Name: 모기 및 기타 외온선의 온도 선호도 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: 학습하세요 모기와 Drosophila melanogaster의 온도 선호도를 측정하는 이중 챔버 장치 방법을. 간단한 설정과 자연 행동 관찰이 가능한 이 기법은 곤충 생태학 및 기후 변화 연구에 활용됩니다.

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AHR은 Majlis Amanah Rakyat (MARA)의 자금 지원을 인정합니다.

참고: 이 프로토콜은 BSL 1 또는 2용으로 작성되었습니다. BSL 3 작업의 경우 클래스 3 생물안전 캐비닛(글러브 박스) 내부에서 전체 프로토콜을 수행합니다.
1. 곤충 준비
<ol><li>12cm의 슬리브 구멍이있는 두 개의 빈 모기장 (17.5cm x 17.5cm x 17.5cm)을 준비하십시오 (그림 1). 실험을 진행하기 전에 모기장에 구멍이나 기타 손상이 없는지 확인하십시오.</li>
	<li>기계식 흡인기 (수집 챔버가있는 간단한 푸터)를 사용하여 30 마리의 곤충 (예 : Aedes aegypti 모기, 여기서는 출현 후 3-5 일 암컷이 사용됨)을 별도의 케이지로 옮겨 실험 후 취급 및 폐기를 용이하게합니다. 알림: 모기 탈출의 높은 위험 없이 관리하고 계산하기 쉽기 때문에 실험당 총 30마리의 곤충이 제안됩니다. 사용 된 곤충의 수는 실험 목적에 맞게 조정할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 2 챔버 장치 설정
<ol><li>인큐베이터 제조업체의 지침에 따라 인큐베이터를 원하는 온도로 설정하십시오.</li>
	<li>인큐베이터가 25-30 ° C 범위의 온도에 대해 <30 분 인 특정 온도에서 가열되고 안정화되도록합니다. 온도 프로브로 인큐베이터의 공기 온도를 확인하여 인큐베이터가 의도 한 온도로 설정되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>각 인큐베이터에 빈 모기장을 놓습니다 (그림 2A).</li>
	<li>인큐베이터의 전면 구멍을 통해 케이지의 슬리브를 공급하십시오. 덕트 테이프로 열 수 있는 덮개(플랩)를 준비하고 아크릴 튜브의 구멍 위에 놓습니다(그림 2B).</li>
	<li>인큐베이터 구멍 상단의 한 케이지 슬리브에 아크릴 튜브를 삽입하십시오. 튜브의 직경은 인큐베이터 전면의 구멍보다 커서 구멍을 완전히 덮습니다.</li>
	<li>고무 밴드 또는 재사용 가능한 케이블 타이로 튜브 주위의 슬리브 메쉬를 조입니다(그림 2C). 아크릴 튜브가 느슨하지 않고 사이에 매달려 있지 않은인큐베이터; 그렇다면 케이지 슬리브를 당겨 케이지와 고무 밴드 사이의 과도한 재료를 제거하십시오.</li>
	<li>두 인큐베이터를 서로 마주 보도록 놓고 다른 인큐베이터의 슬리브로 2.5 단계와 2.6 단계를 반복하십시오. 이제 두 케이지가 아크릴 튜브를 통해 단단히 연결됩니다(그림 2D).</li>
</ol>3. 모기 삽입
<ol><li>모기 삽입을 위해 덕트 테이프 플랩을 엽니다. 구멍에 깔때기를 놓습니다. 곤충을 아크릴 튜브에 넣은 깔때기에 비우십시오. 참고: 원하는 경우/필요한 경우: 모기의 경우 깔때기(21)에 넣기 전에 CO2 펜을 사용하여 모든 모기를 녹아웃합니다. 초파리의 경우 얼음을 사용하여 곤충을 쓰러 뜨리십시오22.</li>
	<li>깔때기를 제거하고 덕트 테이프 플랩으로 튜브의 구멍을 덮습니다. 곤충이 선호하는 방을 선택할 수 있도록 30 분 동안 그대로 두십시오. 알림: CO2 또는 얼음을 사용한 경우 튜브 브리지를 가볍게 두드려 몇 분 후에 곤충을 깨 웁니다.</li>
</ol>4. 모기 계수
<ol><li>30 분 후, 육안으로 관찰하고 다리 (아크릴 튜브)에서 얼마나 많은 곤충이 발견되었는지 기록하십시오.</li>
	<li>인큐베이터의 양쪽으로 다리에있는 곤충을 두드리거나 불어냅니다. 나중에 총 곤충 수에서 공제하는 기록. 참고 : CO 2를 다리에 방출하여 장치의 30 개 곤충을 모두 녹아웃하십시오 (얼음이 새장의 곤충을 쓰러 뜨리지 않으므로 모든 곤충에 CO2를 사용하십시오). 또한 인큐베이터의 양쪽으로 날아가는 다리의 곤충 수를 기록해 두십시오.</li>
	<li>양쪽의 아크릴 튜브에서 슬리브를 꼬집어 닫고 매듭으로 빠르게 고정하여 새장을 닫고 고무 밴드가 손상되지 않도록하여 곤충이 빠져 나가지 않도록하십시오.</li>
	<li>인큐베이터에서 새장을 제거하고 각 새장의 곤충을 시각적으로 세십시오 (필요한 경우 다리에서 곤충 수를 공제하십시오).</li>
	<li>다른 케이지에 대해 4.4단계를 반복합니다. 두 인큐베이터와 다리의 숫자가 최대 30 개 (또는 다른 경우 사용 된 곤충의 수)가되는지 확인하십시오.</li>
	<li>숫자가 1.2 단계에서 사용 된 곤충의 총 수에 합산되지 않으면 케이지 슬리브에서 나머지 곤충을 찾으십시오.</li>
</ol>5. 복제
<ol><li>실험을 수행할 때 빛의 방향, 주변 냄새 등과 같은 가능한 외부 편향을 고려해야 합니다. 예를 들어, 케이지, 인큐베이터 방향 및 반복 실험 간의 조합을 뒤집습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Wright, R. K., Cooper, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+effects+on+ectotherm+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+%26+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">Temperature effects on ectotherm immune responses.</a> Developmental & Comparative Immunology. 5, 117-122 (1981).</li>
<li>Deal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temperature+preferendum+of+certain+insects%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Animal+Ecology%22%5BJournal%5D)">The temperature preferendum of certain insects.</a> The Journal of Animal Ecology. 10 (2), 323-356 (1941).</li>
<li>Hongoh, V., Berrang-Ford, L., Scott, M. E., Lindsay, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+geographical+distribution+of+the+mosquito%2C+Culex+pipiens%2C+in+Canada+under+climate+change%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Geography%22%5BJournal%5D)">Expanding geographical distribution of the mosquito, Culex pipiens, in Canada under climate change.</a> Applied Geography. 33, 53-62 (2012).</li>
<li>Beck-Johnson, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+temperature+fluctuations+in+understanding+mosquito+population+dynamics+and+malaria+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">The importance of temperature fluctuations in understanding mosquito population dynamics and malaria risk.</a> Royal Society Open Science. 4 (3), 160969(2017).</li>
<li>Erraguntla, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+model+for+microclimatic+temperature+and+its+use+in+mosquito+population+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Predictive model for microclimatic temperature and its use in mosquito population modeling.</a> Scientific Reports. 11 (1), 18909(2021).</li>
