멸균 PBS로 두 번 반복합니다 (그림 1A-3).</li>
	</ol></li>
	<li>최종 PBS 세척 후 튜브를 닫고 캡 면이 아래로 향하도록 벤치에서 몇 번 세게 두드려 파리가 캡에 들어가도록 합니다.</li>
	<li>튜브를 열고 집게를 사용하여 우물에 파리를 분배합니다 (그림 1A-4). 각 웰에 파리 한 마리씩 놓습니다(그림 1A-5). 파리를 마취 상태로 유지하기 위해 적재하는 동안 접시를 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	<li>열 결합 열 밀봉 호일을 사용하여 플레이트를 밀봉하십시오( 재료 표 참조).<ol><li>먼저 우물에 가까운 흩어진 구슬은 호일 씰에 누출을 일으킬 수 있으므로 제거하십시오. 호일의 둔한 면이 플레이트에서 아래로 향하고 반짝이는 면이 히트 실러를 향하도록 하십시오. 히트 실러(재료 표 참조)를 5초 동안 단단히 누릅니다(그림 1A-6). 핸드 애플리케이터(재료 표 참조)로 광택을 내어 호일을 고정합니다. 참고: 밀봉 불량은 시료 손실의 원인입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>플레이트 셰이커에 플레이트를 고정합니다. 5 분 동안 균질화합니다 (그림 1A-7). 미니 플레이트 스피너(재료 표 참조)에서 비드 플레이트를 350 x g으로 30초 동안 돌려 밀봉 호일에서 액체를 제거합니다.</li>
	<li>우물에서 파리 균질 물 방울이 튀지 않도록 플레이트를 잡고 호일을 제거하십시오.</li>
</ol>3. CFU 플레이트에 파리 균질액과 스포팅의 연속 희석
<ol><li>4 개의 직사각형 MRS 한천 성장 플레이트 ( 재료 표 참조)를 생물 안전 캐비닛에 놓고 뚜껑을 제거합니다. 이 프로토콜에서 MRS 한천은 L. plantarum의 성장에 사용되었습니다. 이 접시를 최소 10분 동안 건조시키십시오(보관에서 갓 붓거나 차갑게 부은 경우 20분). 알림: 플레이트가 젖 으면 96 웰 플레이트의 물방울이 함께 흐르고 카운트를 망칠 수 있습니다.</li>
	<li>96채널 피펫터를 사용하여 멸균된 96웰 플레이트의 각 웰에 100μL의 PBS를 추가하여 3개의 희석 플레이트를 준비합니다. P20 팁 랙을 96채널 피펫터에 로드합니다.</li>
	<li>섹션 2에서 준비한 샘플 플레이트에서 11.1μL의 균질액을 흡인하여 1:10 희석을 만듭니다(그림 1A-8). 파리 균질액과 유리 구슬이 피펫을 막을 수 있으므로 우물 바닥이 아닌 우물 중앙에서 그려야 합니다. 구슬이 가라 앉고 파리 미립자가 떠 다니며 중간 층은 대부분 투명합니다.</li>
	<li>11.1 μL를 이미 웰당 100 μL의 멸균 PBS가 들어 있는 첫 번째 희석 플레이트에 분주합니다. 희석 플레이트를 플레이트 셰이커에 600rpm에서 10초 동안 유지합니다. 5주기 동안 위아래로 피펫팅하여 다시 혼합합니다. 11.1 μL를 제1 희석 플레이트로부터 제2 희석 플레이트로 옮기고, 다음 2개의 희석 플레이트에 대해 혼합 단계를 반복한다.</li>
	<li>아래 설명된 대로 희석 시리즈 도금을 수행합니다.<ol><li>생물안전 캐비닛에서 성장판을 회수합니다.</li>
		<li>가장 희석된 플레이트부터 시작하여 96웰 피펫터를 사용하여 각 웰에서 한천 플레이트로 2μL를 스폿합니다(그림 1A-9).<ol><li>피펫터 헤드를 플레이트 위로 천천히 내리고 한천에 찌르지 않도록 주의하십시오. 플레이트를 주의 깊게 검사하고 모든 지점이 분배되었는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 적절한 위치에 2μL를 수동으로 추가합니다. 액체 반점이 한천에 빨리 스며 들어 함께 움직이지 않는지 확인하십시오.</li>
			<li>반점이 함께 달리면 새로운 한천 접시 세트를 더 오랜 기간 동안 말리고 얼룩을 다시하십시오. 여러 플레이트 유형(예: 다른 배지 또는 항생제 포함)이 있는 경우 해당 플레이트도 발견하십시오. 남은 용액을 희석 플레이트에 다시 분주하고 다음으로 더 높은 농도로 진행합니다. 알림: 희석액을 발견할 때 다음 희석액을 5회 혼합하여 피펫 팁의 내용물이 이전 희석액에서 제거되도록 합니다. 희석 플레이트는 콜로니 카운트(35)에 영향을 주지 않고 4°C에서 >8 h 저장될 수 있다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>나머지 희석 플레이트에 대해 단계 3.5에 기재된 바와 같이 도금 공정을 반복하고, 플레이트가 원래의 균질액이 될 때까지 가장 희석된 것부터 가장 농축된 것까지 진행한다.</li>
	<li>모든 액체가 한천에 흡수되면 플레이트를 뒤집어 인큐베이터에 넣으십시오 (그림 1A-10). 초파리의 락티플란티바실러스 및 아세토박터의 경우 MRS 배지에서 최적 온도는 30°C입니다. 콜로니가 최적의 크기에 도달 할 때까지 배양하십시오 : 콜로니는 명확하게 볼 수있을만큼 충분히 크지 만 너무 커서 병합되거나 서로의 성장을 방해하지는 않습니다 (최적 크기의 정량화는 대표 결과 참조). 참고: 최적의 성장 조건은 균주에 따라 다르며 경험적으로 결정되어야 합니다. 초파리의 락티플란티바실러스의 경우 최적의 배양 시간은 MRS 한천에서 26시간에서 30시간입니다. 초파리의 아세토 박터의 경우, 배양의 최적 시간은 균주에 따라 MRS에서 30 시간에서 48 시간입니다.</li>
	<li>배양 후, 필요한 경우 계수할 준비가 될 때까지 플레이트를 4°C에서 보관합니다.</li>
</ol>4. CFU의 정량화
<ol><li>아래에 자세히 설명된 대로 플레이트를 촬영한 다음 자동화된 소프트웨어를 사용하여 콜로니를 계산하여 CFU를 정량화합니다. 플레이트를 4°C에서 보관한 경우 먼저 플레이트에 결로가 발생하여 눈부심이 발생하지 않도록 실온에 도달하도록 합니다.</li>
