small extracellular vesicle의 High-throughput Isolation and Purification (고처리량 분리 및 정제를 위한 유세포 분석 분류 파라미터 최적화)
2023년 1월 20일
이 프로토콜은 공기 분무 노즐의 크기, 시스 유체 압력, 샘플 흐름 압력, 전압, 이득 및 트리거링 임계값 매개변수를 최적화하여 작은 세포외 소포에 대한 신속하고 크기별 분리 방법을 제공합니다.
이 프로토콜은 유세포 분석 분류 매개변수를 최적화하여 작은 세포외 소포에 대한 신속하고 크기별 솔루션 방법을 제공합니다. 이러한 최적화는 순방향 산란 대 크기 산란만을 사용하여 작은 세포외 소포의 대표 개체군을 얻을 수 있는 중요한 정렬 설정 패널을 제공합니다. 플로우 셀 분류기의 표준 시작 절차를 수행하여 시작합니다.
시작 버튼을 눌러 기기를 켠 다음 레이저 제어판에서 레이저 전원 버튼을 클릭합니다. Smart Sampler 하위 메뉴의 탱크 변경 버튼을 눌러 유체 장치에 압력을 가합니다. 초음파로 세척된 50마이크로미터 제트 및 에어 노즐을 사용하여 노즐 어셈블리에 설치합니다.
압력 콘솔에서 시스 유체의 경우 압력을 80SI, 샘플 흐름의 경우 80.3SI로 조정합니다. 피복 흐름 시작 버튼을 눌러 피복 스트림 흐름을 시작합니다. Smart Sampler 하위 메뉴에서 거품 버튼을 클릭하여 10분 동안 자동으로 거품을 제거한 다음 끕니다.
스트림을 정렬하고 레이저 스폿을 결정하려면 조명 챔버 조명을 켜서 view 핀홀 위의 스트림. 위아래, 왼쪽과 오른쪽, 앞뒤 마이크로미터를 조정하여 스트림을 핀홀의 중앙에 놓고 스트림의 초점을 맞춥니다. 모든 레이저 셔터를 열고 레이저 및 스트림 인터셉트 탭을 선택한 다음 프롬프트에 따라 녹색 화살표 버튼을 계속 눌러 레이저 인터셉트 및 노즐 정렬 보정 프로세스를 완료합니다.
미세 레이저 정렬 화면에 액세스합니다. 640 나노미터 레이저 및 772 bar 44 대역 통과 채널을 x축 매개변수로 선택하고 405 나노미터 레이저 및 448 bar 59 대역 통과 채널을 y축 매개변수로 선택합니다. 트리거 매개변수 선택기를 누르고 488나노미터 레이저의 전방 산란 매개변수를 선택합니다.
다음으로, 이중 증류수 1밀리리터에 1방울을 첨가하여 무지개 형광 입자를 10 내지 6번째 비드의 최종 농도로 희석한다. 샘플 챔버 도어를 열고 준비된 무지개 형광 입자 튜브를 로드합니다. 샘플 시작 버튼을 누르고 마이크로미터를 위아래로 조정하여 형광 강도를 최적화하여 각 신호를 최대한 강렬하게 만듭니다.
터치스크린 제어판의 품질 관리 시작 또는 QC 버튼을 눌러 QC를 자동으로 수행합니다. 그런 다음 IntelliSort 초기화 단추를 누릅니다. 기기는 액적 진동의 주파수와 진폭을 자동으로 조정하여 약 25의 낙하 지연을 얻고 낙하의 브레이크 오프 포인트를 명확하게 시각화할 수 있습니다.
그런 다음 드롭 지연 버튼과 유지 버튼을 누릅니다. 정렬 출력 유형으로 튜브를 선택합니다. 분류 챔버에 15밀리리터 튜브 홀더를 놓습니다.
플레이트 전압을 켜고 플레이트 전압을 약 4, 000 볼트로 설정하십시오. 그런 다음 스트림 설정 단추를 선택하여 테스트 패턴을 켭니다. 충전 위상 슬라이더와 편향 슬라이더를 조정하여 스트림의 이미지가 수집 튜브와 일치하는지 확인합니다.
