Name: 플루오로겐 RNA 압타머에 대한 시험관 내 및 세포 턴온 역학 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 학습하세요 플루오로겐 RNA 압타머의 시험관 내 및 세포 내 역학 측정 방법을. 플레이트 리더와 유세포 분석을 활용하여 Spinach2와 Broccoli 압타머의 실시간 결합 특성을 정량적으로 분석하는 기술입니다.

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이 작업은 MCH에 대한 NSF-BSF 1815508 및 NIH R01 GM124589에 대한 보조금으로 지원되었습니다. MRM은 훈련 보조금 NIH T32 GM122740에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

<ol><li>Su, Y., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-based+fluorescent+biosensors+for+live+cell+imaging+of+small+molecules+and+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs.</a> Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+spinach+array+for+mRNA+Imaging+in+living+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells.</a> Scientific Reports. 5, 17295(2015).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+spatial+complementation+of+aptamer-mediated+recognition+enables+live-cell+imaging+of+native+RNA+transcripts+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time.</a> Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).</li>
<li>Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+superfolding+Spinach2+reveals+the+dynamic+nature+of+trinucleotide+repeat-containing+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA.</a> Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).</li>
<li>Thavarajah, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-use+detection+of+environmental+fluoride+via+a+cell-free+riboswitch-based+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).</li>
<li>You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+metabolite+dynamics+in+living+cells+using+a+Spinach-based+riboswitch%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).</li>
<li>Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-based+fluorescent+biosensors+for+live+cell+imaging+of+second+messengers+cyclic+di-GMP+and+cyclic+AMP-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).</li>
<li>Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanidine+biosensors+enable+comparison+of+cellular+turn-on+kinetics+of+riboswitch-based+biosensor+and+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).</li>
<li>Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-based+fluorescent+biosensor+for+high-throughput+analysis+of+the+cGAS-cGAMP-STING+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway.</a> Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).</li>
<li>Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+RNA-based+fluorescent+biosensors+enable+anaerobic+detection+of+cyclic+di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 139(2016).</li>
<li>Paige, J. S., Thinh, N. -D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+cellular+metabolites+with+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA.</a> Science. 335 (6073), 1194(2012).</li>
<li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333 (6042), 642-646 (2011).</li>
<li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broccoli%3A+Rapid+selection+of+an+RNA+mimic+of+green+fluorescent+protein+by+fluorescence-based+selection+and+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li>
<li>Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plug-and-play+fluorophores+extend+the+spectral+properties+of+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).</li>
<li>Basch, H., Gadebusch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antimicrobial+activity+of+dimethylsulfoxide%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide.</a> Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).</li>
<li>Kallansrud, G., Ward, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+measured+and+calculated+single-+and+double-stranded+oligodeoxynucleotide+extinction+coefficients%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients.</a> Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).</li>
<li>Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neutral+pH+thermal+hydrolysis+method+for+quantification+of+structured+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs.</a> RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).</li>
<li>Szatmári, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+ion+concentrations+and+cation-dependent+remodelling+of+bacterial+MreB+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies.</a> Scientific Reports. 10, 12002(2020).</li>
<li>Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIVE%2FDEAD%C2%AE+BacLightTM%3A+Application+of+a+new+rapid+staining+method+for+direct+enumeration+of+viable+and+total+bacteria+in+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">LIVE/DEAD® BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water.</a> Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+G-quadruplex-containing+RNA+activates+fluorescence+in+a+GFP-like+fluorophore%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore.</a> Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).</li>
<li>Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorophore+ligand+binding+and+complex+stabilization+of+the+RNA+Mango+and+RNA+Spinach+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers.</a> RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).</li>
<li>Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+photophysics+of+the+Spinach-DFHBI+RNA+aptamer-fluorogen+complex+to+improve+live-cell+RNA+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+properties+of+Spinach+and+its+use+in+selective+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging.</a> Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).</li>
<li>Dao, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photophysics+of+DFHBI+bound+to+RNA+aptamer+Baby+Spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach.</a> Scientific Reports. 11, 7356(2021).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

