Name: 확장 가능한 3D 엔지니어링 근육 조직의 전임상 약물 테스트 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 배우세요 3D 엔지니어링 근육 조직을 이용한 고처리량 약물 스크리닝 방법을 자기 감지 시스템으로 24개 샘플을 동시에 분석하여 심장 및 골격근 질환의 신약 개발과 질병 모델링에 활용할 수 있습니다.

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이 작업은 식품의약국(U01 FD006676-01, 보건 및 환경 과학 연구소에 수여)과 국립 보건원(HL151094에서 Dr. Geisse)의 자금 지원으로 부분적으로 지원되었습니다. 이 원고를 준비하는 데 도움을 주신 Alec S. T. Smith 박사에게 감사드립니다.

<ol><li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4, 150(2013).</li>
<li>Mudera, V., Smith, A. S. T., Brady, M. A., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cell+density+on+the+maturation+and+contractile+ability+of+muscle+derived+cells+in+a+3D+tissue-engineered+skeletal+muscle+model+and+determination+of+the+cellular+and+mechanical+stimuli+required+for+the+synthesis+of+a+postural+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The effect of cell density on the maturation and contractile ability of muscle derived cells in a 3D tissue-engineered skeletal muscle model and determination of the cellular and mechanical stimuli required for the synthesis of a postural phenotype.</a> Journal of Cellular Physiology. 225 (3), 646-653 (2010).</li>
<li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li>
<li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), 126(2018).</li>
<li>Fleming, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+skeletal+muscle+capable+of+functional+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human skeletal muscle capable of functional regeneration.</a> BMC Biology. 18 (1), 145(2020).</li>
<li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 4, 04885(2015).</li>
<li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLOS One. 15 (5), 0232081(2020).</li>
<li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10, 6918(2020).</li>
<li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li>
<li>Vila, O. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+human+neuromuscular+function+through+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Quantification of human neuromuscular function through optogenetics.</a> Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).</li>
<li>Khodabukus, A., Baar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+electrical+stimulation+emphasizing+excitability+for+the+development+and+testing+of+engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (5), 349-357 (2011).</li>
<li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+%26+Nerve%22%5BJournal%5D)">Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle & Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li>
<li>Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+force+and+frequency+analysis+of+engineered+human+heart+tissue+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+using+magnetic+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Enineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing.</a> Tissue Enineering Part C Methods. 22 (10), 932-940 (2016).</li>
<li>Smith, A. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput%2C+real-time+monitoring+of+engineered+skeletal+muscle+function+using+magnetic+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">High-throughput, real-time monitoring of engineered skeletal muscle function using magnetic sensing.</a> bioRxiv. , 492879(2022).</li>
<li>Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thrombin-fibrinogen+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The thrombin-fibrinogen interaction.</a> Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).</li>
<li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li>
<li>Carvalho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxorubicin%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Doxorubicin: the good, the bad and the ugly effect.</a> Current Medicinal Chemistry. 16 (25), 3267-3285 (2009).</li>
<li>Ahmad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+dysfunction+associated+with+a+nucleotide+polymerase+inhibitor+for+treatment+of+hepatitis+C%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Cardiac dysfunction associated with a nucleotide polymerase inhibitor for treatment of hepatitis C.</a> Hepatology. 62 (2), 409-416 (2015).</li>
<li>Gill, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+cover%3A+Investigative+nonclinical+cardiovascular+safety+and+toxicology+studies+with+BMS-986094%2C+an+NS5b+RNA-dependent+RNA+polymerase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">From the cover: Investigative nonclinical cardiovascular safety and toxicology studies with BMS-986094, an NS5b RNA-dependent RNA polymerase inhibitor.</a> Toxicological Sciences. 155 (2), 348-362 (2017).</li>
