Name: 쥐 분변 분리 및 미생물군 이식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 학습하세요 쥐 분변 수집 및 스위스 롤 방법을 이용한 심혈관 질환에서 장내 미생물 불균형 연구 방법을. 이 프로토콜은 무균 기술과 면역염색을 활용하여 장 조직 분석 및 미생물군 이식을 가능하게 합니다.

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이 연구는 National Center for Advancing Translational Sciences의 Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243(to A.K.)의 지원을 받았습니다. 미국 심장 협회 보조금 POST903428 (JAI에); 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소는 K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941(AK로) 보조금을 부여하고 NIH는 1P01HL116263(VK로)을 부여합니다. 그림 1 은 Biorender를 사용하여 생성되었습니다.

밴더빌트 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 이 원고에 설명된 모든 절차를 승인했습니다. 생후 3개월의 C57B1/6 수컷 마우스를 잭슨 연구소(Jackson Laboratory)에서 구입하여 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 사육하고 관리했습니다.
1. 인간 배설물 샘플의 수집, 저장 및 처리
<ol><li>피험자가 클리닉에 있는 경우 멸균 용기를 사용하여 대변 샘플을 수집합니다. 처리 준비가 될 때까지 수집 후 36시간 이내에 4°C에서 대변 샘플을 냉장 보관합니다. 또는 시중에서 판매되는 도구를 사용하여 대변 샘플을 수집하여 주변 온도, 특히 가정에서 쉽게 DNA 안정성을 확보할 수 있습니다.</li>
	<li>10% 표백제 용액 또는 기타 환경 보호국에서 승인한 소독제로 생물 안전 수준의 흄 후드를 소독하십시오.</li>
	<li>서늘한 보관소에서 의자를 꺼내 흄 후드에 넣습니다. 일회용 주걱을 사용하여 ~1g 분취량을 만들고 완전히 처리할 준비가 될 때까지 -80°C 냉동고에 보관합니다.</li>
	<li>모든 일회용품은 생물학적 위험 쓰레기통에 버리십시오. 모든 표면(후드 및 프로세서가 만지는 모든 표면)과 후드에서 제거할 품목을 소독합니다.</li>
</ol>2. 쥐 배설물 샘플의 무균 수집
알림: 멸균된 기구를 포함한 무균 기술을 사용하십시오.
<ol><li>마우스를CO2 질식으로 안락사시킨다. 마우스의 가슴과 측면에 70% 에탄올을 뿌리고 피부와 복강을 조심스럽게 열어 위장관을 노출시킵니다.</li>
	<li>맹장을 분리하고 멸균 수술용 가위를 사용하여 반으로 자릅니다. 간단히 말해서 맹장을 노출시키고 회장에서 근위부로 0.5cm, 결장과의 접합부에서 원위부로 0.5cm를 자릅니다. 분리된 맹장을 멸균된 페트리 접시에 옮깁니다.</li>
	<li>멸균 주걱을 사용하여 맹장 내용물을 멸균 튜브로 옮기고 분취액을 -80°C 냉동고에 보관합니다19. 알림: 장내 박테리아의 대부분은 혐기성 세균이기 때문에 산소에 노출되면 실내 대기에서 격리 절차를 진행하는 동안 유기체가 손상되거나 죽을 수 있습니다. 따라서 분변 샘플은 박테리아의 생존력을 유지하기 위해 혐기성 챔버에서 분리되어야 합니다.</li>
</ol>3. 배설물 이식
<ol><li>신선하거나 이전에 냉동된 배설물 펠릿을 멸균 식염수에 1:20(w:v) 비율로 재현탁하고 균질화될 때까지 소용돌이칩니다.</li>
	<li>균질액을 30μm 공극 나일론 필터에 통과시켜 큰 입자상 물질을 제거합니다. 79 × g 에서 5분 동안 원심분리하고 이식에 사용할 상층액을 수집합니다.</li>
	<li>무균 수용자 마우스당 슬러리 100 μL를 연속 3일 동안 경구 위관영양하고, 2주 동안 3일마다 위관영양법을 투여하였다. 기존 마우스를 사용하여 항생제로 처음 치료받은 경우 장내 미생물총의 메커니즘을 연구하여 수혜자 자신의 고유 미생물군을 제거합니다. 예를 들어, 분변 슬러리의 위관영양법 전에 경구 위관영양법으로 연속 5일 동안 수용자 마우스에게 매일 세프트리악손(400mg/kg)을 투여합니다. 참고: 연구에 따르면 혈압을 포함한 심혈관 변화를 유도하기 위해서는 최소 2주 이상의 치료가 필요하다고 한다20.</li>
	<li>무균 수용자 마우스가 gnotobiotic film isolators에 단독으로 수용되고 멸균 식품과 물이 공급되는지 확인하십시오.</li>
</ol>4. 수축기 혈압 측정
참고: 기존 수용된 3개월 된 C57Bl/6 마우스에서 FMT를 받은 Gnotobiotic 마우스에 2주 동안 저용량 안지오텐신 II(140ng/kg/min)를 주입하기 위해 삼투성 미니 펌프(Alzet, 모델 2002)를 이식했습니다. 혈압은 꼬리 커프 를 통해 매주 모니터링되었습니다. 삼투압 미니펌프를 이식하기 위한 프로토콜은 이전에 보고된바 있다 21. 테일-커프는 아래에 간략하게 요약된 바와 같이 수행되었다. 꼬리 커프와 같은 혈압을 측정하는 비침습적 방법은 영지생물 생쥐의 FMT 연구에 적합합니다. 테일 커프를 수행하는 방법에 대한 자세한 단계는 이전에 설명되었습니다22.
<ol><li>간단히 말해서, gnotobiotic isolators에서 마우스를 회수하고 테일 커프 기계 플랫폼과 마우스 홀더를 예열합니다.</li>
	<li>의식이 있는 마우스를 가열된 플랫폼에 구속하고 꼬리 커프 혈량 측정법을 사용하여 최소 3라운드의 수축기 압력 측정을 수집합니다. 적절한 측정일 3일 전에 연속 3일 동안 아래 단계를 수행하여 스트레스를 줄이기 위해 마우스를 제지하도록 훈련시킵니다.<ol><li>예열 된 홀더에 마우스를 부드럽게 넣고 꼬리를 바깥쪽으로 둡니다. 마우스에 스트레스가 가해지지 않도록 윗부분을 꼬집지 않고 조심스럽게 테이프로 감습니다.</li>
		<li>마우스를 홀더에 놓으십시오. 적응을 위해 시트로 덮인 3-5분 동안 플랫폼에 놓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>각 동물의 평균 수축기 혈압에 대한 모든 라운드의 측정값을 평균화합니다.</li>
</ol>5. 심혈관 변화에 대한 FMT 평가
<ol><li>혈압 측정 후, 마우스를 안락사시키고 섹션 2에 설명된 대로 맹장 내용물을 무균적으로 수집합니다.</li>
	<li>심장, 대동맥, 간, 장간막 동맥 및 신장을 포함한 장 및 기타 조직을 채취하여 심장 대사 건강에서 장내 미생물총의 역할을 조사합니다. 조직을 채취하려면 마우스에서 조직을 찾아 가위를 사용하여 절제하십시오.</li>
	<li>FMT23 후 장내 미생물총의 생착을 확인하기 위해 기증자 및 수용자 마우스에서 수집한 분변 샘플/맹장 내용물에 대한 메타게놈 시퀀싱 분석을 실행합니다. 미생물총의 성공적인 식민지화에 대한 첫 번째 증거는 기증자와 수혜자의 미생물군이 유사하다는 것을 확인하는 것입니다.</li>
	<li>채취한 장 조직에 Swiss-roll 기법(섹션 6 참조)을 사용하여 면역염색 및 조직학과 함께 형태학적 및 세포 발현 변화를 검사한다24.</li>
</ol>6. 장 만들기 스위스 롤
<ol><li>1일차<ol><li>70% 에탄올을 살포한 적절하게 안락사된 마우스에서 항문 쪽(후복막에 고정됨)에서 위 쪽으로 마우스 내장을 해부합니다. 분리된 위장관 전체를 인산염 완충 식염수(PBS)가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다. 위 끝에서 근위 끝을 부드럽게 잡고 주변 지방과 결합 조직을 손으로 제거합니다.</li>
		<li>소장 (맹장에서 두부)을 분리하고 각 길이로 Z 형 지그재그를 만듭니다. 이어서, 십이지장, 공장, 및 회장을 앞서 기술한 바와 같이 연속적으로 절단하여 얻었다25. 맹장 아래의 장 부분을 절단하여 결장을 분리하십시오.</li>
		<li>십이지장, 공장, 회장 및 결장을 자릅니다.</li>
		<li>장을 찢지 않도록 주사기와 볼 팁이 달린 바늘로 PBS를 사용하여 내부를 씻어 내고 씻으십시오.</li>
		<li>내장을 여과지에 올려 놓으십시오. 단면 이름(예: 십이지장)으로 용지에 레이블을 지정한 다음 오른쪽 상단 모서리에 근위부에 'P'를, 오른쪽 하단 모서리에 원위부에 'D'를 표시합니다.</li>
		<li>볼팁 가위로 내장을 세로로 자릅니다. 여과지의 내장을 엽니 다. 필요에 따라 더 많은 PBS로 세척하십시오.</li>
		<li>두 개의 여과지 사이에 내장을 끼우십시오. 내장 근처의 4개 지점/모서리에 여과지를 스테이플링합니다.</li>
		<li>10 % 포르말린 중성 완충액 (인산 나트륨 4.0g, 일 염기성, 인산 나트륨 6.5g, 2 염기성, 37 % 포름 알데히드 100mL, 증류수 900mL)에 담그십시오. 플랫폼 로커를 사용하여 실온에서 5rpm으로 밤새 흔듭니다.</li>
	</ol></li>
	<li>2일차<ol><li>증류수에 2% 아가로스를 준비하고 알루미늄 호일로 덮인 비커에서 교반 막대로 가열합니다.</li>
		<li>조직을 회수하십시오. 상단 여과지를 벗겨냅니다. 근위부에서 내장을 굴려 근위부가 먼저 안쪽으로 들어가도록 하고 안쪽으로 굴려서 내강도 슬라이드 안쪽에 오도록 합니다. 필요에 따라 30G 바늘 또는 두 개로 고정합니다.</li>
		<li>일회용 졸업 파이펫을 사용하여 1mL의 아가로스를 흡인하고 조직의 기포를 피하면서 평평한 표면의 롤링된 내장 섹션에 아가로스를 붓습니다.</li>
		<li>용란증을 식히고 굳히십시오. 면도날을 사용하여 조직 부분 주변의 여분의 아가로스를 다듬습니다.</li>
		<li>조직 처리/내장 카세트에 내장 섹션을 넣습니다(아가로스로 인해 증가된 높이를 수용하기 위해 일반 카세트보다 큼). 4 °C에서 70 % 에탄올에 담그십시오.</li>
		<li>파라핀이 포매된 조직 슬라이드를 준비하고 아래에 설명된 대로 면역염색을 진행합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>7. 장의 면역 염색
<ol><li>탈파라핀화<ol><li>랙에 슬라이드가있는 다음 욕조를 통과하십시오 : 3 분 동안 크실렌, 3 분 동안 다시 신선한 크실렌, 3 분 동안 100 % 에탄올 (1 : 1)이 함유 된 크실렌, 3 분 동안 95 % 에탄올, 3 분 동안 70 % 에탄올, 3 분 동안 50 % 에탄올.</li>
		<li>흐르는 차가운 수돗물로 부드럽게 헹굽니다. 수돗물 욕조에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>항원 검색<ol><li>탈파라핀화 후, 항원 회수 완충액(pH 6에서 0.01M 시트르산삼나트륨 이수화물 및 0.05% 트윈-20)의 수조에서 20분 동안 슬라이드를 끓입니다.</li>
		<li>차가운 수돗물 아래에서 실행하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>얼룩<ol><li>욕조에서 슬라이드를 꺼내고 젖은 실험실 물티슈/종이 타월이 바닥에 있는 슬라이드 상자에 티슈를 뒤집어 놓습니다. 소수성 마커 펜으로 조직 주위에 윤곽을 그립니다.</li>
		<li>트리스 완충 식염수(TBS) + 0.025% 트리톤 X-100을 조직에 떨어뜨리고 5분 동안 배양합니다. 이 단계를 반복합니다.</li>
		<li>TBS + 10% 소 태아 혈청(FBS) + 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 실온에서 2시간 동안 차단합니다. 슬라이드를 옆으로 돌리고 실험실 와이프에서 차단 버퍼를 제거합니다.</li>
		<li>1차 항체 용액을 첨가하고 4°C에서 최소 2시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다. TBS + 0.025% Triton X-100으로 절편에 ~200μL를 부드럽게 피펫팅하여 부드럽게 세척합니다.</li>
		<li>2차 항체 용액을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양한다. 7.3.4단계에서와 같이 피펫으로 헹구어 슬라이드를 TBS로 3 x 5분 동안 헹굽니다.</li>
