Name: 유세포분석 기반 심근 B 세포의 정량화 및 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T14:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: 학습하세요 심근 B 세포의 유세포분석 기반 정량화 및 분석 방법을 통해 면역학 및 심장학 연구에서 재현성 있는 결과를 얻는 기술을 습득하세요.

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이 연구는 Luigi Adamo에게 수여 된 NHLBI 보조금 5K08HLO145108-03 및 1R01HL160716-01의 지원을 받았습니다.
이 연구를 개발하는 데 사용 된 오로라 유세포 분석기는 NIH Grant S10OD026859의 자금 지원을 받았습니다. 우리는 JHU Ross Flow Cytometry Core의 지원을 인정합니다.

이 원고에 설명 된 모든 실험은 존스 홉킨스 의과 대학의 IACUC의 승인을 받아 수행되었습니다.
1. 준비
<ol><li>표 1에 설명된 대로 FACS 버퍼를 준비합니다.</li>
	<li>동물을 안락사시키기에 충분한CO2 가 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>해부 공간을 준비하십시오 (벤치 패드를 놓고 테이프와 해부 도구를 근처에 두십시오).</li>
	<li>15mL 튜브에 라벨을 붙이고 각 튜브에 칼슘과 마그네슘이 함유된 HBSS 3mL를 넣고(재료 표 참조) 얼음 위에 놓습니다(심장당 튜브 1개, 참조 그룹/유세포분석 대조군의 경우 추가 튜브 1개). 또한 작은(35mm) 페트리 접시에 HBSS를 채웁니다.</li>
	<li>온도 제어 셰이커를 켜고 37 ° C로 설정 한 다음 4 ° C의 온도에서 원심 분리기를 사전 냉각합니다.</li>
	<li>주사기 펌프를 준비하고 유속을 3mL/분으로 설정합니다. 20mL 주사기에 HBSS를 채우고 튜브 라인을 버퍼로 프라이밍한 다음 기포를 제거합니다.</li>
</ol>2. 혈관내 B세포 염색(생체 내)
<ol><li>C57BL/6J 균주의 12주령 수컷 마우스의 무게를 측정합니다. 3/10cc 인슐린 주사기에 100μL의 B220 항체 희석액을 넣습니다(PBS의 경우 1:10). 빛으로부터 보호하기 위해 주사기를 알루미늄 호일로 덮으십시오.</li>
	<li>마우스 한 마리를 마취하십시오.<ol><li>2 mg / kg의 용량으로 2 % 2,2,2- 트리 브로 모 에탄올을 복강 내 주사하고 10-20 분 정도 기다리십시오. 참고: 마우스의 호흡과 움직임을 모니터링합니다. 마우스가 움직이지 않으면 발가락을 꼬집어 통증을 자극하십시오. 금단 반사가 없으면 적절한 마취를 나타냅니다.</li>
		<li>20분 이내에 적절한 마취가 이루어지지 않으면 100mg/kg의 추가 마취제를 투여할 수 있으며 5분마다 마우스 역학, 금단 반사 및 호흡을 평가해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>한쪽으로 기울어진 벤치 패드의 실험실 벤치에 마우스를 놓고 등의 피부를 부드럽게 아래로 당기고 몸을 벤치에 대고 약간 눌러 눈이 튀어나오도록 합니다.</li>
	<li>단계 2.1로부터 희석된 B220 항체를 역궤도 주사로 주입한다.<ol><li>주사기를 마우스 머리의 시상면에서 45° 떨어진 눈에 삽입합니다. 천천히 용액을 주입하십시오. 저항이 느껴지면 주사기를 제거하고 다시 들어가십시오. 2분 동안 기다립니다. 참고: 배양 시간이 길어지면 주입된 항체가 혈관 구조 외부로 확산될 시간을 주기 때문에 혈관 내 B 세포와 혈관 외 B 세포를 구별하는 능력이 위태로워집니다.</li>
	</ol></li>
	<li>IACUC 규정에 따라 마우스를 안락사시킵니다.<ol><li>안락사 챔버로의 CO2 흐름을 0.5 L / min의 속도 또는 챔버 크기에 따른 권장 유량으로 엽니 다.</li>
		<li>권장 시간 동안 마우스를 챔버에 넣고 더 이상 호흡하지 않도록하십시오. 그것을 제거하고 안락사의 2 차 방법으로 자궁 경부 탈구를 수행하십시오.</li>
		<li>마우스가 안락사되면 즉시 장기 적출 및 관류를 진행합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 하트 수집
<ol><li>가슴 열기.<ol><li>상복부 부위에서 집게로 마우스의 피부를 잡으십시오. 가위를 사용하여 피부에 2mm의 구멍을 만들고 집게를 사용하여 피부를 벗겨내어 가슴과 복부의 반짝이는 반투명 층 인 근막 층을 드러냅니다. 근막과 복막을 통해 상복부를 절단하여 복벽을 열고 xiphoid 과정을 드러냅니다. 지혈 집게를 사용하여 검상돌기를 고정하십시오.</li>
		<li>가위로 양쪽의 쇄골 중간 선 수준에서 흉벽을 수직으로 자르고 전방 흉벽을 들어 올려 종격동 내용물을 드러내고 지혈 겸자를 무게로 사용하여 개구부를 유지합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>심장 관류 및 추출.<ol><li>집게를 사용하여 심장 주변의 지방이나 흉선 조직을 제거하십시오.</li>
		<li>집게를 사용하여 대동맥을 뒤에서 단단히 잡으십시오. 주사기 바늘 (25G)을 심장의 정점에 삽입하십시오. 3mL/분의 속도로 3mL의 HBSS와 관류합니다. 알림: 관류를 모니터링하십시오. 간은 채워야하며 관상 혈관의 혈액은 완전히 제거되어야합니다. 일정한 흐름을 유지하려면 분당 1mL로 보정된 주사기 펌프를 사용하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>가위로 대동맥을 자르고 심장을 꺼냅니다. 남은 혈액을 제거하기 위해 HBSS로 페트리 접시의 심장을 씻으십시오. 가위와 집게를 사용하여 지방, 결합 조직 및 흉선을 제거하고 심장을 건조시킵니다. 고립 된 심장의 무게를 측정하고 밀리그램 단위의 무게를 기록하십시오. 실온에서 심장을 칼날로 작은 조각 (1-2mm)으로 만듭니다. 알림: 성인 마우스 심장의 무게는 0.090-0.210mg 사이입니다.</li>
		<li>심장 조직의 질량을 측정하고 다진 심장 60mg을 HBSS 3mL가 포함된 15mL 튜브에 넣습니다. 나머지 심장 조직을 유지하고 "참조 대조 조직"이라고 표시된 튜브에 넣습니다. 이것은 살아있는 죽은 신호 및자가 형광에 대한 보상 제어에 사용됩니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 심장 소화 및 세포 염색
<ol><li>다진 조직이 들어있는 각 튜브에 효소를 첨가하십시오 ( 표 1 참조). 0.5 μL/mg의 DNase 1(심장 조직 60mg에 대해 300단위), 콜라게나제 II 0.5μL/mg(심장 조직 60mg에 대해 625단위) 및 0.2μL/mg의 히알루로니다아제(심장 조직 60mg에 대해 50단위)를 튜브에 추가합니다.</li>
	<li>소화 반응을 셰이커에 넣고 300rpm에서 30분 동안 둡니다. 셰이커 랙을 경사면에서 약 25°로 조정합니다.</li>
	<li>각 15mL 반응 튜브에 HBSS 7mL를 추가하고 가속 및 파단을 보통 또는 느리게 설정하여 4°C에서 5분 동안 250 x g 에서 원심분리합니다. 상청액을 따라 내고 각 펠릿을 5mL의 ACK 용해 완충액에 재현탁하여 적혈구를 제거합니다. 실온에서 5분 동안 ACK 용해 완충액에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>각 튜브에 10mL의 PBS를 넣고 혼합한 다음 40μm 스트레이너로 50mL 튜브에 여과합니다. 모든 파편이 필터 챔버 내부에 있는지 확인하십시오. 필터 챔버 내에 완전히 매달릴 때까지 주사기 플런저로 필터의 이물질을 부수십시오.</li>
	<li>부피가 심장 당 25mL에 도달 할 때까지 필터를 통해 PBS를 추가하십시오. 이렇게하면 부유 된 세포가 필터를 통과 할 수 있습니다. 기준 대조군 조직 튜브에 PBS 25mL를 추가하고 부피를 다른 튜브(각각 25mL)로 나눕니다. 튜브 중 하나는 "염색되지 않음"이라고 표시하고 다른 하나는 "Live-dead"로 표시합니다. 250 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 참고: 이 시점에서 살아있는 죽은 얼룩에 대한 희석을 준비하십시오(희석: 1x PBS에서 1:500).</li>
	<li>상청액을 디캔트하고, 펠렛을 100 μL의 PBS에 염색되지 않은 튜브에 재현탁하고, 각각의 다른 펠렛을 100 μL의 살아있는 염색 희석액으로 재현탁시킨다. 어둠 속에서 30 분 동안 얼음 위에서 배양하고 얼음 양동이를 알루미늄 호일로 덮습니다.</li>
