Name: 인간 세포에서 HSV-1 감염 후 RIPK3 및 MLKL의 ZBP1 의존성 인산화의 면역형광염색을 위한 티라마이드 신호 증폭 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 학습하세요 티라마이드 신호 증폭을 이용한 인간 세포에서 HSV-1 감염 후 ZBP1 의존성 네크로프토시스 동안 인산화된 RIPK3 및 MLKL의 면역형광염색법을. 이 방법은 민감도를 높여 연구자들이 바이러스 감염에서 세포 사멸 메커니즘을 연구하는 데 도움을 줍니다.

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VIB Bioimaging Core의 교육, 지원 및 장비 파크 이용에 감사드립니다. J.N.은 플랑드르 연구 재단 (FWO)의 박사 학위 펠로우십의 지원을 받고 있습니다. JM 그룹의 연구는 Odysseus II Grant (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), Research Foundation Flanders (FWO)의 주니어 연구 보조금 (G031022N), CRIG 젊은 연구자 개념 증명 보조금 및 겐트 대학의 지원을 받았습니다. P.V. 그룹의 연구는 EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO 선임 연구 보조금 (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation Against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG 및 GIGG 컨소시엄, VIB의 지원을 받았습니다.

1. 비오티닐화 티라마이드의 제조
<ol><li>비오틴-티라마이드에서 시작하는 비오티닐화 티라마이드를 준비합니다. 10mM 스톡 용액을 만들려면 3.6mg의 비오틴-티라마이드를 1mL의 DMSO에 녹입니다. 용해된 생성물을 품질 보존을 위해 -20°C의 분취량에 보관하십시오.</li>
</ol>2. 배양에서 HT-29 세포 유지
참고: ZBP1-발현 HT-29는 인간 ZBP1을 코딩하는 렌티벡터27 을 사용한 형질도입에 의해 생성되었다.
<ol><li>ZBP1 발현 HT-29 세포를 L- 글루타민, 나트륨-피루 베이트 및 10 % 태아 소 혈청이 보충 된 McCoy의 5A 배지 (이제부터는 전체 배지라고 함)에 보관하고 37 ° C의 인큐베이터에서 5 % 이산화탄소로 유지합니다. 이상적으로는 낮은 계대 수 (10 미만)의 셀을 사용하십시오. 실험 시작 전에 해동 주기 후 최소 5일 동안 세포를 회복하도록 두십시오.</li>
	<li>배양 플라스크로부터 세포를 분리하기 위해, 배지를 제거하고, 세포를 5 mL의 PBS(37°C로 예열)로 세척한다. 다음으로, 적절한 양의 트립신/EDTA(각각 0.05% 트립신 및 0.032% EDTA, 37°C로 예열됨)를 세포에 추가합니다(T75 플라스크의 경우 2mL, T175 플라스크의 경우 3mL).</li>
	<li>트립신/EDTA로 세포를 5% 이산화탄소와 함께 37°C의 인큐베이터에서 최대 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 플라스크를 두드리고 4x-20x 대물 배율의 현미경을 사용하여 플라스크에서 세포가 분리되었는지 육안으로 확인합니다.</li>
	<li>세포가 완전히 분리되지 않은 경우 37°C에서 5분 더 배양합니다. 세포가 분리되면 플라스크에 6mL의 전체 배지를 추가하여 효소 반응을 중지합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 15mL 튜브에 모으십시오. 생존력을 평가하기 위해 트리판 블루 염색을 사용하여 세포를 계수하고; 1:5 희석을 권장합니다. 세포의 생존율이 90 %를 초과하는 경우에만 실험을 진행하십시오.</li>
</ol>3. 세포의 실험, 파종 및 자극 시작
<ol><li>고급 현미경 검사가 가능한 1cm² 표면적 웰 플레이트에 전체 배지에 90,000개의 ZBP1 발현 HT-29 세포를 시드합니다. 웰당 200μL의 종단 부피를 사용하십시오.</li>
	<li>세포를 37°C에서 5% 이산화탄소와 함께 밤새 배양한다. 염색 제어를 위해 일부 추가 웰을 시드해야 한다는 점을 고려하며, 이는 5.6단계에서 더 자세히 설명합니다.</li>
	<li>세포가 70%-80% 컨플루언스에 도달하면 세포에 괴사증 유발 자극을 추가합니다. 여기서, 세포를 HSV-1 ICP6mutRHIM (5의 감염 다중성[MOI], 세포 수로 나눈 플라크 형성 단위(pfu)으로 정의됨; pfu는 Vero 세포에 대한 플라크 분석을 사용하여 정량화됨)을 6시간, 8시간 또는 10시간 동안 감염시켰다.</li>
	<li>괴사 유도에 대한 양성 대조군으로서, 30 ng/mL TNF, 20 μM의 범-카스파제 억제제 zVAD-fmk, 및 5 μM의 SMAC 모방체 BV6을 함유하는 괴사증 유도 칵테일로 세포를 4시간 동안 자극한다.</li>
	<li>p-RIPK3(S227) 염색을 위한 음성 대조군으로서, RIPK3 키나제 활성을 억제하고 S227의 자가인산화를 방지하는 GSK'840(1 μM)을 포함한다. 이상적으로는 치료되지 않은 상태와 괴사 자극 후에 억제제를 추가하십시오. 억제제는 바이러스 감염과 동시에 첨가 될 수 있습니다.</li>
	<li>37°C로 예열된 완전 배지에서 자극을 준비한다. 모든 자극에 대해 웰당 200μL의 최종 부피를 사용하십시오.</li>
</ol>4. 세포 고정
<ol><li>배지를 제거하고 세포를 200 μL의 1x PBS로 세척하였다. 그런 다음 150μL의 4% PFA(이미 실온에서 평형화됨)를 세포에 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 참고: 쉽게 분리되는 셀을 사용하는 경우 다음과 같이 셀 고정을 최적화할 수 있습니다. 웰에서 100μL의 배지를 제거하여 100μL의 부피가 플레이트에 남아 있도록 합니다. 100 μL의 4 % PFA를 세포에 첨가하십시오. 세포를 실온에서 5분 동안 배양한다. 그런 다음 웰에서 배지/고정액을 제거하고 150μL의 4% PFA로 교체합니다. 세포의 완전한 고정을 보장하기 위해 실온에서 20분 더 세포를 배양합니다.</li>
