Name: 세포 세포 골격의 모델 시스템으로서의 (Poro-) 탄성 수축 Actomyosin 네트워크의 역학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 학습하세요 세포 골격 모델에서 포로탄성 액토미오신 겔의 역학을 연구하는 방법을. 이 단순한 시험관 내 접근법은 미오신 수축성과 유체 흐름의 관계를 밝히고 동적 시스템의 기계적 특성을 정교한 장비 없이 추출합니다.

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단백질 정제 및 라벨링에 대해 Dina Aranovich에게 감사드립니다. GL은 Jabotinsky 박사 학위 장학금에 대해 이스라엘 과학 기술 우주부에 감사드립니다. ABG는 재정 지원에 대해 이스라엘 과학 재단(보조금 2101/20)과 이스라엘 과학 기술부(보조금 3-17491)에 감사드립니다.

1. 유리 표면 처리 및 부동태화:
알림: 이 섹션에는 (i) 세척 및 친수화, (ii) 실란화 및 (iii) 표면 패시베이션의 세 가지 주요 단계가 포함됩니다( 그림 1 참조).
<ol><li>세척 및 친수성<ol><li>유리 표면 청소를 위해 피라냐 용액을 사용하십시오. 참고 : 피라냐 용액은 30 % H 2 O 2 와 70 % H2SO4 (재료 표)의 혼합물입니다. 주요 목표는 커버슬립 표면에서 유기 오염을 제거하고 유리 표면에 OH 그룹을 노출시키는 것입니다. 이러한 방식으로, 유리 표면은 친수성이된다.</li>
		<li>10-12 #1.5(22mm x 22mm) 유리 커버슬립(재료 표)을 수제 폴리테트라플루오로에틸렌 홀더(베이스 면적: 5.5cm x 5.5cm)에 넣습니다. 폴리테트라플루오로에틸렌 홀더를 400mL 비커(표 재료)에 옮기고 300mL의 피라냐 용액과 함께 2시간 동안 배양합니다. 얼음과 화학 후드에서이 단계를 수행하십시오. 알림: 홀더 베이스에 나사로 고정된 폴리테트라플루오로에틸렌 폴은 길이가 12cm로 비커(11cm)보다 길기 때문에 홀더를 피라냐 용액 안팎으로 안전하게 옮기거나 빼낼 수 있습니다. 피라냐 용액은 여전히 반응성이 높고 매우 뜨거울 수 있기 때문에 반응을 멈추는 것이 필수적입니다. 반응을 멈추는 가장 쉬운 방법은 피라냐 용액을 물에 부어 (최소한) 50 배 희석을 달성하는 것입니다. 그런 다음 솔루션을 안전하게 폐기할 수 있습니다. 사용한 피라냐 용액을 밀폐 된 유리 병에 보관하지 마십시오 - 병 폭발로 끝날 수 있습니다.</li>
		<li>폴리테트라플루오로에틸렌 홀더를 신선한 이중 증류수(DDW)로 채워진 깨끗한 비커에 옮겨 커버슬립에서 과도한 피라냐를 씻어냅니다.</li>
		<li>비커를 초음파 처리 수조 (재료 표)로 옮기고 25 °C에서 10 분 동안 최대 전력으로 80Hz에서 초음파 처리합니다. 새로운 DDW로 이 단계를 두 번 더 반복합니다. 매번 신선한 DDW를 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>실란화<ol><li>홀더를 300mL의 순수 메탄올(재료 표)로 채워진 깨끗한 비커(400mL)에 옮긴 다음 초음파 처리 수조(재료 표)로 옮깁니다. 25 °C에서 30 분 동안 최대 전력으로 80Hz에서 초음파 처리합니다.</li>
		<li>초음파 처리 후, 홀더를 15 mL의 DDW, 3.1 mL의 아세트산 (재료 표), 340 mL의 메탄올 및 7.6 mL의 실란 ((3-메르캅토프로필) 트리 메 톡시 실란)을 사용하여 제조 된 실란 용액으로 옮깁니다 (재료 표). 비커를 파라필름으로 밀봉하고 냉장고에 4°C에서 밤새 보관합니다. 알림: 실란 용액의 준비 및 취급은 화학 후드에서 수행해야 합니다. 실란 화 단계 후, 사용한 실란 용액 (폐기물)을 화학 후드 내의 전용 유리 병에 넣습니다.</li>
		<li>다음날 홀더를 300mL의 순수 메탄올로 채워진 깨끗한 비커에 15초 동안 옮깁니다. 이어서, 홀더를 깨끗한 비커에 옮기고, 폴리테트라플루오로에틸렌 홀더의 바닥을 건조시키기 전에 과량의 메탄올을 제거한다. 비커를 오븐(Table of Materials)으로 옮겨 120°C에서 5분 동안 유리 커버슬립을 건조시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>불활성 폴리머를 사용한 표면 패시베이션<ol><li>유리 커버슬립을 불활성 폴리머로 배양하여 표면 패시베이션을 달성합니다(재료 표). 각 실험에 대해 두 개의 커버슬립을 가져와서 처음에 에탄올(EtOH)로 세척한 파라필름 층으로 코팅된 페트리 접시에 넣습니다(DDW/EtOH: 30/70 vol/vol)(재료 표).</li>
		<li>각 커버슬립을 1mL의 4mg·mL-1 5kDa 분자량 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드(mPEG-mal, Mw=5kDa)(재료 표)를 1x 인산염 완충 식염수(PBS)(재료 표)에서 22°C에서 1시간 동안 배양합니다. 알림: 소수성 파라필름 층에 커버슬립을 놓으면 친수성 PEG 폴리머 용액이 유리 커버슬립 표면에 가두어집니다. 배양 시간은 최적의 패시베이션을 달성하는 데 중요합니다. 45분에서 2시간 사이의 배양 시간을 사용하십시오. 이 배양 시간이 지나면 유리 커버슬립 표면이 열화되어 단백질 접착력과 투명성 손실이 발생할 수 있습니다.</li>
