유전자 코드 확장을 이용한 박테리아 분비 단백질의 초고해상도 이미징

유전자 코드 확장 또는 GCE는 다른 라벨링 전략의 한계를 극복합니다. 이를 통해 특이적으로 표지된 단백질의 위치를 파악할 수 있으며, 시각화를 가능하게 하는 밝은 유기 형광단을 가지고 있으므로 단백질 기능을 방해할 수 있는 형광 단백질 융합을 만드는 전략을 피할 수 있습니다. 이 방법은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

예를 들어, 우리는 지카 CO 단백질을 라벨링하는 데 사용했으며, 이를 통해 숙주 세포를 감염시키는 것을 관찰할 수 있는 라벨링된 지카 바이러스를 제공하고 생산할 수 있습니다. 시작하려면 100 마이크로 리터의 1 차 배양 물을 밀리 리터 당 35 마이크로 그램의 클로람페니콜과 밀리 리터 당 100 마이크로 그램의 암피실린을 함유 한 5 밀리리터의 LB 배지로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 250RPM으로 진탕하면서 600나노미터의 광학 밀도가 0.6에 도달할 때까지 배양합니다.

LB 배지를 비표준 아미노산인 1밀리몰 TCO가 보충된 변형된 N-최소 배지로 교체합니다. 그리고 섭씨 34도에서 30분 동안 박테리아를 키웁니다. 아라비노스 0.2%, 클로람페니콜 밀리리터당 25밀리그램, 암피실린 밀리리터당 100밀리그램을 넣고 250RPM으로 진탕하면서 6시간 더 세포를 성장시킵니다.

6시간 후, 비정준 아미노산 또는 ncAA가 없는 신선한 MgM 배지로 30분 간격으로 박테리아를 4회 세척합니다. 박테리아를 원심분리하고 PBS 완충액에 다시 현탁한 다음 암흑 속에서 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양하여 과도한 ncAA를 제거합니다. 1 시간 후, 박테리아를 섭씨 4도에서 15 분 동안 3, 000 G에서 원심 분리하고 추가 사용을 위해 보관하십시오.

대조 실험의 경우, ncAA가 없는 상태에서 ncAA 보유 단백질을 발현하여 동일한 실험을 반복합니다. TCO와 혼입된 SseJ를 발현하는 살모넬라 세포를 PBS에서 TCO의 부재 또는 존재 하에 재현탁한다. PBS에서 600 나노미터에서 4로 광학 밀도를 조정하고, 암흑 속에서 섭씨 37도에서 20 마이크로몰 Janelia Fluor 646 테트라젠 또는 20 마이크로몰 BDPFL 테트라진으로 세포를 배양하고, 250 RPM에서 1 내지 2시간 동안 흔들어 준다.

세포를 펠렛화하고 5% DMSO 및 0.2% Pluronic F-127을 함유한 PBS로 3-4회 세척합니다. 5%DMSO를 함유한 PBS에 펠릿을 다시 현탁합니다. 어둠 속에서 섭씨 4도에서 밤새 배양한 후 PBS로 다시 두 번 세척합니다.

컨포칼 현미경을 사용하여 세포를 즉시 이미지화하거나 PBS의 1.5% 파라포름알데히드로 실온에서 30-45분 동안 암흑 속에서 고정합니다. 페니실린 스트렙토마이신과 함께 10% FBS가 보충된 고혈당 DMEM에서 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 95%에서 HeLa 세포를 배양하고 유지합니다. 감염 하루 전에 균을 배양하고, 표준 LB 배양액을 함유하는 항생제 5mm에 직교 tRNA 합성효소 쌍을 함유하는 pEVOL 플라스미드와 pWSK29 플라스미드를 함유하는 야생형 살모넬라균 단일 콜로니를 섭씨 37도에서 250RPM으로 진탕하여 하룻밤 동안 접종한다.