	<li>플레이트를 논리적인 순서로 구성하고 사진을 찍는 동안 순서대로 유지하면 파일 이름을 더 쉽게 지정할 수 있습니다. A1이 모든 플레이트의 왼쪽 상단 모서리에 오도록 모든 플레이트의 방향을 지정합니다. 사진이 섞이지 않도록 A1 모서리에 고유 ID를 표시하는 것이 좋습니다. 각 희석 시리즈를 순서대로 쌓습니다.</li>
	<li>플레이트 뚜껑을 제거하고 A1이 올바른 모서리를 향하도록 플레이트를 스테이지에 놓습니다. 플레이트 사진 상자(보충 파일 1, 보충 파일 2)에 대한 디자인이 포함되어 있으며, 이 상자는 이러한 트레이 플레이트 촬영에 최적화되어 있으며 형광 콜로니를 이미지화하는 조명 및 필터 옵션을 포함합니다.</li>
	<li>접시를 이미지화합니다. 카메라( 재료 표 참조)를 수동 설정으로 사용하여 플레이트 사이에 일관된 노출 수준을 얻으십시오. 원근 왜곡을 최소화하기 위해 긴 초점 거리 설정을 권장합니다. 카메라 흔들림으로 인한 흐림을 최소화하기 위해 원격 셔터를 사용하여 사진을 캡처합니다.</li>
	<li>이미지를 컴퓨터로 전송하고 실험 이름, 배지 유형, 희석 계수 및 기타 관련 세부 정보를 포함하여 이름을 바꿉니다. 일부 운영 체제( 재료 표 참조)에는 Finder에서 선택한 파일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 유용한 일괄 이름 바꾸기 기능이 있습니다.</li>
</ol>5. Count-On-It 제품군을 사용한 자동 식민지 계수 (보충 파일 3)
<ol><li>ImageJ에 제공된 자르기 플러그인(보조 코딩 파일 2)을 사용하여 이미지를 자릅니다. 이 플러그인은 이미지를 하위 영역의 정렬 배열로 나누는 데 도움이됩니다 (예 : 96 웰 플레이트의 경우 8 x 12). 하위 지역은 개별적으로 계산됩니다. 참고 : 서커스라고하는 원형 플레이트를 계산하기위한 별도의 플러그인은 보충 코딩 파일 3 Circus_.ijm에 설명되어 있습니다.<ol><li>정량화를 위해 처리할 이미지를 폴더로 구성합니다. 플레이트를 구별하는 파일 이름을 선택하면 이러한 파일 이름이 각 카운트 집합에 대한 열 제목이 됩니다. 이 폴더 내에서 "잘린" 및 "영수증"이라는 하위 폴더를 만듭니다.</li>
		<li>자르기를 시작하고 확인을 클릭하여 자르기를 시작합니다. 참고: 기본 설정이 표시되며 일반적으로 충분합니다. 이미지의 해상도, 조명, 스폿 크기 등에 따라 기본 매개 변수를 조정하는 것이 도움이 될 수 있습니다.</li>
		<li>이미지가 이미 직선이면 스페이스바를 누르기만 하면 됩니다. 그렇지 않으면 수평이되어야하는 가장자리를 따라 선을 그려 이미지를 똑바로 펴십시오. 이미지가 여전히 똑바르게 표시되지 않는 경우 필요한 만큼 선을 다시 그립니다.</li>
		<li>다음으로 계산을 수행 할 영역의 경계 상자를 그립니다. 모든 반점이 셀 안에 있을 때까지 크기와 비율을 조정합니다. 커서를 경계 상자 밖으로 끌어 그리드를 새로 고칩니다. 그리드가 좋아 보이면 스페이스바를 누릅니다.</li>
		<li>다음 이미지가 첫 번째 이미지와 동일한 각도로 자동으로 회전하는지 확인하십시오. 플러그인은 모든 사진이 동일하게 정렬되었다고 가정합니다. 이것이 정확하면 스페이스바 를 눌러 계속합니다. 그렇지 않으면 이전과 같이 이미지를 똑바르게 합니다. 그리드는 또한 이전 이미지와 동일한 위치를 호출합니다. 필요한 경우 조정한 다음 스페이스바를 누릅니다.</li>
	</ol></li>
	<li>제공된 Count-On-It: ImageJ용 그리드아이언 플러그인(보충 코딩 파일 4)을 사용하여 플레이트에 콜로니를 열거합니다. 플러그인 설치 및 사용에 대한 자세한 지침은 보충 파일 3에 포함되어 있습니다.<ol><li>Count-On-It > Gridiron을 시작하십시오. 자르기와 동일한 그리드 설정을 사용합니다. 사용자는 전체 폴더를 일괄 처리하거나, 단일 이미지를 분석하거나, 현재 이미지에서 시작할 수 있습니다.</li>
		<li>상한 및 하한 픽셀 강도 값을 기준으로 임계값을 설정합니다. 모든 식민지를 선택하면서 임계 값을 가능한 한 엄격하게 설정하십시오. 이상적으로는 선택한 콜로니 사이에 약간의 공간이 있지만 소프트웨어는 Blob을 어느 정도 분할할 수 있습니다. 임계값이 만족스러울 때 "작업 필요" 대화 상자에서 확인을 클릭합니다.</li>
		<li>결과를 검사하려면 확대하여 식민지 수를 더 자세히 살펴보십시오. 취소를 클릭하면 플러그인이 중단됩니다. OK(확인 )를 클릭하여 계속합니다.</li>
		<li>첫 번째 이미지에서 계속 진행하거나 설정 메뉴로 돌아가는 옵션(예: 최소 콜로니 크기 변경)이 제공되는지 확인합니다. 일괄 처리를 계속하려면 확인을 클릭합니다. 그런 다음 영수증 및 결과 테이블을 보관할 폴더를 선택합니다. "영수증"폴더를 사용하거나 새 폴더를 만듭니다.</li>
		<li>첫 번째 이미지 이후의 다음 이미지는 기본적으로 이전 설정과 동일한 임계값으로 설정됩니다. 확인을 클릭하여 이러한 설정을 사용하거나 설정을 조정합니다. 사진이 일관되고 설정이 정확하면 "작업 필요" 대화 상자에서 확인을 클릭합니다. 참고: 배치의 모든 이미지가 완료되면 결과 테이블이 영수증과 동일한 폴더에 자동으로 저장됩니다.</li>
		<li>소프트웨어에서 생성된 카운트 영수증을 검토하고 카운트 오류를 수동으로 수정합니다. ImageJ 플러그 인은 통계적으로 정확하지만 오류가 발생합니다. 영수증을 증명하여 이상값을 조사하고 잘못된 계산을 식별합니다. 소프트웨어는 CFU 데이터를 영수증과 동일한 폴더에 .csv 파일로 저장합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>사용자가 선호하는 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다.</li>
</ol>