		<li>배양 과정이 끝나면 각 커버슬립을 5mL의 DDW로 헹구고 N2 (가스)의 흐름으로 건조시킵니다. 커버슬립을 진공 상태에서 건조하지 마십시오. 커버슬립은 패시베이션 후 젖은 상태로 유지해야 하므로 즉시 페길화된 표면에 10mM Tris 1mL를 놓습니다. 2시간 이내에 커버슬립을 사용하십시오. 알림: 유리 표면 오염을 방지하기 위해 층류 챔버에서 다양한 단계를 수행해야 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 단백질 정제
<ol><li>겔 여과 방법을 사용하여 토끼 골격근 아세톤 분말에서 G-actin을 정제합니다24.<ol><li>액틴 정제에는 1 주일이 걸립니다. 정제된 G-액틴을 G-완충액(5 mM Tris pH 7.8, 0.01%NaN3, 0.1 mMCaCl2, 0.2 mM ATP, 및 1 mM DTT)에 보관하고, 얼음 위에 보관한다. 2 주 이내에 솔루션을 사용하십시오. 알림: 이틀에 한 번씩 얼음을 교체하십시오.</li>
		<li>액틴을 말레이미드 변성 형광 염료16 (재료 표)으로 라벨링합니다. Ono et al.25의 방법에 따라 GST-fascin을 정제합니다. 두 단백질을 액체 N2 에 급속 동결시키고 -80 °C에서 보관합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>토끼 골격근에서 미오신 II를 정제하기 위해 표준 프로토콜을 사용한다26. 정제된 미오신 II(이량체) 스톡 완충액에는 10mM Tris pH 7.4, 0.5M KCl 및 35% w/v 자당이 포함됩니다. 액체 N2 에서 미오신 을 급속 동결시키고 -80 °C에서 보관한다. 참고: KCl의 고농도는 미오신 모터를 이량체 형태로 유지하는 반면, 높은 비율의 자당은 동결 시 모터의 활성이 방해받지 않도록 합니다. myosin II 원액으로 작업할 때 점성 유체 처리를 위한 전용 피펫을 사용하십시오(재료 표).<ol><li>미오신 II 이량체를 형광 염료(재료 표)로 표지하여 조작된 시스테인 잔기19,27쌍에 표시한다. 그 목적을 위해 닭 모래주머니 RLC 돌연변이 A를 사용하십시오26. 표지된 미오신 II를 액체N2 중 급속 동결하고, -80°C에서 보관한다. 참고: 이 표지 절차는 표지된 미오신이 천연 미오신 II 단백질로 활성화됨을 보장합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>UV-Vis 분광 광도계(재료 표)를 사용하여 원유 단백질 용액의 흡광도를 측정하고 다음 흡광 계수를 사용하여 Beer-Lambert 법칙으로 단백질 농도를 추론합니다. G-액틴(ε290 = 26,460 M−1·cm−1), GST-파시온(ε 280 = 99,330 M−1·cm−1), 미오신 II 이량체(ε 280 = 268,800 M−1·cm−1), 및 RLC 돌연변이 A (ε280 = 3,960 M−1·cm−1)19.</li>
</ol>3. 시료 전처리
참고: 미오신 II 모터의 큰 응집체와 강력한 수동 가교제 파신의 존재 하에서 액틴 단량체를 중합하여 거시적으로 수축하는 탄성 악토미오신 네트워크19,23을 생성합니다. 용액에 형광 비드를 첨가하면 겔 수축 동안 용매 흐름을 추적할 수 있습니다.
<ol><li>단백질 ( "actomyosin") 용액<ol><li>G-액틴을 제외하고 단백질을 -80°C에서 소량으로 보관하고 사용하기 전에 37°C에서 해동합니다. 악토미오신 용액의 총 부피는 40μL입니다.</li>
		<li>10 mM Tris pH 7.4, 2 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1 mM ATP, ATP 재생 시스템 (0.5 mg · mL-1 크레아틴 키나아제 및 5 mM 크레아틴 포스페이트), 200 μM EGTA (킬레이트 Ca2+ 이온), 표백 방지 용액 (0.1 mg · mL-1 포도당 산화 효소, 0.018 mg · mL-1 카탈라아제 및 5 mg · mL-1 포도당), 5μM G-액틴, 280nM GST-파시안 및 1.67nM 미오신 II. 표지 된 G- 액틴의 비율은 5 % (몰 백분율)입니다. 참고: 낮은 비율의 라벨이 붙은 G-액틴을 사용하여 젤 수축의 진행 단계에서 형광 신호의 포화를 피하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>미오신 II 모터 응집체 준비<ol><li>myosin 모터를 응집체 형태로 단백질 용액에 첨가하십시오. 큰 미오신 응집체(150 미오신 이량체/응집체)를 형성하려면 미오신 원액을 10mM Tris pH 7.4로 희석하여 최종 농도 25mM KCl에 도달합니다.</li>
