Name: small extracellular vesicle의 High-throughput Isolation and Purification (고처리량 분리 및 정제를 위한 유세포 분석 분류 파라미터 최적화) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 배우세요 flow cytometry 분류 매개변수를 최적화하여 small extracellular vesicle을 고속으로 분리하고 정제하는 방법을. 이 기술은 세포 간 소통 연구에 필수적인 대표적인 소포 집단을 획득할 수 있습니다.

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이 작업은 절강 중의과 대학 과학 연구 기금 (2020ZG29), 절강 성 기본 공공 복지 연구 프로젝트 (LGF19H150006, LTGY23B070001), 절강 성 교육부 프로젝트 (Y202147028) 및 절강 대학 실험실 부서의 실험 기술 프로젝트 (SJS201712, SYB202130).

1. 세포 배양
<ol><li>10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)의 배양 배지를 준비합니다. 인간 췌장암 세포인 PANC-1을 75cm2 배양 플라스크에서 1 x 106 cells/mL의 밀도로 배양합니다. 배양물을 5%CO2와 함께 37°C에서 배양한다.</li>
	<li>세포 밀도가 현미경 관찰에서 75%-80%에 도달할 때 세포를 계대 배양합니다. 배지를 제거하고, 3-5 mL의 인산염 완충 식염수(PBS; 0.01 M, pH 7.2-7.4)로 2x 헹굽니다.</li>
	<li>용액을 버리고 1-2mL의 트립신-EDTA 용액을 추가하고 현미경으로 배지에 둥글게 될 때까지 세포가 분리되도록 합니다. 신선한 배지를 추가하고, 흡인하고, 15 mL 배양 배지와 함께 75cm2 배양 플라스크에 분산시킨다. 1:2에서 1:4의 하위 재배 비율을 사용합니다(권장). 알림: 모든 작업은 세포 오염을 방지하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다.</li>
</ol>2. 배양 배지 수집
<ol><li>세포를 5%CO2와 함께 37°C에서 48시간 동안 인큐베이션한다. 세포 상층액(90mL)을 2개의 50mL 원심분리기 튜브에 수집하고 4°C에서 10분 동안 300x g 로 원심분리합니다.</li>
	<li>상청액을 새로운 멸균 튜브로 옮기고 4°C에서 2,000 x g에서 20분, 10 x g에서 30분, 12,000 x g에서 70분 동안 연속적으로 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 제거하고 부드럽게 피펫팅하여 10mL의 PBS로 펠릿을 헹굽니다. 다시 4°C에서 70분 동안 12,000 x g 에서 원심분리하고, 펠렛을 10 mL의 PBS 완충액에 재현탁하여 EVs의 혼합물을 얻었다.</li>
	<li>나노 입자 추적 분석(NTA)을 수행하여 EV 혼합물을 정량화하고 크기를 측정합니다. 기기 작동 참조 매뉴얼 및 참조21에 따라 NTA 분석을 수행합니다.</li>
</ol>3. 세포 분류
<ol><li>플로우 셀 분류기의 표준 시작 절차를 수행합니다. 시작 버튼을 눌러 기기를 켭니다. 레이저 제어판에서 Laser Power 버튼을 클릭합니다. Smart sampler 하위 메뉴의 Change Tanks 버튼을 눌러 유체 장치에 압력을 가합니다. 알림: 시작하기 전에 폐기물 탱크가 비어 있고 피복 탱크가 가득 찼는지 확인하십시오.</li>
	<li>초음파로 세척된 50μm 제트 인 에어 노즐을 사용하여 노즐 어셈블리에 설치합니다. 압력을 시스 유체의 경우 80psi로, s의 경우 80.3psi로 조정합니다.amp압력 콘솔의 흐름.</li>
	<li>피복 흐름 시작(Start Sheath Flow) 버튼을 눌러 피복 스트림 흐름을 시작합니다. 스마트 샘플러 하위 메뉴에서 버블 버튼을 클릭하여 10분 동안 자동으로 버블을 제거한 다음 끕니다. 알림: 세포 분류의 경우 다양한 크기의 공기 분무 노즐은 액체 흐름 안정성을 유지하기 위해 서로 다른 피복 유체 압력이 필요합니다. 이 방법에서는 50μm의 노즐을 사용했으며 80psi 이상의 시스 유체 압력에서만 안정적인 측류를 생성할 수 있었습니다. 시료 흐름과 시스 유체 사이의 압력 차이는 분류의 로딩 속도를 결정합니다. 방법의 설정 조건(샘플 흐름과 시스 유체 사이의 압력 차이는 0.3-0.6psi)에서 액체 흐름은 비교적 안정적이었고 로딩 속도로 분류 효율이 0.3-0.6psi 미만의 압력 차이에 대해 50%에서 80%로 증가했습니다.</li>
	<li>스트림을 정렬하고 레이저 스폿을 결정합니다. 조명 챔버 조명을 켜서 view 핀홀 위의 스트림. 위아래, 왼쪽, 오른쪽, 앞뒤 마이크로미터를 조정하여 스트림을 핀홀의 중앙에 배치하고 스트림의 초점을 맞춥니다.</li>
	<li>Laser and Stream Intercept(레이저 및 스트림 인터셉트) 탭을 선택합니다. 프롬프트에 따라 녹색 화살표 버튼을 계속 눌러 레이저 인터셉트 및 노즐 정렬 보정 프로세스를 완료합니다.</li>