		<li>장착 매체와 커버슬립이 있는 장착.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2021+update%3A+a+report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report From the American Heart Association.</a> Circulation. 143 (8), 254(2021).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+in+prediabetes+and+diabetes%3A+a+population-based+cross-sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota in prediabetes and diabetes: a population-based cross-sectional study.</a> Cell Metabolism. 32 (3), 379-390 (2020).</li>
<li>Crovesy, L., Masterson, D., Rosado, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profile+of+the+gut+microbiota+of+adults+with+obesity%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Profile of the gut microbiota of adults with obesity: a systematic review.</a> European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1251-1262 (2020).</li>
<li>Avery, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiome+in+hypertension%3A+recent+advances+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The gut microbiome in hypertension: recent advances and future perspectives.</a> Circulation Research. 128 (7), 934-950 (2021).</li>
<li>Perez-Matute, P., Iniguez, M., de Toro, M., Recio-Fernandez, E., Oteo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+fecal+transplantation+from+a+lean+state+potentiates+caloric+restriction+effects+on+body+weight+and+adiposity+in+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Autologous fecal transplantation from a lean state potentiates caloric restriction effects on body weight and adiposity in obese mice.</a> Scientific Reports. 10 (1), 9388(2020).</li>
<li>Zoll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+microbiota+transplantation+from+high+caloric-fed+donors+alters+glucose+metabolism+in+recipient+mice%2C+independently+of+adiposity+or+exercise+status%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Fecal microbiota transplantation from high caloric-fed donors alters glucose metabolism in recipient mice, independently of adiposity or exercise status.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 319 (1), 203-216 (2020).</li>
<li>Hvas, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+microbiota+transplantation+is+superior+to+fidaxomicin+for+treatment+of+recurrent+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Fecal microbiota transplantation is superior to fidaxomicin for treatment of recurrent Clostridium difficile infection.</a> Gastroenterology. 156 (5), 1324-1332 (2019).</li>
<li>Kootte, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+insulin+sensitivity+after+lean+donor+feces+in+metabolic+syndrome+is+driven+by+baseline+intestinal+microbiota+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Improvement of insulin sensitivity after lean donor feces in metabolic syndrome is driven by baseline intestinal microbiota composition.</a> Cell Metabolism. 26 (4), 611-619 (2017).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+dysbiosis+contributes+to+the+development+of+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota dysbiosis contributes to the development of hypertension.</a> Microbiome. 5 (1), 14(2017).</li>
<li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restructuring+the+gut+microbiota+by+intermittent+fasting+lowers+blood+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Restructuring the gut microbiota by intermittent fasting lowers blood pressure.</a> Circulation Research. 128 (9), 1240-1254 (2021).</li>
<li>Zhong, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Washed+microbiota+transplantation+lowers+blood+pressure+in+patients+with+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Washed microbiota transplantation lowers blood pressure in patients with hypertension.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 679624(2021).</li>
<li>Ferguson, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+dietary+salt-induced+dendritic+cell+activation+underlies+microbial+dysbiosis-associated+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension.</a> JCI Insight. 5 (13), 126241(2019).</li>
<li>Yu, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+microbiota+transplantation+for+the+improvement+of+metabolism+in+obesity%3A+The+FMT-TRIM+double-blind+placebo-controlled+pilot+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fecal microbiota transplantation for the improvement of metabolism in obesity: The FMT-TRIM double-blind placebo-controlled pilot trial.</a> PLoS Medicine. 17 (3), 1003051(2020).</li>
<li>Leong, K. S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fecal+microbiome+transfer+in+adolescents+with+obesity%3A+the+gut+bugs+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Network+Open%22%5BJournal%5D)">Effects of fecal microbiome transfer in adolescents with obesity: the gut bugs randomized controlled trial.</a> JAMA Network Open. 3 (12), 2030415(2020).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+fecal+microbiota+transplantation+on+obesity+and+metabolic+syndrome-a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Impact of fecal microbiota transplantation on obesity and metabolic syndrome-a systematic review.</a> Nutrients. 11 (10), 2291(2019).</li>
<li>Laubitz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+gut+microbiota+recovery+after+antibiotic+exposure+in+young+and+old+mice+%28a+pilot+study%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Dynamics of gut microbiota recovery after antibiotic exposure in young and old mice (a pilot study).</a> Microorganisms. 9 (3), 647(2021).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fat+feeding+rather+than+obesity+drives+taxonomical+and+functional+changes+in+the+gut+microbiota+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">High-fat feeding rather than obesity drives taxonomical and functional changes in the gut microbiota in mice.</a> Microbiome. 5 (1), 43(2017).</li>
<li>Brunt, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+the+gut+microbiome+ameliorates+age-related+arterial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Suppression of the gut microbiome ameliorates age-related arterial dysfunction and oxidative stress in mice.</a> The Journal of Physiology. 597 (9), 2361-2378 (2019).</li>