		<li>희석된 미오신 용액을 실온(RT)에서 10분 동안 보관한 후 사용할 때까지 얼음에 옮깁니다. 모터는 최대 2시간 동안 완전히 작동합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>용매 흐름 측정<ol><li>겔 기공을 가로지르는 용매 흐름을 추적하려면 형광 비드를 악토미오신 용액에 추가합니다. 비드를 부동태화하여 비드와 악토미오신 네트워크 사이의 상호작용을 감소시킵니다. 실제적으로, 1 μL의 비드(재료표)를 5 μM G-액틴과 함께 RT에서 20분 동안 인큐베이션한 다음, 원심분리(재료표)에 의해 과량의 G-액틴을 제거한다(조건: 4°C에서 5분 동안 6,000 x g).</li>
		<li>10mg·mL-1 소 혈청 알부민(BSA)(재료 표)으로 이 단계를 반복하여 코팅되지 않은 나머지 표면을 차단합니다. 실험에서 1:10,000 vol/vol의 최종 희석으로 비드를 사용합니다. 알림: 모든 단계에서 비드/기공 크기 비율이 <1이 되도록 비드의 직경을 겔 기공 크기에 맞게 조정하는 것이 중요합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>용액 점도의 영향<ol><li>glycerol (재료의 표)를 actomyosin 용액에 첨가하여 용액의 점도를 조절하십시오. 0% 내지 34% 범위의 중량%로 글리세롤을 첨가하는 것은 용액 점도의 상응하는 η ω 내지 2.76 η ω의 증가를 유도하며, 여기서 η ω는 20°C에서의 물의 점도이다28. 알림: 글리세롤로 작업할 때 점성 유체 처리를 위해 전용 피펫을 사용하는 것이 필수적입니다(재료 표).</li>
	</ol></li>
</ol>4. 실험 실행
<ol><li>수제 샘플 홀더 취급<ol><li>PEG 부동태화 커버슬립 중 하나를 가져다가 그 위에 기름칠한 파라필름 스페이서를 놓고 샘플 홀더에 놓습니다. 알림: 파라필름 스페이서를 다른 스페이서로 교체할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>악토마이오신 용액 준비<ol><li>다양한 미세 성분을 통합하고, 미오신 II 모터 응집체를 추가하고, 마지막으로 EGTA를 추가하여 미세 원심분리 튜브의 얼음 위에 악토미오신 용액을 준비합니다. 용액을 잘 섞는다. EGTA의 첨가는 실험의 시작 시간을 설정하는 악토미오신 네트워크 중합을 개시한다.</li>
	</ol></li>
	<li>해당 용액 1.1μL를 홀더에 장착된 커버슬립에 놓고 두 번째 커버슬립을 맨 위에 놓습니다. 홀더를 조여 샘플을 밀봉합니다. 이 과정은 디스크와 같은 모양을 채택하는 방울을 약간 압착합니다. 낙하 직경은 2,800-3,000 μm 사이입니다.</li>
	<li>현미경에 샘플 홀더를 놓고 수집을 시작합니다. 초기 획득 시간을 줄이기 위해 현미경을 미리 준비하십시오. 일반적으로 혼합 후 샘플 이미징을 시작하는 데 1-2분이 걸립니다.</li>
</ol>5. 현미경 기술
<ol><li>전용 소프트웨어(Table of Materials)에 의해 제어되는 도립 형광 현미경(Table of Materials)을 사용하여 샘플을 이미지화합니다.<ol><li>2.5x/0.075 Plan-NEOFLUAR 대물렌즈(재료 표)의 저배율을 사용하여 전체 겔 영역을 시각화하고 시간에 따른 거시적 수축을 추적합니다.</li>
		<li>10x/0.3 Ph1 UPlanFL 대물렌즈(재료 표)를 사용하여 네트워크 다공성 및 구조를 특성화하고 시간 경과에 따른 네트워크 자체 구성 및 수축을 추적합니다. 참고: 이 대물렌즈는 네트워크 내에서 미오신 II 모터 응집체의 위치를 파악하고 겔 기공을 가로지르는 형광 비드의 이동을 추적하는 데에도 유용합니다. 더 높은 배율은 감소된 시야를 희생시키면서 사용할 수 있으며, 이는 이중 색상 이미징 모드(재료 표)에서 훨씬 더 중요합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>488nm(액틴/형광 비드) 및 561nm(미오신 모터 응집체/형광 비드)에서 샘플을 여기시킵니다. 스트리밍 모드에서 전용 소프트웨어(재료 표)를 사용하여 프레임당 100ms의 속도로 이미지를 수집하고, EMCCD(Electron Multipliing Charge-Coupled Device) 카메라(재료 표)를 사용합니다. 알림: 형광등 lamp (재료 표) 강도는 네트워크 수축 중 신호 포화를 피하기 위해 가능한 가장 낮은 값으로 유지되어야 합니다.</li>
	<li>동시 2색 이미징<ol><li>이 모드는 (i) 액틴 네트워크 내에서 미오신 모터 응집체의 국소화를 감지하고 (i) 네트워크 수축 동안 내부 및 외부의 외부 용매 흐름을 특성화하는 두 가지 목적으로 사용합니다.</li>
		<li>액틴 및 미오신 II 모터를 각각 488nm 및 561nm에서 여기시키고 이중 방출 장치(재료 표)를 사용하여 EMCCD 카메라(재료 표)에 이미지를 동시에 기록합니다. 동일한 이미징 시스템을 사용하여 액틴 겔(488nm)과 형광 비드(561nm)를 동시에 이미징합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

