Name: 시험관 내 막 곡률 감지 단백질 연구를 위한 나노바 지원 지질 이중층 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 학습하세요 나노바 지원 지질 이중층 시스템을 이용한 막 곡률 감지 단백질 연구 방법을. 고해상도 나노가공 기술로 정밀한 곡률을 생성하여 단백질 역학을 시험관 내에서 분석할 수 있습니다.

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나노 구조 제조 및 SEM 이미징을 지원하는 난양 기술 대학교 (NTU)의 난양 나노 제조 센터 (N2FC)와 파괴 광자 기술 센터 (CDPT), 단백질 정제를위한 생명 과학 학교 NTU의 단백질 생산 플랫폼 (PPP), 컨포칼 현미경을위한 화학 및 생물 의학 공학 학교 NTU에 감사드립니다. 이 연구는 싱가포르 교육부(MOE)(W. Zhao, RG112/20, RG95/21 및 MOE-T2EP30220-0009), 디지털 분자 분석 및 과학 연구소(IDMxS)가 자금을 지원합니다. 우수 연구 센터 제도(W. Zhao), 휴먼 프론티어 과학 프로그램 재단(W. Zhao, RGY0088/2021), NTU 스타트업 보조금(W. Zhao), 연구 장학금을위한 화학 및 생물 의학 공학 학교 NTU (X. Miao), 연구 장학금을위한 중국 장학금위원회 (J. Wu).