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여기에 제시된 세부 기술을 통해 CFU 계수 실험에서 평가할 수 있는 샘플 수를 >100배 늘릴 수 있습니다. 이 기술은 개별 파리를 분석하기 위해 96웰 플레이트 형식을 사용하여 Drosophila 12,35,36의 마이크로바이옴 실험을 위한 기존 방법을 발전시킵니다. 또한 보다 효율적인 스폿 도금 방법(19,31)과 사진 및 콜로니 계수 플랫폼을 통한 자동화된 워크플로우를 적용합니다. 초파리에 대한 이 방법의 중요성은 실험을 96웰 플레이트 형식으로 표준화하여 자동화를 통해 많은 수의 생물학적 복제물을 동시에 처리하여 CFU의 고처리량 정량화를 달성할 수 있도록 하는 것입니다.
96웰 플랫폼은 전달 빈도가 증가하고 일시적인 박테리아의 "제거"가 평균 존재비와 샘플 간의 변동을 크게 감소시킨다는 것을 보여주며(그림 1B,C), 이 개선된 프로토콜의 엄격성을 보여줍니다. 공동 주택 파리의 한 가지 한계는 파리 사이의 박테리아의 수평 이동입니다. 제안된 해결책은 Whole Animal Feeding Flat38과 같은 96웰 플레이트 형식으로 파리를 개별적으로 유지하는 것입니다.
파리를 에탄올로 씻었을 때 박테리아 부하의 현저한 감소는 관찰되지 않았지만,이 파리는 3 일 동안 외부 박테리아가있는 곳에서만 보관되었습니다. 더 긴 기간 동안 수용하면 더 큰 박테리아 부하가 축적 될 수 있습니다39. 따라서 에탄올로 세척하는 것이 좋습니다.
파리를 96웰 플레이트로 옮기는 것은 워크플로를 설정하기 위한 중요한 첫 번째 단계입니다(그림 1A). 파리가 씻겨지면 한 번에 하나씩 우물에 분배됩니다. 플레이트 차트는 이 단계에서 각 웰에 어떤 조건이 있는지 확인하고 "파리가 손실되었습니다"와 같은 메모를 추가하는 데 유용합니다. 균질화는 몇 가지 중요한 주의 사항이 있는 또 다른 중요한 단계입니다. 박테리아는 파리가있을 때 균질화 과정에서 살아남 았으며 (그림 1D, E), 아마도이 원리는 박테리아가 파리의 내장 내부에있을 때도 마찬가지입니다. 그러나 박테리아는 비드 비터 플레이트에서만 균질화될 때도 사멸되며, 이는 균질화가 특정 상황에서 박테리아 세포를 죽일 수 있음을 보여주며, 예를 들어 해부된 내장을 균질화하는 경우 중요할 수 있는 한계입니다. 특히, 균질화할 때 CFU의 손실은 샘플의 CFU 수에 따라 달라지며, 웰당 ~105 CFU를 사용할 때 손실이 최소화됩니다. CFU의 추가 보존은 중간에 균질화를 중지하고 플레이트를 얼음 위에서 냉각함으로써 달성할 수 있습니다.
균질화는 알려진 수의 CFU가 무균 파리와 혼합 된 대조 실험을 기반으로이 프로토콜에서 5 분 동안 수행되었으며, 이는 파리 박테리아에 대해 경험적으로 작동했습니다. 박동이 적으면 더 큰 플라이 부품이 존재하여 피펫팅을 방해하는 반면, ~10분의 훨씬 더 긴 균질화 시간으로 인해 CFU 카운트가 더 가변적입니다. 원뿔형 플레이트 웰의 더 작은 부피와 각진 모양은 원통형 2mL 튜브에 비해 비드 박동의 효율성을 감소시키는 것으로 관찰되었습니다. 이 일반적인 접근법에 대한 많은 변형이 가능하며, 여기에는 어떤 박테리아 균주, 어떤 비드 박동 용기, 어떤 비드 및 어떤 파리 유전자형이 사용되는지가 포함됩니다. 개별 사용자 사례는 포지티브 컨트롤을 사용하여 접근 방식을 설정해야 합니다.
스팟 도금 방법은 특정 방식으로 사용되었다 : PBS 중 L. plantarum WF의 1 : 2 희석물을 MRS 플레이트 상에 발견하고, 2 일 동안 30 °C에서 배양 하였다 (더 짧은 배양 시간은 더 작은 콜로니 크기를 생성하기 위해 구현 될 수있다). 이 방법은 주로 비드 비터와 96채널 피펫터(그림 2A)와 같은 장비에 대한 초기 투자가 필요하며, 이는 희석 시리즈와 스폿 도금 모두에 필요합니다. 그러나 슬롯형 핀이 있는 96웰 플레이트 복제기를 포함하여 더 저렴한 옵션을 사용할 수 있습니다. 희석 시리즈는 CFU 계수 결과의 정확도에 영향을 미치는 중요한 단계입니다. 고장 모드의 경우, 플라이 부품 또는 유리 비드로 피펫 팁이 막히고 피펫 팁이 피펫터에 제대로 밀봉되지 않거나 다른 이유로 고장날 수 있습니다. 이러한 모든 문제로 인해 영향을받는 우물이 과소 계산되므로 모니터링해야합니다. 희석 시리즈의 각 단계에서 적절한 혼합도 중요합니다. 각 희석액은 플레이트를 플레이트 셰이커에 올려 놓거나 15-20 회 위아래로 피펫 팅하여 철저히 혼합해야하며, 이는 또한 팁을 헹구는 역할을합니다. 가장 희석된 플레이트에서 가장 덜 희석된 플레이트까지 발견함으로써 팁을 전체 희석 시리즈에 재사용할 수 있습니다. 1:2 희석을 사용하면 2-25개의 콜로니 범위에서 계수가 정확하며 수십 배에 걸쳐 있습니다(그림 2C). 따라서 1:10 희석은 시간과 재료를 절약합니다. 활용할 수있는 또 다른 변수는 배양 시간으로, 더 작은 콜로니를 생성하도록 조정할 수 있으므로 인접한 콜로니의 병합을 방지하여 가산 가능한 지점의 범위를 늘릴 수 있습니다.
플레이트의 고품질 사진은 CFU가 분석되고 무기한 보관할 수 있는 원시 소스 데이터가 되기 때문에 필수적입니다. FluoroBox는 한천 표면의 눈부심을 최소화하는 균일한 광도로 플레이트의 사진을 생성하도록 설계되었습니다. 또한 이 설계는 단색 LED 조명과 컬러 사진 필터를 사용하여 형광 콜로니를 선택적으로 촬영할 수 있습니다(그림 3A). 조명 및 카메라 설정이 제어된 FluoroBox와 같은 설정을 구성하면 CFU 이미지의 재현성을 크게 높일 수 있으며, 이는 자동화된 분석에 중요합니다. 콜로니 형태, 형광 강도, 콜로니 성장에 대한 시간 또는 밀도의 영향은 사진을 사용하여 분석할 수 있는 특성 중 일부에 불과합니다. 형광 박테리아를 사용하지 않는 경우 컬러 필터와 단색 조명 없이 포토 박스를 구성할 수 있어 비용과 복잡성이 줄어듭니다. 실험실에서 다른 형광단을 사용하는 경우 여기에서 권장하는 것을 다른 여기등과 방출 필터로 대체할 수 있습니다. 앱을 사용하여 WiFi를 통해 태블릿에 연결된 카메라는 흔들림을 방지하고 데이터 전송을 용이하게 하는 자동 셔터 기능 모두에 유용합니다. 이미지를 태블릿으로 전송한 다음 무선 파일 전송 소프트웨어를 사용하여 노트북으로 전송할 수 있습니다. 이러한 기능을 갖춘 권장 카메라는 재료 표에 표시되어 있습니다.
카운트 온 잇은 ImageJ로 작성된 플러그인입니다. 자동화된 CFU 계수 소프트웨어는 플레이트 이미지를 균일한 96웰 그리드로 분할하고 각 그리드 셀의 콜로니를 계수한 다음 결과를 간단한 스프레드시트로 배치합니다. 플레이트와 사진에서 스폿 격자의 위치에는 항상 차이가 있으므로 사용자는 Croptacular 플러그인을 사용하여 격자를 사진에 수동으로 맞춰야 합니다. 이것은 또한 눈부심이 있는 플레이트 가장자리 근처의 영역을 제외하는 데 도움이 됩니다. 임계값 설정은 이미지에서 가장 정확한 CFU 계수를 얻는 데 중요합니다. 임계값을 너무 높게 설정하면 식민지가 병합됩니다. 임계값을 너무 낮게 설정하면 콜로니가 제외됩니다. 임계값이 설정되면 매크로는 가우시안 블러를 적용하여 가장자리를 부드럽게 하고 앨리어싱을 줄이고, 유역 필터는 겹치는 콜로니를 분할하고, Blob은 파티클 분석을 사용하여 계산됩니다. 
때로는 식민지의 밀도가 특정 지점에서 너무 높습니다. Count-On-It은 이를 처리하는 방법을 제공합니다. 부분적으로 병합된 콜로니가 있는 그리드 셀의 콜로니 수를 추정하려면 먼저 전체 플레이트에서 원형 블롭의 평균 면적을 C평균으로 사용합니다. 이어서, 블롭 A1의 면적을 원형 블롭A1/C 평균의평균 면적으로 나눈다. 이 숫자는 가장 가까운 정수로 반올림되며, 이는 Blob에 있는 콜로니 수에 대한 추정치입니다. 이 함수는 임계값이 계산 결과에 영향을 줄 수 있는 한 가지 이유입니다: 상대 평균 콜로니 영역과 병합된 Blob 영역은 임계값이 병합된 Blob에 미치는 영향에 따라 달라집니다.
제시된 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 여기에는 96웰 플레이트에서 액체 매체를 정확하게 분주하기 위한 장비의 필요성이 포함됩니다. 96채널 피펫터 또는 슬롯형 복제기 핀 공구인 이 장비는 구입하는 데 수천 달러의 비용이 들 수 있습니다. 더 저렴한 대안이 존재하지만 정확도는 떨어집니다. Count-On-It을 통한 자동 계산에도 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 혼합 개체군의 두 콜로니 유형이 크기만으로 구분된 경우 얼룩 계산은 콜로니를 올바른 유형에 할당할 수 없습니다. 이 경우 Blob이 있는 스폿을 개수에서 제거해야 합니다. 형태학에 기초한 콜로니의 추가 차별화는 현재 구현되지 않은 방법의 가치있는 확장이 될 것입니다. 균주 특이적 영양소 및 항생제를 포함한 선택적 배지를 사용하면 복잡한 이미지 분석의 필요성이 간소화됩니다.
96웰 플레이트에서 초파리 실험을 유지하면 단일 실험에서 테스트할 수 있는 샘플 수와 조건이 늘어나고 초파리-박테리아 연관 표현형에서 고처리량 스크린을 용이하게 할 수 있습니다. 우리는 이 방법을 선택적 배지를 사용하여 복잡한 혼합물에서 많은 박테리아 균주를 구별함으로써 확장할 수 있다고 생각합니다. 상기 방법은 플라이 마이크로바이옴의 연구에만 국한되지 않는다. CFU의 정량화는 식수의 대장균군 수에서 병원균 식별에 이르기까지 미생물학의 많은 응용 분야에서 일반적입니다. 여기에 제시된 CFU 도금 시스템은 높은 처리량의 스크린뿐만 아니라 결과의 자동 수집, 처리, 저장 및 전달을 가능하게 합니다.