시험관내 동역학 실험을 위해, 동일한 일반 프로토콜이 리간드-결합 및 형광단-결합 도메인8 둘 다를 함유하는 RNA-기반 형광 바이오센서의 시험관내 동역학을 측정하도록 변형될 수 있다. 이 경우, RNA는 리간드 반응 동역학을 얻기 위해 리간드 주입시 측정 전에 형광단과 함께 배양되어야 한다. 반복실험 간에 높은 변동성이 관찰되면 측정 전에 각 샘플이 96웰 플레이트에서 동일한 시간 동안 평형을 이룰 수 있는지 확인하여 문제를 해결할 수 있습니다. 각 샘플 또는 반복물은 웰에서 개별적으로 준비해야 하며 모든 샘플을 한 번에 준비하는 대신 15분 평형 단계 직후에 측정해야 합니다.
세포 동역학 실험의 경우 프로토콜을 더 짧거나 더 긴 시간 동안 수정할 수 있지만 생물학적 반복 횟수를 계획하고 필요한 세포 용액 부피를 조정하는 것이 중요합니다. 각 생물학적 복제 판독값을 30초에서 1분 사이에 간격을 두어 단...

형광 생성 반응은 형광 신호를 생성하는 화학 반응입니다. 플루오로제닉 RNA 앱타머는 일반적으로 형광 양자 수율을 향상시키기 위해 소분자 염료를 결합하여 이 기능을 수행합니다(그림 1A)1. 상이한 플루오로겐 RNA 앱타머 시스템이 개발되었고, 특정 RNA 앱타머 서열 및 상응하는 염료 리간드1로 구성된다. 플루오로 제닉 RNA 앱타머는 mRNA 및 비 코딩 RNA 2,3,4의 라이브 셀 이미징을 가능하게하는 형광 태그로 RNA 전사체에 추가되었습니다. 그들은 또한 보고 기능이 RNA 수준 5,6이라는 점을 제외하고는 녹색 형광 단백질(GFP)을 리포터로 사용하는 것과 유사하게 유전자 발현의 형광 리포터로서 프로모터 서열 뒤에 배치되었습니다. 마지막으로, 플루오로 생성 RNA 압타머는 특정 소분자에 반응하여 형광 생성 반응을 유발하도록 설계된 RNA 기반 형광 바이오 센서에 통합되었습니다. RNA 기반 형광 바이오센서는 다양한 비형광 대사산물 및 신호 분자 7,8,9,10,11의 라이브 셀 이미징을 위해 개발되었습니다.
RNA 국소화, 유전자 발현 및 소분자 신호의 동적 변화를 시각화하기 위한 형광 RNA 압타머의 개발에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 이러한 각 응용 분야에 대해 실시간 측정을 얻는 것이 바람직하지만 측정의 정확도는 샘플링 주파수보다 빠른 형광 발생 반응의 역학에 따라 달라집니다. 여기에서는 샘플 주입기가 장착된 플레이트 리더를 사용하여 형광 RNA 앱타머 시금치212 및 브로콜리13에 대한 시험관 내 동역학을 결정하고 유세포분석기를 사용하여 대장균에서 발현되는 시금치2에 대한 세포 턴온 동역학을 결정하는 방법을 설명합니다. 이 두 RNA 앱타머는 RNA 국소화연구 2,3,4에 적용되었기 때문에 선택되었으며, 리포터 5,6 및 바이오센서 7,8,9,10,11에 사용되었으며, 해당 염료 리간드(DFHBI 또는 DFHBI-1T)가 시판되고 있습니다. 문헌에서 결정된 이들의 시험관내 특성의 요약은 표 1 4,13,14에 주어지며, 이는 프로토콜 개발(예를 들어, 사용된 파장 및 염료 농도)을 알렸다. 이러한 결과는 RNA 앱타머에 의해 영향을 받는 형광 생성 반응이 빠르며 원하는 세포 생물학적 응용을 위한 정확한 측정을 방해해서는 안 된다는 것을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>BP160500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel 전기영동 장비</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B1A-BP</td><td></td></tr><tr><td>Alpha D-(+)-lactose monohydrate</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>18-600-440</td><td></td></tr><tr><td>Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>황산암모늄 ((NH4)2SO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT 유세포 분석기</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A24861</td><td></td></tr><tr><td>Attune 1x 집속 유체</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A24904</td><td></td></tr><tr><td>Attune 셧다운 솔루션</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A24975</td><td></td></tr><tr><td>Attune 성능 추적 비드</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>4449754</td><td></td></tr><tr><td>Attune 세척 솔루션</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>&nbsp; J24974</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>시그마-알드리치</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>시그마-알드리치</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>카르베니실린 디소듐 염</td><td>시그마-알드리치</td><td>C3416</td><td></td></tr><tr><td>염소 표백제</td><td>아마존</td><td>B07J6FJR8D</td><td></td></tr><tr><td>코닝 코스타 96웰 플레이트</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF86610A</td><td></td></tr><tr><td>배양 튜브, 12 mm x 75 mm, 5 mL, 이중 위치 캡이 부착된</td><td>Globe Scientific</td><td>05-402-31</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI</td><td>시그마-알드리치</td><td>SML1627</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI-1T</td><td>시그마-알드리치</td><td>SML2697</td><td></td></tr><tr><td>D-글루코스 (무수)</td><td>아크로스 유기물</td><td>AC410955000</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨 (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>DNA loading dye</td><td>New England Biolabs</td><td>B7025S</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind tubes (2.0 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>22431048</td><td></td></tr><tr><td>dNTP: dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, pH 8.0</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>에탄올(EtOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>필터 팁 마이크로피펫 팁</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM12635, AM12648, AM12655, AM12665</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>FlowJo v10 소프트웨어</td></tr><tr><td>가열 제어 기능이 있는 형광판 판독기</td><td>VWR</td><td>10014-924</td><td></td></tr><tr><td>겔 전기영동 전원 공급 