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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decline+in+symbiont-dependent+host+detoxification+metabolism+contributes+to+increased+insecticide+susceptibility+of+insects+under+high+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Decline in symbiont-dependent host detoxification metabolism contributes to increased insecticide susceptibility of insects under high temperature.</a> The ISME Journal. 15 (12), 3693-3703 (2021).</li>
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<li>MacLean, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+preference+across+life+stages+and+acclimation+temperatures+investigated+in+four+species+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thermal+Biology%22%5BJournal%5D)">Temperature preference across life stages and acclimation temperatures investigated in four species of Drosophila.</a> Journal of Thermal Biology. 86, 102428(2019).</li>
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<li>Sayeed, O., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+genetics+of+thermosensation+and+hygrosensation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Behavioral genetics of thermosensation and hygrosensation in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (12), 6079-6084 (1996).</li>
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<li>Ziegler, R., Blanckenhorn, W. U., Mathis, A., Verhulst, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+analysis+of+the+locomotory+behaviour+of+Aedes+aegypti+and+Ae.+japonicus+mosquitoes+under+different+temperature+regimes+in+a+laboratory+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thermal+Biology%22%5BJournal%5D)">Video analysis of the locomotory behaviour of Aedes aegypti and Ae. japonicus mosquitoes under different temperature regimes in a laboratory setting.</a> Journal of Thermal Biology. 105, 103205(2022).</li>
<li>Blanford, S., Read, A. F., Thomas, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+behaviour+of+Anopheles+stephensi+in+response+to+infection+with+malaria+and+fungal+entomopathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Thermal behaviour of Anopheles stephensi in response to infection with malaria and fungal entomopathogens.</a> Malaria Journal. 8, 72(2009).</li>
<li>Nakae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-related+anomalies+in+the+growth+of+selected+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Temperature-related anomalies in the growth of selected bacteria.</a> Journal of Dairy Science. 54 (12), 1780-1783 (1971).</li>
<li>Rajpurohit, S., Schmidt, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+thermal+behavior+in+smaller+insects%3A+A+case+study+in+Drosophila+melanogaster+demonstrates+effects+of+sex%2C+geographic+origin%2C+and+rearing+temperature+on+adult+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Measuring thermal behavior in smaller insects: A case study in Drosophila melanogaster demonstrates effects of sex, geographic origin, and rearing temperature on adult behavior.</a> Fly. 10 (4), 149-161 (2016).</li>
<li>Truitt, A. M., Kapun, M., Kaur, R., Miller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+modifies+thermal+preference+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Wolbachia modifies thermal preference in Drosophila melanogaster.</a> Environmental Microbiology. 21 (9), 3259-3268 (2019).</li>
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<li>Lin, C. S., Georghiou, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+mosquito+larvae+and+pupae+to+carbon+dioxide+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Mosquito+News%22%5BJournal%5D)">Tolerance of mosquito larvae and pupae to carbon dioxide anesthesia.</a> Mosquito News. 36 (4), 460-461 (1976).</li>
<li>Ito, F., Awasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+temperature+preference+behavior+and+effects+of+temperature+on+daily+behavior+in+11+Drosophila+species%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of temperature preference behavior and effects of temperature on daily behavior in 11 Drosophila species.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1-15 (2022).</li>
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</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

