Name: 안전성 약리학의 예측 가능성을 높이기 위해 미세 전극 어레이에서 심근 세포의 레이저 유도 활동 전위와 유사한 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 배우세요 레이저 포레이션과 미세 전극 어레이를 결합한 심근 세포 활동 전위 기록법. 이 방법은 이온 채널 동역학을 정밀하게 분석하고 부정맥 유발 가능성을 민감하게 분류하여 심장 안전성 약리학 연구의 예측 가능성을 높입니다.

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저자들은 연구 기간 동안 IntraCell 시스템을 빌려준 Foresee Biosystems에 감사드립니다. 그들은 또한 기술 지원에 대해 Hae In Chang에게 감사하고 싶습니다. 이 작업은 보조금 계약 번호 964518(ToxFree)에 따른 유럽 연합의 Horizon 2020의 연구 및 혁신 프로그램, EU Horizon Europe 유럽 혁신 위원회 프로그램, 프로젝트 SiMulTox(보조금 계약 번호 101057769) 및 바덴뷔르템베르크 주 경제, 노동 및 관광부로부터 자금을 지원받았습니다.

1. 유도만능줄기세포 유래 심근세포 제제
참고: iCell 심근세포2 (유도만능줄기세포[iPSC] 유래 심근세포라고 함)는 공급업체가 제공한 프로토콜에 따라 제조되었습니다. 프로토콜은 다음 섹션에서 간략하게 요약됩니다.
<ol><li>사용 전 4°C에서 24시간 동안 도금 및 유지 보수 매체를 해동합니다.</li>
	<li>멸균 피브로넥틴을 1mg/mL 농도의 멸균수에 용해시켜 피브로넥틴 코팅을 준비합니다. 이 스톡을 분취량(예: 분취량당 25μL)에 동결 보관한다. 분취된 원액을 멸균 둘베코의 균형 염 용액(dPBS)에 1:20으로 희석한다.</li>
	<li>층류 후드 아래에서 이전에 오토클레이브된 MEA의 전극장을 10μL 피펫을 사용하여 피브로넥틴으로 멸균 조건에서 액적별로 코팅합니다. 이를 위해 5μL의 피브로넥틴 코팅 용액을 전극장에 떨어뜨리고 전극 영역 상단에 액적이 형성되는 것을 관찰합니다. 민감한 전극을 만지지 마십시오. 알림: 멸균 상태를 유지하려면 층류 후드에서 제거하기 전에 MEA 칩을 멸균 페트리 접시에 옮깁니다.</li>
	<li>코팅된 MEA를 바람직하게는 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>심근 세포가 포함 된 극저온을 대략 37 ° C의 수조에서 2 분 동안 약간의 얼음 결정이 남을 때까지 해동합니다. 세포 용액을 50mL 튜브에 부드럽게 옮깁니다.</li>
	<li>빈 냉동 비알에 1mL의 도금 매체를 추가합니다. 삼투압 충격을 줄이기 위해 90초 동안 용액을 50mL 튜브에 적가합니다. 튜브에 도금 매체 8mL를 부드럽게 추가합니다.</li>
	<li>10mL 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 조심스럽게 혼합합니다. 자동 형광 세포분석을 사용하여 생존 가능한 세포의 총 수를 계산합니다. 숫자는 제조업체에서 제공 한 데이터 시트의 숫자에 가까워 야합니다.</li>
	<li>실온에서 200 x g 에서 3분 동안 셀 용액을 아래로 돌립니다. 펌핑 시스템에 부착된 유리 피펫을 사용하여 흡인하여 상청액을 제거한다. 세포 수를 6,000에서 15,000 생존 세포/μL 사이에서 조정합니다. 참고: 셀 수는 일반적으로 위에 제공된 범위에 있지만 각 공급업체에 따라 다를 수 있습니다.</li>
	<li>세포 시딩 직전에 10 μL 피펫을 사용하여 MEA 전극 영역으로부터 단계 1.3에서 도포된 코팅 용액을 제거하였다. 코팅의 건조를 피하기 위해 제거 직후에 세포를 시드하십시오. 이를 위해 코팅과 동일한 방식으로 6웰 MEA 및 1웰 MEA 모두에 대해 4μL로 셀을 전극장에 적가합니다.</li>
	<li>층류 후드 아래의 6-웰 MEA 및 단일 웰 MEA의 경우 1mL에 대해 200μL에서 약 37°C로 가열된 멸균 도금 매체로 웰을 채우기 전에 세포가 37°C 및 5%CO2 의 인큐베이터에서 1시간 동안 부착되도록 합니다.</li>
	<li>층류 후드 아래에서 도금 후 48시간 후에 완전한 매체 변경을 수행하십시오. 이를 위해 펌핑 시스템에 부착 된 유리 피펫을 사용하여 흡인하여 도금 매체를 제거하십시오. 이어서, 37°C로 가열된 멸균 유지 배지 200 μL를 웰에 첨가한다.</li>
	<li>격일로 완전한 매체 변경을 수행하십시오.</li>
	<li>해동 후 5-8 일 후에 세포 측정을 시작하십시오. 실험을 시작하기 2시간 전에 완전한 배지 변경을 수행합니다.</li>
</ol>2. MEA 녹음
참고: FP 신호를 liAP로 변환하는 데 사용되는 장치는 정립 현미경과 1064nm 레이저로 구성됩니다.
<ol><li>MEA 칩 홀더가 대물 구멍 중앙에 오도록 MEA 시스템을 장치 위에 놓습니다. 레이저가 전극에 초점을 맞출 수 있도록 대물렌즈가 MEA 시스템의 구멍 바로 아래에 오도록 MEA 설정을 배치합니다.</li>
	<li>배양된 세포가 있는 MEA 칩을 기록 15분 전에 인큐베이터에서 MEA 설정으로 옮겨 세포가 기계적 교란으로부터 회복되도록 합니다.</li>
	<li>소음 수준을 줄이기 위해 이소프로판올과 면봉을 사용하여 접촉 패드와 핀을 조심스럽게 청소하십시오. MEA 설정에 MEA를 조심스럽게 배치합니다. 로고가 있는 MEA 칩을 왼쪽 상단의 하단(6웰 MEA) 또는 기준 전극이 왼쪽(단일 웰 MEA)에 있도록 배치합니다.</li>