	<li>고정 후, 4% PFA를 제거하고, 세포를 200 μL의 1x PBS로 3x 세척하였다. 샘플은 추가 처리가 있을 때까지 밤새 4°C에서 과량(>200μL)의 1x PBS에 저장될 수 있다.</li>
</ol>5. 투과화 및 1차 염색
<ol><li>PBS를 제거하고 100 μL의 투과화 완충액(PBS 중 0.5% 트리톤 X-100)을 첨가한다. 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>투과화 완충액을 제거하고, 이어서 웰을 100 μL의 세척 완충액(PBS 중 0.1% 트리톤 X-100)으로 세척한다. 이미징 챔버를 세척 버퍼로 틸팅 실험실 셰이커에서 실온에서 5분 동안 배양합니다(분당 20-30회 흔들기 동작).</li>
	<li>1차 항체의 비특이적 결합을 방지하려면 차단 배지 100μL를 추가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 대안적으로, 이러한 차단 단계는 실온에서 1시간 동안 PBS 중 3% BSA, 0.1% Triton-X-100으로 블로킹하는 것으로 대체될 수 있다.</li>
	<li>웰을 100μL의 세척 완충액(PBS 중 0.1% 트리톤 X-100)으로 3회 세척합니다. 세척 단계를 틸팅 실험실 쉐이커에서 실온에서 5분 동안 인큐베이션합니다.</li>
	<li>세척 완충액을 제거한 후, 1차 항체를 이미징 챔버에 첨가하고, 4°C에서 밤새 인큐베이션한다. 100 μL의 끝 부피를 사용하여 웰을 덮으십시오. 4°C에서 밤새 배양하는 동안 이미징 챔버를 틸팅 실험실 셰이커 위에 놓지 마십시오. 참고 : Anti p-MLKL (S358; 희석 : 1 : 200) 및 anti-p-RIPK3 (S227; 희석 : 1 : 200)은 토끼를 숙주 종으로 공유하므로 하나의 우물에서 결합되어서는 안됩니다. 바이러스 감염을 모니터링하려면 선택한 바이러스 단백질에 대한 1차 항체를 p-MLKL(S358) 또는 p-RIPK3(S227)와 결합합니다. 여기서, HSV-1 감염 세포를 감염시킨 후 ICP0 염색(희석: 1:50, 숙주종: 마우스)으로 감염시켰다.</li>
	<li>이 시점에서 필요한 염색 제어를 고려하십시오. 마스킹 역치를 설정하기 위해 TSA 증폭 단계의 잠재적 배경을 시각화하기 위해 항상 1차 항체 없음을 포함합니다(9단계 참조). 참고: 공동 염색 프로토콜(예: p-MLKL[S358] 또는 p-RIPK3[S227]을 바이러스 단백질에 대한 항체와 결합)의 경우 단일 염색도 사용하십시오. 단일 염색의 사용은 다른 이미징 채널에서 잠재적인 블리드스루 신호를 교정하는 데 중요합니다.</li>
</ol>6. 티라마이드 신호 증폭 (TSA)
<ol><li>1차 항체 믹스를 제거하고 100μL의 세척 완충액(PBS 중 0.1% 트리톤 X-100)으로 웰을 3배 세척합니다. 세척 단계를 틸팅 실험실 쉐이커에서 실온에서 5분 동안 인큐베이션합니다.</li>
	<li>세척 완충액을 제거하고 증폭이 필요한 1차 항체 종을 인식하는 HRP 표지된 2차 항체 100μL를 추가합니다. p-RIPK3 (S227) 또는 p-MLKL (S358) 신호를 증폭하기 위해 100μL의 항 토끼 -HRP를 추가하고 틸팅 실험실 쉐이커에서 실온에서 30 분 동안 배양합니다. 참고: p-MLKL(S358) 또는 p-RIPK3(S227)만 증폭됩니다. 바이러스 단백질의 염색은 표준 간접 염색 방법을 사용하여 시각화됩니다.</li>
	<li>그런 다음 웰을 100μL의 세척 완충액(PBS 중 0.1% 트리톤 X-100)으로 3배 세척합니다. 세척 단계를 틸팅 실험실 쉐이커에서 실온에서 5분 동안 인큐베이션합니다.</li>
	<li>다음 단계에서는 비오티닐화된 티라마이드를 현미경 플레이트에 추가합니다. 2차 항체에 결합된 HRP 그룹을 사용하여, 효소 반응은 1차 표적에 근접하여 티라미드 라디칼의 형성을 촉발할 것이다(여기서, p-MLKL[S358] 또는 p-RIPK3[S227]).</li>
	<li>HRP의 효소 활성을 활성화하려면 비오티닐화 티라마이드와 함께 산화 기질을 추가하십시오. 이를 달성하기 위해, TSA 완충액 (0.1 M 붕산 [pH 8.5])을 0.03 M H 2 O2 로 보충하십시오. 구체적으로, 5 mL의 TSA 완충액을 취하고, 5 μL의 30 % H 2 O2를 첨가한다.</li>
	<li>이제 비오틴-티라미드를H2O2-보충된 TSA 완충액에 1:1,000에서 1:20,000 범위로 희석합니다. 참고: 비오틴-티라마이드의 희석 계수는 배치당 최적화되어야 합니다.</li>
	<li>웰에서 세척 완충액을 제거하고 희석된 비오틴-티라미드를 웰에 100μL의 최종 부피가 되도록 첨가합니다. 틸팅 실험실 셰이커에서 실온에서 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>다음으로, 웰을 100 μL의 세척 완충액(PBS 중 0.1% 트리톤 X-100)으로 3배 세척한다. 세척 단계를 틸팅 실험실 쉐이커에서 실온에서 5분 동안 인큐베이션합니다.</li>
</ol>7. 형광단
참고: 1차 항체의 신호가 비오틴기로 전환되기 때문에 p-MLKL(S358) 및 p-RIPK3(S227)은 형광단에 결합된 스트렙타비딘을 사용하여 시각화됩니다(형광단 568, 희석: 1:500). 또한 핵은 DAPI(5μg/mL)로 염색됩니다. 바이러스 단백질이 염색 프로토콜에 포함되는 경우, 1차 항체의 숙주 종에 대해 적합한 형광 표지된 2차 항체를 포함시킨다. 대표적인 결과에서, 마우스 항-ICP0을 사용하였다. 2차 항체로서 염소 항-형광단 633에 결합된 마우스(희석: 1:1,000)가 포함되었다.