	<li>미세 레이저 정렬 화면에 액세스합니다. X축 매개변수로 640-722/44( H) 채널을 선택하고 Y축 매개변수로 405-448/59(H) 채널을 선택합니다. 트리거 매개변수 선택기 를 누르고 488nm 레이저의 SSC 매개변수를 선택합니다. 모든 레이저 셔터를 엽니다. 알림: 선택한 X축 및 Y축 매개변수는 시스템의 레이저 구성에 따라 다릅니다. 시스템에 640nm 또는 405nm 레이저가 없는 경우 다른 매개변수가 허용됩니다. 최상의 결과를 얻으려면 핀홀 스트립에서 공간 분리가 가장 큰 레이저를 선택하십시오(355nm 레이저 제외).</li>
	<li>이중 증류수 1mL에 1방울을 넣어 최종 농도가 1 x 10mL당 6 비드가 되도록 무지개 형광 입자를 희석합니다. 샘플 챔버의 도어를 열고 준비된 무지개 형광 입자의 튜브를 로드합니다.</li>
	<li>샘플 시작 버튼을 누릅니다. 상하 마이크로미터를 조정하여 형광 강도를 최적화하여 각 신호를 최대한 강렬하게 만듭니다. 터치스크린 제어판의 품질 관리(QC) 시작 버튼을 누르면 자동으로 QC가 수행됩니다.</li>
	<li>드롭 지연을 수행합니다. 정렬 설정 화면에 액세스하여 드롭 지연 버튼을 선택합니다. IntelliSort 초기화 단추를 누릅니다. 계기는 자동적으로 25 ± 5의 하락 지연을 얻고 하락의 끊는 점을 명확하게 가시화할 수 있기 위하여 진동의 빈도 그리고 진폭을 조정합니다. 유지 관리 버튼을 누릅니다.</li>
	<li>정렬 출력 유형으로 튜브를 선택합니다. 분류 챔버에 15mL 튜브 홀더를 놓습니다. 플레이트 볼륨을 켭니다tage ON하고 플레이트 voltage를 약 4000V로 설정합니다.</li>
	<li>스트림 설정 단추를 선택하여 테스트 패턴을 켭니다. 충전 위상 슬라이더와 편향 슬라이더를 조정하여 스트림의 이미지가 수집 튜브와 정렬되도록 합니다. 확인 표시 단추를 선택합니다.</li>
	<li>컴퓨터에서 Summit 워크스테이션에 로그인합니다. 파일 주 메뉴에서 새 프로토콜을 만듭니다. Summit 소프트웨어 제어판에서 히스토그램 탭을 선택하여 점도표를 만듭니다.</li>
	<li>작업 공간에서 새 도트 플롯의 좌표축을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 X축 매개변수로 FSC 를 선택하고 Y축 매개변수로 SSC 를 선택합니다. FSC와 SSC를 로그 형식으로 표시합니다.</li>
	<li>획득 탭을 선택하고 획득 매개변수 패널을 찾습니다. 활성화 매개변수의 하위 메뉴에서 모든 신호를 활성화합니다. 트리거 매개변수로 FSC를 선택하고 임계값을 0.01로 설정합니다. FSC 및 SSC의 전압과 이득을 250 및 0.6으로 조정하여 FSC 대 SSC 플롯 내의 이벤트와 모집단이 분리되도록 합니다. 참고: 임계값 설정은 유세포 분석으로 감지할 수 있는 입자 크기를 설정하는 것과 동일합니다. 임계값이 클수록 감지된 입자가 커지고 작은 입자는 임계값에 의해 차단되어 감지할 수 없습니다. 이 방법에서는 임계값이 0.01로 설정되므로 전자 노이즈보다 큰 모든 입자를 감지할 수 있습니다.</li>
</ol>4. sEV의 격리
<ol><li>형광 폴리스티렌 마이크로스피어를 100nm, 200nm 및 300nm의 현탁액으로 희석합니다. 1 μL의 마이크로스피어를 1 mL의 이중 증류수에 넣는다.</li>
	<li>마이크로스피어 서스펜션을 연속적으로 로드합니다. summit 소프트웨어의 획득 메뉴에서 시작을 선택하고 20,000개의 이벤트를 기록합니다. 참고: 이벤트 수는 선택 사항입니다. 통계적 유의성을 충족하기 위해 5,000개 이상의 이벤트가 권장됩니다.</li>
	<li>FSC 대 SSC 도트 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 직사각형을 만들고 드래그하여 전자 노이즈 영역과 100nm 마이크로스피어 모집단의 크기와 위치를 변경합니다. 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 각각 R7 및 R4로 이름을 바꿉니다. 위의 단계를 반복하여 200nm 및 300nm 마이크로스피어를 직사각형으로 연속적으로 구성하고 각각 R5 및 R6으로 이름을 바꿉니다.</li>
	<li>마지막으로, 전자 노이즈와 R8로 정의된 200nm 입자의 위치를 기반으로 50-200nm 분류 영역을 결정합니다. 알림: 50nm의 검출 하한은 플로우 셀 분류기의 전자 노이즈 바로 위에 있습니다. 따라서 노이즈와 200nm 마이크로스피어 집단 사이의 영역은 50-200nm 사이로 정의할 수 있습니다.</li>
	<li>정렬 논리 및 통계 패널에서 정렬 결정을 편집합니다. 왼쪽 스트림(L1)의 빈 필드를 두 번 클릭합니다. R8 이라는 영역을 선택하여 정렬 논리를 만듭니다. 순도의 중단 모드를 선택하고 L1 스트림에 대해 1방울의 드롭릿 엔벨로프를 선택합니다.</li>
	<li>500μL 로드 samp2.3단계의 EV 혼합물. Summit의 수집 메뉴 아래에 있는 시작 버튼을 눌러 데이터를 수집한 다음 정렬 메뉴에서 시작을 눌러 50-200nm sEV를 15mL 원심분리기 튜브에 수집합니다. 알림: 모든 절차 중 오염을 최소화하려면 무균 환경이 필요합니다.</li>