1. 나노 칩 청소
<ol><li>나노칩을 패턴화된 면이 위를 향하도록 10mL 비커에 넣습니다. 참고 :이 석영 나노 칩은 앞서 설명한 바와 같이 전자빔 리소그래피를 통해 제조되었습니다21. 칩상의 나노 구조의 기하학적 구조와 배열은 맞춤 설계 될 수있다. 여기에 사용 된 그래디언트 나노 바의 크기는 길이 2000nm, 높이 600nm, 너비 100-1000nm (100nm 스텝 세트)입니다.</li>
	<li>비커에 98% 황산 1mL를 조심스럽게 넣고 산이 칩의 앞면과 뒷면을 완전히 덮는지 확인합니다. 알림: 98% 황산은 부식성이 매우 높으며 피부나 눈에 닿으면 빠른 조직 파괴와 심각한 화학적 화상을 유발할 수 있습니다. 적절한 보호 기능을 갖춘 흄 후드에서 사용하십시오.</li>
	<li>비커를 천천히 돌리고 전체 비커가 뜨거워질 때까지 200μL의 30% 과산화수소를 한 방울씩 추가합니다. 황산과 과산화수소가 잘 혼합되어 나노칩(17)으로부터 유기 분자를 제거하기 위한 피라냐 용액을 형성하는지 확인한다. 앞서 설명된 바와 같이 UV 광 및 오존 노출과 같은 깨끗한 친수성 표면 상에 SLB를 생성하기 위한 대안적인 기술이 있다(23). 알림: 반응은 극도로 발열성이며 용액이 끓을 수 있으므로 황산에 과산화수소를 한 방울씩 넣고 계속 회전하십시오.</li>
	<li>비커를 보조 유리 용기에 넣고 나노 칩을 피라냐 용액에 밤새 담그면 불순물이 완전히 청소됩니다. 알림: 반응으로 인해 가스가 발생할 수 있는 경우를 대비하여 덮개 없이 비커를 흄 후드에 넣으십시오.</li>
	<li>비커를 꺼내 피라냐 용액을 산성 폐기물 용기에 조심스럽게 피펫팅합니다.</li>
	<li>5mL의 탈이온수를 비커에 넣어 잔류 산을 희석하고 산성 폐기물로 버립니다. 이 단계를 5 번 반복하고 5M NaOH를 사용하여 산성 폐기물을 중화하십시오.</li>
	<li>핀셋으로 칩을 잡고 탈이온수의 연속 흐름으로 세척하여 잔류 산을 완전히 제거합니다. SLB 형성을 위해 칩을 99.9% 질소 가스로 블로우 드라이합니다(22).</li>
</ol>2. 작은 단층 소포 (SUV)의 생성
<ol><li>호박색 바이알에 클로로포름 100μL를 넣습니다. 알림: 클로로포름은 휘발성이 높고 무색의 액체이며 흡입하거나 삼키면 유독 할 수 있습니다. 마스크와 장갑을 낀 상태에서 흄 후드에 사용하십시오.</li>
	<li>지질 혼합물 500μg을 클로로포름에 녹인다. 여기에 사용 된 지질 혼합물의 조성은 계란 포스파티딜콜린 (PC) 89.5 몰%, 뇌 포스파티딜 세린 (PS) 10 몰%, 텍사스 레드 1,2- 디 헥사 데카 노일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민, 트리 에틸 암모늄염 (텍사스 레드 DHPE).</li>
	<li>클로로포름이 휘발되고 지질 혼합물이 건조될 때까지 바이알의 지질 혼합물을 99.9% 질소 가스로 블로우 건조합니다. 알림: 이 단계는 흄 후드에서 수행해야 합니다. 블로우 드라이 시 액체 튀김을 피하십시오.</li>
	<li>뚜껑 없이 호박색 바이알에 있는 지질 혼합물을 알루미늄 호일로 덮인 진공 데시케이터에 놓습니다. 그런 다음 클로로포름을 완전히 휘발시키기 위해 펌프로 샘플을 3시간 동안 진공 건조시킵니다.</li>
	<li>250μL의 인산염 완충 식염수(PBS) 버퍼를 바이알에 추가합니다. 균질해질 때까지 용액을 소용돌이치십시오. 알림: PBS 버퍼는 칼슘, 마그네슘 및 페놀 레드가없는 150mM NaCl로 구성됩니다. pH는 PC 및 PS 지질 이중층을 만들기 위해 7.2로 조정된다.</li>
	<li>목욕 초음파 처리기에서 50kHz의 주파수로 30분 동안 지질 혼합물을 초음파 처리합니다. 그런 다음 지질 혼합물을 1.5mL 원심분리 튜브에 옮기고 파라필름으로 밀봉합니다.</li>
	<li>지질 혼합물을 액체 질소에서 20초 동안 동결시킨 다음, 수조에서 42°C에서 2분 동안 해동시킨다. 동결-해동 주기를 30회 반복합니다. 그 후, 지질 혼합물은 투명한 액체처럼 보입니다. 주의 : 액체 질소의 끓는점은 약 -195.8 ° C입니다. 동상이나 극저온 화상을 일으킬 수 있습니다. 단열장갑을 끼고 밀폐되지 않은 공간에서 사용하십시오.</li>
	<li>두 개의 유리 기밀 주사기와 미니 압출기의 커넥터를 각각 에탄올, 클로로포름 및 메탄올로 헹굽니다. 헹굼 순서를 5 회 반복하여 장치를 사전 청소하십시오. 유기 용매가 완전히 휘발 될 때까지 흄 후드에 두십시오.</li>
	<li>미니 압출기 장치를 조립하고 500μL의 PBS 버퍼를 커넥터를 통과시켜 장치를 미리 습윤시킨 다음 다른 주사기에서 버퍼를 버립니다. 이 단계는 불순물을 제거하고 압출을 용이하게합니다.</li>
	<li>미니 압출기 장치를 100nm 기공 크기의 폴리카보네이트 필터 멤브레인으로 조립합니다. 참고: 필터 멤브레인의 기공 크기는 리포좀의 직경을 결정합니다.</li>
	<li>주사기 중 하나로 500μL의 PBS 버퍼를 가져다가 필터를 통해 부드럽게 밀어 다른 쪽 끝에 있는 두 번째 빈 주사기를 채웁니다. 압출을 앞뒤로 세 번 반복하여 장치 누출을 확인하고 두 번째 주사기에서 버퍼를 버립니다.</li>
	<li>지질 혼합물을 미니 압출기를 통과시켜 PBS 완충액을 대체한다. 그런 다음 앞뒤로 20 번 돌출하여 SUV를 만듭니다. 소포의 다층 특성은 불충분한 압출 횟수로 유지될 수 있으며, 이는 SLB 형성(23)에 영향을 미칠 것이다.</li>
	<li>두 번째 주사기에서 SUV를 수집하여 더 큰 입자로 인한 오염을 줄이고 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 알림: 주사기가 파손될 경우 커넥터에서 주사기를 똑바로 제거하십시오.</li>