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여기서, 시험관내 접근법은 세포 세포골격의 모델 시스템으로서, 그리고 보다 일반적으로는 다공탄성 물질로서 거동하는 것으로 밝혀진 세포 세포질의 다공탄성 악토미오신 겔의 역학을 특성화하기 위해 사용된다 3,5. 세포 세포 골격(세포질)의 유변학은 기계적 스트레스가 가해진 후 세포 내 세포질 유체가 세포 내에서 재분배되는 데 걸리는 시간을 나타내는 다공탄성 확산 상수를 특징으로 합니다. 세포는 모양을 조절하기 위해 이 메커니즘을 사용하는 것이 제안되었다5.
이러한 발견에 동기를 부여하여 우리는 시험관 내에서 다공성 탄성을 연구하기 위한 프레임워크를 개발했습니다. 제안된 모델 시스템을 사용하여 미오신 수축성이 유체 흐름의 출현에 어떻게 기여하는지, 네트워크 속도와 용매 속도, 방향성 및 속도가 시간과 공간에...

살아있는 세포는 독특한 기계적 성질을 가지고 있습니다. 적용된 힘에 수동적으로 반응하는 능력 외에도 외부 자극에 반응하여 능동적으로 힘을 생성할 수 있습니다1. 다양한 세포 과정, 특히 세포 운동성 동안 필수적인 이러한 특성은 주로 세포 세포 골격, 특히 극성 액틴 필라멘트, 미오신 분자 모터 및 부속 단백질의 활성 겔인 악토미오신 세포 골격의 기계적 및 동적 특성에 기인합니다. 이러한 악토미오신 네트워크는 액틴 필라멘트를 가교결합하고 ATP 가수분해에 의해 연료가 공급되는 네트워크에서 기계적 응력을 능동적으로 생성하는 미오신 운동 단백질에 의해 구동되는 고유한 자기 조직화 및 수축 특성을 나타냅니다2.
세포골격3의 물질적 성질을 연구하기 위해 수많은 실험적, 이론적 연구가 수행되었다. 일반적으로 받아 들여지는 견해는 세포 골격이 점탄성 물질로 행동한다는 것이다4. 즉, 짧은 시간 척도에서 세포 골격은 탄성 물질로 작용하고 긴 시간 척도에서는 가교 단백질과 미오신 운동 분리 (및 재 부착)로 인해 점성 유체로 작용하여 네트워크가 동적으로 회전할 수 있습니다. 그러나, 많은 상황에서, 점탄성 모델은 실험 결과를 설명할 수 없으며, 이는 세포골격 및 보다 일반적으로는 다공탄성 활성 물질로서 기술되는 세포 세포질을 기술하는 그림과 더 일치한다 5,6. 이러한 유형의 재료를 특징 짓는 두 가지 주요 특징이 있습니다. (i) 첫 번째 주요 특징은 세포 블리빙(cell blebbing)7, 운동성(motility)8, 세포 모양 진동(cell shape oscillation)9과 같은 과정의 기초가 되는 미오신 모터(myosin motor)에 의해 구동되는 수축성 구배(contractability gradients)에 의해 겔 공극을 가로지르는 관통 세포질("용매")의 흐름의 생성이다. 이러한 세포질 흐름의 출현은 세포 운동성과 같이 국소적, 출혈 또는 전 세계적일 수 있습니다. 후자의 경우, 세포 후면에 수축 가해진 응력은 세포질 유체의 흐름을 세포 전면으로 유도하여 라멜리포디아 조립에 필요한 단백질 풀을 보충한다8. (ii) 두 번째 주요 특징은 응력의 완화가 확산되고 겔 탄성률, 겔 다공성 및 용매 점도에 따라 달라지는 유효 확산 상수를 특징으로 한다는 것입니다5. 다공탄성 확산 상수는 시스템이 적용된 응력에 얼마나 빨리 반응하는지를 결정합니다. 확산 상수가 높을수록 응력 재분포가 빨라집니다. 이것은 차례로 미오신 모터에 의해 생성된 활성 수축 응력과 같은 외부 또는 내부의 기계적 응력을 가한 후 세포 내 세포질 유체가 세포 내에서 재분배되는 데 걸리는 시간을 결정합니다. 따라서 이러한 예는 세포 골격과 세포질의 역학이 밀접하게 결합되어 있으며 별도로 치료할 수 없음을 보여줍니다3.
세포는 다양한 방식으로 기계적 특성을 조절할 수 있기 때문에 네트워크 역학과 유체 흐름 역학 간의 상호 작용은 잘 이해되지 않고 있습니다. 강력한 대안적 접근법은 다양한 미세 성분 및 시스템 파라미터를 완전히 제어할 수 있는 시험관 내 재구성 시스템을 사용하는 것이며, 이는 이러한 모델 시스템을 물리적 분석에 최적으로 만듭니다(10,11). 이 접근법은 액틴 기반 운동성 12,13,14,15,16,17,18, 악토미오신 네트워크의 2D 패터닝에 대한 단백질 구성 및 시스템 기하학의 영향을 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다 19,20,21,22, 그리고 다공성 악토미오신 겔의 네트워크 수축성과 유체 흐름 역학 사이의 상호 작용, 이는 이 논문의 초점입니다23.
이 원고에서는 제어 가능한 치수 및 재료 특성의 수축성 탄성 악토미오신 네트워크의 준비는 Ideses et al.23의 연구를 기반으로 논의됩니다. 수축 겔과 배출 된 용매의 역학을 분석하고 정량화하여, 이러한 악토 미오신 겔이 다공성 활성 물질로 설명 될 수 있음을 입증합니다. 응력 확산도에 대한 용매 점도의 영향을 연구하면 이러한 네트워크의 다공성 탄성 특성을 추가로 확인할 수 있습니다. 데이터 정량화에 사용되는 다양한 스케일링 관계가 제공됩니다. 마지막으로, 실험 과제, 일반적인 함정 및 실험 결과와 세포 골격의 관련성에 대해서도 논의합니다.