	<li>각 샘플에 500μL의 FACS 버퍼를 추가하고 40μm 필터를 통해 라벨이 부착된 FACS 튜브로 옮깁니다. FACS 튜브를 250 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 폐기하십시오. 펠릿을 500μL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다.</li>
	<li>50μL의 Fc 차단 용액( 표 1 참조)을 염색되지 않은 튜브와 살아있는 죽은 튜브를 제외한 각 튜브에 추가합니다. 5 분 동안 혼합하고 배양하십시오.</li>
	<li>염색되지 않은 튜브와 살아있는 죽은 튜브를 제외한 각 튜브에 50μL의 항체 혼합 용액( 표 1 참조)을 추가하고 얼음 양동이를 알루미늄 호일로 덮고 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>각 튜브에 2mL의 FACS 버퍼를 추가하고 250 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 300-500 μL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다.</li>
</ol>5. 유세포 분석
<ol><li>기기 제어 설정을 설정합니다. 참고: 이 프로토콜에서 샘플은 4개의 레이저 Cytek Aurora 유세포분석기로 분석됩니다. 또 다른 적절한 유세포분석기를 사용하여 관심 마커를 검출할 수 있습니다.<ol><li>기기 제어 소프트웨어를 엽니다( 재료 표 참조). 창 상단에서 획득 탭을 선택하고 새로 만들기 +를 클릭합니다. 새 실험 만들기 라는 창이 표시됩니다.</li>
		<li>라이브러리 섹션의 필터링할 유형 필드에 PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 및 좀비 아쿠아를 입력하고 각각을 입력한 후 추가를 클릭합니다. 형광단 이름은 오른쪽에 표시되어야 합니다. 그런 다음 다음을 클릭하여 그룹 탭으로 이동합니다.</li>
		<li>그룹 탭에서 튜브가 있는 기호를 클릭하여 분석할 하트를 추가합니다.</li>
		<li>+ 참조 그룹을 클릭하면 창이 표시됩니다. 형광등 태그 열에서 Zombie Aqua를 선택하고 컨트롤 유형 열에서 셀을 선택한 다음 저장을 클릭합니다.</li>
		<li>다음 > 마커 탭을 클릭합니다. 형광단의 이름과 함께 테이블이 표시됩니다. 각 형광단 컬럼의 첫 번째 행에 해당 세포 마커를 입력하고 입력 : PerCP-Cy5.5의 경우 CD45; BV421용 CD19; 알렉사 플루오르 700용 CD11b; PE용 B220; 그리고 좀비 아쿠아를 위해 죽은 자.</li>
		<li>다음을 두 번 클릭하여 획득 탭으로 이동합니다. 실험 그룹의 기록할 이벤트에는 10,000,000을 입력하고 참조 그룹에 대해서는 동일한 필드에 라인 유형을 200,000으로 입력합니다. 저장 후 열기를 클릭합니다. 다른 설정은 기본값으로 유지되어야 하며, 중지 시간은 10,000으로, 중지 볼륨은 3,000으로 유지해야 합니다.</li>
		<li>왼쪽 하단에서 악기 제어를 클릭합니다. 전압을 FSC-50, SSC-175, SSC-B-175로 설정합니다. 그런 다음 획득 제어를 선택합니다. 유량 옵션의 경우 드롭다운 메뉴에서 높음 을 선택합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포분석기로 기준 샘플을 수집하고 소프트웨어에서 혼합하지 않습니다.<ol><li>염색되지 않은 심장 튜브를 소용돌이하여 샘플 주입 포트(SIP)에 단단히 놓습니다. 녹색 표시기 화살표가 올바른 샘플을 가리키고 있는지 확인한 다음 cytometer 소프트웨어의 수집 제어판에서 시작을 클릭하고 이벤트가 기록 될 때까지 기다립니다. 살아있는 죽은 염색 된 심장 조직에 대해서도 똑같이하십시오.</li>
		<li>Unmix 메뉴를 선택하고 다음 컨트롤을 설정합니다.<ol><li>라이브러리의 열에서 PE, PerCP-Cy5.5, BV421 및 Alexa Fluor 700에 대한 확인란을 선택합니다. 좀비 아쿠아가 동일한 열에서 선택 취소되어 있는지 확인합니다. 하단에서 형광 태그로서의 자가형광 옵션을 선택합니다.</li>
			<li>다음을 클릭하여 양성/음성 모집단 식별 탭으로 이동합니다. 이 탭에는 FSC-A 대 SSC-B-A의 플롯이 표시됩니다. 다각형의 점을 클릭하고 드래그하여 FSC-A 축에서 1.0M에서 4.0M 사이, SSC-B-A 축에서 0.2M에서 3.0M 사이의 영역을 선택합니다.</li>
			<li>오른쪽의 다음 플롯에서 V5-A가 X 축에 표시됩니다. 게이트를 이동하여 맨 오른쪽에 있는 피크의 절반을 양수로 선택하고 플롯의 왼쪽에 있는 영역을 음수로 선택합니다. 참조 그룹 - 염색되지 않음이라는 제목의 플롯에서 비슷한 범위의 모집단을 선택합니다. 이를 위해 염색되지 않은 긍정-부정을 설정하지 않아야합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>실험 샘플을 획득합니다.<ol><li>개별 마우스에 대한 샘플이 들어 있는 각 튜브에 대해 튜브를 와동하여 SIP에 단단히 놓습니다. 녹색 표시기 화살표가 올바른 샘플을 가리키고 있는지 확인한 다음 세포분석기 소프트웨어의 수집 제어판에서 시작을 클릭하고 이벤트가 기록될 때까지 기다립니다.</li>
	</ol></li>
	<li>게이팅 전략.<ol><li>혼합되지 않은 기본 워크시트 탭을 선택합니다. 상단의 점 플롯 도구를 사용하여 FSC-A 대 SSC-A 플롯을 생성합니다. 다각형 선택 도구를 사용하여 FSC-A 축에서 0.4M보다 크고 SSC-A 축에서 0.8M보다 높은 이벤트를 선택합니다. 이 선택 항목을 두 번 클릭하면 새 플롯이 표시됩니다.</li>
		<li>새로 생성된 플롯에서 X축 레이블을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 AF-A를 선택합니다. Y 축 레이블을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 살아있는 죽은 얼룩을 선택합니다. 상단의 사각형 선택 도구를 클릭하고 하단 라이브-데드 신호에 해당하는 라이브-데드 축에서 105 아래의 모든 이벤트를 선택합니다. 이 선택 항목을 두 번 클릭하면 새 플롯이 표시됩니다.</li>
		<li>새 플롯에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 X축에 PerCP-Cy5.5-A 를 선택하고 Y축에 SSC-A 를 선택합니다. 사각형 선택 도구를 사용하여 CD45 양성 셀에 해당하는 PerCP-Cy5.5-A 축에서 104 보다 큰 이벤트를 선택합니다. 선택 항목을 두 번 클릭하면 새 플롯이 표시됩니다.</li>
		<li>새 플롯에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 X축에 대해 FSC-A를 선택하고 Y축에 대해 FSC-H를 선택합니다. 다각형 선택 도구를 사용하여 FSC-A 값과 SSC-A 값이 동일한 추세를 따르는 이벤트를 선택합니다. 이를 통해 세포 이중선이 제거되고 선택 항목의 집단을 CD45+ 집단이라고 합니다. 선택 항목을 두 번 클릭하면 CD45+ 모집단이 포함된 새 플롯이 표시됩니다.</li>
		<li>CD45+ 모집단 플롯에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 X축의 BV421 과 Y축의 SSC-A를 선택합니다. 다각형 선택 도구를 사용하여 BV421 축에서 오른쪽에 있는 모집단을 선택합니다. 이것은 B 세포 집단입니다. 이 모집단을 두 번 클릭하여 B 세포 모집단이 있는 두 개의 새 그림을 만듭니다.<ol><li>마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 PE-A 가 X축에 있고 BV421-A 가 Y축에 있는 첫 번째 B 셀 플롯을 설정합니다. 오른쪽의 집단은 혈관 내 B 세포에 해당하고 왼쪽의 집단은 간질 B 세포를 나타냅니다. 다각형 선택 도구를 사용하여 둘 다 선택합니다.</li>
			<li>마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 X축에 Alexa Fluor 700-A 가 있고 Y축에 SSC-A 가 있는 두 번째 B 셀 플롯을 설정합니다. 왼쪽의 집단은 CD11b-세포에 대응하고, 오른쪽의 사건(있는 경우)은 CD11b+ 세포에 대응한다.</li>
			<li>각 선택 항목을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 게이트 속성을 클릭합니다. 개수 및 % 부모 를 클릭하여 크기와 백분율을 표시합니다. 추가 데이터 분석을 위해 이벤트 수와 백분율을 기록합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