<li>Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C3-Butanedione+monoxime+%28BDM%29+as+a+myosin+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">2,3-Butanedione monoxime (BDM) as a myosin inhibitor.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 23 (4), 305-308 (2002).</li>
<li>Fryer, M. W., Gage, P. W., Neering, I. R., Dulhunty, A. F., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralysis+of+skeletal+muscle+by+butanedione+monoxime%2C+a+chemical+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Paralysis of skeletal muscle by butanedione monoxime, a chemical phosphatase.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 411 (1), 76-79 (1988).</li>
<li>Fleming, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regeneration+of+tissue+engineered+skeletal+muscle+in+vitro+is+dependent+on+the+inclusion+of+basement+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Functional regeneration of tissue engineered skeletal muscle in vitro is dependent on the inclusion of basement membrane proteins.</a> Cytoskeleton. 76 (6), Hoboken. 371-382 (2019).</li>
<li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20(2019).</li>
<li>Tsui, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+electroconductive+decellularized+extracellular+matrix+hydrogels+for+engineering+human+cardiac+microphysiological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tunable electroconductive decellularized extracellular matrix hydrogels for engineering human cardiac microphysiological systems.</a> Biomaterials. 272, 120764(2021).</li>
<li>Tsui, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conductive+silk-polypyrrole+composite+scaffolds+with+bioinspired+nanotopographic+cues+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Conductive silk-polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering.</a> Journal of Materials Chemistry B. 6 (44), 7185-7196 (2018).</li>
<li>Gabella, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+cells%2C+nerves%2C+fibroblasts+and+vessels+in+the+detrusor+of+the+rat+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Smooth+Muscle+Research%22%5BJournal%5D)">Muscle cells, nerves, fibroblasts and vessels in the detrusor of the rat urinary bladder.</a> Journal of Smooth Muscle Research. 55 (0), 34-67 (2019).</li>
<li>Christov, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+satellite+cells+and+endothelial+cells%3A+close+neighbors+and+privileged+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).</li>
<li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+environment+for+the+study+of+fibrosis%3A+A+3D+human+muscle+model+with+endothelium+specificity+and+endomysium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineering an environment for the study of fibrosis: A 3D human muscle model with endothelium specificity and endomysium.</a> Cell Reports. 25 (13), 3858-3868 (2018).</li>
<li>Gilbert-Honick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+functional+and+histological+regeneration+of+vascularized+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineering functional and histological regeneration of vascularized skeletal muscle.</a> Biomaterials. 164, 70-79 (2018).</li>
<li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li>
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모든 저자는 Mantarray 하드웨어 및 관련 소프트웨어를 상용화하는 회사인 Curi Bio Inc.의 직원 및 지분 보유자입니다.

이 연구는 24웰 소모품 주조 키트 내에서 3D 엔지니어링 심장 및 골격근 조직을 생성하는 방법을 설명합니다. 이러한 방법을 따르면 후속 약물 스크리닝을 위한 캐스팅 실패 없이 24개 조직의 완전한 배열을 일관되게 달성할 수 있습니다. 이러한 결과를 달성하기 위한 중요한 고려 사항은 캐스팅 중에 하이드로겔의 조기 중합을 방지하기 위해 모든 단계를 얼음 위에서 수행하고, 조직 캐스팅 전에 세포 해리 시약을 제거하고, 각 조직에 대한 세포와 하이드로겔 현탁액의 철저한 혼합, 조직 간 피펫 팁 교체, 열 비활성화 FBS(전혀 사용하지 않는 경우)의 사용을 보장합니다. 또한 주조가 시작되면 포스트 격자가 움직이지 않고 하이드로겔이 형성되면 부드럽게 이동되도록 하는 것이 중요합니다.
주요 변형에는 심장 대 골격 EMT를 달성하기 위한 다양한 세포 유형의 사용과 세포 성숙 및 조직 안정성을 촉진하기 위해 다양한 농도의 기저막 단백질로 하이드로겔을 도핑하는 것이 포함됩니다. 이러한 도핑의 유익한 효과는 사례별로 테스트되어야 하지만 특정 상황에서 기능적 결과와 조직 수명을 향상시키는 것으로 나타났습니다14,16,22. 또한 나열된 세포 밀도는 지침이며 다른 세포주에 맞게 최적화해야 할 수도 있습니다. 대안적인 하이드로겔 조성물은 또한 달성된 EMTs23,24,25의 구조적 및 기능적 특성을 변형시키는 수단으로서 고려될 수 있다. 천연 근육 미세 환경에는 또한 형태와 기능에서 근세포를 지원하기 위해 혈관 형성, 신경 분포 및 매트릭스 침착을 촉진하는 지지 세포 유형이 포함되어 있습니다26,27. 여기에 설명된 시스템은 현재 섬유아세포를 3D 심장 조직에 통합하지만, 추가 세포 유형은 시험관 내에서 치료 화합물의 안전성과 효능을 연구하기 위해 보다 생리학적으로 관련된 모델을 생성할 수 있습니다. 이전에는 다양한 지지 세포 유형이 3D 엔지니어링 조직에 성공적으로 통합되어 자기 감지 수축성 플랫폼 28,29,30을 사용하여 향후 연구를 위한 흥미로운 템플릿을 제시했습니다.
이 프로토콜의 문제 해결은 주조 공정 중 신뢰할 수 없거나 일관되지 않은 조직의 형성에 중점을 둡니다. 하이드로겔은 혼합하는 동안 세포의 균일한 분포를 촉진하면서 캐스팅될 때 기포가 형성되지 않도록 주의해야 합니다. 이상적인 세포 밀도, 세포 비율 및 매트릭스 구성을 식별하기 위해 각각의 새로운 세포 유형에 대해 최적화 실험이 필요할 수 있습니다.