<li>Choo, J. M., Rogers, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+transplantation+for+colonization+of+germ-free+mice%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota transplantation for colonization of germ-free mice.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100610(2021).</li>
<li>Kim, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+transplant+from+resveratrol-fed+donors+improves+glycaemia+and+cardiovascular+features+of+the+metabolic+syndrome+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Fecal transplant from resveratrol-fed donors improves glycaemia and cardiovascular features of the metabolic syndrome in mice.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 511-519 (2018).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+angiotensin+II+infusion+using+osmotic+pumps+induces+aortic+aneurysms+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (103), e53191(2015).</li>
<li>Wang, Y., Thatcher, S. E., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+blood+pressure+using+a+noninvasive+tail+cuff+method+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring blood pressure using a noninvasive tail cuff method in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1614, 69-73 (2017).</li>
<li>Ishimwe, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+and+short-chain+fatty+acids+profile+in+postural+orthostatic+tachycardia+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota and short-chain fatty acids profile in postural orthostatic tachycardia syndrome.</a> Frontiers in Physiology. 13, 879012(2022).</li>
<li>Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Swiss-rolling+technique+for+intestinal+tissue+preparation+for+immunohistochemical+and+immunofluorescent+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54161(2016).</li>
<li>Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%26%2334%3BSwiss+roll%26%2334%3B%3A+a+simple+technique+for+histological+studies+of+the+rodent+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">The &#34;Swiss roll&#34;: a simple technique for histological studies of the rodent intestine.</a> Laboratory Animals. 15 (1), 57-59 (1981).</li>
<li>Ishimwe, J. A., Garrett, M. R., Sasser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1%2C3-Butanediol+attenuates+hypertension+and+suppresses+kidney+injury+in+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">1,3-Butanediol attenuates hypertension and suppresses kidney injury in female rats.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 319 (1), 106-114 (2020).</li>
<li>Bokoliya, S. C., Dorsett, Y., Panier, H., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+fecal+microbiota+transplantation+in+murine+microbiome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Procedures for fecal microbiota transplantation in murine microbiome studies.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711055(2021).</li>
<li>Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+adoptive+transfer+of+high+salt+treated+antigen-presenting+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59124(2019).</li>
<li>Harrison, D. G., Marvar, P. J., Titze, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+inflammatory+cells+in+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vascular inflammatory cells in hypertension.</a> Frontiers in Physiology. 3, 128(2012).</li>
<li>Sylvester, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splenocyte+transfer+from+hypertensive+donors+eliminates+premenopausal+female+protection+from+ANG+II-induced+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Splenocyte transfer from hypertensive donors eliminates premenopausal female protection from ANG II-induced hypertension.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (3), 245-257 (2022).</li>
<li>Reikvam, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+murine+intestinal+microbiota%3A+effects+on+gut+mucosa+and+epithelial+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Depletion of murine intestinal microbiota: effects on gut mucosa and epithelial gene expression.</a> PLoS One. 6 (3), 17996(2011).</li>
<li>Le Roy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+microbiota+engraftment+following+fecal+microbiota+transfer+in+mice+models%3A+age%2C+kinetic+and+microbial+status+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of microbiota engraftment following fecal microbiota transfer in mice models: age, kinetic and microbial status matter.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3289(2019).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+microbiota+transplantation+alleviated+Alzheimer%27s+disease-like+pathogenesis+in+APP%2FPS1+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Translation+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Fecal microbiota transplantation alleviated Alzheimer's disease-like pathogenesis in APP/PS1 transgenic mice.</a> Translation Psychiatry. 9 (1), 189(2019).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+the+microbiota+in+CX%283%29CR1%28%2B%29+intestinal+mononuclear+phagocyte+regulation+of+intestinal+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Critical role for the microbiota in CX(3)CR1(+) intestinal mononuclear phagocyte regulation of intestinal T cell responses.</a> Immunity. 49 (3), 151-163 (2018).</li>
<li>Hintze, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+scope+method+for+creating+humanized+animal+models+for+animal+health+and+disease+research+through+antibiotic+treatment+and+human+fecal+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer.</a> Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).</li>
<li>Wilde, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tail-cuff+technique+and+its+influence+on+central+blood+pressure+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Tail-cuff technique and its influence on central blood pressure in the mouse.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (6), 005204(2017).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fiber+diet+mitigates+maternal+obesity-induced+cognitive+and+social+dysfunction+in+the+offspring+via+gut-brain+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">High-fiber diet mitigates maternal obesity-induced cognitive and social dysfunction in the offspring via gut-brain axis.</a> Cell Metabolism. 33 (5), 923-938 (2021).</li>
</ol>