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Luigi Adamo는 심부전 치료를위한 면역 조절 분자 개발에 중점을 둔 회사 인 i-Cordis, LLC의 공동 설립자이며 B 세포 조절 약물 피르 페니 돈의 유도체에 특별한 관심을 가지고 있습니다. 나머지 작성자는 선언할 충돌이 없습니다.

점점 더 많은 증거에 따르면 B 세포는 심근 생리학 및 심근 리모델링 / 부상에 대한 적응 7,8,9,10,11,12,13,36의 맥락에서 중요한 역할을합니다. 유세포 분석은 모든 조직의 면역 세포 집단을 연구하는 훌륭한 도구이며 심장의 B 세포에 초점을 맞춘 모든 연구에 거의 필수 도구입니다.
B 세포와 심장에 관한 새로운 문헌은 이미 심장의 B 세포 수와 손상으로 인한 심근 B 세포 수의 변화와 같은 매...

B-림프구는 적응면역 반응과 선천성 면역 반응 모두에서 중요한 역할을 하는 고도로 전문화된 면역 세포입니다1. B 세포의 두 가지 주요 집단이 있습니다 : 배아 생활 동안 주로 생성되는 B1 세포의 작은 집단과 골수1에서 성인 생활에서 생성되는 B2 세포의 우세한 집단. 골수에서 성숙 한 후 B 세포는 1 차 및 2 차 림프 기관으로 이동합니다. 거기에서 그들은 혈관과 림프관을 통해 이동하는 림프 기관 사이에서 지속적으로 재순환합니다2. B 세포는 수용체로 기능하는 표면에 특정 항체를 발현합니다. B 세포가 수용체에 결합하는 항원을 만나면 활성화 신호가 트리거 될 수 있습니다. 활성화된 B 세포는 항원이 발견된 조직으로 이동하거나 골수로 돌아가 항체 생성 형질 세포로 성숙할 수 있습니다 3,4.
최근에, 심장에는 상당한 수의 B 세포 집단이 있다는 것이 인식되고 있다. 설치류를 대상으로 한 연구에 따르면 B 세포는 배아 발달 초기에 심장에 식민지화되며5, 심근 관련 B 세포는 대부분 혈관 내 순진한 B2 세포이며 내피 6,7에 부착되어 있으며 B1세포는 적은 비율입니다7. 여전히 많은 불확실성이 있지만 사용 가능한 데이터는 B 세포가 순진한 심장과 부상에 대한 심근 적응의 맥락에서 중요한 역할을한다는 것을 나타냅니다.
순진한 쥐 심장에 대한 연구에 따르면 기준선에서 심근 B 세포는 대부분 혈관 내 공간에 위치하며 내피에 부착되어 있습니다 (> 쥐 심장 B 세포의 95 %가 혈관 내 공간에 위치하는 것으로 밝혀졌습니다). 이들 B 세포는 말초 혈액으로부터 분리된 순환 B 세포와 상이한 유전자 발현 패턴을 갖는 것으로 밝혀졌다. B 세포가 결핍 된 동물과 동종 대조군의 순진한 심장을 분석 한 결과, B 세포가없는 동물은 심장이 더 작고 분출률이 더 높은 것으로 나타났습니다6. 이 모든 증거는 B 세포가 심근 성장 및 / 또는 심근 기능을 조절할 수 있으며 간질뿐만 아니라 혈관 내 B 세포도 그러한 관찰을 담당 할 수 있음을 시사합니다. B 세포는 또한 심근 상주 대식세포의 표현형을 조절하는 것으로 밝혀졌습니다8.
여러 연구에 따르면 B 세포는 손상에 대한 심근 적응의 맥락에서 중요한 역할을합니다 8,9,10,11,12,13. B 세포는 CXCL13-CXCR5 의존성 메커니즘11,13을 통해 손상된 심장에 일시적으로 축적됩니다. 거기에서 B 세포는 사이토 카인 매개 단핵구 모집 9,12를 포함하는 여러 메커니즘을 통해 불리한 심장 리모델링을 촉진합니다. 또한, B- 세포는 여러 메커니즘을 통해 심장 손상 및 불리한 심장 리모델링의 확장을 촉진 할 수있는 심장 단백질에 대한 항체를 생산할 수 있습니다 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B 세포는 또한 IL-1010의 분비를 통해 손상된 심장에 보호 효과를 발휘할 수 있습니다.
순진하고 손상된 심장에서 B 세포의 역할을 조사하는 그룹의 수가 증가함에 따라 심근 B 세포를 적절하게 정량화하고 평가하여 이미 문헌에 나타나기 시작한 불일치를 피하기 위해 공유 프로토콜을 정의하는 것이 점점 더 중요 해지고 있습니다. 지금까지 B 세포는 실제로 설치류 심장에서 가장 널리 퍼진 면역 세포중 하나이며7 골수 세포26,27보다 현저히 낮은 유병률로 존재하거나 매우 드문 것으로 보고되었습니다28. 유사하게, 몇몇 그룹은 급성 허혈성 심근 손상후에 심근 B 세포의 수가 증가한다고 설명했지만, 한 그룹은 손상된 심근29의 B 세포 수에 변화가 없다고보고했다. 심장 면역 세포에 대한 연구는 관류 상태에 대한 세부 정보를 거의 제공하지 않으며 소화 조건에 대한 합의가 없습니다. 설치류 심장에서 B 세포의 상당 부분이 혈관 내이고 심근에서 면역 세포를 추출하는 것은 사용 된 소화 방법에 크게 의존하기 때문에 문헌에보고 된 차이는 장기 관류 및 조직 소화의 차이의 결과 일 수 있습니다.
여기에 제시된 것은 관류 및 소화 조건을 최적화하여 B 세포 회수의 수율을 최대화하고 혈관 내 대 혈관 외 심근 B 세포의 구별을 허용하는 쥐 심근 B 세포의 유세포 분석 기반 정량화에 대한 자세한 방법입니다6. 이 프로토콜은 혈관내 및 간질 면역 세포 28,30,31을 구별하는 다른 유사한 프로토콜의 적응 및 최적화이다.
이 프로토콜에서 우리는 심근 관류를 표준화하여 미세 혈관 내피에 부착 된 생물학적으로 관련된 B 세포를 제거하지 않고 혈관 내 공간에 떠 다니는 B 세포를 제거합니다. 더욱이, 혈관내 면역 세포(32)와 간질 면역 세포(32)를 구별하기 위해 항체의 정맥내 주사의 사용을 기술한 이전 프로토콜을 구축하고, B-세포가 표면 마커 B220(33)을 발현한다는 사실을 이용하여, 동물 희생 및 심장 관류 직전에 B220-특이적 항체의 혈관내 주사를 통해 혈관내 대 혈관외 심근 B 세포를 구별하는 방법을 입증한다. 이 프로토콜은 순진하고 손상된 심장의 심근 B 세포 분석을 포함하는 데 관심이있는 모든 과학자의 연구와 관련이 있습니다. 이 프로토콜의 광범위한 구현은 연구 그룹 간의 불일치를 줄이고 혈관 내 및 혈관 외 심근 B 세포 풀의 변화를 분석 할 수있게하여 심장 면역학 분야의 발견을 강화할 것입니다.
요약하면, 이 프로토콜은 유세포분석을 통해 심근 B 세포를 정량화 및 분석하는 동시에 혈관외 공간과 혈관내 공간에 위치한 세포를 구별하는 최적화된 워크플로우를 나타냅니다.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 700 안티-마우스/인간 CD11b 항체</td><td>101222</td><td>BioLegend</td><td>100 &micro; g 200 &마이크로; L</td></tr><tr><td>(CellTreat 29481) 세포 여과기, 40 & 마이크로; m, Blue</td><td>QBIAP303</td><td>Southern Labware</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL 천연 마이크로 원심 분리기 튜브</td><td>1605-0000</td><td>SealRite, USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>0.9 % 염화나트륨 주입, USP</td><td>114-055-101</td><td>품질 생물학적</td><td>0.90%</td></tr> <tr><td>1.5 mL 천연 마이크로 원심 분리기 튜브</td><td>1615-5500</td><td>SealRite, USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L 눈금이 매겨진 TipOne 여과기는</td><td>11213810</td><td>USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro를 기울였습니다; L 눈금이 매겨진 TipOne 필터 팁</td><td></td><td>11267810 USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브, 플러그 씰 캡, 폴리프로필렌, RNase-/DNase-free</td><td></td><td>430052 Corning</td><td></td></tr><tr><td>1-Way Stop Valve, 폴리카보네이</td>트 <td>SVPT951</td><td>ECT 제조</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-트리브로모에탄올</td><td>T48402</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L 눈금이 매겨진 TipOne 필터 팁</td><td></td><td>11208810 USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>3방향 스톱 밸브, 폴리카보네이</td>트 <td>SVPT953</td><td>ECT 제조</td><td></td></tr><tr><td>5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브, 12 x 75mm 스타일</td><td>352054</td><td>Falcon, Corning 브랜드</td><td></td></tr><tr><td>50mL 원심분리기 튜브, 플러그 씰 캡, 폴리프로필렌, RNase-/DNase-free</td><td>430290</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>ACK( Ammonium-Chloride-Potassium) 용해 버퍼</td><td>118-156-101</td><td>품질 생물학적</td><td>삼투압: 290 + 또는 -5% mOsm/kg H20</td></tr><tr><td>어댑터 4x50ml, Rotor A-4-63 5810759005 Eppendorf</td><td></td><td></td><td></td>어댑터의 250 mL 직사각형 버킷용</tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브용 어댑터, 어댑터당 튜브 9개, Rotor Model A-4-62</td><td>22638289</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>와 함께 사용하기 위한 원뿔형 바닥15개의 둥근 바닥 튜브용 어댑터 2.6 &ndash; 7 mL, Rotor A-4-62</td><td>22638246</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일 12 in x 75' 롤 .0007</td><td>UPC 109153</td><td>Reynolds 랩</td><td></td></tr><tr><td>마취 유도 챔버의 250</td> mL 직사각형 버킷용 <td>- 마우스 RWD-AICMV-100</td><td>Conduct Science</td><td></td></tr><tr><td>BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single-use, 