	<li>MEA 시스템 통합 난방을 38°C로 설정합니다. MEA 칩 위에 작은 챔버를 놓아 가습 된 카보 겐 (5 % CO 2 및 95 % O2)으로 세포를 지속적으로 관류하여 인큐베이터 조건을 재현하고 증발을 방지합니다.</li>
	<li>장치의 덮개를 닫습니다. 통합 안전 스위치는 덮개가 MEA 칩 위에 닫혀 있는 경우에만 레이저를 활성화할 수 있습니다. MEA 구성 프로그램을 사용하여 MEA 시스템 필터를 0.1Hz 이하의 고역 통과 및 3,500Hz 저역 통과로 설정합니다.</li>
	<li>녹음을 위해 MC_Rack 소프트웨어(녹음 소프트웨어) 또는 대체 소프트웨어를 사용하십시오. 필요에 따라 입력 범위를 조정하여 신호가 증폭기와 샘플링 속도(예: 20kHz)를 포화시키지 않도록 합니다. 소프트웨어의 장기 표시 기능을 사용하여 녹음을 확인하십시오.</li>
</ol>3. 레이저 유도 세포 천공
<ol><li>MEA 칩을 MEA 설정에 삽입하고 소프트웨어를 설정한 후 FB Alps 소프트웨어(초기화 소프트웨어)를 사용하여 레이저 역학을 초기화합니다.</li>
	<li>먼저 초기화 버튼을 클릭합니다. 초기화가 끝나면 가상 레이저 포인트는 6웰 MEA의 경우 웰 D에 있고 단일 웰 MEA의 경우 왼쪽 하단에 각각 있습니다.</li>
	<li>Ctrl + 마우스 클릭으로 가상 레이저 포인트를 전극 D5의 중앙으로 이동하고 초점을 조정합니다. 마우스 휠로 Ctrl + 스크롤하여 초점을 조정합니다.</li>
	<li>버튼을 누릅니다 P1 설정. 가상 레이저 포인트가 자동으로 웰 F로 이동합니다. 전극 F5로 이 과정을 반복하고 P2 설정을 선택합니다.</li>
	<li>이 절차가 끝나면 레이저 포인트가 웰 B로 이동합니다. 전극 B5로 동일한 과정을 반복하고 소프트웨어에서 Set P3 을 누릅니다. 이제 시스템이 정렬되었습니다.</li>
	<li>레이저 출력과 공정 시간을 세포의 필요에 따라 조정하십시오. 여기서는 40 %의 전력과 25 %의 공정 시간이 사용되었습니다.</li>
	<li>레이저를 활성화하려면 레이저 끄기 버튼을 클릭하면 레이저 켜짐으로 표시됩니다. 녹음 소프트웨어로 전환하고 파일 이름을 선택한 다음 빨간색 녹음 버튼을 클릭한 다음 창 상단의 재생 버튼을 클릭하여 측정값을 기록합니다.</li>
	<li>레이저로 세포를 열기 전에 60초의 기준선을 기록합니다. 초기화 소프트웨어로 다시 전환합니다.</li>
	<li>Ctrl + 마우스 클릭을 사용하여 오른쪽의 가상 맵에서 레이저로 제외할 전극을 비활성화합니다. 소프트웨어 창의 오른쪽에 있는 배열 표현에서 원하는 전극을 활성화하여 선택합니다.</li>
	<li>레이저를 시작하려면 Alt + 마우스 클릭을 사용하고이 우물의 중심 전극을 선택하십시오. 이것은 레이저가 이 우물의 각 전극에 있는 셀을 자동으로 열도록 시작합니다. 각 웰에 대해 반복합니다. 그러면 레이저가 선택한 우물의 이전에 활성화 된 모든 전극을 자동으로 엽니 다.</li>
</ol>4. 약물 취급 및 적용
<ol><li>측정 당일에 약물 검사에 사용할 모든 물질을 신선하게 준비하십시오. 최종 적용 농도가 배지에서 10배 더 높은지 확인하여 웰에서 1:10 희석을 만듭니다.</li>
	<li>니페디핀, E4031 및 도페틸라이드를 먼저 mM 농도의 DMSO에 용해시킨 다음, 원하는 농도의 10x까지 배지에 추가로 용해시킨다. 웰에서 최종 DMSO 농도 0.1%를 초과하지 마십시오.</li>
	<li>60초 동안의 기준 활동을 기록합니다. 프로토콜의 3단계에 설명된 대로 레이저 유도 천공을 시작하여 FP를 liAP 모양으로 변환합니다.</li>
	<li>모든 약물을 우물 당 단일 농도로 적용하십시오. 6웰 MEA의 경우 웰당 20μL, 단일 웰 MEA의 경우 100μL의 배지를 각각 제거합니다. MEA 유형에 따라 20 μL 또는 100 μL를 측정할 약물의 원액을 웰에 추가하고 조심스럽게 위아래로 2-3회 피펫팅합니다. 통계적 관련성을 달성하기 위해 각 약물 및 농도에 대해 최소 3 회 복제를 수행하십시오.</li>
	<li>화합물을 300초 동안 씻어내십시오. 이 시간 동안 liAP 모양은 FP 모양으로 다시 변형될 수 있습니다. 다시, 레이저 유도 천공을 유도하고 추가 60초 동안 liAP에 대한 가능한 화합물 유도 효과를 기록합니다.</li>
</ol>5. 데이터 내보내기
<ol><li>녹음 소프트웨어에서 녹음을 재생하여 관련 전극을 선택합니다. MC_DataTool 사용하여 MC_Rack 파일을 ASCII .txt 파일로 변환합니다.</li>
	<li>파일을 클릭하고 MCD 열기> > MC_Rack 파일을 선택하십시오. txt 버튼(파란색 텍스트)을 클릭합니다.</li>
	<li>전극을 선택합니다. 선택한 전극이 오른쪽 목록에 표시됩니다.</li>
	<li>찾아보기를 클릭하여 폴더를 선택하고 새 .txt 파일의 이름을 변경합니다. 저장을 클릭합니다.</li>
	<li>내보낸 전극을 선택 취소하고 내보낼 다음 전극을 선택합니다. 관심있는 모든 전극에 대해이 절차를 반복하십시오.</li>
</ol>6. 데이터 처리 및 통계 분석
<ol><li>변환된 이진 트레이스를 R19로 가져옵니다. dplyr, tidyr 및 ggplot220,21,22 패키지를 포함하는 맞춤형 스크립트를 사용하여 데이터를 시각화/분석합니다.</li>
</ol>