	<li>형광 표지 지질의 표백을 방지하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 감싸고 4 ° C에서 보관하십시오. 일반적으로 SUV는 최대 7일 동안 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 나노칩 상에 SLB의 형성
<ol><li>탈이온수에서 세척된 나노칩을 핀셋으로 조심스럽게 꺼내고 99.9% 질소 가스로 블로우 드라이합니다.</li>
	<li>1 시간 동안 공기 플라즈마 처리로 나노 칩의 표면 세정을 수행하십시오.</li>
	<li>나노칩을 폴리디메틸실록산(PDMS) 챔버에 조립하고, 이 챔버는 중간 PDMS 및 상부 PDMS의 두 조각으로 구성된다(도 1A). 중간 PDMS는 얇고 (~ 0.5mm) 중앙에 큰 타원형 개구부가있어 나노 바 패턴에 충분한 노출을 보장합니다. 상단 PDMS는 두껍고(~4.0mm) 액체 처리를 위한 입구와 출구로 큰 타원형 개구부 내에 두 개의 작은 구멍이 있습니다.<ol><li>패턴이 위를 향하도록 깨끗한 표면에 칩을 놓습니다.</li>
		<li>중간 PDMS를 칩으로 부드럽게 덮고 전체 패턴이 중간 PDMS의 큰 타원형 개구부의 중앙 영역에 노출되는지 확인합니다.</li>
		<li>상단 PDMS를 중간 PDMS로 덮고 중간 PDMS의 큰 타원형 구멍 영역 내에 두 개의 작은 구멍을 유지하십시오. 그런 다음 PDMS 챔버가 조립됩니다. 참고: PDMS는 가장 널리 사용되는 실리콘 기반 유기 폴리머입니다. 생체 적합성이 있고 투명하며 변형이 가능하여 현미경으로 칩 조립 및 이미징을 위한 맞춤형 모양으로 설계됩니다. 더 중요한 것은 플라즈마 처리 후 다른 PDMS 층이나 유리에 공유 결합되어 단단히 접착 될 수있어 SLB를 준비하는 챔버로 적합하다는 것입니다. 이 단계를 통해 PDMS의 각 레이어가 단단히 고정되어 틈과 누출이 방지됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>피펫으로 상단 PDMS의 두 개의 작은 구멍 중 하나에서 SUV를 PDMS 챔버에 넣고 실온에서 15분 동안 배양하여 SLB를 형성합니다.</li>
	<li>작은 구멍의 한쪽에서 PBS 버퍼를 PDMS 챔버로 부드럽게 피펫팅하고 다른 구멍에서 면봉으로 폐기물을 제거하여 바인딩되지 않은 SUV를 씻어냅니다. 이어서 나노칩 상에 형성된 SLB를 획득한다(SLB의 품질은 단계 4.4에 도시된 바와 같이 광퇴색 후 형광 회복(FRAP)에 의해 시험되고 대표적인 결과 섹션에서 논의됨). 알림: PBS 버퍼를 챔버에 피펫팅할 때 피펫 팁은 버퍼로 가득 차 있어야 하며 기포가 주입되지 않도록 액체 표면과 접촉해야 합니다.</li>
</ol>4. SLB와 나노칩 상의 곡률 감지 단백질 결합 이미징
참고: 이 섹션은 실험에 사용할 수 있는 현미경 시스템에 따라 다릅니다. 여기서, 이미징을 수행하는 방법에 대한 전반적인 가이드라인이 설명될 것이다. 세부 설정은 서로 다른 현미경 설정 간에 변경할 수 있습니다.
<ol><li>100x(N.A.1.4) 오일 대물렌즈를 사용하여 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 설정합니다. ZEN 소프트웨어를 열어 지질과 단백질의 형광을 자극할 수 있는 여기 레이저 출력을 선택합니다. 획득 모드 > 스마트 설정 > 텍사스 레드 DHPE / EGFP를 선택합니다.</li>
	<li>초점 손잡이로 초점을 조정하여 나노바 가장자리가 지질 채널 아래에서 날카로워질 때까지 칩의 나노바를 찾습니다.</li>
	<li>단백질을 추가하기 전에 지질 채널의 대조 이미지를 얻기 위해 스캔 파라미터를 아래와 같이 설정하십시오: 프레임 크기 = 512픽셀 x 512픽셀(512픽셀 x 512 픽셀, 픽셀 크기 124nm), 픽셀당 비트 = 16( 16비트 심도), 스캔 속도 = 5, 평균 = 4(평균 모드/라인).</li>
	<li>형광 표지된 지질 이중층을 임의의 단일 나노바 영역 상에서 표백함으로써 FRAP 분석을 수행한다.<ol><li>실험 영역 및 표백 확인란을 선택합니다. 중앙에 전체 나노 바를 포함 할 수있는 직경 5μm의 원형 영역 (나노 바 크기는 2μm)을 그리고 실험 영역에 추가합니다. 다음 예와 같이 타임랩스 이미징 파라미터를 입력합니다: 스캔 속도 = 9 및 평균 = 1을 선택합니다. 시계열 > 기간 = 100주기 및 간격 = 2초를 선택합니다. 다음 예와 같이 표백 매개 변수 입력: # 이미지 후 시작 확인란을 선택하고 세 개의 이미지를 선택합니다.</li>
		<li>FRAP를 수행하는 레이저 확인란을 선택하고 전원을 100.0%로 변경합니다. FRAP 실험에 대해 실험 시작을 클릭합니다. 참고: FRAP는 세포 분자의 이동성을 특성화하는 일반적인 방법입니다. SLB의 유동성이 좋으면 표백된 형광단이 확산되고 다른 영역의 표백되지 않은 형광단이 확산됨에 따라 표백된 영역의 형광이 점차 회복됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>단백질 용액을 PDMS 챔버에 로딩하고 SLB에서 단백질의 결합을 허용하기 위해 실온에서 5분 동안 인큐베이션합니다. 참고: 나노바 곡선 SLB에서 단백질 결합을 촉진하는 지질 조성을 입증하기 위해 그림 2G, H에서 사용된 단백질은 74μM GFP 및 79μM GFP-His입니다. 이 두 단백질은 His-태그가 없거나 있는 녹색 형광 단백질입니다. 그림 4 및 그림 5에서 곡률 감지 연구에 사용되는 단백질은 16μM F-BAR, 16μM IDR FBP17 및 16μM FBAR+IDRFBP17입니다. 이 세 가지 단백질은 FBP17의 도메인으로, 직관적으로 곡률 발생기와 센서로 가정되는 전형적인 BAR 단백질입니다. 각 단백질 부피는 20 μL입니다.</li>