	<li>투과전자현미경(TEM)으로 sEV의 존재를 관찰하고 NTA를 이용하여 sEV의 입자 크기를 검증합니다. CD9, CD63 및 CD81 마커18의 발현을 추가로 확인하기 위해 웨스턴 블롯 (WB) 분석을 수행한다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 NTA에서 검증한 플로우 셀 분류기를 사용하여 지정된 입자 크기 50-200nm로 sEV를 분리하고 정제하는 최적화된 방법을 설명합니다. 이 방법은 균일한 입자 크기와 고순도의 sEV를 얻는 병목 문제를 해결하여 대형 EV에 싸인 관련 없는 생물학적 분자의 간섭을 피했습니다(22). 초당 100,000개의 입자를 포획하고 초당 70,000개의 분류 결정을 내릴 수 있는 유세포 분석을 통해 빠르고 높은 처리량의 분석이 가능하여17 시간을 크게 단축하고 sEV 입자의 이질성을 반영할 수 있습니다. 또한, 이 유세포 분석 기반 프로토콜은 특정 크기의 EV 하위 집단에 대한 개별 관심사에 따라 맞춤화할 수 있습니다. 대체 게이트 범위를 사용하여 공기 분무 노즐, 시스 유체 압력, 시료 흐름 압력 및 트리거 임계값 매개변수와 같이 위와 동일한 기기 파라미터를 설정하여 관심 모집단을 식별하고 분리할 수 있습니다. 
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세포는 다양한 크기의 세포외 소포체(EV)를 방출하여 세포간 통신에 중요한 신호 분자와 막 내포물을 생성합니다1. 다양한 크기의 EV는 또한 50-200nm sEV가 RNA, DNA 및 단백질을 올바른 세포외 위치에 정확하게 분배할 수 있는 다양한 생물학적 역할을 합니다. sEV는 또한 면역 감시, 줄기 세포 유지, 혈액 응고 및 조직 복구와 같은 정상적인 생리적 과정의 조절뿐만 아니라 종양 진행 및 전이와 같은 여러 질병의 기저에 있는 병리를 포함하는 분비 메커니즘을 결정하는 데 도움이 됩니다 2,3. sEV의 효과적인 분리 및 분석은 바이오마커를 식별하고 향후 약물 개입을 설계하는 데 중요합니다.
sEV의 임상 적용에 대한 지속적인 연구로 sEV의 격리 방법은 더 높은 요구 사항을 제시했습니다. 크기, 출처 및 함량이 sEV의 이질성과 물리화학적 및 생화학적 특성에서 다른 EV와의 유사성으로 인해 sEV 분리를 위한 표준 방법이 없습니다 4,5. 현재, 초원심분리, 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 폴리머 침전, 면역친화성 포획이 가장 일반적인 sEV 분리 방법이다6. 초원심분리는 시간이 많이 소요됨에도 불구하고 연구에서 sEV 분리의 황금 표준으로 여전히 40-500nm의 넓은 크기 분포로 순도가 낮고 장기간 원심분리후 sEV에 상당한 기계적 손상을 입힙니다 7,8,9. 일반적으로 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 사용하는 고분자 침전은 세포 외 단백질 응집체 및 고분자 오염의 수반되는 침전과 함께 후속 기능 분석에 대해 허용 할 수없는 순도로 어려움을 겪습니다10,11. 면역친화성 포획 기반 방법은 다양한 특이성을 갖는 고가의 항체를 필요로 할 뿐만 아니라 낮은 처리 부피 및 수율12,13,14에 문제가 있습니다. 입자 크기는 분리된 sEV의 순도를 평가하는 주요 지표 중 하나입니다. sEV 순도는 달성할 수 없는 목표로 남아 있지만 SEC는 상당한 양의 중간 성분을 제거하며 SEC 방법으로 추출된 sEV 입자는 주로 50-200nm범위에 있습니다 15. 기존 기술은 시간 소모적이고, 순도가 낮고, 수율이 낮고, 재현성이 낮고, 시료 처리량이 낮고, sEV의 잠재적 손상이 있어 임상적 활용과 양립할 수 없는 몇 가지 단점이 있다16. 따라서 다양한 생체 유체에 적용할 수 있는 빠르고 저렴하며 크기가 지정된 sEV 분리 방법은 여러 연구 및 임상 상황에서 필수적인 요구 사항입니다.
유세포 분석에서, 단일 입자는 높은 처리량, 다중모수 방식으로 분석되고, 부분집합은 분류된다17. EV의 이질성으로 인해, 단일 입자 유세포 측정이 이상적일 것이며, 이는 세포 분석의 패러다임에 따라 EV를 조사하는 데 사용되어 왔으며, 광 산란 및 형광 표지는 생리학 관련 특징 및 단백질 성분을 식별하는 데 사용됩니다18,19,20. 그럼에도 불구하고 기존의 유세포 분석은 sEV의 크기가 작고 표면 바이오마커가 적기 때문에 어려움을 겪고 있습니다. 유세포 분석의 감도는 전방 산란(FSC), 측면 산란(SSC) 또는 형광 임계값 트리거 파라미터19를 사용하는 것과 관계없이 배경 잡음과 sEV를 구별하기 위해 검출 파라미터를 최적화함으로써 향상될 수 있습니다.
현재 프로토콜에서는 형광 비드를 표준으로 사용하여 고분해능 유세포 분석 정렬 설정을 최적화했습니다. 적절한 노즐 크기, 피복액 압력, 임계값 트리거링 매개변수 및 산란광 강도를 제어하는 전압을 선택하여 복잡한 혼합물에서 sEV의 특정 하위 집합을 분리할 수 있었습니다.