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</ol>

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이 혁신적인 방법은 심장 활성 약리학 적 도구 화합물을 적용하는 동안 심장 활동 전위의 약리학 적 조절을 시험관 내에서 조사하는 새로운 방법을 보여줍니다.
고전적인 MEA 기록은 심장 AP14의 파생물 인 FP 기록을 허용합니다. 이 간접 기록은 탈분극 및 재분극의 시간 과정을 컨볼루션하여 AP의 필수 특성을 제거합니다. 또한 AP의 세포 간 전압 변화는 일반적으로 약 100mV 값에 도달하지만 전체 FP 진폭은 여러 100μV와 낮은 한 자릿수 mV 값 사이의 피크 진폭으로 비교적 낮게 유지됩니다. 기록 원리로 인해 재분극 단계가 작습니다. 대부분의 경우 단순히 감지 가능하고 종종 모양이 불분명하여 FP의 끝을 정의하기가 어렵습니다. 세포막이 열리면 세포 내 전압에 접근 할 수있어 심장 AP의 시간 경과를 밝힐 수 있습니다. FP 녹음과 비교하여 이 녹음 방법에는 여러 가지 장점이 있습니다. 첫째, 신호 진폭이 더 두드러져 우수한 신호 대 잡음비를 제공합니다. 둘째, 파형은 재분극을 더 잘 감지합니다. 셋째, 재분극 단계의 형태는 신호 완화의 가파름에 의해 제공되는 테스트 화합물의 작용 모드에 대한 통찰력을 제공합니다. 마지막으로, 이 방법은 심각한 약물 부작용을 감지할 수 있는 향상된 감도를 제공하며, 이는 FP가 아닌 liAP에서는 EAD가 발생하는 경우 그림 6 에 표시된 기록 예에서 입증되었습니다.
지금까지 세포 내 AP에 액세스하는 방법에는 두 가지가 있습니다. 첫 번째는 전기 천공26,27에 의해 달성됩니다. 여기서, 기록 전극을 통해 인가되는 짧고 강한 전압 펄스는 세포막(28)을 열 수 있다. 두 번째 가능성은 레이저 펄스를 통해 멤브레인이 열리는 것으로, 여기에서 설명한 것처럼 표면 플라즈몬 공명이라는 물리적 현상을 사용합니다. 전기 천공에 비해 장점 중 하나는 연속 개방 가능성이 높아진다는 것입니다. 고도로 집중된 레이저 스폿(1-3 μm)으로 인해 이 효과는 관심 전극에 매우 국부적으로 제한됩니다. 흥미롭게도, liAP의 개시는 배양 된 세포 융합의 신호 전파를 변경하지 않았다. 이것은 세포 무결성이 손상되었지만 심근 세포가 막의 구멍을 통해 탈분극되지 않는 것으로 보인다는 것을 나타냅니다.
이 방법에는 제한이 있습니다. 전기 천공과 마찬가지로 멤브레인 개구부는 대부분의 경우 전체 실험 과정에서 지속되지 않습니다. 관심 있는 특정 세포 유형의 안정적인 개방에 필요한 레이저 펄스의 최소 전력 및 지속 시간 설정은 실험 전에 독립적으로 정의되어야 합니다. 우리는 매개 변수가 다른 세포 유형 (우리의 경우 여러 hiPS 유래 및 원발성 심근 세포)간에 크게 다르다는 것을 발견했습니다 (표시되지 않음). 이는 화합물 테스트 실험 중에 세포에 불필요한 스트레스를 방지하고 보다 신뢰할 수 있고 재현 가능한 데이터를 생성합니다. 셀과 전극에 명확한 초점을 맞추기 위해 z축을 조정하는 것이 매우 중요합니다. 초점이 맞지 않는 카메라 사진은 최적이 아닌 수준에 위치한 레이저 스폿을 생성하여 잠재적으로 세포막을 열 수 없게 만듭니다. 가장 잘 조정된 파라미터를 사용하더라도 liAP 효과는 일시적이며 시간이 지남에 따라 진폭이 감소합니다. 또한, 세포의 세포 내 공간에 대한 접근은 동일한 전극의 연속 개구부 내에서 그리고 전극 사이에서 liAP 유도간에 다양합니다. 그 결과 liAP 진폭의 높은 변동성이 발생합니다. 그 이유는 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 가능한 설명에는 레이저 초점의 드리프트 또는 막 개구부의 다른 세포 내 국소화와 같은 기계적 문제가 포함됩니다. 이로 인해이 시점에서 테스트 화합물의 진폭 효과 분석이 복잡해집니다. 또한 MEA 시스템에 의한 전기 활동을 기록하려면 불가피한 기준선 드리프트를 보상하기 위해 고역 통과 필터링이 필요합니다. 여기에 사용된 시스템에서 이 필터링은 0.1Hz(이 시스템에서 사용할 수 있는 가장 낮은 필터 설정)로 설정되었지만 고원 단계 동안의 필터링 효과는 여전히 가시적이어서 심장 AP의 안정기 동안 기준선을 향한 전압 편향의 느린 추세가 발생했습니다. 이는 제어 조건에서 이미 AP >700ms를 생성하는 여기에 사용된 iPSC 유래 iCell 심근세포2 와 같이 광범위하게 긴 기본 AP에서 특히 문제가 됩니다. 필터링이 낮은 시스템을 사용하면 AP의 모양을 더 잘 보존하고 재분극 단계의 시간 과정에 더 잘 액세스할 수 있습니다.