금전적 또는 기타 이해 상충은 저자에 의해 선언되지 않습니다.

심혈관 및 대사 질환에서 장내 미생물총의 인과적 역할을 연구하는 귀중한 접근 방식은 전체 미생물군 또는 선별된 관심 종을 무균 마우스로 옮기는 것입니다. 여기에서 우리는 고혈압 장애에서 장내 미생물총의 역할을 연구하기 위해 인간과 전통적으로 수용된 쥐의 배설물 샘플을 무균 생쥐로 수집하는 프로토콜을 설명합니다.
생쥐에서는 호기성실에서 처리 된 무균 수집 맹장 내용물을 사용하고 인간에서는 대변을 수집합니다. FMT는 샘플이 아직 신선하거나 액체 질소에서 급속 냉동된 상태에서 즉시 수행할 수 있으며 사용할 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 인간이 집에서 샘플을 수집하는 경우와 같이 샘플을 즉시 얼릴 수 없는 경우 에탄올과 같은 핵산에 방부제를 사용하는 것이 중요합니다. 장내 대부분의 박테리아는 혐기성 세균입니다. 이식을 위해 분변 샘플을 준비할 때, 박테리아가 호기성 환경에 노출되는 것을 피하기 위해 신속하게 이루어져야 하는데, 이는 혼합물 내의 혐기성 세균의 감...