장치</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>EC3000XL2</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐 AM95010</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM95010</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>Dotmatics</td><td>N/A</td><td>분석 소프트웨어 아카데믹 그룹 라이선스&nbsp;</td></tr><tr><td>히트 블록&nbsp;</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159Z11</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>Inorganic pyrophosphatase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1643-500UN</td><td></td></tr><tr><td>저분자량 DNA 사다리</td><td>New England Biolabs</td><td>N3233L</td><td>겔 로딩 염료, 보라색(6x), SDS 없음(NEB #B7025)의 무료 바이알과 함께 제공됩니다.</td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물 (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘 (MgSO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MFCD00011110</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 (1.5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge with Temperature Control</td><td>Marshall Scientific</td><td>EP-5415R</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫터</td><td>Gilson</td><td>FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫터 팁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR</td><td></td></tr><tr><td>BioPak 장치가 있는 Millipore 정수 필터</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDUFBI001, ZRQSVR3WW</td><td></td></tr><tr><td>좁은 마이크로피펫터 피펫 팁</td><td>DOT Scientific</td><td>RN005R-LRS</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 10x</td><td>Thermo Fischer 과학적인</td><td>BP39920</td><td></td></tr><tr><td>PCR 세척 키트,</td><td>Qiagen</td><td>28181</td><td></td></tr><tr><td>PCR 프라이머 및 템플릿</td><td>, 통합 DNA 기술</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>얇은 벽 PCR 튜브용 PCR 열순환기</td>, <td></td><td>0.5mL 튜브용 Bio-Rad</td> 1851148 <td></td></tr><tr><td>PCR 열순환기</td>, <td>Techne</td><td>5PRIME/C</td><td></td></tr><tr><td>pET31B-T7-Spinach2, Plasmid</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #79783</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA 중합효소&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td>Phusion High-Fideldity Enzyme 구매는 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, MgCl2 및 DMSO 솔루션과 함께 제공됩니다.</td></tr><tr><td>폴리아크릴아미드 겔 전기영동 겔 빗, C.B.S. Scientific</td><td>C.B.S. Scientific</td><td>VGC-1508</td><td></td></tr><tr><td>폴리아크릴아미드 겔 전기영동 장비</td><td>C.B.S. Scientific</td><td>ASG-250</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td><td>성 Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Genesee Scientific</td><td>38-101</td><td></td></tr><tr><td>rNTP: ATP, CTP, GTP, UTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0450L</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>단파 UV 광원</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>11758221</td><td></td></tr><tr><td>탄산나트륨(Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 염화물(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨(NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨이염기성, 무수</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>S375-500</td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>SoftMax Pro 6.5.1(플레이트리더 소프트웨어) 아카데믹 그룹 라이선스를 통해 획득</td></tr><tr><td>멸균 필터 장치</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>09-741-88</td><td></td></tr><tr><td>슈크로오스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA gel stain</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>아가로즈 젤 전기영동용 TAE 버퍼</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM9869</td><td></td></tr><tr><td>테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><tr><td>트립톤 (과립)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 중합효소</td><td>New England Biolabs</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>Urea-PAGE Gel system&nbsp;</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td></td></tr><tr><td>UV 형광 TLC 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05789.0001</td><td></td></tr><tr><td>UV/Vis 분광 광도계</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>2215415</td><td></td></tr><tr><td>Xylene cyanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물(과립)</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>BP9727-2</td><td></td></tr></tbody></table>