이 연구는 모기의 온도 선호도를 관찰하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 방법에서 모기는 독립적으로 제어 가능한 온도로 두 개의 인큐베이터에 연결된 튜브로 방출됩니다. 이러한 방식으로 모기는 자연스러운 행동과이 선택을 표현하는 메커니즘 (예 : 비행)을 방해하지 않고 두 온도 중에서 자유롭게 선택할 수 있습니다.
우리의 첫 번째 대표적인 실험은 두 챔버 모두에서 모기 최적 온도인 27°C를 사용하였다. 이 실험을 반복하는 동안 모기는 전체 30 분 동안 두 케이지 사이를 자유롭게 날아 다니는 것으로 관찰되었으며 모든 반복에서 두 챔버 각각에 거의 동일한 수가있었습니다. 이것은 모기가 자연적인 행동 (비행)을 나타내면서 우리 중에서 자유롭게 선택할 수있는 능력을 허용하려는 실험적 의도를 확인했습니다. 반대로, 두 번째 대표적인 실험은 한 챔버에서 27°C의 매력적인 최적 온도와 두 번째 챔버에서 30°C의 차선의 반발 온도를 활용했습니다. 예상대로, 모기는 편견을 피하기 위해 인큐베이터를 교체했을 때에도 높은 의미에서 최적의 온도 챔버를 일관되게 선택했습니다.
우리는 또한 다른 외열 모델 유기체를 대표하는 다른 곤충 D. melanogaster (초파리)에 대한 설정을 테스트했습니다. 하나의 챔버는 D. melanogaster의 최적 온도인 25°C로 설정하였고, 다른 챔버는 3°C 더 높은, 28°C로 설정하였다. 모기와 마찬가지로 초파리도 최적의 온도를 선호하고 따뜻한 방을 피했습니다. 이것은 프로토콜이 다양한 외온선에 적합하다는 것을 보여줍니다.
프로토콜의 중요한 단계에 대한 설명 프로토콜의 주요 중요한 단계는 곤충이 탈출 할 가능성을 생성하기 때문에 곤충 취급입니다. 이는 사용된 케이지에 탈출할 수 있을 만큼 큰 구멍이 없는지, 메쉬 슬리브를 교량에 고정하는 데 사용되는 고무줄/케이블 타이가 단단한지, 교량의 곤충 삽입 구멍용 덮개가 단단히 부착 및 밀봉되어 있는지 판단하여 방지할 수 있습니다.
또한 곤충이 실험 전후에 탈출하지 않도록하는 것이 중요하며, 특히 곤충이 다운 스트림 실험 또는 다양한 온도 선택을위한 이후 시점에 필요한 경우 더욱 그렇습니다. 이것은 곤충을 아크릴 다리에 넣기 전에 마취시키고 (Drosophila의 경우 얼음 사용, 모기의 경우 CO 2 사용) 계산 전에 실험 후 곤충을 쓰러 뜨리기 위해 다리 안으로 CO2 를 방출함으로써 수행 할 수 있습니다. CO2의 사용은 행동 결과에 영향을 미치지 않기 때문에 모기에 이상적입니다21. 파리에서CO2에 노출되면 비행 행동이 바뀔 수 있으므로23 얼음22를 사용하는 것이 좋습니다.
곤충 계수는 정확한 결과를 위해 실험 전후에 곤충의 수가 동일한지 확인하기 위한 중요한 단계이기도 합니다. 이를 위해 실험이 완료되면 다리에있는 곤충을 쓰러 뜨리기 위해 CO2 펜을 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 곤충을 챔버의 양쪽으로 옮기는 데 도움이되므로 탈출자의 수를 줄일 수 있습니다. 우리는 또한 프로토콜에서 케이지 분리 중에 케이지의 소매에 곤충이 걸릴 수 있음을 강조합니다. 따라서 계수 중에 철저히 확인하십시오.
기술의 잠재적 수정 및 문제 해결 이 기술의 주요 어려움은 케이지 슬리브의 유연한 메쉬로 인해 틈이나 은신처가 생겨 곤충이 탈출하거나 덫을 놓는 것입니다. 필요한 경우 기술을 개선하기 위해 몇 가지 잠재적인 수정 사항이 있습니다. 곤충을위한 잠재적 인 공간을 남기지 않고 다리가 챔버 사이에 적절하게 고정되도록하기 위해 두 개 이상의 고무 밴드를 사용하는 것이 좋습니다 (느슨한 메쉬는 곤충을위한 은신처 공간을 만듭니다). 또한 장치를 조립할 때 2.6 단계에서 설명한대로 메쉬 슬리브를 팽팽하게 당기는 데 특히주의하는 것이 좋습니다.