1 mL</td><td>309626</td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>Brandzig 초미세 인슐린 주사기 29G 1cc 1/2" 100팩</td><td>CMD 2613</td><td>Brandzig</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 안티-마우스 CD19 항체</td><td>115537</td><td>BioLegend</td><td>50 &micro; </td></tr><tr><td>플로우 튜브용 g/mL CAPS w/스트레이너 메쉬 35 &마이크로; m, 12 x 75 mm 튜브용 이중 위치, 멸균</td><td>T9009</td><td>Southern Labware</td><td></td></tr><tr><td>이산화탄소 USP E CGA 940&nbsp;</td><td>CD USPE</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Essentials 저형 비커, 유리, 500mL</td><td>UX-34502-46</td><td>Cole-Parmer</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase 2</td><td>LS004176</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>커넥터 황동 크롬 도금 1/4" 암 NPT x 1/4" 미늘</td><td>Y992611-AG</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Cytek Aurora 유세포 분석기</td><td></td><td>Cytek Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>디스 1080 니플 1/4 바브 CP</td><td>M-08-12</td><td>에어가스 USA</td><td></td></tr><tr><td>DNase I - 40,000 U</td><td>D4527</td><td>시그마-알드리치</td><td></td></tr><tr><td>이지펫&nbsp; 3 - 전동 피펫 컨트롤러</td><td>4430000018</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Electronic Balance, AX223/E</td><td>30100606</td><td>Ohaus Corp.</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R 원심분리기</td>, <td>5810R</td>, <td>Eppendorf</td><td></td></tr>, <tr><td>Eppendorf Research plus, 1채널 가변 피펫,</td><td></td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.8.1</td><td></td>, <td>BD, Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>, GLACIERbrand, 삼중 밀도 아이스 팬(IPAN-3100)</td><td>Z740287</td><td>Heathrow Scientific</td><td></td></tr><tr><td>HBSS(1x) - Ca2+ [+], Mg2+ [+]</td><td>14025076</td><td>gibco</td><td>1x</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>H3506</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Kelly 지혈제, 스트레이트</td><td>13018-14</td><td>파인 사이언스 도구</td><td></td></tr><tr><td>루어 슬립 주사기 멸균, 일회용, 20 mL</td><td>302831</td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940</td><td>M1-940-PG</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>McKesson 언더패드, 보통</td><td>4033- CS150</td><td>McKesson</td><td></td></tr><tr><td>네비게이터 다목적 휴대용 저울</td><td>NV2201</td><td>오하우스 공사</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]</td><td>10010023</td><td>gibco</td><td>1x</td></tr><tr><td>PE 안티-마우스/인간 CD45R/B220 항체</td><td></td><td>103208 BioLegend</td><td>200 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>PerCP/Cyanine5.5 안티-마우스 CD45 항체</td><td>103132</td><td>BioLegend</td><td>100 &micro; g 500 uL</td></tr><tr><td>페트리 접시, 쌓을 수 있는 35mm x 10mm 멸균 폴리스티렌</td><td>FB0875711YZ</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02</td><td>M08-1</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>강력한 6와트 LED 듀얼 구즈넥 일루미네이터</td><td>LED-6W</td><td>AmScope</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)</td><td>305122</td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>정제된 쥐 안티 마우스 CD16/CD32 (마우스 BD Fc 블록) 클론 2.4G2 (RUO)</td><td>553141</td><td>BD Becton, Dickinson and Company Biosciences</td><td>0.5 mg/mL</td></tr><tr><td>R 4.1.1</td><td></td><td>The R Foundation</td><td></td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>9501250000</td><td>Accutec Blades Inc</td><td></td></tr><tr><td>레귤레이터 분석 2단계 0-25 psi 전달 CGA320 3500 psi 주입구</td><td>Y12244A320-AG</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Rotor A-4-62, 4 x 250 mL 직사각형 버켓 포함</td><td>Rotor A-4-62</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipette, 플러그형, 10 mL, sterile, 비발열성/내독소 무함유, 비세포독성, 1개/블리스터</td><td>86.1254.001</td><td>Sarstedt AG & Co KG</td><td></td></tr><tr><td>시그마 라벨 테이프</td><td>L8394</td><td>시그마-알드리치</td><td></td></tr><tr><td>스펙트로플로 3.0.0</td><td></td><td>Cytek Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>Spex VapLock 루어 피팅, PP, 스트레이트, 남성 루어 락 x 1/8" 호스 바브; 1/EA</td><td>MTLL230-6005</td><td>Spex</td><td></td></tr><tr><td>Std 벽 실험실 튜빙, 크기 S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" 벽 x 50' 길이</td><td>CG-730-003</td><td>Excelon 연구소</td><td></td></tr><tr><td>주사기 PP/PE without needle, 3 mL</td><td>Z683566</td><td>Millipore Sigma</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>55-1199 (95-240)</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td></tr><tr><td>Thomas 3-채널 알람 타이머 TM10500</td><td>9371W13</td><td>Thomas Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Tube Rack, 12&nbsp; 위치, 6 대 5.0&nbsp; mL 및 15&nbsp; mL 튜브 및 6 개 25&nbsp; mL 및 50&nbsp; mL 튜브, 폴리프로필렌, 번호가 매겨진 위치, 오토클레이브 30119835</td><td></td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Tube Rack, 12&nbsp; 위치, 5.0&nbsp; mL 및 15&nbsp; mL 튜브, 폴리프로필렌, 번호가 매겨진 위치, 오토클레이브 가능</td><td>30119827</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. &times; O.D. 1/4 in. &times; 3/8 in.</td><td>T8913 (Millipore Sigma)</td><td>Tygon, Saint-Gobain</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>SI-0236</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>VWR 곡선 팁이 있는 가이드 핀이 있는 해부 집게</td><td>89259-946</td><td>Avantor, VWR</td><td></td>제작</tr><tr><td>VWR 해부 가위, 날카로운 팁, 4&frac12; "</td><td>82027-578</td><td>Avantor, by VWR</td><td></td></tr><tr><td>VWR Incubating Orbital Shaker, 모델 3500I</td><td>12620-946</td><td>Avantor, by VWR</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td><td>423102</td><td>BioLegend</td><td></td></tr></tbody></table>