<table><tbody><tr><td>원심분리기 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>문화 플라스크</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>430641</tr><tr><td>둘베코' s modified eagle medium</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>SUER</td><td>SUER050QY</td><td></td></tr><tr><td>플로우 셀 분류기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Moflo Astrios EQ</td><td></td></tr><tr><td>인간 췌장암 세포, PANC-1</td><td>NA</td><td>NA</td><td>PANC-1 세포는 Zhejiang University 생명 과학 대학의 Weijun Yang 교수에 의해 기증되었습니다</td></tr>. 레이저 <tr><td>입자 크기 및 제타 전위 분석기&nbsp;</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano ZS 90</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수</td><td>Gibco</td><td>C20012500BT</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 형광 마이크로스피어</td><td>Beckman Coulter</td><td>6602336</td><td></td></tr><tr><td>투과 전자 현미경 JEOL</td><td></td><td>JEM-1200EX</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA 용액</td><td>Gibco</td><td>1713949</td><td></td></tr><tr><td>울트라 레인보우 형광 입자</td><td>벡크만 쿨터</td><td>B28479</td><td></td></tr><tr><td>울트라 원심분리기</td><td>벡크만 쿨터</td><td>Optima-L80XP</td><td></td></tr><tr><td>초원심 분리기 로터</td><td>벡크 맨 쿨터</td><td>SW32TI</td><td></td></tr></tbody></table>