<table><tbody><tr><td>(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>175617</td><td>4 °deg의 아르곤 대기권 하에서 저장; 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Bio-Lab ltd</td><td>1070521</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488</td><td>Invitrogene</td><td>A10254</td><td>DMSO로 희석, -20 °C의 아르곤 분위기 하에서 저장; 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 647</td><td>Invitrogene</td><td>A20347</td>은 <td>DMSO로 희석되어 -20°C의 아르곤 분위기 하에 보관됩니다. 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma -Aldrich Company</td><td>A3059</td><td>4 &deg에 저장; 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma -Aldrich Company</td><td>C9322</td><td>재고 병은 -20°C의 건조한 분위기(실리카 겔)에서 보관됩니다. C</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Mezel-glaser</td><td>CG2222-1.5</td><td>Piranha 처리 후 milliQ-water에 보관하고 3주 이내에 사용</td></tr><tr><td>크레아틴 키나아제</td><td>Roche 생명 과학 제품</td><td>10736988001</td><td>글리신 완충액에서 신선하게 준비하여 얼음에 보관하고 3일 이내에 사용했습니다. 스톡 병은 4 &deg의 건조한 분위기 (실리카겔)로 유지됩니다. C</td></tr><tr><td>크레아틴 인산</td>염 <td>Roche 생명 과학 제품</td><td>10621714001</td><td>용해 될 때 -20 &deg로 유지해야합니다. C는 3 달 안에 사용했습니다. 스톡 병은 아르곤 분위기 하에 보관되고 4°C에 보관됩니다. C</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Roche 생명 과학 제품</td><td>10708984001</td><td>용해 시 -20°C로 유지해야 합니다. C 및 3개월 이내에 사용</td></tr><tr><td>듀얼 뷰 동시 이미징 시스템&nbsp;</td><td>광도</td><td>DV2-CUBE</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>MP 바이오 메디컬</td><td>195174</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD 카메라</td><td>Andor Technology Ltd</td><td>DV 887</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD 카메라</td><td>광도 측정</td><td>Evolve Delta</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Bio-Lab ltd</td><td>525050300</td><td></td></tr><tr><td>형광 램프</td><td>Rapp 광전자</td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광 브라이트 YG Microspheres</td><td>Polysciences</td><td>17151-10</td><td>200 nm 직경</td></tr><tr><td>포도당</td><td>ICN Biomedicals Inc</td><td>194024</td><td>용해 될 때 -20 °C로 유지해야합니다. C는 3 달 안에 사용했습니다.</td></tr><tr><td>포도당 산화 효소</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>G7141</td>은 <td>-20 &deg에서 유지했습니다. C는 3 달 안에 사용했습니다. 재고 분말은 아르곤 분위기 하에서 유지되고 -20 &deg로 유지됩니다. C</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>ICN Biomedicals Inc</td><td>800687</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>MP Biomedicals</td><td>808822</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>시그마-알드리치 회사</td><td>216763</td><td>4°°C에 저장; 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>EMD 밀리포어 공사</td><td></td><td></td>529552</tr><tr><td>메탄올</td><td>바이오 랩 주식 회사</td><td>1368052100</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td></td><td></td>442615</tr><tr><td>현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMI3000</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-mal</td><td>Nanocs</td><td>PG1-ML-5k&nbsp;</td><td>Mw = 5000 Da. 무게에 따라 작은 배치로 나뉩니다. 아르곤 대기권의 밑에 -20 &deg에 저장하는; C</td></tr><tr><td>나일 레드 마이크로스</td><td>피어 Spherotech</td><td>FP-2056-2&nbsp;</td><td>2300 nm 지름</td></tr><tr><td>대물렌즈(10x)</td><td>Leica Germany</td><td>HC PL AP0</td><td>UPlanFL Numerical Aperture = 0.3</td></tr><tr><td>대물렌즈(2.5x)</td><td>Leica Germany</td><td>506304</td><td>&nbsp; Plan-NEOFLUAR 개구수 = 0.075</td></tr><tr><td>오븐</td><td>WTC 바인더</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td>Amcor</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>PBS 버퍼</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>셔터 드라이버</td><td>Vincet Associates</td><td>VMM D1</td><td></td></tr><tr><td>실리카겔</td><td>Merck</td><td>1.01907.5000</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Elma</td><td>Elmasonic P</td><td></td></tr><tr><td>황산</td><td>Carlo Erba 시약</td><td>410301</td><td></td></tr><tr><td>DV2 듀얼 채널 동시 이미징 시스템</td><td>광량</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>MP Biomedicals</td><td>819620</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS 분광 광도계</td><td>Pharmacia</td><td>Ultraspec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>MICROMAN E</td><td>Gilson</td><td>FD10001</td><td>1&ndash; 10</td></tr><tr><td>uL MATLAB R2017b</td><td>MathWorks</td><td></td><td>데이터 정량화&nbsp;</td></tr><tr><td>메타모프&nbsp;</td><td>분자 장치</td><td></td>광학 <td>이미징 시스템의 제어 소프트웨어; 데이터 정량화(입자 추적 분석, 네트워크 메시 크기)</td></tr></tbody></table>