	<li>나노바의 초점을 다시 맞추고 4.3단계를 반복하여 단백질 곡률 감지 감지를 위해 지질과 단백질 채널의 이미지를 모두 촬영합니다.</li>
	<li>단계 4.4를 반복하여 지질 및 단백질 채널 모두에서 FRAP 분석을 수행하고 타임 랩스 이미징을 수행하여 곡률 감지 단백질의 이동성을 특성화합니다.</li>
</ol>5. 나노 칩의 재사용
<ol><li>핀셋으로 나노 칩을 잡고 탈 이온수로 채워진 50mL 비커에서 PDMS 챔버에서 조심스럽게 분리합니다. 참고: 이것은 중요한 단계입니다. 핀셋이 나노 구조에 닿지 않도록하고 균열을 피하기 위해 칩을 강제로 분리하지 마십시오.</li>
	<li>나노 칩을 무수 에탄올로 철저히 씻어 표면에 부착 된 유기 잔류 물을 제거하십시오. 알림: 무수 에탄올로 세척하기 전에 깨끗한 티슈 페이퍼를 사용하여 표면의 물을 제거하십시오. 주의 : 무수 에탄올은 휘발성이 높고 약간 위험한 화학 물질입니다. 피부와 눈과의 접촉을 피하십시오. 마스크와 장갑을 낀 상태에서 흄 후드에 사용하십시오.</li>
	<li>잔류 에탄올을 제거하기 위해 많은 양의 탈 이온수로 칩을 철저히 씻으십시오. 그런 다음 99.9% 질소 가스로 칩을 블로우 드라이합니다. 알림: 피라냐 산은 유기 용매와 격렬하게 반응하여 폭발을 일으킬 수 있으므로 다음 단계로 진행하기 전에 칩에 있는 모든 미량의 에탄올을 제거하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>패턴면이 위를 향하도록 깨끗한 10mL 비커에 칩을 넣고 '나노칩 세척'과 동일한 단계에 따라 재사용을 위해 피라냐 용액으로 칩을 청소합니다.</li>
</ol>6. 이미지 정량화
<ol><li>현미경으로 획득한 이미지를 회전하여 나노바 어레이가 피지 소프트웨어에서 후속 분석을 위해 수직 위치에 있도록 합니다.</li>
	<li>사용자 지정 MATLAB 코드 'c_pillarmask_averaging'를 사용하여 지질 채널과 단백질 채널 모두에서 정사각형 마스크(51픽셀 x 51픽셀)로 개별 나노바를 찾습니다. 참고: 이 MATLAB 코드는 나노칩용으로 특별히 설계되었습니다. GitHub에서 링크를 통해 얻을 수 있습니다 : https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX.</li>
	<li>MATLAB 코드 'BarGra_avg'의 meshgrid 함수를 사용하여 영상 모서리에 ROI 3개(5픽셀 x 5픽셀)가 있는 각 영상의 배경 신호를 뺍니다. 이 작업은 현미경 설정 또는 현미경 스테이지의 칩 레벨링으로 인해 발생할 수 있는 고르지 않은 배경 소음을 수정하는 것을 목표로 합니다.</li>
	<li>MATLAB 코드 'BarGra_avg'를 사용하여 동일한 크기의 나노바의 평균 영상을 생성하며, 여기서 각 점은 모든 개별 나노바 사각형 마스크에서 해당 점에 있는 값의 평균입니다. 피지 소프트웨어에서 평균 이미지의 3D 표면도를 생성하여 나노바 주변의 평균 신호 분포를 직관적으로 보여줍니다. > 표면도 분석을 선택하고 다각형 승수에 대해 입력 100> 선택하고 음영, 축 그리기 및 부드럽게 확인란을 선택합니다.</li>
	<li>각 나노바를 두 개의 나노바 말단 영역과 하나의 나노바 중심 영역을 포함하는 세 개의 영역으로 분할하여 MATLAB 코드 'avg_nanobar_quantification'로 각각 형광 강도를 추출합니다. 나노바 ROI의 크기는 '위치' 파일을 사용하여 나노바의 치수에 따라 조정됩니다.</li>
	<li>단백질 강도를 막대 끝 영역의 MATLAB 코드 'avg_nanobar_quantification'에서 추출한 지질 강도로 나누어 표면적 효과를 제외한 나노바 말단 밀도를 얻습니다.</li>
	<li>다양한 농도의 나노바 말단 밀도를 GraphPad Prism에 플로팅하여 결합 곡선을 얻습니다. 분석 메뉴를 엽니다. 비선형 회귀(곡선 맞춤) > 결합 - 채도 > 힐 기울기 함수를 사용한 특정 결합 을 선택하여 곡선을 힐 방정식에 맞춘 다음 KD 및 힐 계수 값을 계산합니다.</li>
	<li>지질과 단백질 강도는 MATLAB 코드 'avg_nanobar_quantification'를 사용하여 동일한 이미지에서 획득한 600nm 나노바 중심에서 해당 강도로 정규화됩니다.</li>
	<li>동일한 크기의 나노바로 단백질 곡률 감지를 정량화하기 위해 바 중심 영역으로 나눈 나노바 말단 영역에서 정규화된 단백질 강도의 가장 밝은 9픽셀을 사용하여 값을 "종단 대 중심 비율"이라고 합니다. 표준화 된 단백질 강도의 비율을 사용하여 지질 강도를 정규화하여 다양한 크기의 나노 막대로 단백질 곡률 감지 범위를 정량화하면 값을 "정규화 된 나노 바 말단 밀도"라고합니다. 이 값은 MATLAB 코드 'avg_nanobar_quantification'로 계산됩니다.</li>
	<li>피지 소프트웨어에서 FRAP 스택 이미지를 로드합니다. FRAP 영역을 선택하고 ROI를 생성합니다. 추가 > 다중 측정 기능을 선택하여 각 시간에 대한 FRAP 영역의 강도를 측정합니다. 그래프패드 프리즘에 강도를 플로팅하여 FRAP 회복 곡선을 생성합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는이 작업에 대해 경쟁하는 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