<ol><li>염색 혼합물을 상기 언급된 항체 및 염색을 함유하는 세척 완충액(PBS 중 0.1% Triton X-100)에서 확인한다. 세척 완충액을 제거하고, 염색 혼합물 100μL를 추가하고, 틸팅 실험실 쉐이커에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 이 단계부터 이미징 챔버를 빛으로부터 차폐하십시오.</li>
	<li>다음으로, 웰을 세척 완충액(PBS 중 0.1% 트리톤 X-100)으로 2배 세척한다. 세척 단계를 틸팅 실험실 쉐이커에서 실온에서 5분 동안 인큐베이션합니다.</li>
	<li>마지막으로 웰을 1x PBS로 2x 헹굽니다. 이미징 될 때까지 1x PBS의 초과 (> 200 μL)에 샘플을 보관하십시오. 또는 염색을 보존하기 위해 샘플을 장착 매체에 담그십시오. 이제 이미징 챔버를 컨포칼 현미경으로 시각화할 준비가 되었습니다.</li>
</ol>8. 컨포칼 현미경을 사용한 이미징
<ol><li>이미징하기 최소 10분 전에 컨포칼 현미경과 레이저를 켭니다.</li>
	<li>민감도를 위해 몰입 목표를 사용합니다. 가급적이면 40x 또는 63x 대물 배율을 사용합니다. 이미징하기 전에 적절한 면봉을 사용하여 렌즈 클리너로 침수 대물렌즈를 청소하십시오. 대물렌즈가 더러우면(예: 먼지로 인해) 이미지 품질이 저하될 수 있습니다.</li>
	<li>이미징 챔버 바닥에 과도한 양의 오일을 넣으십시오. 또한 선택한 목적에 기름 한 방울을 추가하십시오.</li>
	<li>이미징 챔버를 현미경에 놓습니다. DAPI 염색 또는 명시야 이미징을 사용하여 초점 필드를 찾습니다. 필요한 경우 이미징 챔버 주위를 이동하여 액침 오일이 적절하게 퍼지도록 합니다.</li>
	<li>현미경에 필요한 이미징 트랙을 설정합니다. 현미경에 따라 다음 단계가 다를 수 있습니다(표 1). 알림: 이미징 트랙을 설정할 때 핵 염색이 마지막으로 측정되도록 트랙을 프로그래밍하십시오. 405nm 레이저는 광퇴색에 기여하여 모든 채널에서 특정 신호를 손실시킬 수 있습니다.</li>
	<li>p-RIPK3(S227) 또는 p-MLKL(S358)의 존재 여부에 대해 완전한 셀을 분석하려면 셀의 높이에 걸쳐 있는 z-스택을 측정합니다. 여기서 z-스택은 0.16μm마다 40개의 슬라이스로 만들어져 6.22μm의 범위를 만들었습니다.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>추적하다</td>
			<td>레이저</td>
			<td>빔 스플리터</td>
			<td>필터</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358)</td>
			<td rowspan="2">561</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 570-620 + LP645</td>
		</tr><tr><td>MBS 488/561/633 + SBS SP615</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">바이러스 유전자 : ICP0</td>
			<td rowspan="2">633</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 420-480 + LP605</td>
		</tr><tr><td>MBS 488/561/633 + SBS LP570</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">핵: 다피</td>
			<td rowspan="2">405</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 420-480 + BP 495-550</td>
		</tr><tr><td>MBS 488/561/633</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 세포 시각화를 위한 이미징 트랙.
9. 데이터 분석 및 정량화
<ol><li>현미경 이미지를 소프트웨어에 업로드합니다. 확장 초점을 사용하여 z 스택의 모든 정보를 2D 이미지로 시각화합니다.</li>
	<li>다음으로, 다음 정보를 추출하기 위해 분석 프로토콜을 프로그래밍합니다 : 이미지 당 세포 수, p-RIPK3 (S227) + 또는 p-MLKL (S358) + 염색을 나타내는 복셀의 합. 복셀은 픽셀에 해당하는 3차원으로 정의되는 3차원 볼륨을 나타냅니다.</li>
	<li>이미지 당 세포 수를 정량화하려면 핵을 분할하십시오. 분할 결과의 노이즈를 줄이려면 분할에 크기 제한(>100μm³)을 추가합니다. 분할된 핵의 수는 이미지의 세포 수를 나타냅니다.</li>
	<li>p-RIPK3(S227)+ 또는 p-MLKL(S358)+ 복셀의 양을 정량화하려면 임계값 기반 분할을 프로그래밍합니다. 1차 항체 없음(NP) 이미지에서 신호가 포착되지 않도록 임계값을 설정합니다.</li>
	<li>처리되지 않은 모의 조건의 이미지를 사용하여 임계값을 추가로 조정합니다. 괴사증 자극으로 인한 신호 증가의 민감한 감지를 보장하려면 더 높은 임계값을 설정하여 모의 조건에서 p-RIPK3(S227)+ 또는 p-MLKL(S358)+ 복셀의 픽업을 제한합니다. 모의 상태 및 괴사증 유발 바이러스 감염의 여러 이미지에서 프로그래밍된 분석 프로토콜을 항상 확인하십시오.</li>
	<li>모든 이미지 세트에 대해 분석을 실행합니다. 복셀 정량화 및 핵 분할을 스프레드시트 소프트웨어에서 추가 처리를 위해 .txt 파일로 내보냅니다.</li>
	<li>이미지 이름, 핵 정량화 및 검출된 복셀의 합을 보여주는 데이터의 피벗 테이블을 만듭니다.</li>
	<li>다음으로, 양의 복셀의 합을 이미지의 셀 수로 나눕니다. 그 결과 셀당 양의 복셀의 상대적 값이 생성됩니다. 폴드 증가를 시각화하려면 셀당 p-RIPK3(S227)+ 또는 p-MLKL(S358)+ 복셀의 상대 값을 처리되지 않은 상태(mock)의 중앙값으로 나눕니다.</li>
</ol>