유세포분석 기반 심근 b 세포의 정량화 및 분석

Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells

점점 더 많은 증거에 따르면 B- 림프구는 심근 생리학 및 심근 적응의 맥락에서 중요한 역할을합니다. 그러나 문헌은 심근 B 세포의 유병률에 대한 대조적 인 데이터를보고합니다. B 세포는 설치류 심장에서 가장 널리 퍼진 면역 세포 중 하나이거나 존재하는 것으로 보고되었지만 골수 세포보다 유병률이 현저히 낮거나 매우 드문 것으로 보고되었습니다. 유사하게, 몇몇 그룹은 급성 허혈성 심근 손상 후 심근 B 세포의 수가 증가한다고 설명했지만, 한 그룹은 손상된 심근의 B 세포 수에 변화가 없다고보고했다. 심근 B 세포의 유병률을 평가하기 위한 공유되고 재현 가능한 방법의 구현은 다양한 연구 그룹의 관찰을 조화시켜 B 세포 심근 상호 작용 연구의 발전을 촉진하는 데 중요합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 문헌에보고 된 겉보기에 대조적 인 관찰은 쥐의 심근 B 세포가 대부분 혈관 내피에 연결되어 있고 미세 혈관 내피에 연결되어 있다는 사실에서 비롯된 것 같습니다. 따라서 쥐의 심장에서 회수 된 B 세포의 수는 장기를 청소하는 데 사용되는 관류 조건과 사용 된 소화 방법에 절묘하게 민감합니다. 여기에서는 이 두 가지 중요한 변수를 특정 방식으로 설명하는 최적화된 프로토콜을 보고합니다. 이 프로토콜은 쥐 심근 B 세포 수에 대한 재현 가능한 유세포 분석 기반 분석을 강화하고 연구원이 혈관 외 심근 B 세포와 혈관 내 심근 B 세포를 구별 할 수 있도록합니다.

수집이 완료되고 모든 이벤트가 수집되면 표준 유세포분석 관행에 따라 데이터를 분석해야 합니다. 분석의 초점은 각 실험의 개별 목표에 따라 다릅니다. 이 경우 혈관내 및 혈관외 B세포의 정량화를 추구하였으며, 조직 mg당 세포수로 표시하였다.
스펙트럼 세포분석기를 사용하는 경우 초기 게이팅으로 분석을 시작하여 면역 세포에 해당하는 범위에 있지 않은 크기의 파편을 제거한 다음 살아있는 염색+ 신호를 제거하는 것이 좋습니다. 이를 통해 백혈구에 해당하는 CD45 양성 세포의 깨끗한 집단을 검출 할 수 있습니다 (그림 1). 더블릿을 제거한 후 순진한 손상되지 않은 심장에서 CD45+ 세포의 약 20%가 CD19+ B 세포가 될 것으로 예상됩니다(그림 2A, 이 대표적인 실험에서 18.1% B 세포). 이 세포 중 평균 5.5 %는 간질 공간에 위치하고 94.5 %는 혈관 내 공간...

여기서 우리는 유세포 분석을 사용하여 혈관 내 또는 내피 공간에서의 위치를 기반으로 심근 B- 림프구의 정량화 및 분화를위한 프로토콜을보고합니다.

유세포분석 기반 심근 B 세포의 정량화 및 분석

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. ...