심장 박동의 전기적 기여는 많은 심장 채널과 수송체의 복잡하고 정확한 타이밍의 상호 작용뿐만 아니라 심근1을 통한 전기 신호의 정밀하게 조정 된 전파로 인해 발생합니다. 이러한 밀접하게 조정된 메커니즘의 변경(예: 약물 사용)은 심장 기능에 심각한 결과를 초래할 수 있습니다(즉, 생명을 위협하는 부정맥)2,3. 부정맥은 심장의 정상적인 리듬을 변화시키는 불규칙한 심장 박동으로 정의되며, 이는 생명을 위협하는 결과를 초래할 수 있습니다. 이들은 심장 흥분의 파동의 개시 장애 또는 심장 흥분4의 비정상적인 전파로 인해 발생할 수 있으며, 이는 차례로 심장 펌핑 메커니즘의 기능 장애를 초래합니다.
많은 매우 강력한 약물 후보는 (친) 부정맥 잠재력 2,3으로 인해 초기 약물 개발 단계에서 추가 조사에서 제외되어야 합니다. 이들은 정상적인 심장 활동 전위 형성 및 종료뿐만 아니라 후속 신호 전파5를 담당하는 주요 심장 채널 (예 : 인간 에테르 - 고 고 관련 유전자 채널 [hERG])을 조절합니다.
제약 회사는 약물 후보에 의해 유도된 잠재적인 심장독성 오프타겟 효과를 조사하기 위해 패치 클램프 측정 또는 미세 전극 어레이(MEA)를 일상적으로 사용합니다. 패치 클램프 기록을 통해 심장 이온 채널에 대한 물질의 영향을 해독하고 높은 시공간 분해능 6,7로 세포 간 심장 활동 전위를 분석 할 수 있습니다. 그러나 이 기술의 단점은 수동 패치 클램프의 처리량이 낮고 현탁액의 세포에 대한 이 방법의 의존성으로 인해 자동화의 제한된 적용 가능성을 포함합니다. 또한, 만성 효과는 방법의 침습성으로 인해 조사 할 수 없습니다. 마지막으로, 일반적으로 전체 심장 세포 융합이 아닌 단일 세포 만 동시에 연구되므로 신호 전파에 대한 정보를 다루는 것이 불가능합니다.
전압에 민감한 염료는 심장 활동 전위 및 약물 유발 부정맥을 비침습적으로 조사하는 데유용합니다8. 그들은 단일 세포 및 세포 융합 활성의 조사를 허용합니다. 이 방법의 단점은 염료 자체 또는 조명 동안 반응 생성물의 세포 독성 효과입니다. 그들은 급성 실험에 사용되며 장기 연구 9,10,11에는 거의 적용되지 않습니다. 대안으로서의 전압에 민감한 단백질은 유용성 및 민감도 측면에서 지난 몇 년 동안 상당한 진전을 이루었지만 관심 세포의 유전자 변형이 필요하고 전기 생리 학적 기술에 비해 높은 시간 분해능이 부족합니다12.
가장 최근의 CiPA 이니셔티브13의 정보에 따르면 MEA는 심장 기능 및 안전 약리학을 조사하기 위한 강력하고 잘 확립된 도구를 나타내기 때문에 대체 전기생리학적 접근 방식으로 심장 안전 검사에 널리 사용됩니다. 심근 세포는 칩 바로 위에 syncytium으로 배양되고 세포 외 전위 (FP)는 기질 통합 미세 전극을 통해 비 침습적으로 기록됩니다. 이 기록 원리를 통해 며칠 동안 처리량 스크리닝을 늘릴 수 있으므로 만성 효과에 대한 제약 연구에 적합합니다. 결과적인 FP 파형은 세포내 AP(14)의 유도체이다. 비트 레이트, FP의 초기 부분의 진폭 및 FP 지속시간과 같은 파라미터는 쉽게 접근할 수 있다(15). FP의 연장과 삼각 측량 (부정맥16,17의 중요한 마커)의 구별과 같은 다른 필수 기준은이 기술의 AC 필터링 효과로 인해 액세스 할 수 없습니다. 또한, 조기 및 지연된 탈분극 후 (각각 EAD 및 DAD)과 같은 다른 작은 부정맥 사건을 감지하는 것은 진폭이 작기 때문에 종종 간과되기 쉽습니다.
여기서 우리는 심근 세포의 막을 열어 세포 내 막 전위에 접근하는 방법을 설명합니다. IntraCell 장치(이하 세포 내 기록 장치라고 함)는 특정 물리적 현상(표면 플라즈몬 공명)18을 통해 고도로 집속된 나노초 레이저 빔을 사용하여 MEA 전극 위에 배양된 심근 세포의 반복적인 막 개구부를 허용합니다. 결과적으로 기록은 일반 FP에서 세포 내 AP (레이저 유도 AP, liAP)로 전환됩니다. 이 프로토콜은 FP를 분석하여 쉽게 캡처할 수 없는 파형의 키네틱 측면에 액세스할 수 있는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 전통적인 세포 내 패치 클램프와 MEA 기록 사이의 다리를 나타냅니다. 따라서이 기술은 현재의 심장 안전성 평가 방법의 강력한 확장입니다.

<table><tbody><tr><td>1 웰 MEA 칩</td><td>멀티 채널 시스템 MCS GmbH</td><td>890301</td><td></td></tr><tr><td>6 웰 MEA 칩</td><td>멀티 채널 시스템 MCS GmbH</td><td>7600069</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck KGaA</td><td>20-139 약물용 Sigma-Aldrich</td><td>용매</td></tr><tr><td>Dofetilide</td><td>ALOMONE LABS ISRAEL HEADQUARTERS</td><td>D-100</td><td>약물 측정</td></tr><tr><td>dPBS</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>12037539</td><td>코팅</td></tr><tr><td>E4031</td><td>ALOMONE LABS ISRAEL HEADQUARTERS</td><td>E-500</td><td>약물 측정</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>FB Alps 버전 0.5.005</td><td>Foresee Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Merck KGaA</td><td>11051407001</td><td>코팅</td></tr><tr><td>iCell 심근세포</td><td>FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI)</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>IntraCell</td><td>Foresee Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>CN09.1</td><td>MEA 접촉 패드 세척용</td></tr><tr><td>유지보수 매체</td><td>FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI)</td><td>#M1003</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>MC_Data 도구</td><td>다중 채널 시스템 MCS GmbH</td><td></td><td>데이터 내보내기</td></tr><tr><td>MC_Rack</td><td>Multi-Channel Systems MCS GmbH</td><td></td><td>MEA 기록 MEA</td></tr><tr><td>2100 - 2x60 - system</td><td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td><td>890485</td><td>MEA 기록용</td></tr><tr><td>Nifedipine</td><td>Merck KGaA</td><td>N7634 Sigma-Aldrich</td><td>Drug-Measurement</td></tr><tr><td>Plating Medium</td><td>FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI)</td><td>M1001</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>Tergazyme</td><td>VWR International, LLC</td><td>1304-1</td><td>MEA 세척</td></tr></tbody></table>

안전성 약리학의 예측 가능성을 높이기 위해 미세 전극 어레이에서 심근 세포의 레이저 유도 활동 전위와 유사한 측정

Laser-Induced Action Potential-Like Measurements of Cardiomyocytes on Microelectrode Arrays for Increased Predictivity of Safety Pharmacology

생명을 위협하는 약물로 인한 심장 부정맥은 종종 연장 된 심장 활동 전위 (AP)가 선행되며, 일반적으로 작은 부정맥막 전위 변동이 동반됩니다. AP의 재분극 분율의 모양과 시간 과정은 부정맥의 존재 또는 부재에 중추적인 역할을 할 수 있습니다.
미세 전극 어레이(MEA)를 사용하면 세포외 전위(FP) 를 통해 심독성 화합물 효과에 쉽게 접근할 수 있습니다. 연구 및 심장 안전 약리학에서 강력하고 잘 정립 된 도구이지만 FP 파형은 세포 외 기록 원리와 그에 따른 고유 교류 (AC) 필터링으로 인해 원래 AP 모양을 추론 할 수 없습니다.
여기에 설명된 새로운 장치는 고도로 집속된 나노초 레이저 빔을 사용하여 여러 배양 시점에서 MEA 전극 위에 배양된 심근 세포의 막을 반복적으로 열 수 있습니다. 레이저 천공은 FP에서 세포 내 유사 AP(레이저 유도 AP, liAP)로 전기생리학적 신호를 변환하고 세포 간 전압 편향을 기록할 수 있습니다. 이러한 세포 내 접근은 AP 모양에 대한 더 나은 설명과 일반 MEA 기록보다 부정맥 전위의 더 좋고 민감한 분류를 허용합니다. 이 시스템은 기존 전기생리학적 방법을 혁신적으로 확장한 것으로, MEA 기반 기록의 모든 장점(간편, 급성 및 만성 실험, 신호 전파 분석 등)과 함께 심장 독성 효과를 정확하게 평가할 수 있습니다.