이 기술의 주요 한계는 24개의 EMT로 구성된 전체 플레이트를 설정하는 데 필요한 상당한 수의 셀입니다. 여기에 제시된 데이터의 경우 플레이트당 1,500만 개의 심근 세포와 1,800만 개의 골격 근모세포가 사용되었습니다. 특정 연구자들은 이러한 대규모 세포 물질 풀에 접근하지 못할 수 있으며, 이로 인해 이 플랫폼을 최대한 활용하는 능력이 저해될 수 있습니다. 최종 사용자가 자기 감지 하드웨어에 액세스할 수 없는 경우 사후 처짐 측정을 광학적으로 수행해야 하므로 처리량이 크게 감소하고 여러 웰에서 근육 수축이 동시에 기록되지 않습니다. 그러나 Mantarray 하드웨어는 이러한 한계를 극복하여 여러 구조에서 동시에 EMT 수축을 지속적이고 비침습적으로 분석할 수 있는 최초의 상용 시스템을 제공합니다.
24웰에 걸친 자기 감지는 EMT 기능 발달에 대한 종단 연구를 실시간으로 용이하게 하고 화학적, 환경적 또는 유전자 조작에 대한 급성 반응을 정확하게 측정할 수 있습니다. 자기 감지는 여러 조직에서 동시에 측정할 수 있고 복잡한 데이터 분석이 필요하지 않은 몇 가지 장점이 있지만, 광학 감지 방법을 사용하면 칼슘 플럭스 또는 전압 매핑과 같은 생리학적 지표를 동시에 측정할 수 있습니다. 그러나 결과 섹션에 설명된 것과 같은 데이터 세트는 이 기술이 약물 개발 분야에서 가지고 있는 응용 프로그램의 폭을 보여줍니다. 시중에 나와 있는 분석법이 공학적 근육의 수축 출력을 직접 평가할 수 있는 수단을 제공한다는 점을 감안할 때 이러한 방법은 전임상 개발 파이프라인에 혁명을 일으킬 잠재력을 가지고 있습니다.

유도만능줄기세포(iPSC) 모델은 기초 생물학적 연구 및 질병 모델링 1,2,3,4,5뿐만 아니라 치료제 발견 및 개발을 위한 전임상 파이프라인에서 점점 더 핵심적인 역할을 하고 있습니다. iPSC에서 파생된 심장 및 골격근과 같은 수축 조직은 근육 수축력 및 동역학의 직접적인 평가가 전체 조직 기능을 연구하기 위한 정량적 지표이기 때문에 인간 시험관 내 연구의 예측력을 향상시킬 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다 4,6,7,8. 전형적으로, 수축력의 측정은 기판 편향(9,10)의 광학적 추적에 의해 간접적으로 또는 힘 변환기(4,11,12)에 세포/조직을 부착함으로써 직접적으로 얻어졌다. 이러한 방법은 정확하지만 본질적으로 처리량이 낮으며 일반적으로 데이터를 수집하고 분석하려면 고도로 숙련된 작업자가 필요합니다.
이전 연구에서는 자기장 감지가 이러한 장애물을 우회하고 여러 조직 구조에 걸쳐 공학적 근육 기능을 동시에 평가하는 대체 방법을 제공한다는 것을 보여주었습니다13. Mantarray(Magnetometric Analyzer for eNgineered Tissue ARRAY) 3D 수축성 플랫폼은 이 기술을 기반으로 하며, 고처리량 스크리닝을 통해 3D 세포 모델의 복잡성을 활용하는 고도로 평행한 방식으로 조작된 근육 조직의 수축성을 측정할 수 있는 장치를 사용합니다14. 이 플랫폼은 표준 세포 배양 인큐베이터 내부 또는 외부의 심장 및 골격근 조직의 수축 기능에 대한 라벨 없는 정량적 실시간 모니터링을 가능하게 하여 광학 기반 수축성 이미징 및 분석의 필요성을 제거합니다. 이 기술은 건강한 세포주와 질병에 걸린 세포주의 직접적인 비교를 용이하게 하고 수축 조직에 대한 약물의 효과를 측정하여 신규 및 기존 치료 화합물에 대한 정량화 가능한 시험관 내, 안전성 및 효능 데이터를 확립합니다.