장내 미생물총과 동물 숙주 사이의 관계는생물학적 연구1의 최전선에 점점 더 많이 등장하고 있으며, 이는 미생물군집의 균주 구성이 숙주 생리학 2,3,4에 중요하다는 것을 보여줍니다. 발견의 속도는 높은 자연적 개인 간 변이 및 식민지 박테리아 5,6,7의 높은 다양성과 같은 교란 요인에 의해 제한되었습니다. 초파리인 초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)는 자연적으로 낮은 다양성의 미생물군집, 취급 용이성 및 강력한 숙주 유전학 8,9,10,11로 인해 유망한 모델로 부상했습니다. 파리는 무균으로 만들 수 있고 정의된 미생물총(12)과 재연관될 수 있으며, 식물상이 파리의 생리학적 형질(13,14)에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 타고난 식물상은 모두 배양 가능한 제한된 박테리아 세트로 구성되며, 이들의 가까운 친척도 락토바실러스, 프로테오박테리아 및 엔테로코커스15를 포함한 포유류의 장에 내인성입니다.
숙주 특성에 대한 마이크로바이옴의 영향을 연구하려면 존재하는 종과 절대 풍부도 측면에서 마이크로바이옴을 정량화해야 합니다16. 파리 마이크로바이옴을 분석하는 주된 방법은 콜로니 형성 단위(CFU) 카운트17, 16S rRNA 유전자 앰플리콘 시퀀싱9 및 16S rRNA 유전자18의 qPCR입니다. CFU 계수는 값비싼 시약 없이 얻을 수 있고, 이들은 박테리아 세포(19)의 생존성을 확인한다. qPCR을 포함하는 16S 기술은 미생물의 분류학적 정체성이 그들의 성장 요건 또는 콜로니 형태학에 관계없이 확인될 수 있다는 점에서 이점이 있다(20).
실험에서 알려진 박테리아(gnotobiotic flies)의 정의된 마이크로바이옴이 있는 파리를 사용하는 경우 CFU 카운트는 시퀀싱21에 비해 특별한 이점이 있습니다. 시퀀싱은 비용이 많이 들고 DNA 추출, PCR 기반 라이브러리 준비 및 상대적 풍부도를 얻기 위해 고처리량 시퀀싱이 필요합니다22. 높은 비용으로 인해, 고처리량 시퀀싱 방법은 일반적으로 샘플당 가격을 낮추기 위해 대량으로 수행될 필요가 있다(23). 절대 풍부도16을 얻기 위해서는 qPCR과 같은 추가 방법이 필요합니다. 대조적으로, CFU 카운트는 빠르고 저렴하며 생존 가능한 세포의 절대 수를 제공합니다. 초파리8 및 기타 작은 마이크로바이옴 모델 24, 웜, Caenorhabditis elegans 25,26 및 뇨토비오로 성장한 유충 제브라피쉬, 다니오 레리오(Danio rerio)27을 포함하여, 제한된 범위의 박테리아를 가지며, 이는 알려진 성장 특성28을 갖는다. 이러한 경우, 특히 gnotobiotic 동물의 경우, CFU 계수는 다종 장내 공동체 21,27,29 내의 모든 박테리아 종을 구별 할 수 있습니다. 더 높은 처리량의 CFU 계수 방법은 마이크로바이옴의 구성을 측정하는 비용 효율성과 속도를 더욱 향상시키고 다른 많은 미생물학 실험에 적용할 수 있습니다.
한천 기반 성장 배지에서 박테리아 현탁액의 연속 희석 도금으로 CFU를 계수하는 것은 미생물학 분야의 표준 방법입니다. 그런 다음 판에서 자라는 식민지를 수동으로 계산합니다. 희석을 통해 연구원은 셀 수 있는 콜로니 밀도(예: 플레이트당 ~100CFU)를 선택할 수 있으며, 이는 콜로니가 서로 성장하지 않고 합리적인 시간 내에 계산될 수 있음을 의미합니다. 대부분의 미생물학자들은 140년 전 Robert Koch의 실험실에서 개발된 것과 본질적으로 동일한 CFU 계수 방법을 사용하며 많은 응용 분야에서 이 방법이 여전히 적합합니다. 그러나 많은 수의 샘플을 정량화하려고 할 때 문제가 발생합니다. 단일 샘플은 가산 가능한 CFU를 얻기 위해 샘플의 1-10 연속 희석을 도금해야 할 수 있으므로 수십 개 이상의 샘플을 포함하는 실험은 부담이됩니다. CFU 열거의 효율성을 높이기 위해 다양한 방법이 개발되었습니다. 자동 나선형 도금은 연속 희석(30)의 필요성을 제거하여 CFU 계수에 하나의 플레이트만 필요하지만 샘플을 도금하는 시간을 늘립니다. 단일 플레이트 직렬 희석 스포팅 (SP-SDS)은 샘플 당 더 적은 플레이트에서 CFU 추정을 허용합니다31. 이러한 방법은 기존의 확산 도금 방법을 개선한 것이지만 여전히 박테리아 시료를 단독으로 취급 및 도금해야 하므로 높은 처리량에는 적합하지 않습니다. 96웰 플레이트에서 샘플을 처리하고 직사각형 한천 플레이트에서 96개의 샘플을 스폿 플레이팅하면 샘플(19)의 처리량이 크게 향상됩니다.
마이크로바이옴은 일반적으로 여러 균주와 종으로 구성됩니다. 종은 종종 콜로니 형태 또는 성장 배지에 의해 구별될 수 있지만, 형광은 상이한 유형의 박테리아 및 이들의 성장 형질을 추가로 구별하기 위해 사용될 수 있다(32). 예를 들어, 동일한 종의 다른 유전자형은 서로 다른 유전적으로 암호화된 형광 단백질로 표지될 수 있습니다. 형광을 포함하는 플레이트 이미징 방법을 통해 연구자들은 CFU 기반 분석에서 이러한 유전 기술을 활용할 수 있습니다32. 형광을 고처리량 CFU 계수 방법에 통합하면 유용성이 더욱 향상됩니다.
CFU를 수동으로 계수하는 것은 샘플 수가 많은 경우 번거로워집니다. CFU의 자동 계수는 플레이트를 촬영하고 특수 소프트웨어(33)를 사용하여 이미지를 처리함으로써 수행될 수 있다. Sieuwerts 등은 종래의 디지털 사진 및 ImageJ 소프트웨어19를 사용하여 자동 콜로니 계수와 스폿 도금의 향상된 도금 효율을 결합했다.
특정 미생물 및 숙주 협회의 표현형을 스크리닝하는 고처리량 방법은 마이크로바이옴 커뮤니티 어셈블리와 숙주 건강 및 피트니스에 미치는 영향에 대한 연구에 도움이 될 것입니다. 초파리 마이크로바이옴 연구를 위해 고처리량 미생물학 플랫폼은 96웰 플레이트 형식의 파리 샘플 처리, 박테리아 용해 없는 파리 용해, 스팟 플레이팅의 효율성, 형광을 사용하고 다중 형광단을 구별하는 기능, CFU 플레이트의 재현 가능한 이미징을 위한 제어된 조명 환경 및 신뢰할 수 있는 자동 콜로니 계수 소프트웨어를 통합합니다. 이 기사에서는 간단하고 빠르며 자동화된 gnotobiotic 파리의 CFU 분석에 최적화된 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 이전에 발표된 최고의 방법을 결합하고 초파리의 장내 마이크로바이옴을 탐색하는 데 최적화된 새로운 워크플로를 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Bead beating 및 spot plating</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly 바이알</td><td>Genesee</td><td>32-121</td><td>오토클레이브 가능</td></tr><tr><td>플라이 바이알 스토퍼</td><td>Genesee</td><td>59-201</td><td>오토클레이</td></tr><tr><td>브 핸드 어플리케이터</td><td>3M</td><td>3M PA1</td><td></td></tr><tr><td>히트 실러</td><td>Eppendorf</td><td>5390</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater 96</td><td>BioSpec</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Mini-BeadBeater 유리 밀 비즈, 0.5 mm</td><td>BioSpec&nbsp;</td><td></td><td></td>11079105</tr><tr><td>MPS 1000 Mini PCR 플레이트 스피너</td><td>Labnet</td><td>LI-CF-P1000</td><td></td></tr><tr><td>Rainin BenchSmart 96 반자동 피펫터</td><td>Mettler Toledo</td><td>30296705</td><td>VP Scientific TempPlate의 슬롯형 96웰 핀 도구를 포함한 저렴한 옵션 사용</td></tr><tr><td>가능 세미 스커트 96웰 PCR 플레이트, 스트레이트 스커트, 천연</td><td>USA Scientific</td><td>1402-9220</td><td>히트 실러는 폴리프로필렌이어야 합니다.</td></tr><tr><td>열 접착 열 밀봉 호일</td><td>4titude</td><td>4ti-0591</td><td>멸균</td></tr><tr><td>트레이 플레이트, 128 x 85 mm, 폴리스티렌, 멸균</td><td>SPL Life Sciences</td><td>31001</td><td>직사각형 한천 플레이트 제작</td></tr><tr><td>용Photobox construction</td>&frac14<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>; "-20 X &frac12; &rdquo; 볼트(X2)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B07BP1WR3H</td><td>카메라 브래킷을 부착합니다. 브랜드는 중요하지 않습니다. 모든 1/4"-20 1/2" 볼트가 작동합니다.</td></tr><tr><td>&frac14; "-20 x &frac12; &rdquo; 커넥터 너트&nbsp;</td><td>Amazon</td><td>UPC: 799862376780</td><td>캡 너트 또는 커넥터 볼트라고도 합니다. 플레이트 홀더에 고무 밴드를 부착하기 위한 것입니다. 브랜드는 중요하지 않습니다.</td></tr><tr><td>&frac14; "-20 x &frac34; &rdquo; 볼트 (X3)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B003QZSZY4</td><td>플레이트 홀더용. 브랜드는 중요하지 않습니다.