세포 세포 골격의 모델 시스템으로서의 (poro-) 탄성 수축 actomyosin 네트워크의 역학

The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

세포는 적극적으로 모양을 바꾸고 운동성을 가질 수 있으며, 이는 내부 구조를 능동적으로 재구성하는 능력에 달려 있습니다. 이 특징은 세포 세포 골격의 기계적 및 동적 특성, 특히 고유 수축 특성을 나타내는 극성 액틴 필라멘트, 미오신 모터 및 보조 단백질의 활성 겔인 악토미오신 세포 골격에 기인합니다. 일반적으로 받아 들여지는 견해는 세포 골격이 점탄성 물질로 작용한다는 것입니다. 그러나 이 모델은 실험 결과를 항상 설명할 수 없으며, 이는 세포골격을 다공탄성 활성 물질(세포질에 내장된 탄성 네트워크)로 설명하는 그림과 더 일치합니다. 미오신 모터에 의해 생성된 수축성 구배는 겔 기공을 가로질러 세포질의 흐름을 유도하며, 이는 세포골격과 세포질의 역학이 밀접하게 결합되어 있음을 추론합니다. 다공탄성의 주요 특징 중 하나는 겔 탄성률, 다공성 및 세포질(용매) 점도에 따라 달라지는 효과적인 확산 상수를 특징으로 하는 네트워크의 응력 확산 완화입니다. 세포는 구조와 물질 특성을 조절할 수 있는 여러 가지 방법이 있기 때문에 세포 골격 역학과 세포질 흐름 역학이 어떻게 결합되는지에 대한 우리의 현재 이해는 잘 알려져 있지 않습니다. 여기서, 시험관 내 재구성 접근법은 세포 세포 골격에 대한 모델 시스템으로서 다공성 악토미오신 겔의 물질 특성을 특성화하기 위해 사용됩니다. 겔 수축은 미오신 운동 수축력에 의해 구동되며, 이는 침투 용매의 흐름의 출현으로 이어진다. 이 논문은 이러한 젤을 준비하고 실험을 실행하는 방법을 설명합니다. 또한 용매 흐름과 겔 수축을 지역 및 글로벌 규모에서 측정하고 분석하는 방법에 대해서도 논의합니다. 데이터 정량화에 사용되는 다양한 스케일링 관계가 제공됩니다. 마지막으로, 세포 세포 골격 역학과의 관련성을 포함하여 실험적 과제와 일반적인 함정에 대해 논의합니다.

