Name: Teleost 모델의 정자 수집 및 컴퓨터 보조 정자 분석 일본 메다 카 (Oryzias latipes) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: 배우세요 일본 메다카(Oryzias latipes) 정자 수집 및 컴퓨터 보조 정자 분석(CASA) 기법을 통해 생식 생물학 및 생태독성학 연구를 수행하는 방법을. 복부 마사지와 고환 절제법을 비교하고 정자 운동성을 정량적으로 평가합니다.

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이 연구는 노르웨이 생명 과학 대학과 미국 풀 브라이트 프로그램의 자금 지원을 받았습니다. 저자는 어류 시설 유지 보수를 위해 NMBU의 Anthony Peltier와 Lourdes Carreon G Tan과 INRAE (프랑스)의 ISC LPGP의 Guillaume Gourmelin에게 이러한 방법을 추가로 테스트 할 수있는 어류 및 실험실 공간을 제공 한 것에 대해 감사드립니다.

모든 실험 및 동물 취급은 노르웨이 생명 과학 대학 (NMBU)의 실험 동물 복지에 대한 권고에 따라 수행되었습니다. 실험은 NMBU (노르웨이 Ås)에서 자란 성인 (6-9 개월) 수컷 일본 메다 카 (Hd-rR 균주)를 사용하여 수행되었습니다. 이 방법은 또한 국립 농업, 식품 및 환경 연구소 (INRAE, Rennes, France)에서 자란 9 개월 된 수컷 일본 메다 카 (CAB 균주)에서 간단히 테스트되었습니다.
1. 기기 및 용액 준비
<ol><li>마취 원액 (0.6 % 트리 카인)을 준비하십시오.<ol><li>0.6x 인산염 완충 식염수(PBS) 100mL에 트리카인(MS-222)을 희석합니다.</li>
		<li>마취 원액 2mL를 50 2 mL 플라스틱 튜브에 분취하고, 마취 또는 안락사에 사용될 때까지 -20°C에서 보관한다.</li>
	</ol></li>
	<li>회수수 (0.9 % 염화나트륨 [NaCl] 용액)를 준비하십시오.<ol><li>3 L의 수족관 물에 27 g의 NaCl을 첨가하십시오.</li>
		<li>사용할 때까지 용액을 실온(RT)에서 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>필요한 경우 활성화 매체를 조정하십시오 (행크의 균형 잡힌 소금 용액 [HBSS]). 참고: HBSS는 상업적으로 구입하거나 실험실에서 만들 수 있습니다(재료 표).<ol><li>pH 측정기를 사용하여 HBSS의 pH를 측정합니다. 필요한 경우 염산 또는 수산화 나트륨을 사용하여 pH를 조정하여 최종 pH가 7.1-7.3이되도록합니다.</li>
		<li>향후 보고를 위해 삼투압계를 사용하여 HBSS의 삼투압 농도를 측정합니다. 알림: 상업용 제품의 범위는 266-294 mOsmol/kg입니다. 현재 연구에서 삼투압 농도는 287 mOsmol / kg이었습니다. 원하는 경우 삼투압을 줄이기 위해 증류수로 희석 할 수 있지만 150-300 mOsmol / kg HBSS에서 메다 카 정자의 활성화에 큰 차이가 없기 때문에 필요하지 않습니다.</li>
		<li>사용할 때까지 RT에 솔루션을 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>홀딩 스폰지를 준비하십시오.<ol><li>페트리 접시에 꼭 맞도록 부드러운 스폰지를 자릅니다.</li>
		<li>물고기를받을 수있을만큼 충분히 길고 (3-4cm) 깊이가 약 1cm 인 스폰지 중앙에서 직선을 자릅니다 (그림 1A). 스폰지의 이 슬릿은 배설강을 노출시키기 위해 물고기 복부 쪽을 위로 유지합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 정자 수집
알림: 정자 수집은 복부 마사지 또는 고환 해부의 두 가지 방법으로 수행 할 수 있습니다.