small extracellular vesicle의 high-throughput isolation and purification (고처리량 분리 및 정제를 위한 유세포 분석 분류 파라미터 최적화)

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

작은 세포외 소포(sEV)는 모든 세포 유형에서 방출될 수 있으며 단백질, DNA 및 RNA를 운반할 수 있습니다. 신호 분자는 세포의 생리적 및 병리학적 상태를 나타내는 지표 역할을 합니다. 그러나 다운스트림 바이오마커 식별 및 약물 개입 연구를 방해하는 sEV 분리를 위한 표준 방법은 없습니다. 이 기사에서는 플로우 셀 분류기에 의한 50-200nm sEV의 분리 및 정제를 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이를 위해 50μm 노즐과 80psi 시스 유체 압력을 선택하여 우수한 분류 속도와 안정적인 측류를 얻었습니다. 표준 크기의 폴리스티렌 미소 구체는 100, 200 및 300 nm 입자의 집단을 찾는 데 사용되었습니다. 전압, 이득 및 순방향 산란(FSC) 트리거 임계값을 추가로 최적화하면 sEV 신호를 배경 잡음과 분리할 수 있습니다. 이러한 최적화는 FSC 대 측면 산란(SSC)만 사용하여 sEV의 대표 모집단을 얻을 수 있는 중요한 정렬 설정 패널을 제공합니다. 유세포 분석 기반 분리 방법은 고처리량 분석을 가능하게 할 뿐만 아니라 바이오마커 발현을 기반으로 sEV의 동기식 분류 또는 프로테옴 분석을 가능하게 하여 수많은 다운스트림 연구 응용 분야를 열어줍니다.

실험 프로토콜의 순서도는 그림 1에 나와 있습니다. 이 방법에서는 표준 크기의 폴리스티렌 미소 구체가 입자 크기 분포에 대한 참조 표준으로 사용되었습니다. 특정 기기 매개변수 조건에서 입자 신호는 로그 형식을 사용하여 FSC 대 SSC 플롯의 배경 잡음과 명확하게 구별될 수 있습니다. 게이팅 전략은 그림 2에 나와 있습니다. R4, R5 및 R6은 각각 100nm, 200nm 및 300nm 미소 구체의 위치를 나타냅니다. R7은 50nm 미만의 전자 노이즈 감지 한계이고 R8은 50-200nm 입자의 위치 범위입니다.
PANC-1 세포로부터 유래된 EVs 혼합물의 입자 크기 분포는 초원심분리 후 40-400 nm의 넓은 범위로 나타났다(도 3). 50-200 nm sEV를 분리하고 정제하기 위해, 표준 마이크로스피어의 위...