실험당 두 개의 유리 커버슬립이 사용됩니다. 유리 커버슬립은 PEG 폴리머로 세척 및 부동태화됩니다. 패시베이션은 초기 실험 단계에서 가용화된 단백질이 유리 표면에 부착되는 것을 방지하고 수축 네트워크와 유리 벽의 상호 작용을 최소화하는 데 필수적입니다. 좋은 패시베이션을 달성하지 못하면 비효율적인 수축이 발생할 수 있으며 극단적인 경우 액틴 네트워크 형성을 억제할 수도 있습니다.
그림 1은 표면 처리 절차의 세 가지 주요 단계를 설명합니다. 이러한 단계는 다음을 포함한다 : (i) 커버 슬립 표면으로부터 유기 오염을 제거하고 유리 표면에 OH 그룹을 노출시키는 피라 냐 용액을 사용한 표면 세정 및 친수화; (ii) 실란을 유리 표면에 공유 결합시키는 것을 목표로하는 (3- 메르 캅토 프로필) 트리 메 톡시 실란을 사용한 표면 실란 화, 각 실란 분자는 SH 그룹으로 끝납니다. (iii) PEG 폴리머 (mPEG-mal, 5 ...

이 연구에서는 통제된 조건에서 악토미오신 겔의 다공성 탄성을 연구하기 위해 시험관 내 재구성 접근법을 사용합니다. 악토미오신 겔과 포매된 용매의 역학을 정량화하여 네트워크 다공탄성을 입증합니다. 또한 실험적 과제, 일반적인 함정 및 세포 골격 역학과의 관련성에 대해서도 논의합니다.

세포 세포 골격의 모델 시스템으로서의 (Poro-) 탄성 수축 Actomyosin 네트워크의 역학

Cells can actively change their shapes and become motile, a property that depends on their ability to actively reorganize their internal structure. This ...

우리는 세포 세포 골격의 모델 시스템으로서의 다공탄성 악토미오신 겔의 역학을 특성화하기 위한 시험관 내 접근법을 개발했으며, 보다 일반적으로 다공탄성 활성 물질로 거동하는 것으로 밝혀진 세포질. 이 방법은 미오신 수축성이 유체 흐름의 출현에 어떻게 기여하는지, 그리고 네트워크와 세포질 속도가 시간과 공간에서 어떻게 상관되는지에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 간단한 접근 방식을 통해 AFIM과 같은 기존 도구를 사용할 수 없는 정교한 장비나 기술을 사용하지 않고도 동적으로 진화하는 시스템의 기계적 특성을 추출할 수 있습니다.이 방법은 활성 겔과 포매된 유체의 특이성에 관계없이 다공성 활성 물질의 유변학에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 시작하려면 수제 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 홀더에 10-12 개의 1.5 번 유리 커버 슬립을 넣고 400 밀리리터 비커에 피라냐 용액을 준비하십시오. 화학 후드의 얼음 위에 용액을 준비하십시오.홀더를 피라냐가 채워진 비커에 옮깁니다. 3 시간 후, 홀더를 신선한 이중 증류수로 채워진 깨끗한 비커로 옮겨 커버 슬립에서 과도한 피라냐를 씻어 내고 비커를 80 헤르츠의 초음파 처리 욕조로 옮기고 섭씨 25도에서 10 분 동안 최대 전력으로 옮깁니다. 신선한 이중 증류수로 이 단계를 두 번 더 반복합니다.염분화를 위해 홀더를 300 밀리리터의 순수한 메탄올로 채워진 깨끗한 비커로 옮긴 다음 30 분 동안 초음파 처리 욕조에 넣습니다. 그런 다음 홀더를 실란 용액으로 옮깁니다. 비커를 파라필름으로 밀봉하고 섭씨 4도의 냉장고에 밤새 보관합니다.다음날 홀더를 300ml의 순수 메탄올로 채워진 깨끗한 비커에 15초 동안 옮깁니다. 홀더 바닥을 건조시켜 과도한 메탄올을 제거하고 깨끗한 비커에 옮깁니다. 그런 다음 비커를 오븐으로 옮겨 섭씨 120도에서 5분 동안 유리 커버슬립을 건조시킵니다.표면 패시베이션을 달성하려면 각 실험에 대해 두 개의 커버 슬립을 가져 와서 처음에 에탄올로 세척 한 파라 필름 층으로 코팅 된 페트리 접시에 넣습니다. 섭씨 22도에서 1시간 동안 1X PBS에 1밀리리터의 메톡시폴리에틸렌 글리콜 말레이미드와 함께 각 커버슬립을 배양합니다. 배양 과정이 끝나면 페트리 접시를 기울여 제거하고 못을 박습니다.각 커버 슬립을 5 밀리리터의 이중 증류수로 헹구고 질소 가스의 흐름으로 건조시킵니다. 커버 슬립은 패시베이션 후 젖은 상태로 유지해야하므로 즉시 10 밀리 몰의 트

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

시험관 내에서 액토미오신 다발의 형성 및 광학 핀셋을 사용한 미오신 앙상블 힘 생성 측정이 제시되고 논의됩니다.