</td></tr><tr><td>1/8" x &frac12; &rdquo; 와셔</td><td>Amazon</td><td>UPC:</td><td>상자 외부의 캡 너트용 611982484599 와셔. 브랜드는 중요하지 않습니다. 아크릴과 혼합하기 위해 부착하기 전에 검은색 스프레이 페인트를 칠하십시오.</td></tr><tr><td>18 게이지 와이어 - 두 개의 전도체 전원 와이어 - 18 AWG 전원 와이어 &ndash; 10ft</td><td>Superbrightleds.com</td><td>WP18-2</td><td></td></tr><tr><td>22-10 AWG 레드 와이어 너트 - WN-R2210 &ndash; 수량 4Superbrightleds.com</td><td></td> <td>WN-R2210</td><td></td></tr><tr><td>22-18 AWG 3/16in 여성 푸시 온 커넥터 - 22-18 AWG &ndash; 수량 3</td><td>Superbrightleds.com</td><td>SCFP-2218</td><td></td></tr><tr><td>4" 무납땜 클램프온 점퍼 커넥터 - 8mm 단색 LED 스트립 라이트 - <강력>수량 3</강력></td><td>Superbrightleds.com</td><td>SBL-MA2P-8-2</td><td></td></tr><tr><td>4" 무납땜 클램프온 핀테일 어댑터 - 8mm 단색 LED 스트립 조명 &ndash; <강력>수량 3</강력></td><td>Superbrightleds.com</td><td>SBL-MA2P-8-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>6인치 서랍 손잡이</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B07Z331P99</td><td>모든 서랍 손잡이가 작동해야 합니다.</td></tr><tr><td>6인치 서랍 슬라이드</td><td>Btibpse</td><td>UPC: 712243424979</td><td>서랍 슬라이더의 소프트 클로즈 고무 마개를 자릅니다.</td></tr><tr><td>8-32 x &frac12; &rdquo; 캡 너트(x4)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B00HYLZB98</td><td>상자 외부에 서랍 슬라이드 볼트를 부착합니다. 브랜드는 중요하지 않습니다. 나일론은 아크릴을 손상시키지 않습니다. 아크릴과 혼합하기 위해 부착하기 전에 검은색 스프레이 페인트를 칠하십시오.</td></tr><tr><td>8-32 x &frac12; &rdquo; 나일론 볼트(x4)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B07KX9T7NF</td><td>서랍 슬라이드를 부착합니다. 브랜드는 중요하지 않습니다. 사양을 충족하는 모든 볼트 또는 기계 나사가 작동합니다. 나일론은 아크릴을 손상시키지 않으며 너트와 같은 높이로 볼트를 절단할 수 있습니다. 아크릴과 혼합하기 위해 부착하기 전에 검은색 스프레이 페인트를 칠하십시오.</td></tr><tr><td>아크릴 접착제</td><td>SCIGRIP</td><td>Ean:</td><td>7844908489337 SCIGRIP Weld-On #4 접착제, 핀트 및 용접식 애플리케이터 병과 바늘</td></tr><tr><td>검정 케이블 타이 - 10팩 - 4인치 길이&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>CT-B04-10</td><td></td></tr><tr><td>카메라 L-브래킷</td><td>WLPREOE, Vikerer, 브랜드 없음</td><td>ASIN: B09X46YKQZ</td><td>카메라가 L의 "바깥쪽"에 있도록 브래킷을 의도한 구성에서 "반전"해야 합니다. 일부 브래킷은 두 부분으로 제공되어 이 대체 구성을 허용하고 일부는 그렇지 않으므로 뒤집을 수 있는 브래킷이 필요합니다. 또한 부착을 위한 1/4" 구멍이 있어야 합니다. WLPREOE, Vikerer, 브랜드 없음. Amazon 일련 식별 번호를 예로 들어 보겠습니다.</td></tr><tr><td>테더링 옵션용 Canon T 시리즈 카메라 또는</td><td>Canon, Panasonic, Sony, Nikon 등.</td><td>1894C002</td><td>Canon Ti 시리즈 카메라는 좋은 옵션이며 컴퓨터에 연결할 수 있습니다. 18-55mm 표준 키트 렌즈와 함께 사용하십시오. Canon T5에서 T7(현재 모델)까지 사용하는 옵션을 사용하는 것이 좋습니다.</td></tr><tr><td>사용자 정의 길이 단색 LED 스트립 라이트 - 에코 시리즈 테이프 라이트 - 24V - IP20 - 250 lm/ft - 블루 - 2 미터</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-BBLU-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>사용자 정의 길이 단색 LED 스트립 라이트 - 에코 시리즈 테이프 라이트 - 24V - IP20 - 250 lm/ft - 녹색 &ndash; 2 미터</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-BGRE-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>사용자 정의 길이 단색 LED 스트립 라이트 - 에코 시리즈 테이프 라이트 - 24V - IP20 - 250 lm/ft - 자연 흰색 4000K &ndash; 2 미터&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-A40K80-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>드릴과 &frac14; ", 1/8" 드릴 비트</td><td>블랙 & 데커</td><td>&lrm; BDCDD12PK</td><td>브랜드는 중요하지 않습니다.</td></tr><tr><td>플랫 블랙 스프레이 페인트,&nbsp; 2X 울트라 매트</td><td>루스톨륨</td><td>331182</td><td>모든 플랫 블랙의 내부를 페인트합니다. 브랜드는 중요하지 않습니다.</td></tr><tr><td>레이저 컷 아크릴 벽</td><td>빅 블루 톱</td><td>www.bigbluesaw.com</td><td>첨부된 PDF를 사용하고, 카메라에 원하는 구멍을 제외한 상단 부분의 모든 컷아웃을 삭제하십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>Mean Well LED 스위칭 전원 공급 장치 - LPV 시리즈 20-100W 단일 출력 LED 전원 공급 장치 - 24V DC - 20 와트&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>LPV-20-24</td><td></td></tr><tr><td>Panasonic ZS100은 전화, 태블릿 또는 컴퓨터</td><td>Canon, Panasonic, Sony, Nikon 등에</td> Wi-Fi 연결을 제공합니다.<td>DMC-ZS100K</td><td>Panasonic 카메라는 데이터 전송 및 원격 셔터 옵션을 위해 컴퓨터에 무선으로 연결할 수 있습니다. 사용 된 옵션이 좋습니다.</td></tr><tr><td>퀵 릴리즈 플레이트</td><td>Neewer 알루미늄 50mm 퀵 릴리즈 플레이트 QR 클램프 3/8인치, 1/4인치</td><td>ASIN: B07417F21D</td><td>이것을 브라켓에 추가하면 컬러 필터를 변경하기 위해 카메라를 쉽게 제거할 수 있습니다. Amazon 일련 식별 번호를 예로 들어 보겠습니다.</td></tr><tr><td>고무 밴드, 다양한 크기</td><td>BAZIC 제품</td><td>얼라이언스 고무 26649</td><td>고무 밴드는 플레이트 홀더에 부착됩니다. 브랜드는 중요하지 않습니다.</td></tr><tr><td>나사/접착 케이블 타이 마운팅 베이스 - 3/4 인치 베이스 &ndash; 수량 4</td><td>Superbrightleds.com</td><td>CTMB-20</td><td></td></tr><tr><td>SPST 라운드 록커 스위치 - LED 없음 &ndash; 수량 3</td><td>Superbrightleds.com</td><td>RRS-SP</td><td></td></tr><tr><td>Tiffen 29 필터 (빨강) 72 mm&nbsp;</td><td>Tiffen</td><td>72R29</td><td></td></tr><tr><td>Tiffen 58 필터 (녹색) 72 mm</td><td>Tiffen</td><td>7258</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ64</td><td>https://imagej.net/downloads</td><td>N/A</td><td>무료. 그냥 인용하십시오 : Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., &hellip; 카르도나, A. (2012). 피지: 생물학적 이미지 분석을 위한 오픈 소스 플랫폼. 자연 방법, 9(7), 676&ndash;682. doi:10.1038/nmeth.2019</td></tr><tr><td>MacOSX</td><td>Apple</td><td>N/A</td><td>Count-on-it에서 쉽게 구성하고 분석할 수 있도록 사진 그룹의 이름을 바꿀 수 있는 Finder에 유용한 일괄 이름 바꾸기 기능이 있습니다.</td></tr><tr><td>Unix</td><td>BSD</td><td>N/A</td><td>64비트</td></tr><tr><td>Windows</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>64비트</td></tr></tbody></table>