이 프로토콜은 공기 분무 노즐의 크기, 시스 유체 압력, 샘플 흐름 압력, 전압, 이득 및 트리거링 임계값 매개변수를 최적화하여 작은 세포외 소포에 대한 신속하고 크기별 분리 방법을 제공합니다.

small extracellular vesicle의 High-throughput Isolation and Purification (고처리량 분리 및 정제를 위한 유세포 분석 분류 파라미터 최적화)

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

이 프로토콜은 유세포 분석 분류 매개변수를 최적화하여 작은 세포외 소포에 대한 신속하고 크기별 솔루션 방법을 제공합니다. 이러한 최적화는 순방향 산란 대 크기 산란만을 사용하여 작은 세포외 소포의 대표 개체군을 얻을 수 있는 중요한 정렬 설정 패널을 제공합니다. 플로우 셀 분류기의 표준 시작 절차를 수행하여 시작합니다.시작 버튼을 눌러 기기를 켠 다음 레이저 제어판에서 레이저 전원 버튼을 클릭합니다. Smart Sampler 하위 메뉴의 탱크 변경 버튼을 눌러 유체 장치에 압력을 가합니다. 초음파로 세척된 50마이크로미터 제트 및 에어 노즐을 사용하여 노즐 어셈블리에 설치합니다.압력 콘솔에서 시스 유체의 경우 압력을 80SI, 샘플 흐름의 경우 80.3SI로 조정합니다. 피복 흐름 시작 버튼을 눌러 피복 스트림 흐름을 시작합니다. Smart Sampler 하위 메뉴에서 거품 버튼을 클릭하여 10분 동안 자동으로 거품을 제거한 다음 끕니다.스트림을 정렬하고 레이저 스폿을 결정하려면 조명 챔버 조명을 켜서 view 핀홀 위의 스트림. 위아래, 왼쪽과 오른쪽, 앞뒤 마이크로미터를 조정하여 스트림을 핀홀의 중앙에 놓고 스트림의 초점을 맞춥니다. 모든 레이저 셔터를 열고 레이저 및 스트림 인터셉트 탭을 선택한 다음 프롬프트에 따라 녹색 화살표 버튼을 계속 눌러 레이저 인터셉트 및 노즐 정렬 보정 프로세스를 완료합니다.미세 레이저 정렬 화면에 액세스합니다. 640 나노미터 레이저 및 772 bar 44 대역 통과 채널을 x축 매개변수로 선택하고 405 나노미터 레이저 및 448 bar 59 대역 통과 채널을 y축 매개변수로 선택합니다. 트리거 매개변수 선택기를 누르고 488나노미터 레이저의 전방 산란 매개변수를 선택합니다.다음으로, 이중 증류수 1밀리리터에 1방울을 첨가하여 무지개 형광 입자를 10 내지 6번째 비드의 최종 농도로 희석한다. 샘플 챔버 도어를 열고 준비된 무지개 형광 입자 튜브를 로드합니다. 샘플 시작 버튼을 누르고 마이크로미터를 위아래로 조정하여 형광 강도를 최적화하여 각 신호를 최대한 강렬하게 만듭니다.터치스크린 제어판의 품질 관리 시작 또는 QC 버튼을 눌러 QC를 자동으로 수행합니다. 그런 다음 IntelliSort 초기화 단추를 누릅니다. 기기는 액적 진동의 주파수와 진폭을 자동으로 조정하여 약 25의 낙하 지연을 얻고 낙하의 브레이크 오프 포인트를 명확하게 시각화할 수 있습니다.그런 다음 드롭 지연 버튼과 유지 버튼을 누릅니다. 정렬 출력 유형으로 튜브를 선택합니다. 분류 챔버에 15밀리리터 튜브 홀더를 놓습니다.플레이트 전압을 켜고 플레이트 전압을 약 4, 000 볼트로 설정하십시오. 그런 다음 스트림 설정 단추를 선택하여 테스트 패턴을 켭니다. 충전 위상 슬라이더와 편향 슬라이더를 조정하여 스트림의 이미지가 수집 튜브와 일치하는지 확인합니다.그런 다음 확인 표시 단추를 선택합니다. 컴퓨터에서 Summit 워크스테이션에 로그인합니다. 파일 주 메뉴에서 새 프로토콜을 만듭니다.그런 다음 Summit Software 제어판에서 히스토그램 탭을 선택하여 점도표를 만듭니다. 전방 산란을 x축 파라미터로 선택하고 측면 산란을 y축 파라미터로 선택합니다. 