플루오로겐 rna 압타머에 대한 시험관 내 및 세포 턴온 역학 결정

Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers

플루오로제닉 RNA 앱타머는 살아있는 세포에 적용되어 RNA에 태그 및 시각화하고, 유전자 발현에 대해 보고하고, 대사 산물 및 신호 분자의 수준을 감지하는 형광 바이오센서를 활성화합니다. 이들 시스템 각각에서의 동적 변화를 연구하기 위해서는, 실시간 측정을 얻는 것이 바람직하지만, 측정의 정확도는 샘플링 주파수보다 빠른 형광 생성 반응의 동역학에 의존한다. 여기에서는 각각 샘플 주입기와 유세포분석기가 장착된 플레이트 리더를 사용하여 플루오로제닉 RNA 앱타머에 대한 시험관내 및 세포 턴온 동역학을 결정하는 방법을 설명합니다. 우리는 시금치2 및 브로콜리 압타머의 형광 활성화에 대한 시험관 내 동역학이 2상 연관 반응으로 모델링될 수 있고 각각 0.56 s-1 및 0.35 s-1의 다른 빠른 위상 속도 상수를 갖는다는 것을 보여줍니다. 또한, 우리는 그람 음성 박테리아로의 염료 확산에 의해 더욱 제한되는 대장균에서 시금치2의 형광 활성화를 위한 세포 역학이 분 시간 척도에서 정확한 샘플링 빈도를 가능하게 할 만큼 충분히 빠르다는 것을 보여줍니다. 형광 활성화 동역학을 분석하기 위한 이러한 방법은 개발된 다른 형광 RNA 앱타머에 적용할 수 있습니다.

체외 동역학 합성 올리고뉴클레오티드로 구입한 DNA 주형 및 프라이머의 서열은 표 2 에 나와 있으며 시약 레시피는 보충 파일 1에 나와 있습니다. PCR 증폭은 후속 시험관 전사 (IVT) 반응에 필요한 T7 프로모터로 DNA 주형의 양을 확장하는 데 사용됩니다. 또한, PCR 증폭은 동일한 반응에서 두 가지 목적으로 사용될 수 있습니다: 프라이머 확장에 의해 전장 브로콜리 DNA 주형을 생성하고 DNA 주형을 확장하는 것입니다.
RNA를 합성하기 위한 IVT 반응 후, PAGE 정제는 전장 RNA 생성물에서 원치 않는 잘린 전사체, 분해된 생성물 및 미반응 rNTP를 제거합니다. 이러한 유형의 정제는 잘리거나 분해된 RNA가 RNA 농도의 부정확한 결정을 유발하기 때문에 선호됩니다. 뉴클레오티드 염기는 UV 광을 흡수하...

이 프로토콜은 플루오로 생성 RNA 압타머 시금치2 및 브로콜리의 동역학을 결정하는 두 가지 방법을 제시합니다. 첫 번째 방법은 플레이트 리더로 시험관 내에서 형광 발생 압타머 역학을 측정하는 방법을 설명하는 반면, 두 번째 방법은 유세포 분석에 의한 세포의 형광 발생 압타머 역학 측정을 자세히 설명합니다.

플루오로겐 RNA 압타머에 대한 시험관 내 및 세포 턴온 역학 결정

Fluorogenic RNA aptamers have been applied in live cells to tag and visualize RNAs, report on gene expression, and activate fluorescent biosensors that ...