그런 다음 확인 표시 단추를 선택합니다. 컴퓨터에서 Summit 워크스테이션에 로그인합니다. 파일 주 메뉴에서 새 프로토콜을 만듭니다.
그런 다음 Summit Software 제어판에서 히스토그램 탭을 선택하여 점도표를 만듭니다. 전방 산란을 x축 파라미터로 선택하고 측면 산란을 y축 파라미터로 선택합니다. 그런 다음 작업 공간에서 새 점도표의 축을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 전방 산란과 측면 산란을 로그 형식으로 표시합니다.
획득 탭을 선택하고 획득 매개변수 패널을 찾습니다. 활성화 매개변수의 하위 메뉴에서 모든 신호를 활성화합니다. 전방 산란을 트리거 파라미터로 선택하고 임계값을 0.01로 설정합니다.
전방 산란과 측면 산란의 전압과 이득을 250과 0.6으로 조정하여 전방 산란도 대 측면 산점도 내의 이벤트와 모집단이 분리되도록 합니다. 형광 폴리스티렌 마이크로스피어를 100, 200 및 300 나노미터 현탁액으로 희석하여 1밀리리터의 마이크로스피어를 1밀리리터의 이중 증류수에 첨가합니다. 그런 다음 마이크로스피어 서스펜션을 연속적으로 로드합니다.
Summit Software의 획득 메뉴에서 시작을 선택하여 20, 000개의 이벤트를 기록한 다음 이벤트를 기록한 후 중지를 클릭합니다. 전방 산scatter 대 side scatter 도트 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 직사각형을 만들고 드래그하여 크기를 조정합니다. 전자 노이즈 영역과 100나노미터 마이크로스피어 모집단의 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 각각 R7 및 R4로 이름을 바꿉니다.
이 단계를 반복하여 200 나노미터 및 300나노미터 마이크로스피어를 직사각형으로 연속적으로 구성하고 각각 R5 및 R6으로 이름을 바꿉니다. 마지막으로, 전자 노이즈를 기준으로 50 내지 200 나노미터 분류 영역을 결정하고 200 나노미터 입자의 위치를 R8로 정의한다. 정렬 로직 및 통계 패널에서 왼쪽 스트림 또는 L1 스트림의 빈 필드를 두 번 클릭하고 R8이라는 영역을 선택하여 정렬 로직을 생성하여 정렬 결정을 편집합니다. 순도의 중단 모드를 선택하고 L1 스트림에 대해 한 방울 이상의 액적 엔벨로프를 선택합니다.
로드 500 마이크로리터amp이전에 준비된 세포외 소포 또는 EV 혼합물의 파일. Summit의 수집 메뉴 아래에 있는 Start(시작) 버튼을 눌러 데이터를 수집한 다음 Stop(중지)을 클릭합니다. 그런 다음 정렬 메뉴에서 시작을 눌러 50-200 나노 미터 크기의 작은 세포 외 소포 또는 sEV를 15 밀리리터 원심 분리기 튜브에 수집합니다.
전방 산란 대 측면 산란 플롯에서 50-200 나노미터 크기 범위를 찾기 위한 표준 크기의 폴리스티렌 마이크로스피어의 유세포 분석을 통해 구별 가능한 입자 신호를 나타냈습니다. R4, R5 및 R6은 각각 100, 200 및 300 나노미터 입자의 위치를 나타냅니다. R7은 50 나노미터 입자에 대한 검출 한계로서의 전자 노이즈이고 R8은 50 내지 200 나노미터 입자의 위치 범위를 나타낸다.