소형 폼 팩터 인큐베이터는 일반적으로 여기에 사용 된 인큐베이터의 경우와 같이 가열 만합니다 (즉, 활성 냉각이 없음). 결과적으로 주변 실내 온도 주변 또는 그 이하의 온도를 사용하려면 인큐베이터에 설정된 온도가 원하는 만큼 낮아지도록 차가운 실내에서 실험을 수행해야 합니다.
또한 이 설정은 클래스 3 생물안전 캐비닛(글러브 박스)이 필요한 BSL 3에도 사용할 수 있습니다. 이 경우 글러브 박스는 전체 장치에 맞을만큼 충분히 커야합니다. 이 프로토콜에 설명된 실험은 필요한 모든 것이 글로브박스 내에 포함되고 중요한 것은 곤충이 탈출할 가능성이 최소화되기 때문에 글러브 박스에서의 실험에 이상적입니다.
마지막으로, 인큐베이터에는 새장의 곤충에 영향을주지 않고 외부 조명이나 습도 원을 추가 할 수있는 충분한 공간이 있습니다. 곤충 종이나 실험 설계에 따라 1cm 두께의 LED 램프를 하나 또는 두 개의 인큐베이터 내부의 케이지 위에 쉽게 놓을 수 있습니다. 둘 다에 빛을 제공하고 온도 선택을 제공하는 것은 일부 감광성 실험 설계에 대해 보다 현실적인 프로토콜이 될 수 있으며, 하나의 챔버에만 빛(또는 습도)을 제공하는 것은 빛/습도 선택을 평가하기 위한 프로토콜의 가능한 수정입니다.
이중 선택 온도 선호도 분석의 맥락에서 이 기술의 장점 여기에 설명된 방법은 이전 연구10,13,14,16에서 설명된 전통적인 온도 구배 방법에 대한 대안을 제시합니다. 이러한 연구의 대부분에서 열 구배가 있는 대형 수평 알루미늄 블록이 사용되는 반면, 이 구배를 생성하는 메커니즘은 가열/냉각 블록, 수조 등을 포함하여 다양합니다. 이러한 경우 온도 구배는 케이지의 공기 온도가 아닌 알루미늄 블록 표면에서 생성됩니다. 결과적으로, 대부분의 (전부는 아니지만) 대체 기술은이 프로토콜보다 곤충의 비행 능력을 더 제한합니다. 여기서 곤충은 우리 사이를 비교적 자유롭게 날 수 있으므로 선택의 자연스러운 행동을보다 사실적으로 표현할 수 있습니다. 예를 들어 더 큰 곤충의 경우 더 큰 케이지와 인큐베이터를 사용하여이 실험 장치를 확장 할 수도 있습니다.
자연스러운 거동 이점 외에도 두 챔버 내에서 매우 높은 온도 균일성을 입증하여 간단한 스코어링과 두 개의 대형 단일 온도 챔버를 명확하게 선택할 수 있습니다. 이와 같은 이진 대형 챔버 설계를 사용하면 데이터의 노이즈를 줄일 수 있으며, 예를 들어 그래디언트 장치에서 곤충의 부수적 인 움직임은 그래디언트의 위치를 변경하여 인식 된 온도 선호도를 변경합니다.
여기에 설명 된 기술은 매우 간단하고 저렴합니다. 이 기술은 온도를 설정하기 위한 추가 기기(즉, 수조(10) 및/또는 핫 플레이트(11,12,13,14,15)를 필요로 하지 않으며, 절단된 아크릴 튜브 및 천공된 구멍 외에 전문 장비가 없으며, 카메라(18, 19) 또는 정교한 소프트웨어(19)가 없다. 분석을 위해. 다른 기술에 사용되는 이러한 구성 요소는 비용이 많이 들거나 실험을 시작하기 위해 상당한 전문 지식과 테스트가 필요할 수 있습니다.
이 기술은 외부 전원 공급 장치가없는 경우 배터리를 사용하는 다른 장치에서도 복제 할 수 있으므로 시스템은 현장에서 실험을 수행하는 데 이상적입니다. 또한 실험실이나 현장에서 밝은 습도 대 어두움, 높거나 낮은 습도 등과 같은 다른 이진 선택 선호 상황을 연구하기 위해 동일한 장치를 약간 수정할 수 있습니다.
프로토콜의 풀 사이즈 장치는 온도 구배 설정보다 훨씬 작기 때문에 위에서 설명한 대로 BSL 3 글로브박스 내부에 더 쉽게 장착할 수 있습니다. 또한, 곤충은 실험이 끝날 때 CO2 로 쓰러 질 수 있기 때문에 포함하기가 더 쉽고, 케이지는 다리에서 분리 된 후 신속하게 재 밀봉 될 수있다. 이러한 봉쇄 이점은 BSL 3 작업에 이상적입니다.
그러나 우리는 우리의 장치가 그라디언트를 따라 자유로운 선택이 아닌 이진 결정만을 허용한다는 것을 인정하며, 응용 분야에 따라 최적의 온도를 식별하기 위해 추가 실행이 필요할 수 있습니다.