시험관 내 및 세포 불소 생성 압타머 동역학을 연구하면 사용자는 압타머 염료 상호 작용이 관심 프로세스를 실시간으로 연구할 만큼 충분히 빠른지 평가할 수 있습니다. 제시된 기술은 세포 내부와 외부 모두에서 정량적 동역학 측정을 허용하며, 둘 중 하나는 압타머의 적용에 따라 관련될 수 있습니다. 제시된 방법은 대체 압타머 및 소분자용 RNA 기반 바이오센서를 포함한 모든 형광 RNA 시스템에 적용할 수 있습니다.시작하려면 열 순환기에서 RNA 재생 프로그램을 설정하십시오. 새 프로그램 만들기"새 단계 추가"를 선택하여 프로그램 만들기"새 단계 추가"를 여러 번 눌러 저장"을 누르기 전에 온도별 단계를 추가합니다."프로그램에 따라 추가 설정을 조정합니다. 시금치 2개와 브로콜리 RNA를 재활성화하려면 0.5밀리리터의 얇은 벽 PCR 튜브에 이중 증류수에 각 RNA의 마이크로몰 줄기 2개를 준비합니다.그런 다음 동일한 부피의 2-x 재생 버퍼를 추가하여 하나의 마이크로 몰 RNA 용액을 만듭니다. 튜브를 열순환기에 넣습니다. 저장된 재생 프로그램을 열고 실행을 누르십시오"다음으로 플레이트 리더 인젝터 프로그램을 설정하십시오.형광판 판독기에서 온도를 선택하십시오"섭씨 37도로 설정합니다. 역학을 시작하기 전에 온도가 이 값과 평형을 이루는지 확인하십시오. 플레이트 리더 소프트웨어를 엽니다.설정 선택"그런 다음 획득 보기"운동 측정을 위한 프로그램을 입력하려면 루프를 선택하십시오"각 웰에 대해. 다음으로, 기준 설정을 60 기준 읽기로 설정하고 10마이크로리터 주입에 대한 스마트 주입 설정을 설정합니다. 형광 판독 여기 파장을 448 나노 미터로, 방출 파장을 506 나노 미터로, 카트리지를 모노로 설정합니다.총 읽기 시간을 10분으로 설정하고 읽기 간격은 0.5초입니다. PMT 및 광학 장치를 읽기당 6회 깜박임으로 설정합니다. 그런 다음 다음 웰에 루프를 입력합니다.플레이트 리더 인젝터를 준비하려면 플레이트 리더에 주입"을 선택하고 지시에 따라 폐기물 수집 플레이트를 공급하십시오. 그런 다음 세척"을 선택하고 플레이트 리더의 지침에 따라 1밀리리터 부피의 이중 증류수, 75% 에탄올 및 증류수로 주입 튜브를 청소합니다. 다음으로 흡인 선택"인젝터가 과도한 액체를 배출 할 수 있도록합니다.그런 다음 프라임"을 선택하여 2개의 260마이크로리터의 100마이크로몰 D F H B 2개의 인젝터를 프라이밍 I.To 하나의 동역학 실험을 수행합니다. 80마이크로리터의 결합 버퍼 마스터 믹스를 96웰 투명 바닥 판의 한 웰에 추가합니다. 그런 다음 10 마이크로 리터의 변성 RNA를 추가하십시오. 플레이트와 D F H B I 용액을 인젝터에서 섭씨 37도까지 15분 동안 평형을 이룰 수 있도록 합니다.그런 다음 읽기 영역 아래의 소프트웨어 설정에서 분석할 웰을 선택합니다. 그런 다음 홈 탭에서 실행"을 선택하여 앞에서 설명한 동역학 프로그램을 실행합니다. 모든 실험이 완료될 때까지 이 과정을 반복합니다.실행 후, 인젝터를 세척하여 이전에 설명된 바와 같이 주입 튜브로부터 나머지 DF H B I 용액을 제거한다. 실험 파일을 설정하려면 유세포 분석기와 컴퓨터를 켜십시오. 