배양 된 심근 세포의 전기적 활동을 기록하는 데 사용되는 기록 시스템은 히터가 장착 된 표준 MEA 시스템과 컴퓨터에 부착 된 carbogen 용 챔버로 구성되었습니다. 시스템은 세포 내 기록 장치 위에 설치되었으며, 차례로 작은 진동 방지 장치 위에 장착되었습니다 (그림 1A-B).
iPSC 유래 심근 세포 2는 해동 후 2-3 일 이내에 자발적으로 박동하기 시작했으며 (시험관 내 일수, DIV) 현미경으로 볼 수있었습니다. DIV 4부터는 박동 주파수가 규칙적이되었고, 1에서 5 mV 사이의 탈분극 성분의 피크 대 피크 진폭을 갖는 세포 외 전위 (FP)가 MEA 칩의 각 웰 내의 대부분의 전극에서 검출 될 수있었습니다. 전기 활동은 조사중인 우물의 95 % 이상에서 감지 될 수 있습니다. DIV 7부터는 세포 분리 가능성이 높아져 이러한 웰을 더 이상 사용할 수 없게 되었습니다.
레이저 유도 막 개방을 제어하는 소프트웨어를 사용하면 조사 중인 전극에서만 세포막의 개방을 매개하는 레이저의 출력과 공정 시간을 모두 조정할 수 있지만(그림 1C), 각 웰의 다른 전극은 영향을 받지 않습니다. 너무 보수적 인 설정은 FP의 파형을 변경하지 않았지만 너무 높은 설정은 격렬하지만 일시적인 박동 또는 신호 손실로 표시되는 심근 세포의 추정 손상을 초래했습니다. 셀에 의해 잘 허용되는 40% 전력 및 25% 공정 시간의 설정으로 조정될 때, 레이저 펄스의 트리거링은 기록된 파형에 다중 변경을 초래하였다(예시적인 기록은 도 1D 참조). 이러한 조건 하에서, 전극 물질의 어떠한 변화도 거시적으로 관찰되지 않았다. 기록 된 신호 진폭은 무작위로 선택된 기록 하위 집합에서 분석 된 4.1 ± 0.41 (n = 20, 범위 1.34-8.83) 배 증가하여 진폭이 7에서 22mV 사이가되었습니다. 또한, 파형은 처음에 급속, 이상성 및 과도 전압 편향이 있는 표준 FP 모양에서 변환된 후 기준선에서 다시 안정 위상을 나타내고 FP의 끝을 나타내는 작은 편향이 급격한 상승, 확장된 탈분극 고원 위상 및 베이스라인 아래의 언더슈트가 있는 재분극 위상이 있는 세포 내 기록된 AP에 더 가까운 모양으로 변환되었습니다(그림 1E ). 우리는 이러한 전압 편향을 레이저 유도 AP(liAP)로 정의했습니다. 대부분의 경우 전환은 일시적이었고 5분 이내에 적어도 부분적으로 반전되었습니다. 심장 동결과 내의 신호 전파는 liAP 유도 후에도 변경되지 않았으며(그림 2), 이는 나머지 동결과 레이저 펄스의 잠재적 손상에 영향을 받지 않았음을 나타냅니다.
FP에 액세스할 수 없는 liAP의 파라미터를 추출하기 위해 허용된 세포내 기록된 AP와의 유사성(예시적인 파라미터에 대해서는 예를 들어, 도 3A 참조), 가장 두드러지게 특정 시점들(예를 들어, 20%, 50%, 및 90%)에서의 liAP의 지속기간의 측정(도 3B)은 AP들의 설명에 일반적으로 사용되는 APD20/50/90과 유사하다.
다음으로 우리는 일반적으로 사용되는 심장 활성 약리학 도구 화합물에 대한 레이저 개방 심근 세포의 반응을 테스트했습니다. 예시적인 프로토콜 설계는 도 3C에서 찾을 수 있다. liAP의 변형이 전체 실험에 걸쳐 항상 지속되는 것은 아니었기 때문에, 화합물 적용은 총 기록 시간을 줄이기 위해 누적 방식이 아닌 웰당 단일 농도로 수행되었습니다. 그럼에도 불구하고 테스트 화합물을 적용하기 전에 셀을 다시 열거 나 다른 전극 영역을 열어야했습니다.
특정 L형Ca2+ 채널 차단제인 니페디핀23,24를 첨가하면 농도 의존적으로 liAP의 안정기가 감소하여 전체 liAP가 단축되었습니다(그림 4A,B). 이 단축은 조작되지 않은 전극 (그림 4C)의 심근 세포의 FP로부터 얻은 분석과 유사했으며,이 기록 방법이 고전적인 FP 기록에 비해 부작용이 없음을 나타냅니다.
E4031은 관련 Kv1.11 (hERG) 칼륨 채널25의 재분극을 억제하고 증가 된 농도에서 심근 세포의 부정맥 거동을 유도합니다. FP 기록에서 얻은 분석과 유사하게 E4031은 농도 의존적 방식으로 liAP 지속 시간을 늘렸습니다(그림 5). 또한 0.01μM 이상의 농도에서는 liAP 끝에서 작은 양의 전압 편향이 나타났습니다. 이러한 처짐은 농도가 높을수록 더 두드러졌으며, 이는 이러한 편향이 거의 보이지 않는 FP와 달리 일시적인 새로운 탈분극을 나타냅니다(그림 5B-C, 상부(FP) 대 하부(liAP) 트레이스 참조). 이 행동을 조기 탈분극(EAD)이라고 합니다. 0.1μM의 최고 농도에서 이러한 EAD는 시간이 지남에 따라 조기 활동 전위인 이소성 박동으로 확대되었습니다(그림 5C). EAD와 이소성 박동은 모두 부정맥 활동의 핵심 지표입니다. 도 5D에 도시된 예의 끝에서, 전기적 활동은 부정맥 박동을 초래하였다. 또한 FP와 liAP 기록 사이에 표시된 농도-반응-관계가 일치했습니다(그림 5E). 그러나, 더 높은 농도의 시험 화합물에서 FP의 약한 재분극 성분으로 인한 FP 데이터에는 더 상당한 변동성이 있다. iPSC 유래 심근세포2의 특징적인 성질은 또한 제어 조건 하에서 비생리학적으로 긴 AP를 생성하는 경향이 있는 것으로 보인다(AP 지속시간 &gt; 700 ms). MEA 시스템은 고유 0.1Hz AC 필터링을 적용하여 기본 AP의 시작 및 종료에 대한 정성적 정보를 가리지 않았지만 liAP의 부분적으로 필터링된 모양을 생성했습니다.