<ol><li>복부 마사지에 의한 정자 수집<ol><li>100mL 유리 용기에 수족관 물 38mL에 트리카인 스톡 (0.6 %) 튜브 1 개를 희석하여 0.03 % 마취액을 준비하십시오.</li>
		<li>끝이 뭉툭한 부드러운 집게와 10μL 일회용 보정 유리 마이크로피펫 및 흡인기 튜브 어셈블리를 포함한 기기를 준비합니다(그림 1A). 1.4단계에서 준비한 홀딩 스폰지를 마취액으로 적십니다.</li>
		<li>즉각적인 분석을 위해 36 μL의 활성화 용액이 있는 튜브를 준비합니다. 활성화 용액을 27°C로 설정된 수조 또는 인큐베이터에서 최소 5분 동안 예열합니다. 알림: 개별 물고기에서 샘플을 분석할 수 있지만 동일한 활성화 용액에서 여러 수컷의 샘플을 풀링하여 개별 변동을 줄일 수 있습니다. 여러 물고기의 샘플을 모을 때는 물고기 당 36 μL의 활성화 용액을 사용하십시오. 이 희석은 사용되는 메다카의 변형 또는 사육 조건에 따라 조정해야 할 수 있으며, 이러한 요인은 정자 농도와 부피에 영향을 미칠 수 있습니다. CASA 프로그램은 농도가 너무 높아 정자를 식별 할 수 없는지 여부를 나타냅니다.</li>
		<li>물고기를 30-90 초 동안 마취액에 넣어 마취하십시오. 알림: 마취 기간은 물고기의 크기에 따라 다르므로 조정해야합니다. 물고기가 완전히 마취되도록하려면 꼬리 꽃자루를 집게로 부드럽게 꼬집습니다. 물고기가 반응하지 않으면 마사지를 시작할 수 있습니다.</li>
		<li>마취액에서 물고기를 꺼내 종이 타월을 사용하거나 부드럽게 닦아 물고기의 복부를 말리십시오. 생선을 축축한 스폰지 복부 쪽이 위로 향하게 하여 아가미가 스폰지의 마취액에 노출되도록 합니다(그림 1B).</li>
		<li>배설물 주변이 젖은 경우 일회용 티슈 닦음으로 물고기의 밑면을 부드럽게 말리십시오.</li>
		<li>해부 현미경으로 홀딩 스폰지에 생선을 넣고 흡인기 튜브가 물고기의 배설강에 부착된 마이크로피펫을 놓습니다(그림 1C).</li>
		<li>뭉툭한 끝의 부드러운 집게를 주둥이에서 꼬리 동작으로 부드럽게 짜내면서 동시에 흡입하여 배출 된 암컷을 피펫에 모아 물고기의 복부를 마사지하십시오 (그림 1D).</li>
		<li>스폰지에서 물고기를 회복수로 방출하십시오. 수족관 시스템으로 되돌리기 전에 적어도 15 분 동안 용액에서 회복하도록하십시오.</li>
		<li>예열 된 활성화 용액과 피펫으로 준비된 튜브에 민트를 흡인기 튜브 어셈블리를 흡입하고 불어 여러 번 위아래로 옮깁니다.</li>
		<li>분석 전에 튜브를 튕겨서 희석된 정자를 부드럽게 균질화합니다. 참고: 최상의 결과를 얻으려면 활성화 후 즉시(예: 5초) 샘플을 분석하십시오. medaka에서는 정자가 몇 시간 동안 운동성을 유지하기 때문에 필요한 경우 분석이 지연 될 수 있지만 시간이 지남에 따라 운동성이 감소하므로 샘플간에 시간이 일정하게 유지되어야합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>고환 해부에 의한 정자 수집<ol><li>100 mL 유리 용기에 26 mL의 수족관 물에 2 개의 트리카인 스톡 튜브 (0.6 %)를 희석하여 0.08 % 안락사 용액을 준비하십시오.</li>
		<li>뭉툭하고 가는 집게와 작은 해부 가위를 포함한 해부 도구를 준비하십시오(그림 1E).</li>
		<li>즉각적인 분석을 위해 120μL의 활성화 용액으로 각 샘플에 대한 튜브를 준비합니다. 활성화 용액을 27°C로 설정된 수조 또는 인큐베이터에서 최소 5분 동안 예열합니다. 알림: 개별 물고기에서 샘플을 분석할 수 있지만 동일한 활성화 용액에서 여러 수컷의 샘플을 풀링하여 개별 변동을 줄일 수 있습니다. 여러 물고기의 샘플을 풀링하려면 물고기 당 120 μL의 활성화 용액을 사용하십시오. 이 희석은 사용되는 메다카의 변형 또는 사육 조건에 따라 조정해야 할 수 있으며, 이러한 요인은 정자 농도와 부피에 영향을 미칠 수 있습니다. CASA 프로그램은 농도가 너무 높아 정자를 식별 할 수 없는지 여부를 나타냅니다.</li>