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</ol>

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이 면역형광 염색 프로토콜은 RIPK3 및 MLKL26의 인산화를 포함하여 검출하기 어려운 인간 괴사 신호 전달 경로의 신호 이벤트에 대한 민감도를 증가시키기 위해 티라마이드 신호 증폭(TSA)의 사용을 설명합니다. TSA 단계를 포함하면 p-RIPK3(S227) 및 p-MLKL(S358)의 검출 임계값이 크게 향상되고 p-MLKL(S358) 변형의 감도가 증가합니다. TSA는 모의 처리된 샘플에 이미 존재하는 p-RIPK3(S227) 신호를 밝혔습니다. 인간 세포에서, S227에서의 RIPK3의 자가인산화는 MLKL과의 안정적인 상호작용을 가능하게 함으로써 괴사증 활성화를 위한 전제 조건이다. 이 과정은 이미 기저 수준에서 발생하며 괴사 유도 2,5,31 이전에 안정적인 비활성 p-RIPK3 (S227) / MLKL 이량 체를 형성합니다....

수용체 상호작용 세린/트레오닌 단백질 키나아제 3(RIPK3) 및 혼합 계통 키나아제 도메인 유사(MLKL)는 괴사 세포 사멸 1,2의 중심 조절자입니다. 괴사증은 항 바이러스 면역 및자가 염증에 관여하는 조절 된 세포 사멸의 용질 및 염증성 형태입니다. 바이러스에 감염된 세포의 괴사는 즉시 바이러스 복제를 차단합니다. 괴사 유도 후 세포 용해는 또한 항 바이러스 면역을 자극하는 손상 관련 분자 패턴을 방출합니다 3,4. 괴사증은 3개의 업스트림 활성화 분자 중 하나와의 RIP 동형 상호작용 모티프(RHIM) 매개 상호작용에 따른 RIPK3의 활성화에 의해 시작됩니다: RIPK1 (TNF 수용체 1 [TNFR1] 관여시), TIR 도메인 함유 어댑터 유도 인터페론-β (TRIF; 톨 유사 수용체 3 및 4 결합시) 또는 항바이러스 핵산 센서 Z-DNA 결합 단백질 1 (ZBP1)1,2 . 괴사증 신호 전달은 RIPK3의 자가 인산화로 시작하는 일련의 인산화 이벤트를 통해 진행됩니다. 키나아제 도메인 내부의 세린 (S) 227에서 인간 RIPK3의 자가 인산화는 MLKL과의 상호 작용을 가능하게함으로써 괴사를위한 전제 조건이며 일반적으로 인간 RIPK3 활성화 및 괴사 세포 사멸 1,5에 대한 생화학 적 마커로 사용됩니다. 일단 활성화되면, RIPK3는 트레오닌 (T)357 및 S3581에서 MLKL의 활성화 루프를 인산화한다. 이로 인해 MLKL 형태가 변경되어 N 단자 4 개의 나선 번들 도메인이 노출됩니다. 그런 다음 MLKL은 올리고머화되어 세포막으로 이동하여 지질 이중층에 노출된 4개의 나선 다발을 삽입하여 기공을 형성하여 결국 세포 사멸을 초래합니다 2,6.
ZBP1은 Z-형태(Z-RNA)에 이중 가닥 RNA를 포함하여 왼손잡이 Z형 핵산을 인식하는 항바이러스 핵산 센서입니다. Z-RNA 결합은 ZBP1의 N-말단에 위치한 두 개의 Zα-도메인을 통해 발생합니다. RNA 및 DNA 바이러스 감염 동안 축적되는 Z-RNA는 ZBP1 7,8과 직접 관여하는 것으로 생각된다. 활성화 된 ZBP1은 중앙 RHIM을 통해 RIPK3를 모집하고 괴사 9,10을 포함하여 조절 된 세포 사멸을 유도합니다. 바이러스는 ZBP1 유도 숙주 세포 괴사11에 대응하기 위해 수많은 탈출 메커니즘을 채택했습니다. 예를 들어, ICP6으로 알려져 있고 UL39에 의해 코딩되는 단순 포진 바이러스 1 (HSV-1) 리보 뉴클레오티드 환원 효소 서브 유닛 1은 인간 세포12,13,14,15에서 ZBP1 매개 RIPK3 활성화를 방해하는 N- 말단에 RHIM을 보유한다. ZBP1은 바이러스 복제를 제한 할뿐만 아니라 마우스 연구에 따르면 ZBP1 활성화는 염증성 질환을 유발하고 암 면역16,17,18,19,20,21을 자극합니다. 따라서 인간 세포에서 ZBP1 유발 괴사 중에 발생하는 신호 이벤트를 감지하는 프로토콜은 이러한 과정에서 ZBP1의 역할을 평가하는 데 중요합니다.
촉매 리포터 증착(CARD)이라고도 하는 티라마이드 신호 증폭(TSA)은 항체 기반 면역 분석에서 검출 한계 및 신호 대 잡음비를 개선하기 위해 개발되었습니다. TSA 동안, 임의의 1차 항체가 관심있는 항원을 검출하는데 사용될 수 있다. 2차 항체에 결합된 고추냉이 과산화효소(HRP)는 과산화수소의 존재 하에 비오티닐화된 티라마이드 라디칼의 국소 축적을 촉매합니다. 이러한 활성화 된 비오틴-티라마이드 라디칼은 근위 티로신 잔기와 반응하여 공유 결합을 형성합니다. 잠재적인 티라미드-비오틴 기질은 항원 자체, 1차 및 2차 항체, 및 이웃 단백질을 포함한다. 따라서 TSA는 분석의 감도를 크게 향상시키지만 공간 분해능의 일부가 손실됩니다. 마지막 단계에서 비오틴 분자는 형광 표지된 스트렙타비딘을 사용하여 검출됩니다. HRP 반응은 관심 항원 위 또는 그 근처에 많은 티라마이드-비오틴 분자를 침착시킵니다. 이것은 스트렙타비딘-플루오로크롬 결합 부위의 수를 크게 증가시켜 분석의 감도를 크게 증폭시킵니다(그림 1). 대안적으로, 티라마이드는 형광 색소에 직접 결합될 수 있어 스트렙타비딘 결합 형광단의 필요성을 제거합니다. 단백질 면역 조직 화학 및 DNA / RNA 현장 혼성화는 TSA가 신호 강도를 개선하기 위해 사용 된 최초의 방법 중 하나였습니다22,23. 보다 최근에, TSA는 세포내 유세포분석법(24) 및 질량분석법(25)과 결합되었다.
여기에서는 면역형광현미경을 이용하여 HSV-1 감염에 의한 ZBP1의 활성화시 인산화된 인간 RIPK3(p-RIPK3[S227]) 및 인산화된 인간 MLKL(p-MLKL[S358])을 검출하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 인간 ZBP1을 안정적으로 발현하도록 형질도입된 괴사에 민감한 HT-29 인간 결장직장 선암 세포주를 사용합니다. 이 세포들은 바이러스 RHIM (VQCG) 내의 4 개의 핵심 아미노산이 알라닌 (AAAA)으로 대체 된 돌연변이 ICP6 단백질 (HSV-1 ICP6mutRHIM)을 발현하는 HSV-1 균주에 감염되어 ICP6가 ZBP1 매개 괴사13,14,15를 차단할 수 없게되었습니다. 면역염색26에서 p-RIPK3 및 p-MLKL에 대한 현재 상용화된 항체의 낮은 신호 대 잡음비 문제를 극복하기 위해 티라마이드 신호 증폭(TSA) 단계(그림 1)를 수행하여 인간 p-RIPK3의 강력한 검출(S227)을 달성하고 인간 p-MLKL의 검출 감도를 한 단계 향상시킵니다(S358).