나노입자 추적 분석(NTA)에 의해 췌장 한 세포로부터 유래된 EVs 혼합물의 입자 크기 분포는 초원심분리 후 40 내지 400 나노미터의 넓은 범위로 나타났다. R8 영역 내에서 50 내지 200 나노미터 sEV를 분리 및 정제하기 위해 유세포 분석 분류를 수행하였다. 분리의 품질은 NTA에 의해 검증되었으며, 분류 후 sEV의 입자 크기 범위는 50 내지 200 나노 미터 사이 인 것으로 밝혀졌다.
sEV의 존재는 TEM에 의해 추가로 관찰되었고, 분리된 sEV는 웨스턴 블롯 분석에 의해 CD6, CD63 및 CD81의 마커를 함유하는 것으로 확인되었습니다. 이 방법을 사용하면 작은 세포외 소포체의 분리와 작은 세포외 소포체 유전자 발현의 분류 또는 프로 분석을 통해 수많은 다운스트림 연구 응용 분야를 열 수 있습니다.
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개요
이 프로토콜은 유체 세포 분류 정렬 매개변수를 최적화하여 작은 세포외 소포에 대한 신속하고 크기별 해결 방법을 제공합니다. 이러한 최적화를 통해 전진 산란 대 크기 산란을 사용하여 작은 세포외 소포의 대표적인 집단을 획득할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 영역
- 신경과학
- 세포 생물학
- 세포외 소포
배경
- 작은 세포외 소포는 세포 간 통신에 중요한 역할을 합니다.
- 분리 방법은 그 기능을 연구하는 데 필수적입니다.
- 유체 세포 분류는 이러한 소포를 분류하는 강력한 도구입니다.
- 분류 매개변수를 최적화하면 분리된 샘플의 품질을 향상시킬 수 있습니다.
연구 목적
- 작은 세포외 소포의 신속한 분리 방법을 개발합니다.
- 유효한 분류를 위한 유체 세포 분류 매개변수를 최적화합니다.
- 대표적인 소포 집단의 수집을 보장합니다.
사용된 방법
- 유체 세포 분류기의 표준 시작 절차.
- 레이저 출력 및 유체 압력의 최적화.
- 초음파로 세척한 50 마이크로미터 제트 및 공기 노즐의 사용.
- 전진 산란 대 크기 산란을 기반으로 한 분류.
주요 결과
- 작은 세포외 소포의 성공적인 분리.
- 유체 세포 분류를 위한 중요한 분류 설정의 확립.
- 얻은 대표적인 집단의 시연.
- 분류 과정의 효율성 향상.
결론
- 최적화된 프로토콜은 작은 세포외 소포의 분리를 향상시킵니다.
- 유체 세포 분류는 이러한 목적을 위해 효과적으로 사용할 수 있습니다.
- 미래 연구는 이러한 최적화된 매개변수를 기반으로 할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
High-throughput, size-specific isolation of small extracellular vesicles (sEVs) is critical for enabling robust biomarker discovery and mechanistic studies in biopharma R&D. The lack of standardized sEV isolation methods has historically limited translational research and downstream assay development. Optimized flow cytometric sorting parameters now provide a reproducible, scalable solution for generating high-purity sEV populations, supporting portfolio-wide biomarker and drug intervention pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of sEV-mediated signaling pathways for target validation.
- Supports biological de-risking by isolating vesicles with defined size and marker profiles.
- Facilitates predictive confidence in functional studies by reducing sample heterogeneity.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, high-purity sEV preparations for downstream assay workflows.
- Improves assay reproducibility and quantitative output by minimizing background noise.
- Enables scalable, high-throughput screening of sEV-associated biomarkers.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sEV isolation with disease-relevant biomarker discovery and validation.
- Ensures continuity from discovery through preclinical evaluation of vesicle-based signatures.
- Reduces risk of confounding variables in translational studies by ensuring sample consistency.
Pipeline & Workflow Integration
This optimized flow cytometric sorting method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting both early target validation and downstream translational research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by isolating vesicles with defined characteristics.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative sEV samples for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides robust size and marker-based readouts for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical continuity by standardizing sEV isolation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable platform for sEV isolation across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in sEV research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable sEV isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling reliable biomarker studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of vesicle-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and vesicle biology for optimal parameter selection.
- Demands access to high-sensitivity flow cytometers and analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of gating and sorting protocols.
- May require adaptation of settings for different cell sources or vesicle populations.
- Practical limitations include instrument sensitivity and potential overlap with electronic noise at lower size thresholds.