심장병과 뇌졸중을 포함한 심장 대사 장애는 전 세계 주요 사망 원인입니다1. 신체 활동 부족, 영양 부족, 노화 및 유전학은 이러한 장애의 병태생리학을 조절합니다. 축적된 증거는 장내 미생물군이 제2형 당뇨병2, 비만3, 고혈압4을 포함한 심혈관 및 대사 장애에 영향을 미친다는 개념을 뒷받침하며, 이는 이러한 질병에 대한 새로운 치료법 개발의 열쇠가 될 수 있습니다.
미생물군이 질병을 일으키는 정확한 메커니즘은 아직 알려지지 않았으며, 부분적으로는 방법론적 차이로 인해 현재 연구는 매우 다양합니다. 분변 미생물군 이식(FMT)은 질병 병태생리학에서 전체 미생물군 또는 분리된 종의 직접적인 역할을 설명하는 귀중한 접근 방식입니다. FMT는 표현형을 유도하거나 억제하기 위해 동물 연구에서 널리 사용됩니다. 예를 들어, 칼로리 섭취 및 포도당 대사는 배설물을 아픈 기증자로부터 건강한 수혜자에게 전달함으로써 조절될 수 있다 5,6. 인간의 경우, FMT는 클로스트리디움 디피실 감염이 재발하는 환자에게 안전한 치료 옵션인 것으로 나타났다7. 심혈관 질환 관리에 대한 사용을 뒷받침하는 증거가 나타나고 있습니다. 예를 들어, 희박한 대사 증후군 환자에서 FMT는 인슐린 감수성을 개선한다8. 장내 dysbiosis는 또한 인간 및 설치류 연구모두에서 고혈압과 관련이 있습니다 9,10,11. 무균 생쥐에 고염식을 먹인 생쥐의 FMT는 수혜자가 염증과 고혈압에 걸리기 쉽다12.
설치류에서 FMT 성공률이 높음에도 불구하고 번역 문제는 여전히 남아 있습니다. 비만과 대사증후군을 치료하기 위해 FMT를 사용한 임상 시험은 이러한 장애에 대한 영향이 미미하거나 전혀 없음을 나타냅니다13,14,15. 따라서 심장 대사 장애 치료를 위해 장내 미생물군을 표적으로 하는 추가 치료 방법을 식별하기 위해서는 더 많은 연구가 필요합니다. 장내 미생물군과 심혈관 질환에 대한 이용 가능한 증거의 대부분은 연관성이 있습니다. 설명된 프로토콜은 질병과 장내 미생물군 사이의 연관성을 보여주고 장내 모든 부분의 무결성을 직접 평가하기 위해 FMT와 스위스 롤링 기술의 조합을 활용하는 방법에 대해 논의합니다16,17,18.
이 방법의 전반적인 목표는 실험적 심혈관 질환에서 장내 미생물군집의 영향을 연구하기 위한 지침을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜은 생리학적 번역을 촉진하고 결과의 엄격함과 재현성을 높이기 위해 실험 설계에서 더 많은 세부 사항과 주요 고려 사항을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost</td><td>ThermoFisher</td><td>B40932</td><td></td></tr><tr><td>혐기성 챔버</td><td>COY</td><td>7150220</td><td></td></tr><tr><td>Apolipoprotein AI</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-52979</td><td></td></tr><tr><td>동맥 가위 - 볼 팁</td><td>Fine Science Tools</td><td>14086-09</td><td></td></tr><tr><td>표백제 솔루션</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-412-53</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Fisher Scientific</td><td>B14</td><td></td></tr><tr><td>CD3 항체</td><td>ThermoFisher</td><td>&nbsp; 14-0032-82</td><td></td></tr><tr><td>CD68 단클론 항체</td><td>ThermoFisher</td><td>14-0681-82</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-004-221</td><td></td></tr><tr><td>CODA 고처리량 모니터</td><td>Kent Scientic Corporation</td><td>CODA-HT8</td><td></td></tr><tr><td>극저온 바이알</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-26</td><td></td></tr><tr><td>일회용 대학원 전사 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>137119AM</td><td></td></tr><tr><td>일회용 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-2A</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA33361M1</td><td></td></tr><tr><td>Feeding Needle</td><td>Fine Science Tools</td><td>18061-38</td><td></td></tr><tr><td>여과지 시트</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-802</td><td></td></tr><tr><td>포르말린 (10%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-581</td><td></td></tr><tr><td>고염 다이어트</td><td>Teklad</td><td>TD.03142</td><td></td></tr><tr><td>OMNIgene.GUT</td><td>DNAgenotek</td><td>OM-200+ACP102</td><td></td></tr><tr><td>오스모틱 미니 펌프</td>스 <td>Alzet</td><td>&nbsp; 모델 2002</td><td></td></tr><tr><td>PAP 펜</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS4050</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-18C</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>세릴 인산염 완충 식염수</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ61196AP</td><td></td></tr><tr><td>스마트 주걱</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0133733</td><td></td></tr><tr><td>대변 수집 장치</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-203-7255</td><td></td></tr><tr><td>TBS 버퍼</td><td>Fisher Scientific</td><td>R017R.0000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td> 9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Varimix 플랫폼 로커</td><td>Fisher Scientific</td><td>09047113Q</td><td></td></tr><tr><td>Vortex 믹서</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>02-215-41</td><td></td></tr><tr><td>크실렌</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>1330-20-7, 100-41-4</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐 분변 분리 및 미생물군 이식