실험 탐색기 탭에서 유세포분석기"사용자 이름"을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 새 파일을 만듭니다.그런 다음 새 실험"드롭다운 창에서 컴퓨터 화면의 새 창이 나타나면 실험 유형을 튜브로 선택하십시오."그런 다음 확인"새 실험 파일에서 그룹 폴더를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 새 샘플 튜브 추가"각 특정 시점에 대해 샘플 튜브에 레이블을 지정하고 샘플을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 복제"를 선택하고 이름 바꾸기"드롭다운 메뉴에서. 다음으로, 배양 튜브의 AI 배지에 1.5 밀리리터의 1 X P B S와 3 마이크로 리터의 유도 세포를 첨가하여 희석 된 세포 용액을 준비합니다. 염료를 첨가하기 전에, 세포의 배경 형광을 측정하여 시간 경과에 따른 폴드 턴을 관찰한다.염료가 첨가되면 PBS의 세포가 포함된 배양 튜브를 샘플 튜브 리프터에 넣고 리프터를 샘플 주입 바늘로 올립니다. 그런 다음 컬렉션 패널 탭에서 적절한 샘플 파일을 선택하고 기록을 클릭하십시오"실행이 완료되면 배양 튜브로 샘플 튜브 리프터를 손으로 내립니다. 헹굼 단계를 개시하여, 유체계를 세척하고, 각각의 생물학적 복제 샘플 사이의 캐리오버를 최소화한다.다음 샘플로 이동하려면 레코드 아이콘 아래의 샘플 튜브 이름 근처에 있는 오른쪽 화살표 아이콘을 클릭하여 다음 샘플 파일을 선택합니다. 염료로 세포의 형광을 측정하기 위해 1.4 마이크로리터의 농축 염료 스톡을 세포가 있는 하나의 X P B S에 첨가하고, 최종 농도 50 마이크로몰 DF H I ONE T.Secure 배양 튜브 뚜껑을 고정하고 3 내지 5배 뒤집어 용액을 고르게 혼합한다. 다음으로 뚜껑을 제거하고 배양 튜브를 샘플 튜브 리프터에 넣습니다.홀더를 샘플 주입 바늘에 올린 후 적절한 샘플 파일 아래의 "레코드"아이콘을 클릭하십시오. 이어서, 타이머 시작 "불소 압타머 시금치 2 및 브로콜리의 시험관내 동역학"을 눌러 시작하여, DF HB I 염료에 결합하는 2상 연관 동역학을 표시하였다. 두 압타머 모두, 동역학 데이터는 긴 측정 시간에서 1상보다 2상 연관성에 의해 더 적합했습니다.최적 적합 곡선은 빠른 연관성과 느린 연관성에 대한 속도 상수와 반감기 값을 결정했습니다. 결합 능력 상태에서 시금치 2는 브로콜리보다 빠른 턴온을 보였다. 두 압타머에 대한 제2 단계 동역학은 유사하고, 공통된 속도 제한 단계에 대응할 수 있다.앱타머 운동 곡선은 유사한 정도의 빠른 결합 RNA로 구성됩니다. 시금치 2개의 T RNA를 발현하는 세포의 경우, 평균 형광 강도 또는 MFI는 제로 시점에서 즉시 증가한다. 더욱이, 세포 형광은 5분 이내에 최대 평형 MFI 값에 도달하였다.대조적으로, 대조군 세포는 낮은 배경 형광을 보였고 DM O 첨가로 MFI 값의 변화가 없었습니다. 제시된 방법을 통해 연구자들은 형광 생성 압타머에서 RNA 기반 센서를 더 빠르게 만들 수있는 방법을 결정할 수 있습니다.