초파리 마이크로바이옴에 적용된 96웰 플레이트 형식의 빠른 콜로니 형성 단위 계수

Fast Colony Forming Unit Counting in 96-Well Plate Format Applied to the Drosophila Microbiome

동물의 내장은 숙주 발달, 건강 및 행동에 영향을 미치는 공생 미생물에 의해 식민지화됩니다. 집락화의 정확한 정량화는 미생물 구성을 검증하고 그 효과를 연구하기 위해 숙주와 미생물 간의 복잡한 상호 작용을 연구하는 데 필수적입니다. 초파리 멜라노가스터는 토착 미생물 다양성이 낮고 정의된 미생물 구성으로 사육하기에 경제적이며 장내 미생물군집을 연구하기 위한 모델 유기체로 부상했습니다. 개별 유기체의 미생물군집을 분석하려면 어떤 미생물 종이 존재하는지 식별하고 절대 풍부도를 정량화해야 합니다. 이 기사는 많은 수의 개별 파리 미생물 군집을 분석하는 방법을 제시합니다. 파리는 96웰 플레이트에서 준비되므로 한 번에 많은 수의 샘플을 처리할 수 있습니다. 미생물 풍부도는 일련의 반점에서 단일 한천 플레이트에 최대 96 개의 전체 파리 균질 물을 도금 한 다음 각 지점에서 자라는 집락 형성 단위 (CFU)를 계산하여 정량화됩니다. 이 도금 시스템은 ImageJ 플러그인을 사용하여 플레이트 사진, 형광 콜로니 분화 및 콜로니 자동 계수를 통합하는 자동화된 CFU 정량화 플랫폼과 쌍을 이룹니다. 장점은 (i) 이 방법이 처리 간의 차이를 감지할 만큼 충분히 민감하고, (ii) 스폿 도금 방법이 기존 도금 방법만큼 정확하며, (iii) 자동 계수 공정이 수동 계수보다 정확하고 빠르다는 것입니다. 여기에 제시된 워크플로우는 많은 수의 반복에서 CFU의 고처리량 정량화를 가능하게 하며 체외 및 기타 소형 동물 모델을 포함한 다른 미생물학 연구 시스템에 적용할 수 있습니다.

이 방법은 콜로니 형성 단위(CFU)를 플레이트하기 위해 96웰 플레이트 형식을 사용하여 미생물 풍부도를 정량화하고 전체 파리 균질물 샘플의 초파리 마이크로바이옴에 적용됩니다. CFU는 여기에 제공된 자동 이미지 분석 소프트웨어로 계산됩니다.

The intestines of animals are colonized by commensal microbes, which impact host development, health, and behavior. Precise quantification of colonization ...