여기에 설명된 나노바-SLB 시스템은 기존의 여러 시험관 분석에서 장점의 고유한 조합을 제공합니다. 리포솜 부유 또는 침강 분석과 같이 고도로 구부러진 막에 대한 단백질의 우선적 결합을 효율적으로 나타내지만 훨씬 적은 수의 샘플이 필요하며 개별 나노바 8,29에서 보다 정확하게 정의된 곡률을 제공합니다. 또한 SLiC 분석법과 동시 비교를 위해 정밀하게 제어된 광범위한 곡률을 제공하며, SLB가 이동성이 있고 모든 크기의 나노바를 지속적으로 커버하기 때문에 다양한 곡률의 지질 조성 변화와 빛의 회절 한계 미만의 크기로 감지할 수 없는 형태학적 또는 곡률 변화에 대한 우려가 적습니다.30 . Nanobar-SLB는 또한 테더 당김 분석법으로 곡면에서 단백질의 동적 거동을 관찰할 수 있지만 튜브 생성의 처리량과 광학 트래핑 조작 경험에 의해 제한되지 않습니다<sup cl...

막 곡률은 형태 형성, 세포 분열 및 세포 이동과 같은 다양한 세포 과정에서 발생하는 세포의 중요한 물리적 매개 변수입니다1. 막 곡률이 세포 사건의 단순한 결과를 넘어선다는 것이 이제 널리 인식되고 있습니다. 대신, 단백질 상호 작용 및 세포 내 신호 전달의 효과적인 조절자로 부상했습니다. 예를 들어, 클라 트린 매개 세포 내 이입에 관여하는 여러 단백질이 곡선 막에 우선적으로 결합하여 세포 내 이입2에 대한 핫스팟을 형성하는 것으로 나타났습니다. 세포골격력에 의한 막 당김, 크기가 다른 머리 그룹을 가진 지질 비대칭의 존재, 원뿔 모양의 막 횡단 단백질의 존재, BAR 도메인 단백질(Bin, amphiphysin 및 Rvs 단백질의 이름을 따서 명명됨)과 같은 막 형성 단백질의 축적, 양친매성 나선 도메인을 막1에 삽입하는 것과 같은 막 변형의 다양한 원인이 있습니다. . 흥미롭게도 이러한 단백질과 지질은 막을 변형시킬 뿐만 아니라 막 곡률을 감지하고 우선적인 축적을 나타낼 수있습니다1. 따라서 곡률이 다른 막이 단백질과 지질의 분포와 역학을 변화시키고 관련 세포 내 과정에 대한 잠재적 영향을 변화시키는지 여부와 방법을 연구하는 것이 중요합니다.
살아있는 세포와 시험관 내 시스템 모두에서 곡선 막과 단백질 간의 상호 작용을 분석하기 위해 많은 기술이 개발되었습니다. 살아있는 세포 시스템은 풍부한 지질 다양성과 동적 단백질 신호 조절 2,3,4,5,6,7을 갖춘 실제 세포 환경을 제공합니다. 그러나, 이러한 정교한 시스템은 세포 내 환경의 불확실성 및 변동으로 인해 연구하기가 어렵다. 따라서 알려진 지질 종과 정제된 단백질로 구성된 인공 막을 사용하는 시험관 내 분석은 단백질과 곡선 막 사이의 관계를 특성화하는 강력한 재구성 시스템이 되었습니다. 전통적으로, 다양한 직경의 리포좀은 원심력을 이용한 공동 침강 분석 또는 단백질 응집을 피하기 위한 밀도 구배를 갖는 공동 부유 분석 8,9를 통해 곡률에 민감한 단백질을 검출하기 위해 압출에 의해 생성됩니다. 그러나, 압출된 리포좀의 곡률은 압출기(10)에 사용되는 멤브레인 필터의 사용 가능한 기공 크기에 의해 제한된다. 단일 리포좀 곡률(SLiC) 분석은 이러한 한계를 극복하는 것으로 입증되었으며, 여기서 직경이 다른 리포좀은 형광 표지되고 표면에 고정화되어 곡률이 형광 강도(11)로 표시될 수 있습니다. 그러나, 지질 조성에서의 강한 가변성이 작은 소포에서 관찰되었고, 이는 곡률 측정의 정확도에 영향을 미친다(12). 테더-풀링 실험은 광학 핀셋을 사용하여 거대한 단층 소포(GUV)로부터 당겨진 과도 테더 상의 곡률의 보다 정확한 측정을 제공하며, 여기서 곡률은 생성된 막 장력에 의해 잘 제어될 수 있다(13,14). 이 방법은 포지티브 또는 네거티브 곡률 감지 단백질을 연구하는 데 적합하지만 튜브 생성10의 처리량에 의해 제한됩니다. 지원되는 멤브레인 튜브(SMrT) 분석은 미세유체 흐름에 의해 동일한 지질 저장소에서 압출되는 여러 멤브레인 튜브를 동시에 생성할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 막 곡률은 나노튜브를 따라 본질적으로 변하며, 이는 형광-강도-기반 곡률 측정(15,16)의 정확도를 손상시킨다. 이에 비해, 작은 단층 소포 (SUVs, 직경 <100 nm17)를 사용하여 설계된 지형을 포함하는 표면 상에 지지된 지질 이중층 (SLB)을 형성하여 나노 제조 또는 나노 물질에 의해 미리 결정된 곡률을 갖는 단일 이중층 막을 높은 정확도로 생성하였다18,19,20.
여기에서는 나노바 어레이가 있는 제작된 나노칩 표면에 SLB를 형성하기 위한 프로토콜과 이를 사용하여 시험관 내 단백질의 곡률 감도를 조사하는 방법을 제시합니다. 도 1에 도시된 바와 같이, 분석의 6가지 필수 성분이 있다: A) 칩을 마이크로유체 챔버로 세척 및 조립하는 단계; B) 정의된 지질 조성을 갖는 SUV의 제조; c) 나노칩 상에 SLB를 형성하고 곡률 민감성 단백질과 결합하는 단계; D) 형광 현미경 하에서 SLB 및 곡률 민감성 단백질의 이미징 및 특성화; E) 재사용을 위해 칩을 청소하는 단계; F) 단백질 곡률 센싱 능력의 정량 분석을 위한 영상 처리. 자세한 프로토콜은 아래에 단계별로 설명되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>무수 에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>다이아몬드</td><td>RN0879999FU</td><td></td></tr><tr><td>앰버 바이알</td><td>시그마-알드리치</td><td>27115-U</td><td></td></tr><tr><td>Brain PS: L-&alpha;-phosphatidylserine (Brain, porcine) (sodium salt)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td>840032</tr><tr><td>10 mL 비커</td><td>Schott-Duran</td><td>SCOT211060804</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 비커</td><td>Schott-Duran</td><td>SCOT211061706</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL 비커</td><td>Schott-Duran</td><td>SCOT211065408</td><td>두 번째 용기&nbsp;</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마-알드리치</td><td>V800117</td><td></td></tr><tr><td>면봉</td><td>왓슨스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[(N-(5-아미노-1-카르복시펜틸)이미노디아세틱산)숙시닐](니켈염)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td>790404</tr><tr><td>달걀 PC: L-&알파;-포스파티딜콜린(달걀, 닭고기)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td>840051</tr><tr><td>F-BAR</td><td>단백질 생산 Plaftorm, 생물 과학부, 난양 기술 대학교, 싱가포르</td><td></td><td>단백질 및 펩타이</td></tr>드 <tr><td>F-BAR+IDR</td><td>단백질 생산 Plaftorm, 생물 과학부, 난양 기술 대학교, 싱가포르</td><td></td><td>단백질 및 펩타이드</td></tr><tr><td>GFP</td><td>단백질 생산 Plaftorm, 생명 과학부, 난양 기술 대학교, 싱가포르</td><td></td><td>단백질 및 펩타이드</td></tr><tr><td>GFP-His</td><td>단백질 생산 Plaftorm, 생물 과학 대학, 난양 기술 대학교, 싱가포르</td><td></td><td>단백질 및 펩타이드</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>V9.0.0</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소, 30%(ACS 인증)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td> 인간 FBP17 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.의 H325-500 <td></td></tr><tr><td>IDR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>1.50d</td><td></td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 Zeiss</td><td>&nbsp;</td>Airyscan <td>100x(N.A.1.4) 오일 대물렌즈</td><td>가 장착된 LSM 800</td>.</tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 과학</td><td>10010240</td><td></td></tr><tr><td>미니 엑스투더&nbsp;</td><td>아반티 폴라 지질(Avanti Polar Lipids, Inc.)</td><td>610000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로튜브</td><td>Greiner</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2018b</td><td></td></tr><tr><td>핵포어 친수성 멤브레인,0.1 &mu; m</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td><td>70013</td><td></td></tr><tr><td>폴리디메틸실록산(PDMS) 베이스</td><td>다우코닝 코퍼레이션</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>폴리메틸실록산(PDMS) 크로스링커</td><td>다우코닝 코닉</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>HARRICK PLASMA</td><td>PDC-002-HP</td><td></td></tr><tr><td>석영 나노칩</td><td>동하이 카운티 알파 석영 제품 CO., LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>황산</td><td>시그마-알드리치</td><td>258105</td><td></td></tr><tr><td>텍사스 레드 DHPE: 텍사스 레드 1,2-디헥사데칸노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 트리에틸암모늄 Salt</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td><td></td><td></td>T1395MP</tr><tr><td>핀셋</td><td>Gooi</td><td>PDC-002-HP</td><td></td></tr><tr><td>초음파 세척기</td><td>Elma</td><td>D-78224</td><td></td></tr><tr><td>Voterx</td><td>Scientific Industries</td><td>G560E</td><td></td></tr><tr><td>진공 탈착기</td><td>NUCERITE</td><td>5312</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Julabo</td><td>TW8</td><td></td></tr></tbody></table>