Murine Fecal Isolation and Microbiota Transplantation

장내 미생물 dysbiosis는 심혈관 및 대사 장애의 병태생리학에서 중요한 역할을 하지만 그 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 분변 미생물군 이식(FMT)은 질병 병태생리학에서 전체 미생물군 또는 분리된 종의 직접적인 역할을 설명하는 귀중한 접근 방식입니다. 재발성 클로스트리디움 디피실 감염 환자에게 안전한 치료 옵션입니다. 전임상 연구에 따르면 장내 미생물군을 조작하는 것이 dysbiosis와 질병 사이의 기계적 연관성을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 분변 미생물군 이식은 심혈관 질환의 관리 및 치료를 위한 새로운 장내 미생물군 표적 치료제를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 설치류의 높은 성공률에도 불구하고 이식과 관련된 번역 변화가 남아 있습니다. 여기서 목표는 실험적 심혈관 질환에서 장내 미생물군집의 영향을 연구하는 데 지침을 제공하는 것입니다. 이 연구에서는 쥐 연구에서 분변 미생물총의 수집, 취급, 처리 및 이식에 대한 자세한 프로토콜이 설명됩니다. 수집 및 처리 단계는 인간 및 설치류 기증자 모두에 대해 설명됩니다. 마지막으로, 우리는 심혈관 질환 및 관련 장내 미생물군 메커니즘의 장 특이적 형태 및 무결성 변화를 평가하기 위해 스위스 롤링 및 면역 염색 기술의 조합을 사용하여 설명합니다.

위에서 설명한 단계는 그림 1에 요약되어 있습니다. 마우스 맹장 내용물 또는 인간 배설물을 멸균 식염수에 재현탁하여 먼저 연속 3일 동안, 그 다음 3일에 한 번씩 위관영양법으로 무균 마우스(100μL)에게 제공할 슬러리를 제조합니다. 프로토콜이 끝나면 꼬리 커프 방법으로 혈압을 측정하고 마우스를 안락사시키고 조직을 채취하여 장내 미생물총의 변화와 심혈관 및 대사 변화를 평가합니다.
미생물군을 선택하는 핵심 단계는 관심 있는 질병 표현형이 기증자에게 존재하고 dysbiotic 변화와 관련이 있는지 확인하는 것입니다. 예를 들어, 고염식은 dysbiosis와 심혈관 기능 장애와 밀접한 관련이 있습니다. 이 연구에서는 8% NaCl 식단을 먹인 마우스 기증자를 사용했습니다. 높은 염분에 대한 장내 미생물총의 변화에는 박테리아 생물다양성의 감소가 포함되었으며(그림 2A), 이는 ...

여기서 목표는 심혈관 질환에서 dysbiosis의 메커니즘을 조사하기 위한 프로토콜을 설명하는 것입니다. 이 논문은 쥐 분변 샘플을 무균적으로 수집 및 이식하고, 장을 분리하고, "Swiss-roll" 방법을 사용한 다음 면역염색 기술을 사용하여 위장관의 변화를 조사하는 방법에 대해 설명합니다.