그런 다음 작업 공간에서 새 점도표의 축을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 전방 산란과 측면 산란을 로그 형식으로 표시합니다.획득 탭을 선택하고 획득 매개변수 패널을 찾습니다. 활성화 매개변수의 하위 메뉴에서 모든 신호를 활성화합니다. 전방 산란을 트리거 파라미터로 선택하고 임계값을 0.01로 설정합니다.전방 산란과 측면 산란의 전압과 이득을 250과 0.6으로 조정하여 전방 산란도 대 측면 산점도 내의 이벤트와 모집단이 분리되도록 합니다. 형광 폴리스티렌 마이크로스피어를 100, 200 및 300 나노미터 현탁액으로 희석하여 1밀리리터의 마이크로스피어를 1밀리리터의 이중 증류수에 첨가합니다. 그런 다음 마이크로스피어 서스펜션을 연속적으로 로드합니다.Summit Software의 획득 메뉴에서 시작을 선택하여 20, 000개의 이벤트를 기록한 다음 이벤트를 기록한 후 중지를 클릭합니다. 전방 산scatter 대 side scatter 도트 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 직사각형을 만들고 드래그하여 크기를 조정합니다. 전자 노이즈 영역과 100나노미터 마이크로스피어 모집단의 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 각각 R7 및 R4로 이름을 바꿉니다.이 단계를 반복하여 200 나노미터 및 300나노미터 마이크로스피어를 직사각형으로 연속적으로 구성하고 각각 R5 및 R6으로 이름을 바꿉니다. 마지막으로, 전자 노이즈를 기준으로 50 내지 200 나노미터 분류 영역을 결정하고 200 나노미터 입자의 위치를 R8로 정의한다. 정렬 로직 및 통계 패널에서 왼쪽 스트림 또는 L1 스트림의 빈 필드를 두 번 클릭하고 R8이라는 영역을 선택하여 정렬 로직을 생성하여 정렬 결정을 편집합니다. 순도의 중단 모드를 선택하고 L1 스트림에 대해 한 방울 이상의 액적 엔벨로프를 선택합니다.로드 500 마이크로리터amp이전에 준비된 세포외 소포 또는 EV 혼합물의 파일. Summit의 수집 메뉴 아래에 있는 Start(시작) 버튼을 눌러 데이터를 수집한 다음 Stop(중지)을 클릭합니다. 그런 다음 정렬 메뉴에서 시작을 눌러 50-200 나노 미터 크기의 작은 세포 외 소포 또는 sEV를 15 밀리리터 원심 분리기 튜브에 수집합니다.전방 산란 대 측면 산란 플롯에서 50-200 나노미터 크기 범위를 찾기 위한 표준 크기의 폴리스티렌 마이크로스피어의 유세포 분석을 통해 구별 가능한 입자 신호를 나타냈습니다. R4, R5 및 R6은 각각 100, 200 및 300 나노미터 입자의 위치를 나타냅니다. R7은 50 나노미터 입자에 대한 검출 한계로서의 전자 노이즈이고 R8은 50 내지 200 나노미터 입자의 위치 범위를 나타낸다.나노입자 추적 분석(NTA)에 의해 췌장 한 세포로부터 유래된 EVs 혼합물의 입자 크기 분포는 초원심분리 후 40 내지 400 나노미터의 넓은 범위로 나타났다. R8 영역 내에서 50 내지 200 나노미터 sEV를 분리 및 정제하기 위해 유세포 분석 분류를 수행하였다. 분리의 품질은 NTA에 의해 검증되었으며, 분류 후 sEV의 입자 크기 범위는 50 내지 200 나노 미터 사이 인 것으로 밝혀졌다.sEV의 존재는 TEM에 의해 추가로 관찰되었고, 분리된 sEV는 웨스턴 블롯 분석에 의해 CD6, CD63 및 CD81의 마커를 함유하는 것으로 확인되었습니다. 이 방법을 사용하면 작은 세포외 소포체의 분리와 작은 세포외 소포체 유전자 발현의 분류 또는 프로 분석을 통해 수많은 다운스트림 연구 응용 분야를 열 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 동영상은 특성화 연구에 적합한 세포외 소포체의 하위 집단을 분리하기 위한 밀도 구배 초원심분리 기반 정제 방법을 보여줍니다.