		<li>물고기를 0.08 % 마취액에 30-90 초 동안 넣어 안락사시킵니다. 알림: 지속 시간은 물고기의 크기에 따라 다릅니다. 물고기가 안락사되도록하려면 수술실 운동이 중단 될 때까지 기다리십시오. 물고기는 집게의 접촉에 반응해서는 안됩니다.</li>
		<li>안락사 용액에서 생선을 제거하고 종이 타월로 생선을 부드럽게 말리거나 부드럽게 닦으십시오. 알림: 이 단계에서 물고기의 무게를 측정하여 나중에 생식선 체세포 지수(GSI, 생식선 체중/체중)를 계산할 수 있습니다.</li>
		<li>물고기의 왼쪽 측면이 위를 향하도록 해부 현미경 아래에 놓습니다(그림 1F).</li>
		<li>작은 해부 가위를 사용하여 배설강에서 등쪽으로 플랩을 자른 다음 갈비뼈를 가로 질러 아가미까지 잘라 내부 장기를 노출시킵니다 (그림 1G).</li>
		<li>고환을 찾아 가는 집게로 양쪽 끝의 부착물을 자르고 고환을 제거합니다(그림 1H). 알림: GSI를 계산하기 위해 이 단계에서 고환의 무게를 측정할 수 있습니다. 조직의 건조를 피하기 위해 신속하게 작업하십시오.</li>
		<li>예열 된 활성화 용액으로 준비된 튜브로 고환을 옮깁니다.</li>
		<li>집게를 사용하여 튜브 측면에 대해 고환을 여러 번 부수어 정자를 방출하십시오. 정자 방출은 일반적으로 시각화 될 수 있으며 용액을 약간 흐리게 만듭니다.</li>
		<li>분석 전에 튜브를 튕겨서 희석된 정자를 부드럽게 균질화합니다. 참고: 최상의 결과를 얻으려면 활성화 후 즉시(예: 5초) 샘플을 분석하십시오. medaka에서는 정자가 몇 시간 동안 운동성을 유지하기 때문에 필요한 경우 분석이 지연 될 수 있지만 시간이 지남에 따라 운동성이 감소하므로 샘플간에 시간이 일정하게 유지되어야합니다.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64326/64326fig01.jpg"> 그림 1: 복부 마사지(A-D) 및 고환 해부(E-H)에 의한 Milt 수집. (A) 복부 마사지 용 도구 : 스폰지, 무딘 부드러운 집게, 흡인기 튜브 어셈블리가있는 10μL 일회용 보정 유리 마이크로 피펫; (B) 스폰지와 배설강에서 마취에 노출 된 아가미가 위를 향하게하는 홀딩 스폰지에서 물고기의 위치; (C) 복부에 무딘 부드러운 집게의 위치와 배설강에 대한 마이크로 피펫; (D) 부드럽게 마사지하고 빨아 먹은 후 마이크로 피펫에 넣습니다. (E) 고환 해부용 도구 : 무딘 집게, 가는 집게, 작은 해부 가위; (F) 고환 해부를위한 물고기의 위치; (G) 내부 장기의 측면도; (H) 가는 집게로 양쪽 끝의 부착물을 절단하여 고환을 제거합니다. 스케일 바: 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64326/64326fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
3. CASA 시스템을 이용한 정자 분석
<ol><li>CASA 시스템(SCA Evolution)은 녹색 필터를 사용하는 현미경과 위상차가 있는 10x 대물렌즈로 설명서에 따라 설정해야 합니다.</li>
	<li>보온판 또는 27°C로 설정된 인큐베이터에서 최소 5분 동안 예열하여 일회용 20μm 계수 챔버 슬라이드를 준비합니다.</li>
	<li>정자 분석 소프트웨어를 열고 운동성 모듈을 선택합니다.</li>
	<li>그림 2B와 같이 medaka의 구성을 설정합니다.</li>