희석된 세포 스톡을 밀리리터당 100, 000 세포로 복구하고 8웰 챔버 슬라이드에서 10% FBS 성장 배지를 함유하는 500 마이크로리터의 DMEM에서 웰당 50, 000 HeLA 세포를 시드한다. 챔버 슬라이드를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 95%에서 24시간 동안 인큐베이터에 보관합니다. 세균 감염의 경우, 100 마이크로리터의 하룻밤 박테리아 배양을 밀리리터당 35 마이크로그램 및 밀리리터당 100 마이크로그램의 암피실린을 함유하는 LB 배지 3밀리리터에 희석하여 pEVOL 플라스미드 및 SseJ 유전자를 함유하는 pWSK29 플라스미드를 보유하는 야생형 살모넬라균을 계대배양한다.

섭씨 37도에서 250RPM으로 5-7시간 동안 진탕하여 배양합니다. HeLa 세포 감염을 시작하기 위해 인큐베이터에서 HeLa 세포를 꺼낸 후 예열된 DPBS로 세포를 세척하고 10% FBS를 함유한 500마이크로리터의 신선한 DMEM을 각 웰에 추가합니다. 감염이 시작될 때까지 챔버 슬라이드를 이산화탄소 인큐베이터에 다시 놓습니다.

5 내지 7 시간의 배양 후, 600 나노 미터에서의 광학 밀도가 DMEM 성장 배지 1 밀리리터에서 0.2가되도록 살모넬라 배양 물을 희석하고, 살모넬라 접종 물의 필요한 양을 챔버 슬라이드의 각 웰에 첨가하여 감염의 다중도가 100이되도록한다. 감염된 세포를 이산화탄소 배양기에서 30분 동안 배양한 후 예열된 DPBS로 세포를 3회 세척하여 세포외 살모넬라균을 제거한다. 이 시점을 감염 후 0시간으로 설정하고 1시간 동안 겐타마이신 밀리리터당 100마이크로그램을 포함하는 완전한 배지 500마이크로리터를 추가합니다.

인큐베이션 후, 다시 앞서 나타낸 바와 같이 DPBS로 세포를 3회 세척하고, 0.2% 아라비노스로 보충된 완전 배지 500마이크로리터, 겐타마이신 밀리리터당 10마이크로그램을 챔버 슬라이드의 각 웰에 첨가한다. 대조 실험에서, TCO 없이 HeLa 세포의 유사한 감염을 수행한다. 챔버 슬라이드를 이산화탄소 인큐베이터에서 10시간 동안 배양한 후, 완전 배지를 TCO가 없는 새로운 완전 배지로 교체하고, 예열된 DPBS로 각각 30분 간격으로 4회 HeLa 세포를 세척하였다.

그런 다음 TCO없이 신선한 완전 배지로 세포를 세척하십시오. 감염 후 12시간 후, 세포에서 배지를 흡인하고 예열된 DPBS로 세포를 두세 번 세척합니다. 웰의 한 그룹에서, 염료 용액 혼합물 1의 500 마이크로리터를 추가하고, 동일한 챔버 슬라이드의 웰의 다른 그룹에서, 염료 용액 혼합물 2의 500 마이크로리터를 추가한다.

챔버 슬라이드를 다시 이산화탄소 인큐베이터에 1시간 및 1/2 내지 2시간 동안 놓는다. 감염 후 13.5 내지 14 시간 후, 헬라 세포를 예열 된 DPBS로 두 번 헹구고, FBS가 보충 된 신선한 DMEM 500 마이크로 리터를 첨가한다. 30분 동안 배양한 후, 앞서 나타낸 바와 같이 예열된 DPBS로 세포를 다시 세척한 후, 30분 간격으로 신선한 DMEM으로 4회 세척한다.

감염 후 16 시간에, 200 마이크로 리터의 4 % 파라 포름 알데히드를 각 웰에 첨가하고 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 배양하여 파라 포름 알데히드로 헬라 세포를 고정시킨다. 파라포름알데히드를 흡인합니다. PBS로 3회 헹구고 세포를 섭씨 4도의 어둠 속에서 PBS에 보관한다.

세포를 현미경으로 가져오고 이미징 챔버를 현미경 s에 놓습니다.tage 샘플 홀더. 그런 다음 갓 만든 GLOX BME 이미징 버퍼 0.4 밀리리터로 웰의 배지를 교체합니다. 레이저 출력을 약 1밀리와트로 줄여 관심 있는 HeLa 세포를 식별하고 초점면과 레이저 빔 각도를 조정하면서 647나노미터의 낮은 레이저 밀도로 샘플을 비춥니다.