문헌은 심근 B 세포의 유병률에 대한 대조적인 데이터를 보고합니다. 이것은 관류 및 소화 기술의 다양성에서 비롯된 것 같습니다. 당사의 프로토콜은 심근 B 세포에 대한 재현 가능한 유세포 분석 기반 분석을 지원합니다.이 기술은 B 세포의 회수 수율을 극대화하고 B 세포 및 심장 샘플의 다른 집단 간의 유세포 분석 수의 변동성을 줄입니다. 이 최적화된 분해 및 분리 방법은 심장의 다양한 면역 세포 유형을 연구하기 위해 확장된 항체 패널을 구현하도록 쉽게 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 폐 또는 간과 같은 다른 기관에도 적용하여 해당 기관과 관련된 B 세포를 연구 할 수 있습니다.시작하려면 12 주 된 수컷 마우스의 무게를 측정하십시오. 310cc 인슐린 주사기에 100마이크로리터의 B220 항체 용액을 로드합니다. 희석된 B220 항체를 역궤도 주입으로 주입하고 즉시 장기 적출 및 관류를 진행합니다.안락사 후, 상복부 부위에서 집게로 마우스의 피부를 잡으십시오. 가위를 사용하여 피부에 2mm 구멍을 만들고 집게를 사용하여 피부를 벗겨 근막 층을 드러냅니다. 근막과 복막을 통해 상복부를 자릅니다.지혈 집게를 사용하여 검상돌기를 고정하십시오. 양쪽의 쇄골 중간 선 수준에서 흉벽을 수직으로 자르고 전방 흉벽을 들어 올려 종격동 내용물을 드러냅니다. 집게를 사용하여 대동맥을 뒤에서 단단히 잡으십시오.주사기 바늘을 심장의 정점에 삽입하십시오. 분당 3 밀리리터의 속도로 3 밀리리터의 HBSS로 관류됩니다. 대동맥을 자르고 심장을 제거하십시오.HBSS로 페트리 접시에 담긴 심장을 씻으십시오. 고립 된 심장의 무게를 측정하고 밀리그램 단위의 무게를 기록하십시오. 실온에서 심장을 칼날로 작은 조각으로 만듭니다.심장 조각의 크기는 약 1.5 밀리미터 여야합니다. 저울을 사용하여 심장 조직의 질량을 측정하고 다진 심장 60mg을 HBSS 3ml와 함께 얼음 위의 15 밀리리터 튜브에 넣습니다. B220 항체 주사를 받지 않은 마우스에 대해 이 과정을 반복하고 HBSS 표지된 기준 대조 조직 3밀리리터와 함께 튜브에 넣습니다.다진 조직이 들어있는 각 튜브에 효소를 첨가하십시오. DNase I 밀리그램 당 0.5 마이크로 리터, 콜라게나제 II 밀리그램 당 0.5 마이크로 리터 및 히알루로니다 제 밀리그램 당 0.2 마이크로 리터를 첨가하십시오. 소화 반응을 분당 300 회전으로 30 분 동안 셰이커에 놓습니다.튜브는 약 25도 경사의 작은 각도로 셰이커에 배치됩니다. 15밀리리터 반응 튜브 각각에 HBSS 7밀리리터를 넣고 섭씨 4도에서 5분 동안 250G로 원심분리합니다. 상청액을 디캔팅한 후 각 펠릿을 5밀리리터의 ACK 용해 완충액에 재현탁합니다.실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 각 튜브에 10 밀리리터의 PBS를 첨가 한 후 40 마이크로 미터 스트레이너가있는 50 밀리리터 튜브에 혼합하고 여과합니다. 주사기 플런저로 필터의 파편을 부수어 모든 재료가 필터를 통과하도록 합니다.부피가 심장당 25밀리리터에 도달할 때까지 필터를 통해 PBS를 추가한 후 기준 대조 조직 튜브에 25밀리리터의 PBS를 추가하고 부피를 두 개의 다른 튜브로 나눕니다. 튜브 중 하나는 얼룩이 없고 다른 하나는 살아/죽은 것으로 표시합니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 250G에서 원심분리한 후, 상청액을 디캔트하고 염색되지 않은 튜브를 100마이크로리터의 PBS에 재현탁하고 각각의 다른 펠릿을 100마이크로리터의 살아있는/죽은 염색 용액에 재현탁합니다.어둠 속에서 30 분 동안 얼음 위에서 배양하십시오. 각 샘플에 500 마이크로 리터의 FACS 버퍼를 추가 한 후 40 마이크로 미터 필터를 통해 FACS 튜브로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 250G에서 FACS 튜브를 거부하고 상청액을 버린 후, 펠렛을 500 마이크로리터의 FACS 완충액에 재현탁시켰다.염색되지 않은 튜브와 살아있는/죽은 튜브를 제외한 각 튜브에 50마이크로리터의 FC 차단 용액을 추가합니다. 5 분 동안 혼합하고 배양하십시오. 염색되지 않은 살아있는 / 죽은 튜브를 제외하고 각 튜브에 50 마이크로 리터의 항체 혼합 용액을 추가 한 후 얼음 통을 알루미늄 호일로 덮고 어둠 속에서 30 분 동안 배양합니다.살아있는 / 죽은 얼룩과 마찬가지로 500 마이크로 리터의 FACS 완충액으로 다시 세척하고 300 내지 500 마이크로 리터의 FACS 완충액에 재현탁하십시오. 계측기 제어 소프트웨어를 엽니다. 창 상단에서 획득 탭을 선택하고 새로 만들기를 클릭합니다.라이브러리 섹션의 필터링할 유형 필드에 PE, PerCP-Cy5.5, 브릴리언트 바이올렛 421, Alexa Fluor 700 및 좀비 아쿠아를 입력하고 플루오로-4를 선택하고 각각을 입력한 후 추가를 클릭합니다. 그런 다음 다음을 클릭하여 그룹 탭으로 이동합니다. 이제 튜브가있는 기호를 클릭하여 분석을위한 하트를 추가하십시오.참조 그룹을 클릭하면 창이 표시됩니다. 형광 태그 열에서 형광 태그로 Zombie Aqua를 선택하고 각 태그 옆에 있는 빨간색 휴지통 아이콘을 클릭하여 다른 태그를 삭제합니다. 