광학 핀셋을 사용하여 액틴 필라멘트 번들에서 미오신 앙상블 역학 조사

차동 동적 현미경 (DDM)은 동적 광산란과 현미경의 기능을 결합합니다. 여기서, DDM을 사용하여 비멘틴 네트워크에서 입자의 서브확산 및 케이징된 역학을 정량화함으로써 재구성된 세포골격 네트워크를 특성화하는 과정과 활성 미오신 구동 액틴-미세소관 복합체의 탄도 운동이 제시된다.

차등 동적 현미경을 사용하여 세포 골격 역학 정량화

이 프로토콜은 형광 현미경을 사용하여 재구성된 막 연결 세포골격 네트워크의 역학을 연구하기 위해 지지된 지질 이중층의 형성과 세포골격 필라멘트 및 운동 단백질의 추가를 설명합니다.

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

이 원고에서는 F-actin 세포 골격을 거대한 unilamellar 지질 소포 (리포솜이라고도 함)로 캡슐화하는 실험 기술과 리포솜 막의 내부 전단지에 피질 생모방 F- 액틴 층을 형성하는 방법을 보여줍니다.

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

이 논문은 공동 얽힌 액틴 필라멘트와 미세 소관의 조정 가능한 3차원 복합 네트워크를 엔지니어링하고 특성화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 복합 재료는 미오신 II 및 키네신 모터에 의해 구동되는 능동적 구조 조정 및 탄도 운동을 거치며 액틴, 미세 소관, 운동 단백질 및 수동 가교제의 상대적 농도에 의해 조정됩니다.

조정 가능한 모터 구동 역학 및 역학을 사용한 Actin-Microtubule 복합재 재구성 및 특성화

액토미오신 수축성은 세포 및 조직 형태 형성에 중요한 역할을 합니다. 그러나, 생체 내에서 악토미오신 수축성을 급격히 조작하는 것은 어렵다. 이 프로토콜은 초파리 배아에서 Rho1 매개 악토미오신 수축성을 빠르게 억제하는 광유전학적 시스템을 설명하여 생체 내에서 악토미오신이 비활성화된 후 상피 긴장의 즉각적인 손실을 나타냅니다.

Rho1 매개 악토미오신 수축성의 광유전학적 억제와 초파리 배아의 상피 긴장 측정

여기에서는 정제된 단백질로부터 준2차원(2D) 얽힘, 가교 및 액정 액틴 어셈블리를 준비하는 방법을 제시합니다.

Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops (시험관 내 활성 활성 어셈블리의 수축성 및 변형 모드 조정: 2차원 활성 네트워크에서 액정 방울까지)

본 프로토콜은 마이오신 모터 활성이 막 유사 인터페이스에서 분지형 액틴 조립 및 네트워크 구조에 어떠한 영향을 미치는지 정량적으로 조사하기 위한 조절 가능한 액틴 코멧-테일 비드 운동성 분석법을 설명합니다.

비드 기반 액틴 코멧 꼬리 운동성 분석법을 이용한 마이오신-I 매개 분지 액틴 조립의 재구성

전통적인 2 차원 세포 배양 기술은 종종 차별화 마커, 크린 시토킨 및 성장 요인과 관련하여 변경된 특성의 결과. extravillous trophoblast 세포 라인과 함께 그림과 같이 회전 세포 배양 시스템의 세 가지 차원 세포 배양 (RCCS)는 이러한 요소 중 많은 표현 reestablishes.

인간 세포 배양을위한 회전 세포 배양 시스템 : 모델로 인간 Trophoblast 셀

우리는 endoderm 및 dopaminergic (DA) 뉴런에 전파하고 배아 줄기 세포의 분화에 대한 효과적인 3D 플랫폼으로 microencapsulation 기술을 최적화했습니다. 또한 이식하는 동안 호스트에서 세포의 면역 - 절연을위한 기회를 제공합니다. 이 플랫폼은 다른 세포 유형에 적응하실 수 있습니다.

다른 Lineages로 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 전파 및 차별 화를위한 3D 플랫폼으로서 알긴산의 Microcapsule

학습하세요 세포 골격 모델에서 포로탄성 액토미오신 겔의 역학을 연구하는 방법을. 이 단순한 시험관 내 접근법은 미오신 수축성과 유체 흐름의 관계를 밝히고 동적 시스템의 기계적 특성을 정교한 장비 없이 추출합니다.

세포 세포 골격의 모델 시스템으로서의 (Poro-) 탄성 수축 Actomyosin 네트워크의 역학

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