Purification of subpopulations of extracellular vesicles: A technique to purify subpopulations of extracellular vesicles using Density Gradient Ultracentrifugation(밀도 구배 초원심분리를 사용하여 세포외 소포의 하위 집단을 정제하는 기술)

이 비디오에서는 인간 말초 혈액 B 세포에서 naive B cell, memory B cell 및 plasmablast plasma cell subpopulation의 유세포 분석 기반 분류를 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 서로 다른 B 세포 하위 집단은 B 세포 표면에서 발현된 CD19, CD27 및 CD38 수용체에 대한 형광단 기반 항체 결합에 따라 구별된 후 세포 분류를 기반으로 구별할 수 있습니다.

다양한 순환 B 세포 집단에 대한 유세포 분석 기반 세포 분류

많은 다른 방법은 유동 세포 계측법 (FCM)를 사용하여 세포 외 소체 (전기 자동차)의 측정을 위해 존재한다. 사용하기에 가장 적절한 방법을 결정할 때 여러 측면이 고려되어야한다. 측정 전기 자동차에 대한 두 프로토콜은 개별 감지 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여,되게됩니다.

유동 세포 계측법을 사용하여 세포 외 소포의 분석을위한 기술

프로토콜 셀 문화 supernatants 함께 사용 하기 위해 작은 extracellular 소포 (EV)에 표면 epitopes를 감지 하도록 설계 된 재현 방법을 설명 합니다. 그것은 항 체를 표면 항 원 CD9, 인식 CD81 그리고 CD63, 함께 하는 비즈를 사용 하 여 특정 EV immunoprecipitation 활용. 메서드는 다운스트림 흐름 cytometry 분석에 최적화 되어 있습니다.

Extracellular 소포 세포 조절 미디어에서의 Cytometric 분석 흐름

이 프로토콜은 EV 강수량, 밀도 그라데이션 초원심분리 및 입자 포획을 통합하여 고효율 및 수율을 가진 비리온으로부터 세포외 소포(EV)를 분리하여 간소화된 워크플로우와 시동 감소를 허용합니다. 모든 EV 연구에서 사용할 수 있는 재현 가능한 준비를 할 수 있습니다.

바이러스로부터 멀리 떨어진 고수율 세포 외 소포 제제의 정제

여기서 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 세포외 소포가 컨디셔닝 세포 배양 배지로부터 적절하게 분리될 수 있음을 보여줍니다.

조절된 세포 배양 배지에서 세포외 소포를 분리하기 위한 크기 배제 크로마토그래피

세포외 소포체는 생물의학 응용 분야에 엄청난 가능성을 가지고 있지만, 현재의 분리 방법은 시간이 많이 걸리고 임상적으로 사용하기에는 비실용적입니다. 이 연구에서는 최소한의 단계로 연속적으로 많은 양의 생체 유체에서 세포외 소포체를 직접 분리할 수 있는 미세유체 장치를 제시합니다.

분기된 A4F 미세유체 장치를 사용한 대용량 시료에서 세포외 소포의 단일 단계 분리

이 프로토콜은 중간엽 기질 세포에서 방출되는 세포외 소포체(EV)를 분류하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 특히 기기 설정 및 분류 조건의 최적화에 중점을 둡니다. 목표는 세포외 소포체의 특성을 보존하면서 분류하는 것입니다.

세포외 소포 격리를 위한 성공적인 분류 설정

여기에서는 인간 피험자의 눈물 및 타액과 같은 생물학적 액체에서 수집된 세포외 소포체(EV)의 특성화 방법을 보여줍니다. 이 방법에 사용된 스캐너는 샘플의 1μL에서 EV의 표현형, 크기 및 총 입자 수를 감지할 수 있습니다.

Characterizing Extracellular Vesicles from Biological Fluids(생물학적 유체로부터 세포외 소포체 특성화)

다양한 응용 분야에 걸쳐 구현하기 위해 향상된 효소 안정성을 제공하는 효소 포장 외막 소포체(OMV)의 생산, 정제 및 사용을 위한 프로토콜이 제시됩니다.

에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장<em&gt; 대장균</em&gt; : 디자인, 생산 및 정제

배우세요 flow cytometry 분류 매개변수를 최적화하여 small extracellular vesicle을 고속으로 분리하고 정제하는 방법을. 이 기술은 세포 간 소통 연구에 필수적인 대표적인 소포 집단을 획득할 수 있습니다.

small extracellular vesicle의 High-throughput Isolation and Purification (고처리량 분리 및 정제를 위한 유세포 분석 분류 파라미터 최적화)

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