부정맥 전압 편향의 초기 발생은 FP 기록에 비해 liAP의 낮은 농도에서 감지 될 수 있음이 밝혀졌습니다. 도 6에 도시된 것은 3 μM의 농도에서 도 페틸라이드의 도포 동안 전기적 활동의 기록이다. 녹음은 동일한 우물에서 얻어졌다. FP와 liAP 모두 약 2초의 지속 시간을 표시했지만 FP 파형은 눈에 거슬리지 않아 규칙적인 재분극 편향을 나타냅니다. 동시에 liAP가 끝나면 다양한 크기의 EAD가 표시되었습니다. 관련 안전성-약리학적 민감도의 이러한 증가는 표면 플라즈몬 공명에 의해 유도된 liAP가 재분극 단계의 자격을 향상시켜 조사 중인 테스트 화합물의 작용 방식에 대해 더 많이 배우는 데 도움이 된다는 사실을 더욱 뒷받침합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig1v2.jpg"> 도 1: 세포내 기록 설정 및 예시적인 기록 . (A) 설정 개요. (B) 개방형 MEA 녹음 증폭기가 있는 녹음 시스템의 평면도. (C) 오른쪽에 가상 MEA 맵이 있는 초기화 소프트웨어. 1: 방진 테이블, 2: 세포 내 녹음 시스템, 3: 레이저 보호 뚜껑, 4: 가습 카보겐 챔버, 5: MEA 가열 시스템, 6: MEA 인터페이스 보드, 7: 녹음 증폭기 내부의 1웰 MEA 칩. (D) liAP의 유도 전후의 하나의 전극으로부터의 기록 예. 상단: 약 6분 동안 녹화. 점선은 아래쪽에 표시된 확장된 영역을 표시합니다. (E) 확대 FP (상단) 및 liAP (하단). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig02.jpg"> 그림 2: 신호 전파 패턴은 liAP 유도 후에도 보존된 상태로 유지됩니다. 싱크 리튬 내에서 여기 파의 신호 전파의 가색 코딩. 파란색은 일찍(-4ms에서 시작)을 나타냅니다. 빨간색은 색상 막대로 표시된 대로 기준 전극 E54에서 얻은 신호의 늦은 시점(+3ms)을 나타냅니다. 신호는 전극 어레이의 오른쪽 상단에서 왼쪽 하단으로 이동합니다. (A) liAP 유도 전, (B) liAP 유도 후 1 분. (C) liAP 유도 후 4분. 플래시 기호는 전극(64)에서의 레이저 유도 지점을 나타낸다. 전체 전파 방향의 차이는 보이지 않습니다. 검은색 사각형은 잘못된 데이터를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig3v2.jpg"> 그림 3: FP/liAP 파라미터 정의 및 기록 프로토콜 . (A) 기존 FP에서 추출할 수 있는 파라미터. (B) liAP로부터 얻을 수 있는 추가 파라미터. (C) 약물 측정 일정. 왼쪽에서 오른쪽으로: 60초 동안 제어 기록, liAP 유도, 60초 동안 liAP 기록, 약물 적용, 세척 시간 300초, liAP 재유도, 60초 동안 liAP 기록 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig4v2.jpg"> 그림 4: 니페디핀은 농도 의존적 방식으로 심장 liAP를 단축합니다. (A) 상단: 대조군(파란색) 및 0.3μM 니페디핀(빨간색)이 있는 FP 트레이스. 추적은 더 나은 시각화를 위해 y축 오프셋으로 표시됩니다. 하단: 동일한 MEA 레코딩에서 liAP를 추적하여 liAP가 짧아지고 비트 속도가 증가합니다. (B) 대조군 중 단일 liAP의 중첩 (파란색) 및 다양한 농도의 니페디핀 적용 (빨간색). a: 0.01 μM, b: 0.1 μM 및 c: 0.3 μM. 농도가 증가함에 따라 liAP 지속 시간이 단축됩니다. (C) FP (검은 색) 및 liAP (빨간색) 기록에서 얻은 신호 폭의 농도-응답 관계. 데이터는 n=3의 실험에서 대조군으로 정규화된다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig5v2.jpg"> 그림 5: E4031은 (pro-) 부정맥 동작을 유도합니다. (A) 제어 조건에서 FP(상단) 및 liAP(하단). (B-C) FP와 liAP는 E4031(0.1μM)을 적용한 후 서로 다른 시점에서 기록되었다. 80초 후 첫 번째 EAD는 liAP 끝에 표시됩니다(B, 빨간색 화살표로 표시됨). EAD는 시험 화합물 (C)의 존재하에 320 초 후에 이소성 박동으로 변환됩니다. (D) 530 초 후, 심장 세포 융합은 빈맥 상태가됩니다. liAP 기록에서 묘사된 추적입니다. (E) FP (흑색)와 liAP (적색) 폭의 농도-반응 관계. n = 4 실험의 데이터, 대조군으로 정규화. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig5v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig06.jpg"> 그림 6: 부정맥 전조 이벤트의 검출은 FP보다 liAP에서 더 민감합니다 . (A) FP 기록 및 (B) 3μM 도페틸라이드를 적용하는 동안 동일한 웰 내에서 liAP 기록. 일부 liAP가 끝나면 EAD를 탐지할 수 있지만 FP 기록에서는 검색할 수 없습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