	<li>사전 예열된 일회용 20μm 계수 챔버 슬라이드를 현미경으로 27°C로 설정된 가열된 스테이지에 놓습니다.</li>
	<li>샘플이 과도하게 채워지지 않고 챔버를 채울 때까지 슬라이드의 챔버에 피펫팅합니다. 면봉으로 챔버 입구에서 과도한 샘플을 조심스럽게 닦아내거나 부드럽게 닦아 세포가 떠 다니는 것을 방지합니다.</li>
	<li>분석을 선택하여 현미경으로 샘플을 확인합니다. 알림: 현미경 아이콘이 빨간색이면 프로그램이 정자를 정확하게 추적하도록 현미경 조명을 조정해야합니다. 현미경의 밝기를 조정하여 정자의 꼬리 움직임을 명확하게 볼 수 있습니다. 아이콘은 파란색이어야 합니다.</li>
	<li>현미경에 초점이 맞춰져 있는지 확인하고 분석을 다시 선택하여 현장에서 정자를 기록합니다. 샘플의 새 영역이 프레임에 오도록 슬라이드를 이동하고 반복하여 3-5개의 다른 시야를 캡처합니다. 기포, 셀 덩어리 또는 인공물이 있는 필드를 피하십시오.</li>
	<li>결과를 선택하여 결과를 봅니다. 참고: 결과 페이지의 필드가 빨간색 윤곽선으로 표시되면 시스템의 프롬프트에 따라 집중력이나 운동성이 너무 많이 달라지는 필드를 삭제합니다.</li>
	<li>필드를 두 번 클릭하여 개별 필드에 대한 결과를 보거나 레이블이 잘못되었거나 추적되지 않은 정자가 있는지 수동으로 확인합니다. 필요한 경우 개별 정자를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 운동성을 다시 표시합니다(그림 2A).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64326/64326fig02.jpg"> 그림 2: SCA 에볼루션 소프트웨어 스크린샷 . (A) 한 필드에 대한 정자 추적 결과. 오른쪽에서 필드 데이터를 보고 spermatozoa를 두 번 클릭하여 개별 데이터를 봅니다. (B) 구성 메뉴가 열린 모든 필드에 대한 결과 요약. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64326/64326fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

삼투압은 물고기 정자36,37의 활성화에 중요한 요소입니다. 일반적으로, 정자는 고환에서 움직이지 않으며, 해양 어류의 경우 정액에 비해 고 삼투압 인 배지에서 운동성이되고, 민물 고기의 경우 정액에 비해 저 삼투압 (hypo-tricomtic)이됩니다37. 혈액과 유사하게, 민물 고기의 정액 혈장은 일반적으로 해양 어류보다 낮습니다 (400 mOsmol / kg에 비해 약 300 mOsmol / kg)22,37. 따라서 물고기 정자는 일반적으로 그들이 사는 물과 접촉하면 활성화되며,이 물은 정자 분석을위한 가장 좋고 가장 생물학적 활성화 매개체 역할을합니다. 그러나 복부 마사지 및 고환 박리로 샘플링 한 medaka 정자는 두 개의 다른 실험실에서 자란 Hd-rR 또는 CAB ...

일본 메다카는 동아시아가 원산지인 작은 알을 낳는 민물 텔레오스트 물고기입니다. Medaka는 생태 독성학, 발달 유전학, 유전체학, 진화 생물학 및 생리학 연구 1,2를위한 우수한 척추 동물 모델 시스템이되었습니다. 인기있는 제브라 피쉬와 유사하게, 그들은 번식하기 쉽고 많은 일반적인 물고기 질병 1,2에 매우 강합니다. 짧은 생성 시간, 투명한 배아 1,2 및 시퀀싱 된 게놈3을 포함하여 medaka를 모델로 사용하면 몇 가지 이점이 있습니다. 제브라 피쉬와 달리 메다 카는 성 결정 유전자 4뿐만 아니라 고온 (4-40 ° C) 및 염분 (유리할린 종) 내성5을 가지고 있습니다. 또한 생물학 연구를 용이하게하기 위해 프로토콜 6,7,8,9,10,11,12뿐만 아니라 많은 유전 및 해부학 적 도구가 medaka에서 개발되었습니다.