그런 다음 컨트롤 형식 아이콘에서 셀을 선택합니다.그런 다음 저장을 클릭합니다. 다음을 클릭합니다. 그런 다음 마커 탭을 클릭합니다.테이블이 표시됩니다. 각 fluoro-4 열의 첫 번째 행에 해당 셀 마커를 입력하고 Enter 키를 누릅니다. 다음을 두 번 클릭하여 획득 탭으로 이동합니다.실험 샘플의 기록할 이벤트에 1,000만 개를 입력하고 참조 그룹 줄에 대해 동일한 필드에 200, 000을 입력합니다. 저장 후 열기를 클릭합니다. 왼쪽 하단에서 악기 제어를 클릭합니다.전압을 FSC 50, SSC 175, SSC-B 175로 설정합니다. 획득 컨트롤을 선택합니다. 유량 옵션의 경우 드롭다운 메뉴에서 높음을 선택합니다.염색되지 않은 심장 튜브를 소용돌이 치고 샘플 주입 포트에 단단히 놓습니다. 녹색 표시기 화살표가 올바른 샘플을 가리키고 있는지 확인하십시오. 그런 다음 녹화를 클릭하고 이벤트가 녹화될 때까지 기다립니다.살아 있거나 죽은 염색 된 심장 조직에 대해서도 똑같이하십시오. Unmix 메뉴를 선택하고 컨트롤을 설정합니다. 형광 태그로 자동 형광 확인란을 선택합니다.그런 다음 다음을 클릭하여 양성/음수 모집단 식별 탭으로 이동합니다. 이 탭에는 전방 산란 영역 대 측면 산란 영역의 플롯이 표시됩니다. 다각형의 점을 클릭하고 드래그하여 전방 산란 영역 축에서 1-4백만 사이의 영역과 측면 산란 영역 축에서 0.2-3백만 사이의 영역을 선택합니다.오른쪽의 다음 플롯에서 V5-A가 X 축에 표시됩니다. 게이트를 이동하여 맨 오른쪽에 있는 피크의 절반을 양수로 선택하고 플롯의 왼쪽에 있는 영역을 음수로 선택합니다. 참조 그룹-염색되지 않음이라는 제목의 플롯에서 유사한 범위의 모집단을 선택합니다.염색되지 않은 경우 양성/음수를 선택해야 합니다. 라이브 믹싱 해제 버튼을 클릭합니다. 이제 실험 샘플을 획득하고 튜브를 와류시킨 다음 SIP에 단단히 놓습니다.녹색 표시기 화살표가 올바른 샘플을 가리키고 있는지 확인하십시오. 그런 다음 세포분석기 소프트웨어의 획득 제어판에서 기록을 클릭하고 이벤트가 기록될 때까지 기다립니다. 혼합되지 않은 기본 워크시트 탭을 선택합니다.맨 위에 있는 점도표 도구를 사용하여 FCS-A 대 SSC-A 플롯을 생성합니다. 다각형 선택 도구를 사용하여 FSC-A 축에서 40만 개 이상, SSC-A 축에서 80만 개 이상의 이벤트를 선택합니다. 선택 영역을 두 번 클릭하여 새 플롯을 만들고 이 새 플롯에서 Y축 레이블을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 라이브/데드 스테인을 선택합니다.X축 레이블을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 자가형광 A.살아있는/죽은 축에서 10에서 다섯 번째 사이의 모든 이벤트를 선택합니다. 이들은 살아있는 세포입니다. 이 선택 항목을 두 번 클릭합니다.새 플롯에서 X축에 대해 PerCP-Cy5.5A를 선택하고 Y축에 대해 SSC-A를 선택합니다. PerCP-Cy5.5A의 오른쪽에 있는 모집단을 선택합니다. 이들은 면역 세포입니다.선택 항목을 두 번 클릭합니다. 새 플롯에서 X축에 대해 FSC-A를 선택하고 Y축에 대해 전방 산란 높이를 선택합니다. FSC-A 값과 SSC-A 값이 동일한 추세를 따르는 이벤트를 선택합니다.이것은 단일 셀을 선택하고 이중선을 제거합니다. 이 선택 항목을 두 번 클릭하면 CD45 양성 단일 세포 집단에 새 그림이 표시됩니다. CD45 양성 단일 세포 모집단 플롯에서 X축의 브릴리언트 바이올렛 421과 Y축의 SSC-A를 선택합니다.화려한 보라색 421 축에서 오른쪽의 인구를 선택합니다. 이것은 B 세포 집단입니다. 이 모집단을 두 번 두 번 클릭하여 B 셀 모집단이 있는 두 개의 새 플롯을 생성합니다.X축에 PEA가 있고 Y축에 화려한 보라색 421A가 있는 첫 번째 B 셀 플롯을 설정합니다. 오른쪽의 집단은 혈관 간 B 세포에 해당하고 왼쪽의 집단은 간질 B 세포를 나타냅니다. 둘 다 선택합니다.X축에 Alexa Fluor 700A가 있고 Y축에 SSC-A가 있는 두 번째 B 셀 플롯을 설정합니다. 왼쪽의 집단은 CD11b 음성 세포에 해당하고 오른쪽의 이벤트는 CD11b 양성 세포에 해당합니다. 각 섹션을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 게이트 속성을 클릭합니다.Count 및 Parent를 클릭하여 사건 수와 부모 모집단의 백분율을 표시합니다. 추가 데이터 분석을 위해 이벤트 수와 백분율을 기록합니다. 순진한 손상되지 않은 심장에서 이중선을 제거한 후 CD45 양성 세포의 약 20%가 CD19 양성 B 세포가 될 것으로 예상됩니다.이 세포 중 평균 5.5 %틈새 공간에 있습니다. 94.5%혈관 내 공간에 있습니다. 심장에서 발견되는 전체 B 세포 집단에서 약 1.6 %표면 마커 CD11b를 기반으로 한 B1 세포에 해당하고 나머지 98.4 %는 B2 세포에 해당합니다.유세포 분석을 통해 심근 B 세포를 분석 할 때 프로토콜에 따라 심장을 적절하게 관류하고 다지는 것이 중요합니다. 소화 된 심장의 적절한 여과는 면역 세포의 회복을 극대화하는 데 필수적입니다.