HILO 조명 각도를 조정합니다. 표적 구조의 분율 제한 이미지에 대한 참조를 캡처하고 레이저를 최대 출력으로 돌려 형광단을 어두운 상태로 전환합니다. 프리앰프 게인을 3으로 설정하고 프레임 전송을 활성화합니다.

그런 다음 dSTORM 측정에서 더 높은 감도를 위해 EM 게인을 200으로 설정합니다. 깜박이는 이벤트가 공간과 시간에서 분리되는 적절한 수준으로 레이저 강도를 조정합니다. 노출 시간을 30밀리초로 설정하고 획득을 시작합니다.

10, 000에서 30, 000 프레임을 획득합니다. 서로 다른 ROI에서 유사한 획득을 반복합니다. dSTORM의 영상 재구성을 위해 영상 J를 열고 원시 데이터를 가져옵니다.

Thunderstorm 플러그인을 열고 장치에 해당하는 카메라 설정을 구성합니다. 분석 실행으로 이동하여 이미지 필터링, 위치 파악 방법 및 분자의 하위 픽셀 위치 파악과 같은 적절한 설정을 지정합니다. 확인을 클릭하여 이미지 재구성을 시작하고 후처리 최종 결과 분석을 시작합니다.

TCO와 함께 통합된 SseJ를 발현하는 살모넬라균은 Janelia Fluor 646 테트라진으로 처리되고 TCO의 부재 또는 존재 하에 Janelia Fluor 646 형광으로 이미지화됩니다. SseJ의 형광은 TCO가 존재할 때만 검출됩니다. HeLa 세포는 16시간 동안 psseJ-HA를 보유하는 살모넬라균에 감염되고, 항HA 항체, LPS 및 DAPI로 고정되고 면역염색됩니다.

예상한 바와 같이, SseJ 의존성 살모넬라 유도 필라멘트 또는 SIF가 감염된 세포에서 형성된다. TCO가 없는 경우, 호박 코돈은 억제되지 않고, SseJ 의존성 SIF는 감염된 헬라 세포에 존재하지 않는다. SseJ 의존성 SIF는 TCO의 존재 하에서 관찰되며, 이는 SseJ가 유전자 코드 확장 또는 GCE를 사용하여 SseJF10TCOHA의 발현에 의해 구조되었음을 명확하게 나타낸다.

두 개의 대체 염료 혼합물 1과 염료 혼합물 2를 사용한 SPIEDAC 클릭 반응을 통해 HeLa 세포에서 분비된 SseJF10TCOHA의 표지 특이성이 여기에 나와 있습니다. 클릭 염료 Janelia Fluor 646 TZ를 추가로 사용하여 TCO 및 P 볼트 플라스미드의 존재 하에 SseJ HA를 운반하는 야생형 살마넬라로 감염된 HeLa 세포에서 임의의 배경 표지가 있었는지 관찰하였다. SseJ는 세포내 또는 비특이적 형광 신호 없이 숙주 세포의 세포질 내로 방출되어 형광 신호가 SseJ에 특이적임을 입증하였다.

HeLa 세포에서 GCE 표지 SseJ의 초고해상도 이미징이 이 그림에 나와 있습니다. 관찰 중인 HeLa 세포의 명시야 이미지가 여기에 나와 있습니다. TCO 및 Janelia Fluor 646으로 표지된 분비된 SseJ의 회절 제한 광시야 이미지와 SseJ 데코레이팅된 SIF의 해당 dSTORM 이미지가 여기에 제시되어 있습니다.

인서트는 박스형 영역에서 슈퍼 리졸브된 SseJ의 확대 보기를 보여줍니다. NCAA 스톡 용액은 NaOH에서 제조되었습니다. 미디어에 추가하기 전후에 중화하는 것을 잊지 마십시오.

관심 있는 단백질을 라벨링한 후 세포를 광범위하게 세척하여 배경 신호가 최소화되도록 합니다. GCE 절차에 따라 이제 박테리아의 독성 인자에 라벨을 붙이고 이미징 기술을 사용하여 그 활동을 추적할 수 있습니다.