레이저 천공과 미세 전극 어레이(MEA)의 조합은 배양된 일차 및 줄기 세포 유래 심근 세포의 활동 전위와 유사한 기록을 가능하게 합니다. 파형 모양은 표준 기록보다 테스트 화합물의 작용 모드에 대한 우수한 통찰력을 제공합니다. 패치 클램프와 MEA 판독값을 연결하여 향후 심장 안전 연구를 더욱 최적화합니다.

Life-threatening drug-induced cardiac arrhythmia is often preceded by prolonged cardiac action potentials (AP), commonly accompanied by small ...

이 방법을 사용하면 기존 MEA에서 세포 내 유사 활동 전위를 기록할 수 있으므로 AP 모양을 더 잘 설명하고 부정맥 전위를 보다 민감하게 분류할 수 있습니다. 일반적인 전위 기록과 비교하여 세포 내 유사 실제 전위 모양은 기본 이온 채널의 정확한 승인에 대한 더 많은 통찰력을 제공합니다. 줄기세포 기술을 통해 임상 환자로부터 유래된 심근세포에 적용할 경우, 이 방법은 원인적 진단 및 CRP의 개인화에 기여할 수 있으며, 부정맥과 같은 심장 질환 기술자인 Karin Gebhardt는 심근세포 배양을 시연할 것이다.이전에 오토클레이브된 MEA의 전극장 코팅을 시작하려면 층류 후드 아래에 10마이크로리터 피펫을 사용하여 피브로넥틴을 적가합니다. 삼투압 충격을 줄이려면 해동 된 심근 세포가 들어있는 50 밀리리터 튜브에 도금 용액을 90 초 동안 적가하십시오. 8 밀리리터의 도금 매체를 튜브에 부드럽게 첨가하고 셀 현탁액을 조심스럽게 혼합하십시오.10 밀리리터 피펫을 사용하여 상청액을 제거하고 펠릿을 버리지 않도록하고 세포 수를 최종 농도로 조정하십시오. 셀 안착 전에 10 마이크로리터 피펫을 사용하여 MEA 전극 영역으로부터 도포된 코팅 용액을 제거한다. 코팅의 건조를 피하기 위해 즉시 4 마이크로 리터의 셀을 6 웰 MEA 및 1 웰 MEA 모두에 대한 전극장에 적가하여 셀을 시드하십시오.이제 셀이 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 1 시간 동안 웰에 부착되도록하십시오.층류 후드 아래에 6개의 웰 MEA 및 단일 웰 MEA에 대해 각각 섭씨 37도로 가열된 200마이크로리터와 1밀리리터의 멸균 도금 매체를 추가합니다. MEA 기록의 경우 MEA 칩 홀더가 대물 구멍 중앙에 오도록 MEA 시스템을 장치 위에 놓습니다. 그런 다음 MEA 설정을 배치하여 레이저가 전극에 초점을 맞추도록 하여 대물렌즈가 MEA 시스템의 구멍 바로 아래에 있도록 합니다.세포가 기계적 교란으로부터 회복될 수 있도록 하려면 배양된 세포가 있는 MEA 칩을 기록 15분 전에 인큐베이터에서 MEA 설정으로 옮깁니다. 그런 다음 이소프로판올 면봉을 사용하여 접촉 패드와 핀을 조심스럽게 청소하여 소음 수준을 줄입니다. MEA를 MEA 설정에 조심스럽게 배치하고 오른쪽에 일련 번호가 보이는 6웰 MEA 칩 또는 왼쪽에 기준 전극이 있는 단일 웰 MEA 칩을 배치합니다.이제 MEA 시스템 통합 난방을 섭씨 38도로 설정하십시오. 통합 안전 스위치는 덮개가 MEA 칩 위에 닫혀 있는 경우에만 레이저를 활성화할 수 있으므로 장치의 덮개를 닫습니다. MEA 구성 프로그램을 사용하여 고역 통과 및 저역 통과 MEA 시스템 필터를 각각 0.1 헤르츠 이하 및 3, 500 헤르츠로 설정하십시오.MC 랙 소프트웨어 또는 대체 소프트웨어를 사용하여 녹음하십시오. 실험에 따라 입력 범위를 조정하십시오. 신호가 증폭기와 샘플링 속도를 포화시키지 않는지 확인합니다.소프트웨어의 장기 표시 기능을 사용하여 녹음을 확인하십시오. MEA 칩을 MEA 설정에 삽입하고 소프트웨어를 설정한 후 FB ALP 소프트웨어를 사용하여 레이저 역학을 초기화합니다. 이제 초기화 버튼을 클릭하십시오.초기화가 끝나면 가상 레이저 포인트는 6 개의 웰 MEA의 경우 웰 D에, 단일 웰 MEA의 경우 왼쪽 하단에 각각 있습니다. 그런 다음 마우스 클릭으로 제어 키를 사용하여 가상 레이저 포인트를 D five 전극의 중앙으로 이동하고 제어 키를 누른 상태에서 마우스 휠로 스크롤하여 초점을 조정합니다. 또는 자동 초점 기능을 사용하십시오.버튼을 누르면 P one 설정 가상 레이저 포인트가 자동으로 우물 F로 이동합니다. 실험 요구 사항에 따라 레이저 출력과 공정 시간을 조정하십시오. 레이저를 활성화하려면 레이저 켜짐으로 표시되는 레이저 끄기 버튼을 클릭하고 녹음 소프트웨어로 전환하십시오.파일 이름을 선택하고 빨간색 기록 버튼을 클릭한 다음 창 상단의 재생 버튼을 클릭하여 측정값을 기록합니다. 레이저로 세포를 열기 전에 60초 동안 기준선을 기록한다. 초기화 소프트웨어로 다시 전환하고 소프트웨어 창의 오른쪽에 있는 가상 맵에서 레이저에 의해 제외될 전극을 비활성화합니다.레이저를 시작하려면 Alt 마우스 클릭을 사용하고이 우물의 중심 전극을 선택하십시오. 이것은 레이저가 이 웰의 각 전극 상의 셀을 자동으로 개방하도록 개시하고, 각 웰에 대해 반복하여 이 선택된 웰의 이전에 활성화된 모든 전극을 개방한다. 니페디핀 E-40 31의 밀리몰 농도를 DMSO에 먼저 용해시킨 다음 완전한 배지에서 원하는 농도의 10 배로 용해시킵니다.우물에서 0.1%의 최종 DMSO 농도를 초과하지 마십시오. 60초 동안 기준 활동을 기록합니다. 앞에서 설명한 대로 레이저 유도 퍼레이션을 시작하여 FPS를 liAP로 변환합니다.모든 약물을 우물 당 단일 농도로 적용하십시오. 6개의 웰 및 단일 웰 MEA에서 각각 웰당 20마이크로리터 및 100마이크로리터의 배지를 제거합니다. 측정할 약물 저장 용액 20 마이크로리터 또는 100 마이크로리터를 웰에 첨가한다.MEA 유형에 따라 조심스럽게 위아래로 2-3 회 피펫하십시오. 화합물을 300초 동안 씻어내십시오. 이 시간 동안, liAP 형상은 FP 형상으로 변형될 수 있다.다시, 유도된 레이저 유도 퍼레이션을 추가 60초 동안 liAP에 가능한 화합물 유도 결함을 기록합니다. 니페디핀의 첨가는 농도 의존적 방식으로 liAPs의 고정상 단계를 감소시키고, 이로써 전체 liAP를 단축시켰다. 이 단축은 조작되지 않은 전극으로부터의 심근 세포의 전계자 전위와 비슷했다.E-40 31은 관련 KV 1 점 11 칼륨 채널의 재분극을 억제하고 증가 된 농도에서 심근 세포의 부정맥 거동을 유도했다. 또한, E-40 31은 농도 의존적으로 liAP 지속시간을 증가시켰다. liAP의 끝에서 0.1 마이크로 몰에서 작은 양의 전압 편향이 관찰되었으며, 이는 더 높은 농도에서 더 두드러졌으며, 이는 EAD라고하는 일시적인 새로운 탈분극을 나타냅니다.0.1 마이크로 몰의 최고 농도에서 이러한 EAD는 시간이 지남에 따라 이소성 박동으로 확대되었습니다. 조기 활동 전위입니다. EAD와 이소성 박동은 프로 부정맥 활동의 핵심 지표입니다.그리고 결국, 전기적 활동은 부정맥 박동을 초래합니다. 농도 반응 관계는 FP 및 liAP 기록과 상관 관계가 있습니다. 또한, 도페틸리드의 존재 하에서, FP 및 liAP 모두 동일한 웰 내에서 약 2초의 지속시간을 표시하였고, FP 파형은 규칙적인 재분극 편향을 나타내었다.liAP에있는 동안 EAD는 감지 할 수 있습니다. 초점이 맞지 않는 현미경 이미지가 세포의 개방에 영향을 줄 수 있으므로 각 멜로멘 전에 초점을 조정하는 것이 중요합니다. 또한 옵터레이션을 분석에 사용해야 하는 직후에 활동 전위가 측정됩니다.이 기술은 표준 MEA에 비해 이전의 부정맥 효과를 감지하는 데 더 민감하여 부작용을보다 정확하게 감지 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