집락 형성 단위 또는 CFU를 계산하는 것은 미생물학의 표준 기술이지만 느리고 많은 한천 플레이트가 필요합니다. 당사의 기술은 두 시간 한천 플레이트 모두에서 기존 CFU 계수 방법에 비해 100배의 이점을 제공합니다. 우리는 작은 동물 모델, 특히 초파리의 장내 미생물 군집을 측정하기 위해이 방법론을 적용했습니다.이 프로토콜은 gnotobiotics 파리에서 CFU를 정량화하는 간단하고 빠르며 자동화된 방법입니다. 이 프로토콜은 CFU를 촬영하기 위한 DIY 제작 계측기와 계수를 자동화하는 맞춤형 소프트웨어를 갖춘 워크플로를 제공합니다. 이 프로토콜은 보다 효율적인 도금 및 CFU 계수 방법이 유용할 수 있는 모든 미생물학 실험에 사용할 수 있습니다.파리를 효율적으로 다루고 판을 발견하려면 손재주가 필요하므로 연습해야합니다. 자동 계수 소프트웨어를 사용하려면 임계값에 대한 판단이 필요하므로 영수증을 수동 계수와 비교하여 실험에 가장 적합한 매개변수를 식별해야 합니다. 이 절차를 시연하는 것은 기술을 개발한 내 실험실의 연구원인 Ren Dodge가 될 것입니다. 시작하려면 0.5미크론 유리 구슬을 비드 측정 트레이에 붓습니다.모든 우물이 가득 차고 수평이되도록 트레이에 구슬을 펼치십시오. 그런 다음 여분의 구슬을 원뿔형 튜브에 털어냅니다. 이제 세미 스커트 PCR 플레이트를 측정 트레이에 거꾸로 놓고 측정 트레이의 움푹 들어간 곳에 끼워 웰과 맞춥니다.그런 다음 빠르게 뒤집어 구슬을 옮깁니다. PCR 플레이트 표면에서 과도한 비드를 제거합니다. 모든 우물에 구슬이 포함되어 있는지 확인하십시오.필요한 경우 계량 스쿱을 사용하여 단일 웰에 비드를 추가하십시오. 그런 다음 알루미늄 호일과 오토 클레이브로 플레이트를 덮으십시오. 플레이트를 사용하기 전에 96채널 피펫터를 사용하여 파리를 추가하기 직전에 각 웰에 100마이크로리터의 PBS를 추가합니다.마취 된 파리의 표면 멸균을 위해, 작은 깔때기를 사용하여 바이알에서 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 파리를 옮깁니다. 즉시 70 % 에탄올 1 밀리리터를 튜브에 뿌리고 튜브를 닫은 다음 10 초 동안 뒤집어 혼합합니다. 그런 다음 파리를 흡인하지 않고 P-1000 피펫으로 에탄올을 흡입하십시오.최종 PBS 세척 후 튜브를 닫고 뚜껑 면이 아래로 향하도록 벤치에서 몇 번 세게 두드려 파리가 뚜껑에 들어가도록 합니다. 튜브를 연 후 집게를 사용하여 우물에 파리를 분배하고 각 우물에 파리 하나씩 놓습니다. 적재하는 동안 접시를 얼음 위에 유지하여 파리를 마취 상태로 유지하십시오.우물 가까이에서 흩어진 구슬을 제거하면 호일 씰이 파손되어 누출이 발생할 수 있습니다. 밀봉 호일의 둔한 면이 플레이트에서 아래쪽을 향하고 반짝이는 면이 히트 실러를 향하도록 하십시오. 히트 실러를 5초 동안 단단히 누르고 핸드 어플리케이터로 광택을 내어 호일을 고정합니다.파리를 5 분 동안 균질화하십시오. 파리가 완전히 균질화되고 용액이 착색되는지 확인하십시오. 밀봉 호일에서 액체를 제거하려면 350G의 미니 플레이트 스피너에서 비드 플레이트를 30초 동안 스핀다운하고 플라이 균질액의 물방울이 튀지 않도록 플레이트를 잡고 호일을 제거합니다.뚜껑이 열린 직사각형 MRS 한천 성장 플레이트 3 개를 생물 안전 캐비닛에 넣어 최소 10 분 동안 건조시킵니다. 96-채널 피펫터를 사용하여 멸균된 96-웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 PBS를 첨가하여 2개의 희석 플레이트를 준비한다. P-20 팁 랙을 96채널 파이피터에 로드합니다.샘플 플레이트에서 11.1 마이크로리터의 균질액을 흡인하여 1:10 희석을 만듭니다. 이제 웰당 100마이크로리터의 멸균 PBS가 들어 있는 첫 번째 희석 플레이트에 분주합니다. 희석 플레이트를 플레이트 쉐이커에서 600 RPM에서 10초 동안 유지한다.적어도 10 번 위아래로 피펫팅하여 다시 혼합하십시오. 11.1 마이크로리터를 제1 희석 플레이트로부터 제2 희석 플레이트로 옮기고 임의의 추가 희석에 대해 혼합 단계를 반복한다. 스팟팅 플레이트의 경우 각 웰에서 2마이크로리터를 96채널 피피터에 로드합니다.한천에 찔리지 않도록 피펫터 헤드를 플레이트 위로 천천히 내리고 모든 반점이 분배되었는지 확인합니다. 그런 다음 액체 반점이 한천에 빠르게 스며 들어 함께 흐르지 않는지 확인하십시오. 원고에 설명된 대로 나머지 희석 플레이트에 대해 도금 과정을 반복합니다.액체가 한천에 완전히 흡수되면 플레이트를 뒤집어 식민지가 최적의 크기에 도달 할 때까지 배양합니다. 플레이트를 논리적으로 구성하고 사진을 찍는 동안 특정 순서로 유지하십시오. A1이 모든 플레이트의 왼쪽 상단 모서리에 오도록 방향을 지정합니다.플레이트 뚜껑을 제거한 후 A1이 올바른 모서리를 향하도록 플레이트를 스테이지에 놓습니다. 접시를 이미지화합니다. 이미지를 컴퓨터로 전송하고 실험 이름, 용지 유형, 희석 계수 및 기타 관련 세부 정보를 포함하여 이름을 바꿉니다.정량화를 위해 처리할 이미지를 폴더로 구성합니다. 플레이트를 구분하는 파일 이름은 출력 스프레드시트의 각 카운트 세트에 대한 열 제목이 됩니다. 폴더에 Cropped 및 Receipts라는 하위 폴더를 만듭니다.이러한 폴더는 출력 파일을 수신합니다. 이제 ImageJ에서 자르기 플러그인을 시작하고 확인을 클릭하여 자르기를 시작합니다. 소스 폴더를 선택하는 대화 상자가 나타납니다.확인을 클릭합니다. 원본 폴더를 선택하고 열기를 클릭합니다. 그런 다음 대상 디렉토리를 선택하기위한 대화 상자에서 확인을 클릭하십시오. 대상 폴더를 선택하고 열기를 누릅니다.이미지가 이미 직선이면 스페이스바를 누르기만 하면 됩니다. 그렇지 않으면 수평이되어야하는 가장자리를 따라 선을 그려 이미지를 똑바로 펴십시오. 이미지가 똑바로 나타나지 않는 경우 필요한만큼 선을 다시 그립니다.그런 다음 계산 영역에 대한 경계 상자를 그리고 모든 반점이 셀 내에 올 때까지 크기와 비율을 조정합니다. 커서를 경계 상자 밖으로 끌어 그리드를 새로 고칩니다. 그리드가 좋아 보이면 스페이스바를 누릅니다.플러그인은 모든 사진이 동일하게 정렬된다고 가정하므로 다음 이미지가 첫 번째 이미지와 동일한 각도로 자동으로 회전하는지 확인하십시오. 이것이 정확하면 스페이스바를 눌러 계속합니다. 그렇지 않으면 이전과 같이 이미지를 똑바르게 합니다.그리드는 또한 이전 이미지와 동일한 위치를 호출합니다. 필요한 경우 조정하고 스페이스바를 누릅니다. 카운트 온 잇을 실행하고 그리드 아이언을 선택하십시오.임계값 콜로니 강도를 상위 및 하위 픽셀 강도 값을 기준으로 설정합니다. 임계 값을 가능한 한 엄격하게 유지하면서 모든 식민지를 선택하십시오. 임계값이 만족스러우면 작업 필요 대화 상자에서 확인을 클릭하고 확인을 클릭하여 계속합니다.첫 번째 이미지에서는 계속 진행하거나 설정 메뉴로 돌아갈 수 있는 옵션이 제공됩니다. 일괄 처리를 계속하려면 확인을 클릭합니다. 그런 다음 영수증 및 결과 테이블을 보관할 폴더를 선택합니다. 이전에 만든 영수증 폴더를 사용합니다.첫 번째 이미지 다음에 다음 이미지는 기본적으로 이전 설정과 동일한 임계값으로 설정됩니다. 확인을 클릭하여 이러한 설정을 사용하거나 설정을 조정합니다. 소프트웨어에서 생성된 카운트 영수증을 검토하고 카운트 오류를 수동으로 수정합니다.ImageJ 플러그인은 통계적으로 정확하지만 오류가 발생합니다. 영수증을 증명하여 이상값을 조사하고 잘못된 계산을 식별합니다. 소프트웨어는 CFU 데이터를 영수증과 동일한 폴더에 CSV 파일로 저장합니다.락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)으로 서식한 파리의 경우, 매일 멸균 식품으로 옮기거나, 매일 옮기거나, 분석 4시간 전에 멸균 식품에 보관하거나, 매일 옮겨서 분석 4시간 전에 멸균 한천에 보관한 파리의 박테리아가 현저히 감소했습니다. Acetobacter indonesiensis를 먹인 파리에서도 유사한 결과가 관찰되었는데, 옮겨진 파리, 사후 옮겨진 파리, 제거 된 파리는 CFU가 크게 감소한 것으로 나타 났지만 세척은 측정 가능한 효과가 없었으며, 이는 CFU의 감소가 큐티클이 아닌 장에서 박테리아가 제거되었기 때문임을 시사합니다. 스팟 당 2-25 개의 콜로니가있는 스팟의 CFU 수는 기존 방법과 비교하여 차이가 없었습니다.평균 35개의 콜로니를 가진 반점은 대조군 확산판보다 낮은 CFU를 보였다. 이러한 감소는 빽빽한 지점에서 겹치는 식민지 때문일 수 있습니다. 플레이트 사진에서 식민지 강도는 배경보다 300 % 높았습니다.락토바실러스 플란타룸 m체리 양성 콜로니는 m체리 음성 콜로니보다 1, 000% 더 높은 적색 강도를 나타냈다. 아세토박터 인도네시아 GFP 양성 콜로니는 GFP 음성 콜로니보다 200% 더 높은 녹색 강도를 보였습니다. ImageJ 용 카운트 온 잇 플러그인은 플레이트 사진에서 CFU 카운팅을 자동화합니다.콜로니는 수동 계수와 비슷한 수로 정확하게 감지됩니다. 카운트 영수증은 잘못된 카운트를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 크기 임계값과 형광 파장을 변경하면 서로 다른 콜로니 형태를 별도로 계산할 수 있습니다.비드 비즈 전에 플레이트가 잘 밀봉되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 측정값을 교정하기 위해 포지티브 컨트롤을 설계하는 것도 중요합니다. 또한 이 기술을 사용하여 96웰 플레이트에서 박테리아의 시험관 내 개체군을 연구하여 혼합 박테리아 군집을 연구할 수 있습니다.이 기술은 고처리량 스크리닝 접근법을 통해 장내 집락화와 집락화의 생물학적 변이를 측정할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