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연구

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Google은 최근은 간단 세균 검출을위한 형광 분석 "을 믹스 앤 읽기"를 설정하는 데 적용할 수있는 형광 DNAzyme 프로브를 생성하기위한 새로운 접근 방식을보고했습니다. 이러한 특별한 유전자 프로브는이를 형광 신호 생성에 세균 검출을 번역 특정 세균에 의해 생산되는 원유 세포외 혼합물 (CEM)의 앞에서 발색단 - 수정의 DNA-RNA 키메라 기판의 절단을 catalyze. 이 보고서에서 우리는 "RFD-EC1"표시된 특정 DNAzyme 프로브는 모델 박테리아의 탐지를 위해 고용되는 핵심 실험 절차를...

형광 DNAzymes을 사용하여 박테리아의 탐지

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일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

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IRE / IRP 예 : RNA - 단백질 상호 작용의 연구에 대한 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA)

이 작업에서는 활성 인핸서를 식별하고 실험적으로 검증하는 방법에 대한 실험적 워크플로를 제공합니다.

예측 및 유전자 규제 요소의 검증은 레티노 산 유도 배아 동안 활성화 된 세포 분화 줄기

HIV-1 복제 주기의 통합 후 단계를 표적으로 하는 RNA 분자의 효능 및 독성을 평가하는 방법이 설명되어 있습니다. 이러한 방법은 새로운 분자를 스크리닝하고 기존 분자의 형식을 최적화하는 데 유용합니다.

유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 HIV-1 생산을 표적 RNA를의 효능 및 독성 평가

이 프로토콜 칩 seq, 4sU-seq, seq-총 RNA, 리보솜 세포 선 및 1 차 셀에 대 한 프로 파일링의 조합 사용을 설명 합니다. 전사-요소 바인딩, 드 노 보 전사, RNA 가공, 회전율 및 시간이 지남에, 번역 활성화 및 급변 셀에서 이벤트의 전체 과정을 표시 하 고 변경 내용을 추적을 수 있습니다.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

사이트 지시 된 mutagenesis deoxyribonucleic 산 (DNA) 특정 돌연변이 소개 하는 기술 이다. 이 프로토콜 사이트 감독 mutagenesis 2 스텝을 수행 하는 방법을 설명 하 고 3 단계 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 접근, 관심의 모든 DNA 조각에 적용 됩니다.

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개별 번역 이벤트를 추적하면 캡 종속 번역 메커니즘에 대한 고해상도 운동 연구를 수행할 수 있습니다. 여기서 우리는 형광으로 표지된 항체와 에피토프 태그가 달린 초기 성 펩티드 사이의 화상 진찰 상호 작용에 근거를 둔 체외 단일 분자 분석체를 보여줍니다. 이 방법은 활성 체외 캡 의존 변환 동안 개시 및 펩티드 신장 운동의 단일 분자 특성화를 가능하게한다.

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우리는 시험관 내 전사 반응을 조절하기 위해 새로운 DNA 테더T7 RNA 폴리머라제의 엔지니어링을 설명합니다. 우리는 단백질 합성 및 특성화를 위한 단계를 논의하고, 개념 증명 전사 적 조절을 검증하며, 분자 컴퓨팅, 진단 및 분자 정보 처리에 대한 응용 분야에 대해 논의합니다.

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현재 프로토콜은 표적을 검출하기 위해 빠른 3단계 압타머 기반 지수 증폭 분석의 사용을 보여줍니다. 샘플 준비, 신호 증폭 및 색상 현상은 카페인보다 테오필린의 존재를 인식하기 위해 이 시스템을 구현하기 위해 다룹니다.

3단계 G-Quadruplex 등온 지수 증폭 반응에 의해 촉진되는 Aptamer 기반 표적 검출

이 프로토콜의 목표는 시험관 내에서, 생체 포유류 세포 및 3차원 세포 모델에서 재현 가능한 RNA 영상 워크플로우를 위해 Riboglow 프로브의 정량적 형광 수명 측정을 가능하게 하는 것입니다. 우리는 편향되지 않은 형광 수명 측정을 추출하기 위한 샘플 준비, 프로브 전달, 데이터 수집 및 정량적 분석 워크플로우를 개괄합니다.

생포유류 세포 및 3차원 세포 모델에서 형광 평생 영상 기초로 리보글로우 프로브를 시험 관 내에서 특성화하기

학습하세요 플루오로겐 RNA 압타머의 시험관 내 및 세포 내 역학 측정 방법을. 플레이트 리더와 유세포 분석을 활용하여 Spinach2와 Broccoli 압타머의 실시간 결합 특성을 정량적으로 분석하는 기술입니다.

플루오로겐 RNA 압타머에 대한 시험관 내 및 세포 턴온 역학 결정

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