그대로 고립 Langendorff에 transmembrane 잠재력 (VM)과 일시적인 세포 내 칼슘 (CAT)의 광학 매핑하는 동안이 종이 자세히 해부 절차를, 수단 설치, 그리고 실험 조건 마우스 마음을 perfused.

마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

인간의 다 능성 줄기 세포 (hPSC-CM)에서 유래 된 심근 세포의 전기 생리 학적 특성은 심장병 모델링 및 약물 반응 결정에 중요합니다. 이 프로토콜은 다중 전극 배열에서 hPSC-CM을 해리 및 플레이트하고 필드 전위를 측정하며 QT 및 RR 간격을 분석하는 데 필요한 정보를 제공합니다.

다중 전극 배열 (MEAs)을 이용한 인간 다 능성 줄기 세포 유래 심근 세포 (hPSC-CMs)의 전기 생리 학적 분석

여기 우리는 특히 심 실 같은 유도 만능 줄기 세포 유래 cardiomyocytes에에서 광학 이미지 활동 전위, 하는 방법을 제시. 메서드를 사용 하면 전압에 민감한 형광 단백질의 발기인 기반 식을 기반으로 합니다.

하위 형식 관련 광학 활동 전위 녹음 인간의 유도 만능 줄기 세포 유래 심 실 Cardiomyocytes

본 문서는 멀티웰 MEA 플레이트상에서 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CM) 네트워크의 개발을 위한 프로토콜 세트를 함유하고 있으며, 작용 전위 측정을 위해 세포막을 가역적으로 전기화한다. 높은 처리량 기록은 며칠 동안 반복적으로 동일한 셀 사이트에서 얻어진다.

재발 동작 전위 기록을 위한 멀티웰 마이크로 전극 어레이의 인간 iPSC 유래 심근구 네트워크

우리는 뮤린 근세포를 분리하는 방법론과 동시 디지털 세포 기하학 측정을 통해 형광 광도계를 사용하여 sarcomere 단축 추적과 동시에 전압 또는 칼슘 흔적을 얻는 방법을 제시합니다.

고립 된 뮤린 심실 근세포의 광학 이미징

우리는 토끼 심근 세포에서 GtACR1 활성화의 전기 기계적 효과를 평가하기위한 프로토콜을 제시한다. 당사는 세포 격리, 배양 및 아데노바이러스 전이, 패치 클램프 및 탄소 섬유 기술로 기능적 실험에 대한 자세한 정보를 제공합니다.

광유전학적으로 변조된 심근세포 활동의 전기기계적 평가

이 프로토콜은 전임상 약물 검사를 위해 인간의 심장 조각을 단면화 및 배양하는 절차를 설명하고 이러한 조각에서 동시에 세포간 전압 및 세포내 칼슘 신호를 기록하기 위한 광학 매핑의 사용을 자세히 설명합니다.

인간 조직형 심장 슬라이스의 이중 전압 및 칼슘 광학 매핑에 의한 전임상 심장 전극생리학 평가

여기서는 고속 모듈식 광혈약 시스템을 사용하여 유도된 다능줄기 세포 유래 심근세포로부터의 작용 잠재력의 광학 획득 및 특성화를 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

이 프로토콜은 마우스의 페이스메이킹 결함을 식별하기 위해 전체 시노어심 노드 조직의 미세 전극 어레이 기록을 사용하여 본질적인 심장 발사 속도를 측정하는 새로운 방법론을 설명하는 것을 목표로합니다. 약리학 에이전트는 또한 본질적인 페이스 메이킹에 그들의 효력을 공부하기 위하여 이 방법에 소개될 수 있습니다.

중고심 노드 발사 속도의 마이크로 전극 어레이 기록으로 마우스의 본질적인 심장 페이스메이킹 결함을 식별합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CM)는 약물 유도 심장 독성 스크리닝 및 질병 모델링을위한 유망한 시험관 내 모델로 부상했습니다. 여기에서는 hiPSC-CM의 수축성과 전기 생리학을 측정하기위한 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에 대한 미세 전극 어레이 및 패치 클램프 기록의 기술적 응용

빛을 사용하여 심장 세포와 조직을 제어하면 비접촉 자극이 가능하여 세포의 자연 상태와 기능을 보존할 수 있으므로 기본 연구와 치료 응용 분야 모두에 유용한 접근 방식이 됩니다.

비유전적 광학 자극을 통한 Ca2+ 전파를 연구하기 위한 심장 미세생리학적 시스템

배우세요 레이저 포레이션과 미세 전극 어레이를 결합한 심근 세포 활동 전위 기록법. 이 방법은 이온 채널 동역학을 정밀하게 분석하고 부정맥 유발 가능성을 민감하게 분류하여 심장 안전성 약리학 연구의 예측 가능성을 높입니다.

안전성 약리학의 예측 가능성을 높이기 위해 미세 전극 어레이에서 심근 세포의 레이저 유도 활동 전위와 유사한 측정

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