시험관 내 막 곡률 감지 단백질 연구를 위한 나노바 지원 지질 이중층 시스템

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

막 곡률은 세포 이동, 세포 분열 및 소포 트래피킹과 같은 세포의 다양한 필수 과정에서 중요한 역할을 합니다. 그것은 세포 활동에 의해 수동적으로 생성 될뿐만 아니라 단백질 상호 작용을 적극적으로 조절하고 많은 세포 내 신호 전달에 관여합니다. 따라서 단백질과 지질의 분포와 역학을 조절하는 막 곡률의 역할을 조사하는 것은 큰 가치가 있습니다. 최근에는 시험 관 내에서 곡선 막과 단백질 사이의 관계를 연구하기 위해 많은 기술이 개발되었습니다. 기존 기술과 비교하여 새로 개발된 나노바 지지 지질 이중층(SLB)은 사전 정의된 막 곡률 및 국소 평면 제어를 통해 패턴화된 나노바 어레이에 연속 지질 이중층을 형성하여 막 곡률 생성에서 높은 처리량과 더 나은 정확도를 모두 제공합니다. 곡면막에 대한 지질 유동성과 단백질 민감도는 형광 현미경 이미징을 사용하여 정량적으로 특성화할 수 있습니다. 여기에서는 나노바 어레이를 포함하는 제작된 유리 표면에 SLB를 형성하는 방법과 이러한 SLB 상의 곡률 민감성 단백질의 특성 분석에 대한 자세한 절차를 소개합니다. 또한 나노 칩 재사용 및 이미지 처리를위한 프로토콜을 다룹니다. nanobar-SLB 외에도 이 프로토콜은 곡률 감지 연구를 위한 모든 유형의 나노 구조 유리 칩에 쉽게 적용할 수 있습니다.

나노바 설계는 포지티브 곡률 감지 단백질을 프로빙하는 데 권장되며, 각 끝에는 나노바 너비로 정의된 곡률이 있는 반원이 있고 중앙에 국부적으로 하나의 평면/제로 곡률 제어가 포함됩니다(그림 2A,B). 나노바에 SLB를 성공적으로 형성하면 그림 2C와 같이 전체 나노바 표면에 걸쳐 지질 마커 신호가 고르게 분포됩니다. 개별 나노바 이미지(그림 2D)를 평균화하여 여러 나노바의 신호를 결합할 수 있으므로 서로 다른 나노바 간의 무작위 변동을 최소화할 수 있습니다. 이전의 전자 현미경 연구는 세포 원형질막이 전체 나노구조물 주위에 컨포멀 코팅을 형성한다는 것을 보여주었다(24). 따라서, 합성 지질 이중층은 나노구조물 표면에도 단단히 부착되는 것으로 여겨지며, 이는 <strong class="xfig"...

여기서, 나노바 담지 지질 이중층 시스템은 시험관 내에서 곡률 감지 능력을 가진 단백질의 특성 분석을 가능하게 하는 정의된 곡률을 갖는 합성 막을 제공하기 위해 개발된다.