번식은 종이 영속할 수 있도록 하는 필수적인 생리적 기능입니다. 척추 동물 번식에는 여성의 난 모세포 생성과 남성의 정자 생산을 포함하여 정밀하게 조정 된 무수한 사건이 필요합니다. 정자는 정자 형성의 복잡한 과정을 통해 생산되는 독특한 세포로, 고품질 제품13의 전달을 보장하기 위해 여러 가지 체크 포인트가 있습니다. 배우자의 품질은 수정 성공과 유충 생존에 미치는 영향으로 인해 양식 및 어류 개체군 연구에서 초점이 되었습니다. 따라서 정자의 질은 척추 동물의 남성 생식력의 중요한 지표입니다.
물고기 정자의 질을 평가하는 세 가지 유용한 요소는 운동성, 진보성 및 수명입니다. 퍼센트 운동성과 점진적 운동성은 정자의 질을 나타내는 일반적인 지표이며, 이는 프로그레시브 운동이 필요하고 수정 성공과 밀접한 상관관계가 있기 때문입니다14,15. 대부분의 teleost 종에서 정자가 2 분 미만 동안 완전히 운동성을 유지하고 정자의 궤적이 일반적으로 포유류15보다 덜 선형이기 때문에 운동 지속 시간은 물고기에서 중요한 지표입니다. 그러나 과거에 정자 운동성을 평가하는 많은 연구는 정자를 분석하는 주관적 또는 반 정량적 방법에 의존했습니다15,16. 예를 들어, medaka의 정자 운동성은 과거에 현미경으로 시각적으로 추정되었습니다17. 또한 정자의 움직임을 기록하고 이미징 소프트웨어를 사용하여 프레임을 병합하고 수영 경로와 속도18,19,20을 측정하여 추정되었습니다. 이러한 접근법은 종종 견고성이 부족하여 분석15,21을 수행하는 사람에 따라 다른 결과를 제공합니다.
컴퓨터 보조 정자 분석 (CASA)은 처음에 포유류를 위해 개발되었습니다. CASA는 자동화된 방식으로 속도와 궤적을 기록하고 측정하여 정자의 질을 평가하는 빠른 정량적 방법입니다15. 어류에서는 정자의 질에 대한 여러 수질 오염 물질의 영향을 모니터링하고, 가금류를 개선하기위한 흥미로운 선조를 식별하고, 냉동 보존 및 저장의 효율성을 개선하고, 수정 조건을 최적화하기 위해 여러 종에서 사용되었습니다15. 따라서 다양한 척추 동물 종에서 정자의 질을 안정적으로 평가할 수있는 강력한 도구입니다. 그러나 물고기 간의 번식 전략의 중요한 다양성으로 인해 teleost 물고기의 정자는 포유류의 정자 및 한 물고기 종에서 다른 물고기 종으로 다릅니다. 배우자를 물에 방출하여 외부에서 알을 주로 수정하는 Teleost 물고기는 내부적으로 수정되어 물의 희석을 보상 할 필요는 없지만 더 점성이있는 유체를 견뎌야하는 포유류와 달리 선조체가없는 비교적 단순한 구조의 고농축 정자를 가지고 있습니다14. 또한 대부분의 물고기의 정자는 빠르게 움직이지만 활성화 후 2 분 미만 동안 완전히 운동성이 있지만 몇 가지 예외가 있습니다15,22. 대부분의 물고기에서 운동성이 급격히 감소 할 수 있기 때문에 물고기에 대한 정자 분석 프로토콜을 결정할 때 활성화 후 분석시기에 극도의주의를 기울여야합니다.