Gut microbiota dysbiosis plays a role in the pathophysiology of cardiovascular and metabolic disorders, but the mechanisms are not well understood. Fecal ...

여기에서 우리는 대변 샘플 수집에서 장의 변화를 연구하기 위해 스위스 롤 방법을 사용하는 것까지 질병의 dysbiosis의 메커니즘을 조사하는 데 다른 사람들을 안내하는 프로토콜을 설명했습니다. 먼저 안락사된 쥐의 가슴과 옆구리에 70% 에탄올을 뿌리고 피부와 복강을 조심스럽게 열어 위장관을 노출시킵니다. 맹장을 분리하고 멸균 수술 용 가위를 사용하여 반으로 자릅니다.맹장을 잠깐 노출시키고 회장에서 근위부로 0.5cm, 결장과의 접합부에서 원위부로 0.5cm를 자릅니다. 분리된 맹장을 멸균된 페트리 접시에 옮깁니다. 멸균 주걱을 사용하여 맹장 내용물을 멸균 튜브로 옮기고 분취량을 섭씨 80도 냉동고에 보관하십시오.신선하거나 이전에 냉동된 배설물 펠릿을 멸균 식염수에 1 내지 20 비율로 다시 현탁하고 균질화될 때까지 소용돌이친다. 균질액을 30마이크로미터 기공 나일론 필터에 통과시켜 큰 입자상 물질을 제거합니다. 79G에서 5분 동안 원심분리하고, 이식에 사용할 상층액을 수집한다.무균 수용자 마우스당 슬러리를 100 마이크로리터의 경구 위관영양법으로 연속 3일 동안 위관영양하고, 2주 동안 3일마다 위관영양법을 시행하였다. 예열된 마우스 홀더의 고정 장치에 마우스를 부드럽게 놓고 꼬리를 바깥쪽에 둡니다. 마우스에 스트레스가 가해지지 않도록 꼬집지 않고 조심스럽게 상단을 테이프로 감습니다.마우스를 홀더에 놓고 테일 커프 기계 플랫폼에 3-5분 동안 놓고 시트로 덮어 적응시킵니다. 꼬리 커프 혈량 측정법을 사용하여 최소 3라운드의 수축기 혈압 측정값을 수집하고 각 동물의 평균 수축기 혈압에 대한 모든 라운드의 측정값을 평균합니다. 안락사 된 마우스에서 맹장 내용물을 무균 적으로 수집합니다.내장 및 기타 조직을 채취하려면 마우스에서 조직을 찾아 가위로 절제하여 심장 대사 건강에서 장내 미생물총의 역할을 조사합니다. 첫째 날에는 항문 쪽에서 위 쪽으로 쥐의 내장을 해부합니다. 그리고 분리된 위장관 전체를 PBS가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다.위 끝에서 근위 끝을 부드럽게 당기고 주변 지방과 결합 조직을 손으로 제거합니다. 소장을 분리하고 각 길이마다 Z 형 지그재그를 만듭니다. 그런 다음 십이지장, 공장 및 회장을 얻기 위해 절단합니다.맹장 아래의 장 부분을 절단하여 결장을 분리하십시오. 십이지장, 공장, 회장 및 결장을 자릅니다. 주사기와 볼 팁이 있는 바늘을 사용하여 장을 찢지 않고 PBS로 내장을 조심스럽게 씻어내고 씻습니다.거트를 여과지에 놓고 섹션 이름을 종이에 붙인 다음 왼쪽 상단 모서리에 근위부에 P를, 왼쪽 하단 모서리에 원위부에 D를 표시합니다. 볼팁 가위로 내장을 세로로 자릅니다. 여과지의 내장을 열고 필요에 따라 더 많은 PBS로 씻으십시오.두 개의 여과지 사이에 내장을 끼우고 내장 근처의 네 지점 또는 모서리에 여과지를 스테이플링합니다. 10% 포르말린 중성 완충 용액에 담그고 플랫폼 로커를 사용하여 실온에서 밤새 5rpm으로 흔들어 줍니다. 둘째 날에, 알루미늄 호일로 덮인 비이커에서 교반 막대로 증류수에 준비된 2 % 아가로스를 가열한다.조직을 회수하려면 상부 여과지를 벗겨내고 근위부에서 내장을 굴려 근위부가 먼저 안쪽으로 들어가도록 하고 안쪽으로 굴려서 내강이 슬라이드 안쪽에도 오도록 합니다. 필요에 따라 30게이지 바늘 한두 개로 고정합니다. 일회용 졸업 파이펫을 사용하여 1 밀리리터의 아가로스를 흡인하고 조직의 기포를 피하면서 평평한 표면의 압연 된 내장 부분에 아가로스를 붓습니다.아가로스가 식고 굳은 후 면도날을 사용하여 조직 섹션 주변의 여분의 아가로스를 다듬습니다. 마지막으로 장 부분을 조직 처리 또는 내장 카세트에 넣고 섭씨 4도에서 70 % 에탄올에 담급니다. 정상적인 염분 사료와 고염 사료를 섭취한 쥐에서 얻은 맹장 함량의 종 생물다양성 추정치가 여기에 나와 있습니다.높은 염분에 대한 장내 미생물총의 변화에는 박테리아 생물다양성의 감소가 포함되었습니다. 비미터법 다차원 스케일링은 정상 염분 및 고염식 생쥐의 박테리아가 별도의 클러스터를 형성한다는 것을 보여줍니다. 높은 염분은 Firmicutes 대 Bacteroidetes 비율 증가와 관련이 있습니다.고염분 먹이 마우스의 분변 미생물군 이식은 무균 마우스를 안지오텐신 II 유발 고혈압에 걸리게 합니다. 고염분 유도 dysbiotic 장내 미생물군을 옮기는 것은 정상 염분 장내 미생물군을 투여받은 쥐에 비해 무균 쥐에서 수축기 혈압이 크게 증가하는 것과 관련이 있었습니다. 대표적인 이미지는 단백뇨가 없거나 없는 고지혈증이 있는 마우스에서 얻은 장골에서 아포지단백 A-I 염색을 보여줍니다.이 프로토콜은 인간과 설치류 기증자 모두에 대한 주요 실험 고려 사항에서 성공적인 FMT를 달성하기 위한 단계를 조정합니다.