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

이 나노바 지지 지질 이중층 시스템은 세포 활동 중 단백질과 지질의 역학 및 분포를 조절하는 막 곡률의 역할을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 고해상도 나노 제조에 의해 사전 정의 된 막 곡률로 특허 나노 바 오류에 연속적인 지질 이중층을 형성함으로써 막 곡률 생성에서 높은 서브 루트와 나쁜 것을 모두 제공합니다. 시작하려면 나노 칩을 패턴면이 위를 향하도록 10 밀리리터 비커에 넣습니다.비커에 98 % 황산 1 밀리리터를 조심스럽게 추가하고 산이 칩의 앞면과 뒷면을 완전히 덮도록합니다. 비커를 천천히 돌리고 전체 비커가 뜨거워 질 때까지 200 마이크로 리터의 30 % 과산화수소를 한 방울 씩 추가합니다. 황산과 과산화수소가 잘 혼합되어 나노 칩에서 유기 분자를 제거하기위한 피라냐 용액을 형성하는지 확인하십시오.비커를 보조 유리 용기에 넣고 나노 칩을 피라냐 용액에 밤새 담가 두어 불순물을 철저히 청소하십시오. 비커를 꺼내 피라냐 용액을 산성 폐기물 용기에 조심스럽게 피펫팅합니다. 5 밀리리터의 탈 이온수를 비커에 넣어 잔류 산을 희석하고 산성 폐기물로 버립니다.이 단계를 다섯 번 반복합니다. 핀셋으로 칩을 잡고 탈이온수의 연속 흐름으로 세척하여 잔류 산을 완전히 제거합니다. SLB 형성을 위해 99.9 % 질소 가스로 칩을 불어 건조시킵니다.지질 혼합물을 30 분 동안 초음파 처리하십시오. 지질 혼합물을 액체 질소에서 20 초 동안 동결시킨 다음 수조에서 섭씨 42도에서 2 분 동안 해동합니다. 동결/해동 주기를 30회 반복합니다.그 후, 지질 혼합물은 투명한 액체처럼 보입니다. 지질 혼합물을 미니 압출기를 통과시키고 앞뒤로 20회 압출합니다. 반대쪽의 주사기에서 SUV를 수집하여 더 큰 입자 나 이물질로 인한 오염을 줄이고 1.5 밀리리터 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.한 쌍의 핀셋으로 탈 이온수에서 청소 된 나노 칩을 조심스럽게 꺼내고 99.9 % 질소 가스로 불어 건조시킵니다. 1시간 동안 공기 플라즈마 처리로 나노칩의 표면 세정을 수행한다. 나노 칩을 PDMS 챔버에 조립합니다.패턴이 위를 향하도록 깨끗한 표면에 칩을 놓는 것으로 시작하십시오. 중간 PDMS를 칩으로 부드럽게 덮고 전체 패턴이 중간 PDMS의 큰 타원형 개구부의 중앙 영역에 노출되는지 확인합니다. 상단 PDMS를 중간 PDMS로 덮고 중간 PDMS의 큰 타원형 구멍 영역 내에 두 개의 작은 구멍을 유지하십시오.이어서, PDMS 챔버가 조립된다. 피펫으로 상단 PDMS의 두 개의 작은 구멍 중 하나에서 SUV를 PDMS 채널로 로드하고 실온에서 15분 동안 배양하여 SLB를 형성합니다. PBS 버퍼를 작은 구멍의 한쪽에서 PDMS 채널로 부드럽게 피펫팅하고 다른 구멍에서 면봉으로 폐기물을 제거하여 바인딩되지 않은 SUV를 씻어냅니다.그런 다음 나노 칩 상에 형성된 SLB를 획득한다. 100 x 오일 대물렌즈를 사용하여 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 설정합니다. Zen 소프트웨어를 열어 지질과 단백질의 형광을 자극할 수 있는 여기 레이저 출력을 선택합니다.획득 모드를 선택합니다. 그런 다음 스마트 설정을 클릭한 다음 Texas Red를 클릭합니다. 초점 노브로 초점을 조정하여 나노 막대 가장자리가 지질 채널 아래에서 날카로워질 때까지 칩의 나노 막대를 찾습니다.단백질을 추가하기 전에 지질 채널의 제어 이미지를 얻기 위해 스캐닝 파라미터를 설정합니다. 임의의 단일 나노바 영역에서 형광 표지된 지질 이중층으로 표백하여 FRAP 분석을 수행합니다. 실험 영역 및 표백 확인란을 선택합니다.중앙에 전체 나노 바를 포함 할 수있는 직경 5 마이크로 미터의 원형 영역을 그리고 실험 영역에 추가합니다. 타임랩스 이미징 파라미터를 입력합니다. 시계열을 선택합니다.그런 다음 기간을 클릭합니다. 100 사이클과 2초와 같은 간격을 선택합니다. 표백 매개 변수를 입력합니다.FRAP를 수행하는 레이저 확인란을 선택하고 전원을 100%로 변경합니다. FRAP 실험에 대해 실험 시작을 클릭합니다. 단백질 용액을 PDMS 채널 내로 로딩하고 SLB 상의 단백질의 결합을 허용하기 위해 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 나노바의 초점을 다시 맞추고 스캐닝 파라미터를 설정하여 단백질 곡률 감지 감지를 위해 지질 및 단백질 채널의 이미지를 촬영합니다.실험 영역을 선택하고 지질 및 단백질 채널 모두에서 FRAP 분석을 수행하고 TimeLapse 이미징을 수행하여 곡률 감지 단백질의 이동성을 특성화합니다. 둘 다 300 나노 미터 너비의 SLB 코팅 된 개별 나노 바의 끝 부분에 증가 된 축적을 보여줍니다. 여기서 SLB는 단백질 결합을 정전기적으로 향상시키기 위해 10%PS를 포함합니다.두 단백질 모두 지질보다 말단 대 중심 비율이 높으며 이는 약 1입니다. IDR FBP17과 F-Bar를 비교할 때 IDR FBP17의 더 높은 끝 대 중심 비율은 F-Bar보다 더 강한 곡률 감지를 나타냅니다. 3 개의 단백질 모두 직경이 400 나노 미터 이하로 감소했을 때 곡률이 감소 할 때 나노 바 말단 곡선 막 부위에서 우선적 인 축적을 보였다.이 세 가지 단백질 도메인 중에서 IDR FBP17은 가장 높은 나노 바 및 밀도를 제공하여 가장 강한 곡률 감지 능력을 나타내는 반면 F-Bar는 가장 낮은 값을 나타냅니다. 단백질 결합 곡선은 IDR FBP17이 강한 협력 곡률 감지 능력을 가지고 있음을 보여주는 단백질 농도를 점진적으로 증가시켜 플롯 할 수 있습니다. 나노바에서 지질 신호의 빠른 회복과 비교할 때, F-Bar는 2분 이내에 회복할 수 없으며, 이는 곡선 막 부위에서 막 이동성과 결합 역학이 크게 감소했음을 시사합니다.놀랍게도, F-Bar의 거동과는 달리, IDR FBP17 신호는 동일한 기간 내에 명백한 회복을 보여 주며, 이는 곡선 멤브레인에 축적 된 IDR FBP17의 동적 특성을 나타냅니다. 그러나 솔루션에서 언바운드 IDR FBP17을 씻어낸 후 IDR FBP17 채널에서 이전과 동일한 복구가 관찰되지 않았습니다. SLB 품질은 곡곡 막과 단백질 간의 상호 작용을 연구 할 때 매우 중요합니다.따라서 FRAP 테스트는 멤브레인 이동성을 검증하기 위해 실험에서 필요합니다. 이 시스템은 연구자들이 곡률 감지 도메인 및 지질 조성과 같은 곡선 막과의 단백질 상호 작용에 영향을 미치는 다양한 매개 변수를 연구하고 얼굴 분리 거동과 같은 곡선 막에 대한 동적 연구를 수행하는 데 도움이 될 것입니다.