유기체는 열 내성 범위 내에서만 살고 번식 할 수 있습니다. 계절의 변화와 지구 온난화로 인해 환경 온도가 변하기 때문에 종은 생존을 보장하기 위해 적응하고 그에 따라 대응해야합니다. 여기에는 체온이 환경과 평형을 이루는 외온선이 포함됩니다1. 따라서 각 곤충은2 이내로 유지하려는 최적의 환경 온도 범위를 가지고 있습니다.
온도는 곤충의 분포와 범위를 예측하는 데 사용되는 중요한 요소 중 하나입니다 3,4,5, 병원체-곤충 관계 관찰6,7 및 성체 수명, 번식력 및섭식 속도8,9와 같은 외온선의 적합성에 대한 외부 요인의 영향.
이전 연구에서는 다른 설정으로 외온선의 선호 온도를 조사했습니다. 가장 일반적인 것은 냉각 또는 가열 된 수조 (10), 얼음 욕조 및 프로그램 가능한 히터 요소 (11), 냉장 및 핫 플레이트 (12, 13), 열 조절기 플레이트 (14, 15), 또는 열 팩 및 얼음 팩(16)을 갖는 대형 알루미늄 블록을 사용하는 것입니다. 또한, 다른 연구에서는 온도 구배 인큐베이터를 사용하여 선택된 박테리아17의 성장을 연구하고 열전 장치 (끝에서 가열 및 냉각)에 알루미늄 막대를 장착하여 Drosophila melanogaster18,19의 열 선호도를 관찰했습니다.
그러나 여기에 제안 된 대체 방법론은 특정 곤충 응용 분야에 상당한 이점이 있습니다. 첫째, 다른 솔루션은 알루미늄 시트, 곤충을위한 아크릴 챔버 구성, 종종 카메라 설정 및 전문 소프트웨어를 포함한 기본 재료로 처음부터 완전한 구성이 필요합니다. 설정하는 데 비용과 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 둘째, 많은 대체 장치는 표면의 온도 구배에 의존합니다 (공기 온도와 반대). 결과적으로, 곤충이 연구되는 챔버는 종종 매우 좁아 (예 : 폭 2cm, 깊이1cm 16cm의 24cm 길이 구배), 이는 곤충의 정상적인 이동성에 필수적인 비행과 같은 자연적 행동을 방해 할 수 있으므로 선호하는 온도를 선택하는 데 필수적입니다. 일부 연구에서는 공기 온도를 측정합니다. 그러나, 선택의 채점은 여전히 케이지(20)에서 자유롭게 날아다니는 곤충과는 대조적으로 펠티에 요소에 착륙하는 모기의 수를 세는 것을 포함한다.
이 연구에서는 최소한으로 수정 된 표준 장비를 사용하고 표준 크기의 식민지 유지 관리 케이지에서 상대적으로 방해받지 않고 곤충에게 충분한 공간을 제공하는 더 간단한 설정을 설명합니다. 또한, 그래디언트에 의존하기보다는, 프로토콜은 일정한 내부 온도의 비교적 큰 두 개의 섹션을 이용하여, 선호하는 온도에서 곤충의 자연스러운 로밍 및 간단한 이진 스코어링을 허용한다. 따라서, 여기에 설명된 장치 및 프로토콜은 덜 방해적이고 보다 현실적인 환경에서 모기 온도 선호도를 연구하는 저비용 및 간단한 수단을 제공한다.
프로토콜은 실험 전에 곤충을 준비한 후 2 챔버 장치 설정을 포함합니다. 추가 단계는 온도 선택 및 결과 채점을 허용하기 위해 장치에 곤충을 배치하는 것을 포함한다. 이 방법의 설명을 위해 곤충의 최적 (표준 사육) 온도, Aedes aegypti의 경우 27 ° C, Drosophila melanogaster의 경우 25 ° C, 두 곤충 종의 경우 더 높은 반발 온도 인 30 ° C 및 28 ° C를 각각 선택했습니다. 곤충은 선호하는 챔버를 선택하기 위해 30 분이 주어집니다. 이 시간은 충분한 것으로 밝혀졌으며 더 긴 기간은 결과를 변경하지 않았습니다. 그러나 필요에 따라 종/온도/기타 변수에 따라 확장될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>아크릴 튜브 (브리지)</td> <td>Perspex</td><td>900 mm OD</td><td>크기 (길이 x 직경) : 8cm x 9cm; 인큐베이터 앞 구멍 크기보다 1cm 큽니다. 상단의 구멍 크기: 1.6 cm</td></tr><tr><td>이산화탄소 (CO2) 인플레이터</td><td>Peaken</td><td>B08HM2BDDB</td><td>어떤 CO2 pen도 작동합니다&nbsp;</td></tr><tr><td>디지털 인큐베이터 (&times; 2)</td><td>폭스바겐&nbsp;</td><td>VWR INCU-Line 1L 10 (390-0384)</td> <td>인큐베이터 앞 구멍 크기 : 직경 8cm. 구멍은 중앙에 위치해야 하며 브리지를 정렬할 수 있도록 두 인큐베이터에서 정확히 동일한 위치를 가져야 합니다. 이것은 표준 8cm '를 사용하여 미리 뚫어야 합니다. 홀쏘' 드릴 비트. 인큐베이터는 모기 케이지 하나를 수용할 수 있을 만큼 커야 합니다.</td></tr><tr><td>기계식 흡인기(모기용)&nbsp;</td><td>Watkins and Doncaster</td><td>E710</td><td>이상적인 배럴 크기: 50 x 28mm, 튜브 직경 9mm.</td></tr><tr><td>모기 케이지 (&times; 3; 실험용 2개, 곤충 보관용 1개)</td><td>BugDorm</td><td>BD4S1515</td><td>크기: 17.5cm x 17.5cm x 17.5cm, 12cm 소매 개구부. 메시 재질 : 니트 나일론</td></tr><tr><td>플라스틱 깔때기&nbsp;</td><td></td><td></td><td>개구부 지름 = 5 cm 깔때기의 길이 = 5 cm 구멍의 지름 = 1 cm</td></tr><tr><td>플라스틱 포켓 푸터 (드로소필라 또는 작은 곤충용)</td><td>Watkins and Doncaster</td><td>E714</td><td>수동/입 흡인&nbsp;</td></tr><tr><td>고무 밴드 또는 재사용 가능한 케이블 넥타이</td><td></td><td></td><td>선호도에 따라 둘 중 하나입니다.</td></tr><tr><td>온도 프로브</td><td>Eidyer</td><td>B07J4T1VQZ</td><td>최소 100cm의 좁은 와이어 프로브가 있는 모든 온도계</td></tr></tbody></table>