murine-fecal-isolation-and-microbiota-transplantation

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

마우스 작은 창자 이식 모델은 면역 거부하고 화면의 새로운 immunosuppressive 약물 mechanismes을 연구하는 중요한 도구로 인식되었습니다. 그러나이 모델은 관련된 기술이 매우 기술적으로 도전하기 때문에 사용하는 제한됩니다. 이제 우리는 수정 기법을 소개합니다.

마우스에 작은 창자 이식

이 비디오는 기능적인 인간 면역 체계와 안정적인 생착 인간과 유사한 장내 미생물 군집을 가진 이중 인간화 뼈 BLT(골수, 간 및 흉선) 마우스를 생성하는 방법을 보여줍니다.

이중 인간화 BLT(Bone-Marrow, Liver, Thymus) 마우스 모델 생성

이 비디오는 결장 염증이 있는 인터루킨-10 결핍 마우스의 대변 미생물군 이식 절차를 보여줍니다. 장내 집락화된 대변 미생물은 2차 대사 산물을 방출하여 항염증성 사이토카인 방출을 유도하고 대장 염증을 감소시킵니다.

인터루킨-10 결핍 마우스에서 분변 미생물군 이식의 효과 평가

대장 내시경 검사를 통해 분변 미생물 이식은 재발 및 불응 C.difficile 감염에 대한 안전하고 효과적인 치료입니다. 대장 내시경 검사 중 환자와 기증자 선별, 대변의 준비, 대변의 전달에 대한 체계적인 접근은 치료의 성공을 극대화합니다.

재발을위한 대장 내시경 검사를 통해 분변 미생물 이식 C. 남과 어울리지 않는 감염

우리는 기능적인 인간적인 면역 계통 및 안정한 생착한 인간 같이 창자 microbiome를 특징으로 하는 이중 인간화한 BLT 마우스를 생성하기 위한 새로운 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 세균이 없는 마우스 또는 뇨바이오틱 시설에 대한 필요 없이 따를 수 있다.

안정된 인간과 같은 장내 미생물군유전체와 인간 면역 체계를 특징으로 하는 이중 인간화 BLT 마우스 모델

유전 적 감수성, 점막 면역 및 장내 미세 생태 학적 환경의 상호 작용은 염증성 장 질환 (IBD)의 발병 기전에 관여합니다. 이 연구에서는 IL-10 결핍 마우스에 분변 미생물 이식을 적용하고 결장 염증 및 심장 기능에 미치는 영향을 조사했습니다.

인터루킨 10-결핍 마우스 모델에서 분변 미생물 이식의 치료 평가

이 프로토콜은 무균 마우스를 실험용 단일 케이지 아이솔레이터(isocage)로 옮기고 수용하는 동시에 멸균 상태를 유지하기 위한 모범 사례를 설명합니다. 무균 마우스에 대변 이식 방법과 추가 적용을 위해 이러한 장내 "인간화된" 마우스에서 생존 가능한 박테리아를 수집하는 방법에 대해 논의합니다.

무균 마우스에 인간 배설물 이식을 위한 Bioexclusion IsoPositive 케이지 실험의 준비 및 유지 관리

이 비디오에서는, 우리는 CD40 - 활성화 및 면역의 유도를 연구하는 모델 항원 제시 세포 (APC)로 사용할 수 있습니다 C57BL / 6 마​​우스 splenocytes에서 murine B 세포의 확장 프로 시저를 보여줍니다.

B 세포의 CD40 - 정품 인증 Murine 모델

이 연구는 단일 셀 문화를 생산하기 위해 마우스 구강의 잇몸 조직을 분리하고 처리 할 수​​있는 효율적인 방법을 설명합니다. 그 결과 세포는 더욱 유동 세포 계측법 분석 및 분자 연구에 사용할 수 있습니다.

쥐과 잇몸 세포의 분리, 처리 및 분석

림프절 기질 세포의 분리는 섬유아세포 망상 세포, 림프 및 혈액 내피 세포를 얻기 위한 효소 분해 및 기계적 분해를 포함하는 다단계 절차입니다. 설명된 절차에서는 짧은 분해와 자동화된 기계적 분해를 결합하여 생존 가능한 림프절 기질 세포의 표면 마커 저하를 최소화합니다.

쥐과 림프절 기질 세포의 분리

학습하세요 쥐 분변 수집 및 스위스 롤 방법을 이용한 심혈관 질환에서 장내 미생물 불균형 연구 방법을. 이 프로토콜은 무균 기술과 면역염색을 활용하여 장 조직 분석 및 미생물군 이식을 가능하게 합니다.

쥐 분변 분리 및 미생물군 이식

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