<table><tbody><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit HRP</td><td>Agilent Technologies Belgium</td><td>K4002</td><td>Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse DyLight 633</td><td>Thermofisher</td><td>35513</td><td>Secundary 항체</td></tr><tr><td>HSV-1 ICP0</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53070</td><td>Mouse anti-ICP0(HSV-1) 항체</td></tr><tr><td>IAV-PR8 마우스 혈청</td><td>자체 생산</td><td>xx</td><td>마우스 항-IAV-PR8 폴리클로날 항체</td></tr><tr><td>pMLKL</td><td>Abcam</td><td>ab187091</td><td>토끼 항-MLKL-phospho S358 항체</td></tr><tr><td>pRIPK3</td><td>Abcam</td><td>ab209384</td><td>토끼 항-RIPK3-phospho S227 항체</td></tr><tr><td>Fluorophores</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher</td><td>D21490</td><td>세포의 핵을 시각화하기 위해</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568</td><td>Thermofisher</td><td>S11226</td><td>비오틴 분자를 visulalize하기 위해</td></tr><tr><td>Compounds</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% H2O2</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>HRP 활성에 필요한 산화 기질</td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>SANBIO</td><td>AR1068</td><td>세포를 고정/가교시키기 위하여</td></tr><tr><td>Biotinyl-tyramide</td><td>R& 신호를</td><td></td><td>증폭하기 위해, HRP 기판</td></tr><tr><td>BV-6</td><td>Selleckchem</td><td>S7597</td><td>BV6 IAP 억제제</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>세포 배양의 경우: 세포를 분리하기 위해</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>8.0 g/L 나클</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0.4 g/L EDTA의 이나트륨 염</td></tr><tr><td>EDTA 0.04%</td><td>사내 제형</td><td></td><td>1.1 g/L Na2HPO4</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0.2g/L 나H2PO4</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0.2 g/L 케이클</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0.2 g/L 포도당</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>TICO</td><td>FBS EU XXX</td><td>세포 배양, 세포 배양 유지; 로트 번호: 90439</td></tr><tr><td>GSK'840</td><td>Aobious</td><td></td><td>AOB0917 RIPK3 키나아제 억제제</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>세포 배양, 세포 배양 유지</td></tr><tr><td>MAXblock</td><td>Active Motif</td><td>15252</td><td>차단 용액</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>10444402</tr><tr><td>나트륨 피루브산</td><td>시그마-알드리치</td><td>S8636</td><td>세포 배양을 위해 세포 배양 TNF</td></tr><tr><td>-&알파를 유지합니다.</td><td>자체 생산</td> <td>-</td> <td>BV6 및 zVAD와 함께 세포 사멸을 유발할 수있는 신호 분자</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td>세포를 투과시키기 위해</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Merck</td><td>11732</td><td>세포 계수의 경우 0,1 %에서 살아있는 / 죽은 마커로 사용</td></tr> <tr><td>Trypsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4424</td><td>세포 배양 : 세포</td></tr><tr><td>zVAD</td> <td>분리Bachem</td><td>BACE4026865.0005</td><td>Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone</td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide 8 well high glass bottom</td><td>iBidi</td><td>80807</td><td>세포를 배양하기 위해</td></tr><tr><td>Cotton Preping Balls-size medium</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71001-10</td><td>대물렌즈를 청소하려면</td></tr><tr><td>Immersol 518 F / 30 &deg; C</td><td>ZEISS</td><td>444970-9000-000</td><td>고배율에서 샘플을 시각화하기 위해</td></tr><tr><td>렌즈 클리너</td><td>ZEISS</td><td>000000-0105-200</td><td>대물렌즈를 청소하려면</td></tr><tr><td>LSM880 Fast Airyscan 컨포칼 현미경</td><td></td><td></td><td>샘플을 시각화하기 위해</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Office</td><td>xx</td><td>데이터를 처리하려면</td></tr><tr><td>Prism 9</td><td>Graphpad</td><td>xx</td><td>데이터 분석 - 통계 테스트 및 그래프 생성</td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>Volocity</td><td>xx</td><td>정량화 수행</td></tr><tr><td>Zen black</td><td>ZEISS</td><td>xx</td><td>이미지 수집 및 처리 Zen</td></tr><tr><td>blue</td><td>ZEISS</td><td>xx</td><td>이미지 시각화</td></tr> <tr><td>Viruses</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HSV-1 (mutRHIM) F 균주</td><td>&nbsp; Jiahuai Han 박사가 생산</td> 한 <td>HSV-1</td>은 <td>부사 분폐증의 방아쇠로 사용됩니다. UL39/ICP6의 RHIM 코어 도메인은 돌연변이(VQCG>AAAA)</td></tr><tr><td>HSV-1(WT) F 균주</td><td>Jiahuai Han 박사가 사</td><td>내 복제에서</td> 생산한 <td>HSV-1(WT)은 괴사 유도(ICP6 억제)에 대한 음성 대조군으로,</td></tr> <tr><td>IAV PR8</td>은 <td>사내 복제</td><td>에서</td><td>IAV를 괴사화의 방아쇠</td></tr></tbody></table>로 사용합니다.

인간 세포에서 hsv-1 감염 후 ripk3 및 mlkl의 zbp1 의존성 인산화의 면역형광염색을 위한 티라마이드 신호 증폭

Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

키나아제 수용체 상호작용 세린/트레오닌 단백질 키나아제 3(RIPK3) 및 그 기질 혼합 계통 키나아제 도메인 유사(MLKL)는 중요한 항바이러스 기능을 가진 염증성 형태의 세포 사멸인 괴사증의 중요한 조절자입니다. RIPK3의 자가인산화는 괴사 MLKL의 기공 형성 실행자 단백질의 인산화 및 활성화를 유도합니다. 세포막에서 인산화된 MLKL의 트래피킹 및 올리고머화는 괴사 세포 사멸의 특징인 세포 용해를 초래합니다. 핵산 센서 ZBP1은 RNA 및 DNA 바이러스에 감염된 후 왼손잡이 Z형 이중가닥 RNA(Z-RNA)에 결합하여 활성화됩니다. ZBP1 활성화는 감염된 숙주 세포의 괴사를 포함한 조절된 세포 사멸을 유도하여 바이러스 감염을 제한합니다. 면역형광 현미경 검사를 사용하면 세포별로 ZBP1 매개 괴사의 다운스트림 다양한 신호 전달 단계를 시각화할 수 있습니다. 그러나 인간 RIPK3 및 MLKL에 대한 현재 상업적으로 이용 가능한 포스포 특이적 항체를 사용하는 표준 형광 현미경의 감도는 이러한 마커의 재현 가능한 이미징을 배제합니다. 여기에서는 단순 포진 바이러스 1(HSV-1)에 감염된 인간 HT-29 세포에서 세린(S) 인산화 RIPK3(S227) 및 MLKL(S358)에 대한 최적화된 염색 절차를 설명합니다. 면역형광 염색 프로토콜에 티라마이드 신호 증폭(TSA) 단계를 포함하면 S227 인산화 RIPK3의 특이적 검출이 가능합니다. 또한 TSA는 S358 인산화 MLKL의 검출 감도를 크게 높입니다. 함께,이 방법은 ZBP1 유발 괴사의 유도 동안이 두 가지 중요한 신호 이벤트의 시각화를 가능하게합니다.