모기 및 기타 외온선의 온도 선호도 결정

Determining Temperature Preference of Mosquitoes and Other Ectotherms

대부분의 곤충 및 기타 외온선은 상대적으로 좁은 최적 온도 창을 가지며 최적으로부터의 편차는 다른 특성뿐만 아니라 적합성에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 결과적으로, 많은 이러한 외온선은 최적의 온도 범위를 찾습니다. 모기 및 기타 곤충의 온도 선호도가 잘 연구되었지만 전통적인 실험 설정은 고도로 밀폐 된 공간에서 알루미늄 표면의 온도 구배를 사용하여 수행됩니다. 경우에 따라 이 장비는 비행과 같은 많은 자연스러운 행동을 제한하며, 이는 선호도 선택에 중요할 수 있습니다.
이 연구의 목적은 비행을위한 충분한 공간이있는 2 챔버 장치를 사용하여 공기 온도에 대한 곤충 선호도를 관찰하는 것입니다. 두 개의 챔버는 각각 큰 조리개가 있는 독립적인 온도 제어 인큐베이터로 구성됩니다. 인큐베이터는 짧은 아크릴 브리지를 사용하여이 구멍으로 연결됩니다. 인큐베이터 내부에는 구멍과 다리를 통해 연결된 두 개의 그물 케이지가있어 곤충이 서로 다른 조건 사이를 자유롭게 날 수 있습니다. 아크릴 브리지는 또한 두 인큐베이터 사이의 온도 구배 역할을합니다.
케이지의 넓은 공간과 쉬운 구조로 인해이 방법은 감각 기관 조작,식이 요법, 장내 세균총 및 생물 안전 수준 1 또는 2 (BSL 1 또는 2)의 내 공생 존재를 포함하여 온도 선호도를 변경할 수있는 작은 외열 및 / 또는 조작을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한이 장치는 BSL 3에서 추가 격리 (예 : 생물 안전 캐비닛 내부)를 사용하여 병원체 감염 연구에 사용할 수 있습니다.