번식은 텔레오스트와 메다카가 모델 유기체로 광범위하게 사용된 생물학 분야 중 하나입니다. 실제로 메다카 수컷은 짝짓기보호 23,24와 같은 흥미로운 생식 및 사회적 행동을 보입니다. 또한이 종25,26,27에서 번식의 신경 내분비 조절을 연구하기 위해 여러 형질 전환 라인이 존재합니다. 큰 물고기에서는 비교적 간단한 절차 인 정자 샘플링은 작은 모델 물고기에서는 정자를 덜 생산하고 더 섬세하기 때문에 더 복잡 할 수 있습니다. 이러한 이유로, 해부된 고환 17,28,29,30을 분쇄하여 메다카 추출물 milt(물고기 정액)에서 정자 샘플링을 포함하는 대부분의 연구. 몇몇 연구에서는 수정 된 복부 마사지를 사용하여 milt를 활성화 매체18,19,20으로 직접 표현합니다. 그러나이 방법을 사용하면 추출 된 milt의 양과 색상을 시각화하기가 어렵습니다. 제브라 피쉬에서 복부 마사지는 일반적으로 모세관(31,32,33)에 즉시 수집되는 milt를 표현하는 데 사용됩니다. 이 방법을 사용하면 정자의 질을 빠르고 간단하게 나타내는 사정 색을 관찰 할 수있을뿐만 아니라 milt의 부피를 추정 할 수 있습니다32,33. 따라서 정자 수집 및 분석을위한 명확하고 잘 설명 된 프로토콜은 medaka에 부족합니다.
따라서이 기사에서는 작은 모델 물고기 일본 medaka에서 정자 수집의 두 가지 방법, 즉 고환 해부와 모세 관을 사용한 복부 마사지에 대해 설명합니다. 그것은 두 가지 접근법 모두 medaka에 대해 실현 가능하다는 것을 보여 주며 물고기가 절차에서 빠르게 회복됨에 따라 복부 마사지를 반복적으로 여러 번 수행 할 수 있음을 보여줍니다. 또한 medaka 정자 품질 (운동성, 진행성, 수명 및 상대 정자 농도)의 몇 가지 중요한 지표를 안정적으로 측정하기 위해 medaka에서 컴퓨터 지원 정자 분석을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 유용한 소형 teleost 모델에 대해 지정된 이러한 절차는 척추 동물 남성의 생식력에 영향을 미치는 환경, 생리 학적 및 유전 적 요인에 대한 이해를 크게 향상시킵니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 튜브</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>모든 표준 브랜드를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>10 &micro; L 일회용 보정 유리 마이크로 피펫 및 흡인기 튜브 어셈블리</td><td>Drummond</td><td>2-000-010</td><td></td></tr><tr>위상차 <td>Nikon</td><td>MRP90100</td><td></td>2 mL 튜브<td>가있는 10x 대물</td>렌즈</tr><tr><td></td><td>Axygen</td><td>MCT-200-c-s</td><td>모든 표준 브랜드를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>블런트 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>블런트 부드러운 집게</td><td>Millipore</td><td>XX6200006P</td><td></td></tr><tr><td>일회용 20 마이크론 계수 챔버 슬라이드</td><td>Microptic</td><td>20.2.25&nbsp;</td><td>Leja 2 챔버 슬라이드</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>올림푸스</td><td>SZX7</td><td>모든 표준 브랜드를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>미세 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigmaaldrich</td><td>H8264-1L</td><td></td></tr><tr><td>홀딩 스폰지</td><td>자체 제작</td><td></td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ts2R</td><td></td></tr><tr><td>SCA Evolution</td><td>Microptic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>작은 해부 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>탁상용 소용돌이</td><td>Labnet</td><td>C1301B</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigmaaldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr></tbody></table>

teleost 모델의 정자 수집 및 컴퓨터 보조 정자 분석 일본 메다 카 (oryzias latipes)

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

일본 medaka (Oryzias latipes)는 teleost 물고기이며 생태 독성학, 발달, 유전학 및 생리학 연구를위한 새로운 척추 동물 모델입니다. Medaka는 또한 종이 영속할 수 있도록 하는 필수적인 생물학적 기능인 척추동물 번식을 조사하는 데 광범위하게 사용됩니다. 정자의 질은 남성의 생식력과 번식 성공의 중요한 지표입니다. 정자 추출 및 정자 분석 기술은 teleost 물고기를 포함한 많은 종에 대해 잘 문서화되어 있습니다. 정자 수집은 큰 물고기에서는 비교적 간단하지만 작은 모델 물고기에서는 정자를 덜 생산하고 더 섬세하기 때문에 더 복잡 할 수 있습니다. 따라서이 기사에서는 작은 모델 물고기 인 일본 메다 카에서 정자 수집의 두 가지 방법, 즉 고환 해부와 복부 마사지에 대해 설명합니다. 이 논문은 두 가지 접근법 모두 medaka에 대해 실현 가능하다는 것을 보여 주며 물고기가 절차에서 빠르게 회복됨에 따라 복부 마사지를 반복적으로 수행 할 수 있음을 보여줍니다. 이 기사는 또한 medaka 정자 품질 (운동성, 진행성, 운동성 지속 기간, 상대 농도)의 몇 가지 중요한 지표를 객관적으로 평가하기 위해 medaka의 컴퓨터 보조 정자 분석 프로토콜을 설명합니다. 이 유용한 소형 teleost 모델에 대해 지정된 이러한 절차는 척추 동물 남성의 생식력에 영향을 미치는 환경, 생리 학적 및 유전 적 요인에 대한 이해를 크게 향상시킵니다.