인간 세포에서 MLKL 인산화 및 특히 RIPK3 인산화의 면역형광 검출은 기술적으로 어렵습니다26. 여기에서는 ZBP1의 활성화시 인간 p-RIPK3 (S227) 및 p-MLKL (S358)에 대한 개선 된 염색 프로토콜을 제시합니다. 상기 프로토콜은 형광 신호의 검출 한계 및 감도를 개선하기 위한 TSA 단계를 포함한다. 상기 방법을 검증하기 위해, TSA 매개 면역형광과 p-RIPK3(S227) 및 p-MLKL(S358) 모두의 표준 간접 형광 염색을 나란히 비교하였다.
인간 ZBP1을 발현하는 HT-29 세포를 ICP6 RHIM 돌연변이 HSV-1 균주(HSV-1 ICP6mutRHIM)로 9시간 동안 감염시켜 ZBP1 매개 괴사 및 RIPK3 인산화를 유도했습니다. HSV-1 ICP6mutRHIM 균주는 ICP6 RHIM 내에서 VQCG에서 AAAA 돌연변이를 운반하며 ZBP1<sup cla...

면역형광 염색 중 티라마이드 신호 증폭은 HSV-1 감염 후 ZBP1 유발 괴사 동안 인산화된 RIPK3 및 MLKL의 민감한 검출을 가능하게 합니다.

인간 세포에서 HSV-1 감염 후 RIPK3 및 MLKL의 ZBP1 의존성 인산화의 면역형광염색을 위한 티라마이드 신호 증폭

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical ...