이 실험 설정의 효능과 효과를 테스트하기 위해 30 마리의 모기를 두 인큐베이터에서 동일한 온도로 4 번의 반복으로 테스트했습니다 (그림 3). 두 챔버 모두 모기 최적 온도를 27°C로 설정하였을 때, 챔버 선호도 간에 유의한 차이가 없었다(P=0.342; 윌콕슨 서명 순위 테스트). 그러나, 한 챔버가 매력적인 최적 온도인 27°C로 설정되고 다른 챔버가 30°C의 차선의 온도로 설정되었을 때, 모기는 그들의 최적에 대한 활성 선호도를 일관되게 입증하였다 (P=0.029; 윌콕슨 서명 순위 테스트; 27 °C 및 30 °C에 대해 각각 78.2 % 및 21.8 %의 평균값). 또한 다른 외열 모델과의 적용 가능성을 결정하기 위해 Drosophila를 사용하여 테스트했으며 유사한 결과가 관찰되었습니다.
케이지 내의 온도 균일성 도 4 는 2-챔버 장치의 온도 균일도를 나타낸다. 일단 조립되면, 양면을 27°C 및 30°C로 설정하고 여기에 주어진 지침에 따라 평형을 이루도록 하였다. 인큐베이터와 브리지의 모든 부분은 한쪽 모서리를 (일관되게) 제외하고 중심 온도의 0.4 ° C 이내입니다. 전면 하단 왼쪽 모서리(전면에서 볼 때)는 27°C 및 30°C 모두에서 일관된 핫스팟입니다. 이것은 인큐베이터 컨트롤의 전자 장치가 수행 된 조작이 아닌 인큐베이터의 해당 섹션 바로 아래에 있기 때문일 수 있습니다. 따라서 인큐베이터 모델에 따라 다를 수 있습니다. 이것은 인큐베이터에 대한 조작 및 추가가 온도 균일성에 최소한의 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 또한 다리 온도는 두 챔버 사이의 중간이어서 곤충이 날아 가야하는 온도 골짜기에 직면하지 않도록했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig01.jpg"> 그림 1 : 모기장에 대한 설명. 12cm 소매 구멍이있는 모기장 (17.5cm x 17.5cm x 17.5cm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig02.jpg"> 그림 2: 설정 중 장치의 사진 및 다이어그램. (A) 인큐베이터에 놓인 빈 곤충 케이지. (B) 덕트 테이프로 만든 개폐 가능한 덮개 (플랩)가있는 아크릴 튜브. (C) 회로도가 있는 설정의 측면도. 슬리브의 메쉬는 고무 밴드로 아크릴 튜브 주위를 조였습니다. 이러한 실험을 위해, 3-5일령, 교배된, 암컷 Ae. 이집트 모기가 사용되었다. (D) 설정을 완료합니다. 서로 마주 보는 두 개의 인큐베이터는 아크릴 튜브로 연결됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig03.jpg"> 그림 3 : 곤충의 온도 선호도. 2-챔버 장치는 지침에 따라 조립되었다. 곤충을 프로토콜에 따라 삽입하고 30분 동안 방치하여 선호하는 챔버(온도)를 선택한 다음 계수했습니다. 검은색 점은 개별 반복실험을 나타내고 파란색은 평균을 나타냅니다. (a) 두 배양기 모두 Ae의 온도 선호도와 동일한 온도(27°C)로 설정하였다. (B) 인큐베이터는 Ae의 온도 선호도와 다른 온도 (27 ° C 대 30 ° C)로 설정되었습니다 . 이집트가 관찰되었다. (C) 인큐베이터는 다른 온도 (25 ° C 대 28 ° C)로 설정되었으며 D. melanogaster 의 온도 선호도가 관찰되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig04v2.jpg"> 그림 4: 챔버와 브리지 내의 온도 균일성. 설명된 대로 2개의 인큐베이터, 2개의 케이지 및 브리지가 지침에 따라 조립되었습니다. 온도는 두 인큐베이터 모두에서 27°C, 중앙에서 30°C로 조정하였다. 온도 프로브를 사용하여 케이지 중앙, 인큐베이터의 8 개 모서리 및 브리지 내부의 온도를 측정했습니다. 측정된 온도는 여기에 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig04largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

곤충은 내부에 머물기를 원하는 최적의 환경 온도 범위를 가지고 있으며 많은 외부 및 내부 요인이 이러한 선호도를 변경할 수 있습니다. 여기에서는 곤충이 자연스러운 행동을 자유롭게 나타낼 수 있도록 온도 선택을 연구하는 비용 효율적이고 간단한 방법을 설명합니다.

Most insects and other ectotherms have a relatively narrow optimal temperature window, and deviation from their optima can have significant effects on ...