flow-cytometry-based-quantification-and-analysis-of-myocardial-b-cells

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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이 프로토콜 격리, 식별 하 고 안정 된 상태 또는 염증 동안 쥐의 심근에 있는 면역 세포를 계량 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 제공 합니다. 프로토콜은 cytometry에 의해 더 분석 될 수 있는 단일 세포 현 탁 액의 세대에 대 한 효소 및 기계적 소화를 결합 합니다.

절연 및 심장의 Extravascular 면역 세포의 식별

이 문서에서는 미토 콘 드리 아 또는 살아있는 세포에서는 리소좀을 계량 하는 강력한 방법을 보여 줍니다. 표면 표식에 놓여있는지 활용 된 항 체와 리소좀 또는 미토 콘 드리 아 특정 염료의 조합 사용 하 여 조직 샘플에서 수확 하는 1 차 셀 같은 혼합된 세포 인구에 이러한 세포의 부 량 수 다 색 cytometry입니다.

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

여기서, 우리는 호중구 계보 세포의 고차원 질량 세포측정 (비행 시간, CyTOF에 의한 세포 측정) 분석을 위해 마우스 또는 인간으로부터 분리 된 신선한 골수 (BM)를 처리하는 프로토콜을 제시한다.

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

본 명세서에 의한 복막, 비장 및 골수 조직에서 뮤린 면역 B 세포 구획의 이질성에 대한 간단한 분석을 설명한다. 프로토콜을 다른 마우스 조직으로 조정하고 확장할 수 있습니다.

뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화

절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 통한 세포 특성 분석은 임플란트에 대한 면역 반응 패턴을 이해하는 데 크게 기여할 수 있습니다. 이 논문은 절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 위한 염색을 위한 정확한 방법을 설명합니다.

절개된 임플란트 조직의 면역 기능 분석을 위한 고차원 유세포 분석

학습하세요 심근 B 세포의 유세포분석 기반 정량화 및 분석 방법을 통해 면역학 및 심장학 연구에서 재현성 있는 결과를 얻는 기술을 습득하세요.

유세포분석 기반 심근 B 세포의 정량화 및 분석

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