괴사 유도 중 두 가지 주요 신호 전달 이벤트인 인산화된 RIPK3 및 MLKL의 강력한 시각화는 기술적으로 어려운 일이었습니다. 제시된 티라마이드 증폭 프로토콜은 이 두 분자의 민감한 검출을 가능하게 합니다. 신호 증폭 단계는 검출 임계값을 낮추어 인산화된 RIPK3 및 MLKL의 강력하고 재현성 있는 검출을 가능하게 합니다.90, 000 ZBP1 발현 HT-29 세포를 1cm 정사각형 표면적 웰 플레이트의 전체 강도 McCoy's 5A 배지에 파종하여 고급 현미경 검사를 허용합니다. 웰당 200마이크로리터의 최종 부피를 사용하십시오. 세포를 섭씨 37도에서 5%이산화탄소와 함께 밤새 배양합니다.세포가 70 내지 80%컨플루언시에 도달하면, 5개의 감염 다중성에서 림 돌연변이 ICP6을 암호화하는 단순 포진 바이러스 1을 함유하는 200 마이크로리터 예열된 완전 강도 McCoy's 5A 배지에서 세포를 감염시킨다. 괴사증을 유도하기 위해 9 시간 동안 바이러스와 함께 세포를 배양하십시오. 괴사 유도에 대한 양성 대조군으로서, 예열 된 괴사 유발 칵테일 200 마이크로 리터로 4 시간 동안 세포를 자극하십시오.음성 대조군으로 섭씨 37도에서 예열된 10마이크로몰 GSK840 22마이크로리터를 추가하여 RIPK3 키나아제 활성을 억제합니다. 이 억제제를 치료되지 않은 상태에서 그리고 괴사증 자극 후에 포함시켜 세린 227의 자가인산화를 방지한다. 세포를 고정시키기 위해, 배지를 제거하고 200 마이크로리터의 PBS로 세포를 세척한다.그런 다음 PBS를 제거하고 실온에서 평형 화 된 150 마이크로 리터의 4 % 파라 포름 알데히드를 첨가하십시오. 세포를 실온에서 30분 동안 배양한다. 고정 후 4% 파라포름알데히드를 제거하고 200마이크로리터의 PBS로 세포를 3회 세척합니다.샘플은 추가 처리가 있을 때까지 밤새 섭씨 4도에서 PBS를 초과하여 보관할 수 있습니다. 플레이트로부터 PBS를 제거하고, 세포를 100 마이크로리터의 투과 완충액과 함께 실온에서 30분 동안 틸팅 실험실 진탕기에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 투과화 완충액을 제거하고, 세포를 100 마이크로리터의 세척 완충액으로 세척한다.이미징 챔버를 세척 완충액과 함께 틸팅 실험실 쉐이커에서 실온에서 5분 동안 배양합니다. 1차 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해, 플레이트를 실온에서 100 마이크로리터의 블로킹 배지와 함께 틸팅 실험실 진탕기에서 2시간 동안 배양한다. 다음으로, 틸팅 실험실 쉐이커에서 실온에서 5 분간 배양하면서 100 마이크로 리터의 세척 완충액으로 웰을 3 회 세척한다.세척 완충액을 제거한 후, 100 마이크로리터의 1차 항체를 이미징 챔버에 첨가한다. 티라미드 신호 증폭의 잠재적 배경을 시각화하고 마스킹 역치를 설정하기 위해 1차 항체가 없는 조건을 포함하는지 확인하십시오. 챔버를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.1차 항체 믹스를 제거하고, 웰을 100 마이크로리터의 세척 완충액으로 3회 세척하고 틸팅 실험실 진탕기에서 실온에서 5분간 인큐베이션하였다. 세척 완충액을 제거한 후, 세포를 100 마이크로리터의 HRP-표지된 2차 항체와 함께 인큐베이션하고, 증폭될 1차 항체의 종을 인식하여 틸팅 실험실 진탕기에서 30분 동안 배양한다. 항체 인큐베이션 동안, 비오티닐화된 티라미드 믹스를 준비한다.HRP의 효소 활성을 유발하려면 사용하기 전에 TSA 버퍼에 산화 기질을 새로 추가하십시오. 그런 다음 최적화된 희석액을 사용하여 준비된 TSA 완충액에 비오티닐화된 티라미드를 희석합니다. HRP-표지된 2차 항체로 배양한 후, 틸팅 실험실 진탕기에서 5분간 배양하면서 세척 완충액으로 웰을 3회 세척한다.웰로부터 세척 완충액을 제거한 후, 희석된 비오틴-티라미드를 100 마이크로리터의 최종 부피가 되도록 웰에 첨가한다. 