이 두 챔버 장치 설정은 곤충의 온도 선호도를 연구하는 데 사용되며 밝은 습도 대 어두운 습도 또는 높은 습도 대 낮은 습도와 같은 다른 이진 선택 선호도 상황을 연구하도록 수정할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 간단한 설정, 곤충이 선호하는 온도를 선택할 때 비행 특성을 나타낼 수있는 넓은 공간, 외부 장비없이 쉽게 채점 할 수 있다는 것입니다. 프로토콜의 가장 어려운 부분은 실험 후 아크릴 위반을 제거하는 것입니다.곤충이 탈출 할 확률이 높기 때문입니다. 따라서 곤충을 마취하기 위해 이산화탄소를 사용하는 것이 중요합니다. 이 절차를 시연하는 것은 Kinga Stobierska와 Lorna Glenn, 둘 다 내 실험실의 마스터 학생입니다.시작하려면 12cm 슬리브 개구부가있는 2 개의 빈 모기장을 준비하고 구멍이나 기타 손상이 없는지 확인하십시오. 그런 다음 기계식 흡인기를 사용하여 실험 후 쉽게 취급하고 폐기 할 수 있도록 30 마리의 곤충을 별도의 케이지로 옮깁니다. 인큐베이터를 원하는 온도로 설정하고 가열하고 안정화되도록하십시오.섭씨 25도에서 30도 사이의 온도에 도달하는 데 약 30 분이 걸립니다. 그런 다음 빈 모기장을 인큐베이터에 넣고 인큐베이터의 전면 구멍을 통해 케이지의 슬리브를 공급하십시오. 온도 프로브로 인큐베이터의 내부 공기 온도를 확인하십시오.다음으로 덕트 테이프로 준비된 개방형 플랩을 아크릴 튜브의 구멍 위에 놓습니다. 첫 번째 인큐베이터 앞의 구멍을 통해 튀어 나온 슬리브를 감아 아크릴 튜브의 한쪽 끝에 탄성 밴드로 고정하십시오. 그런 다음 인큐베이터를 서로 마주 보게하고 아크릴 튜브의 한쪽 끝을 두 번째 인큐베이터 구멍의 슬리브에 삽입하십시오.아크릴 튜브의 직경이 인큐베이터 앞면의 구멍보다 커서 구멍을 완전히 덮도록하십시오. 아크릴 튜브가 느슨하지 않고 인큐베이터 사이에 매달려 있지 않은지 확인하십시오. 그렇다면 케이지 슬리브를 당겨 케이지와 고무 밴드 사이의 과도한 재료를 제거하십시오.모기를 안에 넣으려면 덕트 테이프 플랩을여십시오. 아크릴 튜브의 구멍에 깔때기를 놓은 다음 깔때기를 통해 곤충을 튜브에 비우십시오. 곤충을 비운 후 깔때기를 제거하고 덕트 테이프 플랩으로 튜브 구멍을 덮으십시오.곤충이 선호하는 방을 선택할 수 있도록 30 분 동안 그대로 두십시오. 정착 시간이 끝나면 아크릴 튜브 브리지에서 보이는 곤충의 수를 육안으로 관찰하고 기록하십시오. 그런 다음 다리의 모든 곤충을 인큐베이터의 양쪽으로 두드리거나 날려 버리거나 다리로 이산화탄소를 방출하십시오.그런 다음 양쪽의 아크릴 튜브에서 슬리브를 꼬집고 닫으려면 매듭으로 빠르게 고정하십시오. 그런 다음 두 인큐베이터에서 새장을 제거하고 각 새장의 곤충을 시각적으로 세십시오. 인큐베이터와 브리지의 숫자가 모두 30이되는지 확인하십시오.본 연구에서는 모기와 초파리의 온도 선호도를 2-챔버 모델을 사용하여 결정하였다. 결과는 두 케이지가 섭씨 27도에서 유지되었을 때 큰 차이가 없었으며, 이는 모기가 자연스러운 행동을 보이는 케이지 중에서 자유롭게 선택할 수 있음을 나타냅니다. 반대로, 두 개의 챔버가 서로 다른 온도로 설정되었을 때 모기는 섭씨 30도 이상 섭씨 27도의 최적 온도를 일관되게 선택했습니다.유사하게, 초파리 멜라노가스터(Drosophila Melanogaster)로 설정을 테스트했을 때, 초파리의 또 다른 외배엽 모델은 더 따뜻한 챔버를 피하고 섭씨 25도의 최적 온도를 선호했습니다. 곤충이 2개의 챔버 중에서 자유롭게 선택할 수 있도록 은폐 공간과 비행 영역을 방해하는 메쉬 없이 설정이 완전히 밀봉되었는지 확인하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

초파리 초파리는 작은 온도 변화를 구별할 수 있으므로 열 조건이 유리한 환경을 선택할 수 있습니다. 이 비디오는 선형 열 구배에서 초파리 유충의 온도 선호도를 테스트하는 행동 분석에 대해 설명합니다.

온도 구배 분석: 초파리 유충의 온도 선호도를 테스트하는 방법

출처: Liu, X. 외. 항생제 처리된 모기를 이용한 박테리아 경구 먹이 검사. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 항생제 함유 자당 용액을 사용해 모기에서 토종 장내 미생물군이 고갈되는 과정을 보여줍니다. 이후 막 영양 시스템을 통해 박테리아 현탁물을 투여하여 모기 장 내에 정의된 박테리아 집단을 확립하는 통제된 재정착이 이루어집니다.

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열 제한은 급속한 기후 변화에 직면하여 중요한 정보인 유기체가 견딜 수 있는 환경을 예측할 수 있습니다. 여기에 설명된 곤충의 중요한 열 미니마 및 열 녹다운 시간을 평가하는 고처리량 프로토콜이 있습니다. 두 프로토콜 모두 처리량을 최대화하고 분석 비용을 최소화합니다.

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생활사 선택 탐색: 날파리 유충과 암컷 선호도에 대한 상호 작용 요인으로 온도 및 기질 유형 사용

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Drosophila Activity Monitor 시스템을 사용한 열 내성 분석: 데이터 분석을 위한 실행 가능한 응용 프로그램 가이드

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모기 및 기타 외온선의 온도 선호도 결정

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