면역 반응과 행동 사이의 링크를 이해하기 위해, 우리는에서 전위의 행동을 측정하는 방법을...

면역 반응과 수면에서의 양적 측정<em&gt; Drosophila</em

초파리 미생물총(Drosophila microbiota)은 동물의 발달, 면역 및 생리학에 영향을 미칩니다. 이 비디오는 전신 제제에서 집락 형성 단위를 결정하여 파리의 박테리아를 정량화하는 방법을 설명합니다. 주요 프로토콜은 4종의 박테리아를 사용하여 gnotobiotic 조건에서 사육된 파리를 이용한 기술을 보여줍니다.

CFU(Colony Forming Units) 계수: 파리 몸체의 박테리아 정량화

출처: Dodge, R., et al. 초파리 마이크로바이옴에 적용된 96웰 플레이트 형식의 빠른 콜로니 형성 단위 계수. J. Vis. 경험. (2023년)이 비디오는 연속 희석 및 도금 접근법을 사용하여 초파리 파리의 장내 관련 박테리아의 콜로니 형성 단위(CFU)를 정량화하는 방법을 보여줍니다. 장내 세균을 포함하는 균질화된 파리 샘플을 연속적으로 희석하고 한천에 도금한 다음 배양하여 콜로니 성장을 허용합니다. 그런 다음 소프트웨어를 사용하여 플레이트의 이미지를 분석하여 각 지점의 콜로니를 정렬, 분할 및 계산하여 정확한 CFU 정량화를 가능하게 합니다.

초파리 파리에서 장내 관련 박테리아의 군집 형성 단위의 정량화

이 비디오에서는 Drosophila melanogaster의 흉부에 E. coli를 주입한 후 E. coli 박테리아 부하를 측정하는 기술을 보여줍니다.

Measuring E. coli Bacterial Load in Drosophila melanogaster following E. coli Infection(대장균 감염 후 Drosophila melanogaster의 대장균 박테리아 부하)

Drosophila melanogaster는 선천성 면역 체계와 감염 및 질병의 생리학적 결과를 연구하기 위한 뛰어난 모델 유기체입니다. 이 프로토콜은 강력하고 정량적으로 반복 가능한 박테리아 감염을 D. melanogaster에 전달하는 방법과 이후에 감염 중증도를 측정하고 숙주 면역 반응을 정량화하는 방법을 설명합니다.

전신 세균 감염 및 면역 방어 표현형에<em&gt; 초파리 melanogaster의</em

무균 및 무균 조건에서 초파리 melanogaster의를 양육하는 방법이 제공된다. 플라이 배아는, 차아 염소산 나트륨에 dechorionated 멸균 다이어트에 무균 적으로 전송하고, 밀폐 용기에 양육된다. 박테리아와식이 요법과 배아를 접종은 무균 협회에 이르게하고, 세균의 존재는 전신 초파리 균질 도금에 의해 확인된다.

과일 비행을 양육<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 무균 및 무균 조건에서

효모 성장 표현형은 마이크로콜로 성장하는 고정 된 세포의 매우 병렬 시간 경과 이미징을 통해 정확하게 측정됩니다. 동시에, 스트레스 내성, 단백질 발현 및 단백질 국소화를 모니터링할 수 있고, 통합된 데이터 세트를 생성하여 환경 및 유전적 차이뿐만 아니라 동종 세포 간의 유전자 발현 이질성, 변조 성장을 연구할 수 있습니다.

성장과 유전자 발현의 이질성을 측정하는 마이크로콜로니의 높은 처리량 라이브 이미징

마이크로 플레이트 피더 분석법은 Drosophila에서액체 음식 소비를 정량화하기 위한 경제적이고 높은 처리량 방법을 제공합니다. 3D 프린팅 장치는 파리가 트레이서 염료로 공급 용액을 소비하는 1536웰 마이크로 플레이트에 파리가 보관되는 96웰 마이크로 플레이트를 연결합니다. 용액 량 감소는 분광계로 측정됩니다.

드로소필라에서 소비의 정량화를 위한 높은 처리량 마이크로 플레이트 피더 분석

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 은 숙주-마이크로바이옴 상호작용을 유도하는 분자 결정 요인을 조사할 수 있는 강력한 모델입니다. 우리는 예쁜꼬마선충(C. elegans ) 생리학의 주요 측면과 함께 장내 마이크로바이옴 집락화의 단일 동물 수준을 프로파일링하는 고처리량 파이프라인을 제시합니다.

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 장내 마이크로바이옴의 정량화 및 분석을 위한 유동 지렁이 측정법의 적용

콜로니 형성 단위(CFU)의 측정은 눈에 보이는 콜로니를 형성하는 데 몇 주가 걸릴 수 있는 Mycobacterium tuberculosis를 포함하여 박테리아를 정량화하기 위한 황금 표준 기술입니다. 여기서는 시간 효율성 향상, 실험실 공간 및 시약 비용 절감, 중간 및 고처리량 실험으로의 확장성을 갖춘 CFU 측정을 위한 마이크로 CFU에 대해 설명합니다.

결핵에 대한 백신의 효능 평가를 위한 Micro-colony Forming Unit Assay

세포주는 숙주 세포 외부에서 배양할 수 없는 세포 내 유기체에 대한 연구에 유용합니다. Wolbachia에 감염된 계통은 많은 발견을 가능하게 했지만 이러한 계통 내의 이질성으로 인해 다양한 실험 결과가 나올 수 있습니다. Wolbachia에 감염된 JW18 세포에서 단일 세포 클론 및 연속 배양을 생성하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

Wolbachia에 감염된 Drosophila melanogaster JW18 세포주에서 단클론 배양 생성

배우세요 96웰 플레이트 형식의 빠른 콜로니 형성 단위 계수법을 Drosophila 초파리 장내 마이크로바이옴 분석에 적용하는 방법입니다. 자동화된 이미지 분석 소프트웨어와 DIY 장비를 활용하여 기존 방법 대비 100배 빠른 효율성을 제공합니다.

초파리 마이크로바이옴에 적용된 96웰 플레이트 형식의 빠른 콜로니 형성 단위 계수

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