반응물을 틸팅 실험실 진탕기에서 10분 동안 실온에서 인큐베이션한 다음, 3회의 세척 완충액 세척을 한다. 2차 항체, 결합된 스트렙타비딘, 및 핵염색 및 세척 완충액을 포함하는 염색 혼합물을 준비한다.세척 완충액을 제거하고, 플레이트를 실온에서 100 마이크로리터의 염색 혼합물과 함께 틸팅 실험실 진탕기에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 이 단계부터 이미징 챔버를 빛으로부터 차폐하십시오. 염색 후, 세척 완충액으로 2회 연속적으로 세척하고, PBS로 웰을 2회 헹구었다.이미징까지 염색을 보존하기 위해 섭씨 4도에서 PBS를 초과하는 샘플을 보관하십시오. 이제 이미징 챔버를 컨포칼 현미경으로 시각화할 준비가 되었습니다. 티라마이드 신호 증폭을 포함함으로써 림 돌연변이 ICP6 감염 세포를 코딩하는 단순 포진 바이러스의 세포질에서 세린 227에서 인산화된 RIPK3의 강력한 검출이 가능해졌습니다.2%의 레이저 출력은 민감한 감지에 충분했습니다. 표준 간접 면역 형광법에서, 더 높은 레이저 출력은 phospho-RIPK3의 검출에 불충분했다. 3차원 Z-스택 이미지의 정량화에서, 감염된 세포는 모의 처리된 세포에 비해 인산화된 RIPK3에 대해 양성인 복셀의 약 20배 증가를 보였다.모의-처리된 세포에 비해 야생형 단순 포진 바이러스 1 감염된 세포의 증가된 phospho-RIPK3 염색은 ICP6의 림 도메인이 세린 227에서 RIPK3 인산화를 완전히 차단할 수 없음을 나타내었다. GSK840은 RIPK3의 키나아제 도메인에 결합하고, ZBP1 활성화 시 세린 227에서 RIPK3 인산화를 방지하여 티라마이드 신호 증폭 매개 포스포-RIPK3 검출 방법의 특이성을 확인하였다. 모의 처리된 세포는 세린 358에서 MLKL 인산화의 약간 단첨된 세포질 염색에서 낮은 것으로 나타났고, 감염된 세포의 세포질, 핵 및 원형질막에서 강한 염색이 검출되었습니다.표준 간접 면역 형광법은 감염된 세포에서 phospho-MLKL 신호의 특이적 검출을 위해 40%레이저 출력이 필요했습니다. 대조적으로, 티라마이드 신호 증폭은 phospho-MLKL의 검출 감도를 증가시켜 필요한 레이저 출력을 6%로 낮춥니다. 3D Z 스택 이미지 정량화는 티라마이드 신호 증폭을 사용하여 phospho-MLKL에 양성인 복셀 수가 약 90배 증가한 것으로 나타났으며, 표준 방법을 사용한 것과 비교하여 phospho-MLKL에 대한 검출 임계값 및 감도가 향상되었음을 나타냅니다. 단순 포진 바이러스와 유사하게 인플루엔자 A 바이러스 감염은 ZBP1 의존성 괴사를 유발했습니다.티라마이드 신호 증폭은 괴사를 나타내는 포스포-RIPK3 및 포스포-MLKL의 강력한 검출을 가능하게 했습니다. 컨포칼 염색을 해석하려면 여러 염색 제어를 포함해야 합니다. 이것은 일차 조건, 단일 얼룩 및 양성 대조군을 수반하지 않습니다.이 프로토콜을 적용하면 순차적 TSA를 사용하여 여러 표적을 증폭할 수 있습니다. 이것은 동일한 세포 내에서 인산화된 RIPK3 및 MLKL의 검출을 가능하게 할 것이다. 괴사증 바이오마커의 민감한 검출은 실행된 ZBP1 의존성 세포 사멸 경로가 여전히 괴사, 세포자멸사 또는 열병으로 확인되어야 하는 자가염증 또는 바이러스 감염에 대한 진행 중인 ZBP1 연구에 통찰력이 있을 수 있습니다.

tyramide-signal-amplification-for-immunofluorescent-staining-zbp1

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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인간 세포에서 HSV-1 감염 후 RIPK3 및 MLKL의 ZBP1 의존성 인산화의 면역형광염색을 위한 티라마이드 신호 증폭

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