얻은 데이터 유형 SCA Evolution 소프트웨어의 정자 운동성 분석은 운동성(운동성 및 고정성 정자의 백분율), 진행성(진행성 및 비진보성 정자의 백분율) 및 속도(급속, 중간 및 느리게 움직이는 정자의 비율)에 대한 데이터를 제공합니다. 또한 프로그레시브와 속도(빠른 프로그레시브, 중간 프로그레시브, 비프로그레시브)를 결합합니다. 이 라벨은 프로그램 (보충 표 1)에서 제공하는 정자 운동의 측정 (그림 3A) 및 계산 (그림3B)을 기반으로합니다. medaka의 경우 다음 임계값은 이전 문헌 19,34,35와18명의 개체로부터의 me...

이 기사에서는 작은 모델 물고기 medaka (Oryzias latipes)에서 정자를 수집하는 두 가지 빠르고 효율적인 방법과 컴퓨터 보조 정자 분석 (CASA)을 사용하여 정자의 질을 안정적으로 평가하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

Teleost 모델의 정자 수집 및 컴퓨터 보조 정자 분석 일본 메다 카 (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology ...

이 기술을 사용하면 작은 모델 물고기 인 일본 Madaka에서 암컷을 샘플링하고 일관된 방식으로 품질을 조사 할 수 있습니다. 특히 복부 마사지에 의한 정자 수집은이 접근법이 침습적이지 않기 때문에 동일한 물고기에 대한 반복 샘플링을 허용합니다. 또한이 기술은 Madaka 정자 냉동 보존에 적용될 수 있습니다.정자의 질은 수정 성공의 필수 지표이므로 생태 및 전체 생산 생리학 연구에서 분석해야 할 중요한 매개 변수입니다. 시작하려면 페트리 접시에 딱 맞도록 잘라서 부드러운 홀딩 스폰지를 준비하십시오. 스폰지 중간에 직선을 자르면 물고기가 복부 쪽을 위로 향하게 할 수있을만큼 길다.물고기를 마취 한 후 종이 타월로 부드럽게 닦아서 물고기의 복부를 말리십시오. 복부 쪽이 위로 향하도록 젖은 홀딩 스폰지의 골짜기에 물고기를 놓아 아가미가 스폰지의 마취액에 노출되도록합니다. 배설물 주변이 젖은 경우 일회용 티슈 닦음으로 복부 아래쪽을 부드럽게 말리십시오.해부 현미경으로 흡인기 튜브가 부착 된 마이크로 피펫을 물고기의 배설물에 대십시오. 이제 무딘 끝으로 부드럽게 집게를 쥐어 짜서 물고기의 복부를 꼬리 동작으로 마사지하십시오. 물고기를 회수하려면 물고기를 수족관 시스템으로 되돌리기 전에 스폰지에서 미리 준비된 회수수로 풀어주십시오.수집된 민트를 예열된 활성화 용액과 피펫 용액이 들어 있는 튜브에 흡인기 튜브 어셈블리를 사용하여 여러 번 위아래로 옮깁니다. 분석 전에 튜브를 튕겨서 희석된 정자를 부드럽게 균질화합니다. 물고기를 안락사 한 후 이전에 시연 한대로 말리고 왼쪽 측면이 위를 향하도록 해부 현미경 아래에 물고기를 놓습니다.작은 해부 가위를 사용하여 배설물에서 등쪽으로 플랩을 자른 다음 갈비뼈를 가로 질러 아가미까지 잘라 내부 장기를 노출시킵니다. 고환을 찾아 미세한 집게로 양쪽 끝의 부착물을 자릅니다. 고환을 제거하고 예열 된 활성화 용액이 들어있는 준비된 튜브로 옮깁니다.