a-nanobar-supported-lipid-bilayer-system-for-study-membrane-curvature

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

막 단백질 기능은 세포막의 지질 성분에 의해 규제됩니다. 이 비디오 - 문서 변경 막 속성의 기자로 이중층 패치 전극뿐만 아니라 사용하는 방법으로 그램이시딘 채널을 사용하여 패치를 형성하는 방법 세부 사항.

이중층 탄성 등록 정보 모니터링 변경에 대한 단일 분자 방법

이 비디오에서는 전반사 형광 현미경을 사용하여 유리로 지지된 지질 이중층의 체외에서 셉틴 조직을 조사하는 절차를 보여줍니다.

Planar Supported Lipid Bilayer Assay: 생물학적 막 모방체에 대한 셉틴 어셈블리를 조사하기 위한 현미경 기반 체외 기술

이 비디오는 지질 이중층으로 코팅된 미세구에서 셉틴 단백질 어셈블리를 연구하는 기술을 설명합니다. 이 기술은 곡면에 있는 단백질의 곡률 의존적 어셈블리를 이해하는 데 도움이 됩니다.

Spherical Supported Lipid Bilayer Assay: 마이크로스피어에서 Septin 어셈블리를 관찰하는 기술

많은 단백질이 막 표면에 부착될 때 기능을 수행합니다. 나노 디스크 막에 대한 외인성 단백질의 결합은 투과 전자 현미경에 의해 간접적으로 이미지화될 수 있습니다. 우리는 음성 염색 인산 텅스텐 산 나트륨에 의해 유도 된 나노 디스크의 특징적인 적층 (rouleau)이 외인 단백질의 결합에 의해 방지된다는 것을 보여줍니다.

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

셀에 많은 단백질을 감지 하 고 막 곡률을 유도. 곡선된 막 체 외단백질 또는 어떤 곡률 활성 분자의 상호작용을 연구 하는 지질 소포에서 막 나노튜브를 당겨 하는 방법을 설명 합니다.

거 대 한 Unilamellar 소포에서 막 나노튜브를 당기

우리 제공 프로토콜 시험관에 마음과 나의 자기 조직 분석 오픈 챔버에 지원된 지질 bilayer에. 또한, 우리는 vivo에서 조건 반응 감 금에 의해 모방 PDMS microcompartments 지질 입은에 분석 결과 포함 하는 방법을 설명 합니다.

생체 외에서 자가 지원된 지질 Bilayers에 단백질 패턴 구성의 재구성

이 프로토콜은 리포솜의 제조를 설명하고 이들이 어떻게 표면에 고정되고 형광 현미경 검사법을 사용하여 거대한 병렬 방식으로 개별적으로 심상될 수 있는지 설명합니다. 이는 집단의 단일 리포좀 들 사이의 크기 및 조성 불균질의 정량화를 허용한다.

개별 리포좀 간의 조성 불균질성을 검출하기 위한 정량적 형광 현미경 검사법 기반 단일 리포좀 분석

이 프로토콜은 유니 지질 및 다중 지질 소포, 지원지질 이중층 및 일시 중단 된 지질 이중 층을 모방 하는 세포의 형성을 설명 합니다. 이러한 체외 모델은 다양한 지질 유형을 통합하도록 조정할 수 있으며 다양한 분자 및 거대 분자 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

셉틴은 세포골격 단백질이다. 그들은 지질 막과 상호 작용하고 미크론 규모에서 막 곡률을 감지 할 수 있습니다. 우리는 막 변형, 곡률에 민감한 셉틴 결합 및 셉틴 필라멘트 초 구조를 분석하기위한 상향식 시험관 내 방법론을 설명합니다.

Bottom-Up In Vitro Methods to assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

무세포 재구성은 세포 골격 어셈블리를 이해하는 핵심 도구였으며, 지난 십 년 동안의 연구는 최소한의 시스템에서 셉틴 역학을 연구하는 접근법을 확립했습니다. 여기에 제시된 것은 서로 다른 막 맥락에서 셉틴 어셈블리를 관찰하는 세 가지 보완적인 방법입니다 : 평면 이중층, 구형 지지대 및 막대 지지대.

생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성

그라마시딘 A-도핑된 액상 계면 이중층을 조립, 전기자극, 분석하는 실험 프로토콜이 제시됩니다. 지질-단백질 구조-기능 관계는 막 면적, 이온 플럭스, 단일 채널 전도도 변화를 측정하고, 이러한 반응을 전기 시냅스에서 영감을 받은 막 모델에서 이온 전도의 가소성 유사 변화와 연관하여 정량화합니다.

액상 인터페이스 이중층을 이용한 지질-단백질 막 구조-기능 특성 분석

학습하세요 나노바 지원 지질 이중층 시스템을 이용한 막 곡률 감지 단백질 연구 방법을. 고해상도 나노가공 기술로 정밀한 곡률을 생성하여 단백질 역학을 시험관 내에서 분석할 수 있습니다.

시험관 내 막 곡률 감지 단백질 연구를 위한 나노바 지원 지질 이중층 시스템

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