집게를 사용하여 튜브의 측면에 대해 고환을 여러 번 분쇄하여 정자를 방출하면 용액의 약간 흐린 모양으로 시각화 할 수 있습니다. 분석을 시작하려면 정자 분석 소프트웨어를 열고 운동성 모듈을 선택하십시오. 소프트웨어에서 모든 매개 변수에 대한 구성을 설정하십시오.미리 데워진 일회용 20마이크로미터 계수 챔버 슬라이드를 섭씨 27도로 설정된 가열된 스테이지에 현미경 아래에 놓습니다. 샘플이 채워질 때까지 슬라이드의 챔버에 피펫팅하되 과도하게 채우지 마십시오. 용액에서 세포의 드리프트 이동을 방지하기 위해 챔버 입구에서 과도한 샘플을 조심스럽게 닦아냅니다.분석을 선택하여 현미경으로 샘플을 봅니다. 현미경의 초점이 맞춰져 있는지 확인하고 분석을 다시 선택하여 현장에서 정자를 기록합니다. 슬라이드를 프레임에서 샘플의 새 영역으로 이동하고 3-5개의 다른 시야에 대해 절차를 반복하여 기포, 셀 덩어리 또는 아티팩트를 방지합니다.결과를 보려면 결과를 선택하고 필드를 두 번 클릭하여 개별 필드를 시각화하거나 레이블이 잘못 지정되거나 추적되지 않은 정자가 있는지 수동으로 확인합니다. 필요한 경우 개별 정자를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 운동성을 다시 표시합니다. 본 연구에서는 컴퓨터 보조 정자 분석을 사용하여 다양한 속도 및 이동 매개 변수를 기록했습니다.계산된 값에는 직진도 지수, 선형성 지수 및 흔들림이 포함됩니다. 활성화 용액의 삼투압은 고환 해부에서 정자의 운동성에 영향을 미쳤습니다. 정자는 수족관 물에서 움직이지 않지만 HBSS에서는 삼투압이 높고 낮습니다.그러나 운동성은 더 높은 삼투압 용액에 비해 킬로그램 당 36 밀리 삼투압에서 현저히 감소합니다. 운동성은 또한 정자 수집 방법에 의해 영향을 받았으며, 여기서 정자는 복부 마사지에 비해 고환 해부 방법에서 훨씬 더 운동성이 있습니다. 또한, 더 높은 비율의 세포는 점진적이었고 더 많은 세포는 중간 또는 빠르게 움직였다.백분율 운동성과 진행성은 섭씨 27도 저장에 비해 섭씨 4도 또는 얼음에 저장된 정자에서 훨씬 더 높습니다. 환경 및 주거 조건도 정자 운동성에 약간 영향을 미쳤습니다. 산란 후와 산란 전에 수집 된 정자에서 정자 운동성에 큰 차이가 나타나지 않았습니다.한 달 동안 암컷없이 수용 된 수컷은 높은 운동성을 보였지만 그 차이는 미미했습니다. 복부 마사지를 통한 정자 수집을 위해서는 적절한 집게 압력과 움직임을 배우고 대변 오염을 피하기 위해 훈련이 필요합니다. 이 기술은 예를 들어 Medaka가 일반적으로 사용되는 모델 인 생태 독성학 연구에서 남성 생식력에 대한 다양한 오염 물질의 영향을 조사하는 데 매우 유용합니다.

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생물학

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Teleost 모델의 정자 수집 및 컴퓨터 보조 정자 분석 일본 메다 카 (Oryzias latipes)

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