엔지니어링된 3D 근육 조직은 Mantarray 소모품인 24웰 주조 플레이트를 사용하여 재현성이 높은 방식으로 두 기둥 사이에서 제작할 수 있습니다(그림 1). 한 기둥은 단단하고 다른 기둥은 유연하고 작은 자석이 있습니다. 조직 구조가 수축하면 유연한 기둥과 내장된 자석을 대체합니다. EMT 플레이트는 기기 내에 배치되며 플레이트 홀더 아래의 회로 기판에 있는 일련의 자기 센서를 통해 사후 변위를 측정합니다. 측정된 자기장의 변화는 수학적 알고리즘을 사용하여 절대 수축력으로 변환됩니다. 이 기기는 빠른 데이터 샘플링 속도를 사용하여 수축 빈도, 속도 및 감쇠 시간을 포함하여 분석 중인 세포 유형의 기능적 용량 및 성숙도에 대한 자세한 정보를 수집할 수 있습니다. 이러한 기능 측정은 자기 감지 플랫폼을 사용하여 24개 웰 모두에서 동시에 또는 기존의 광학 방법을 사용하여 개별적으로 순차적으로 얻을 수 있습니다.
이 연구는 피브린 기반 하이드로겔에서 3D 골격근 및 심장 미세조직을 엔지니어링하기 위한 재현성이 높은 방법을 설명합니다. 80분간의 짧은 반응 동안, 트롬빈은 피브리노겐이 피브린으로 전환되는 것을 촉매하여, 근육 세포가 부유 배양액에서 발달할 수 있는 스캐폴드를 제공한다15. 기질 세포는 매트릭스를 리모델링하는 데 도움이 되며 근육 세포가 하이드로겔 내에서 융합체를 형성함에 따라 조직이 수축하게 됩니다. 이러한 조직의 수축성은 화합물 노출 전후에 자기 감지 접근 방식을 사용하여 분석되었으며, 용량-반응 약물 연구에 사용하기 위해 이 양식을 검증했습니다. 건강한 기증자 생검에서 얻은 1차 인간 근모세포는 상업적으로 입수하여 공급업체의 프로토콜에 따라 2D로 배양했습니다. 세포는 3D 조직을 제작하기에 충분한 세포 수를 생성하기 위해 3개의 계대를 통해 골격근 성장 배지를 사용하여 확장되었습니다. 기질 세포 및 hiPSC 유래 심근 세포를 3일 동안 공급업체의 프로토콜에 따라 배양하여 세포를 조직으로 캐스팅하기 전에 냉동 보존에서 회복할 수 있도록 했습니다. 자기 감지 플랫폼을 사용하여 수집할 수 있는 데이터 세트의 유형을 보여주는 대표적인 결과가 제공됩니다. 이러한 방법을 사용하여 조작된 조직의 생성과 관련된 일반적인 함정도 해결됩니다.

<table><tbody><tr><td>100 &마이크로; M 세포 스트레이너&nbsp;</td><td>CELLTREAT</td><td>229485</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 세포 배양 접시</td><td>ThermoFisher</td><td>150466</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Steriflip 필터</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td></td><td></td>SCGP00525</tr><tr><td>500 mL 필터 플라스크</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td></td><td></td>S2GVU05RE</tr><tr><td>6-aminocaproic acid</td><td>Sigma</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Cardiosight Maintenance Medium</td><td>NEXEL</td><td>CM-002A</td><td></td></tr><tr><td>Cardiosight Plating Medium</td><td>NEXEL</td><td>CM-020A</td><td></td></tr><tr><td>C-Pace EM stimulator&nbsp;</td><td>아이오옵틱스&nbsp;</td><td></td><td></td>EM</tr><tr><td>Curi Bio 근육 분화 미디어 키트</td><td></td><td>기본 - DIFF</td><td></td></tr><tr><td>Curi Bio 근육 유지 미디어 키트</td><td>Curi Bio</td><td>Primary - MAINT</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>시그마</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Dystrophin 항체&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab154168</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10082147</td><td>반드시 열 비활성화</td></tr><tr><td>Fibrinogen (Bovine)</td><td>Sigma</td><td>E8630</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>Sigma</td><td>354400</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F10</td><td>Gibco</td><td>11550043</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td></td><td></td>Z359629</tr><tr><td>HS-27A 섬유아세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-2496</td><td></td></tr><tr><td>인간 골격근 근아세포&nbsp;</td><td>론자&nbsp;</td><td>CC-2580</td><td></td></tr><tr><td>루어락 0.2 &마이크로; m 주사기 필터</td><td>Corning</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock 10 mL 주사기</td><td>BH 공급</td><td>BH10LL</td><td></td></tr><tr><td>Mantarray Instrument</td><td>Curi Bio</td><td>MANTA-24-B1</td><td>시스템</td></tr><tr><td>Mantarray 플레이트 키트</td><td>Curi Bio</td><td>MA-24-SKM-5</td><td>5개 키트</td></tr><tr><td>Mantarray 자극 뚜껑</td><td>Curi Bio</td><td>EM</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (ECM)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes</td><td>NEXEL</td><td>C-002</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Nikon Ti2E</td><td>MEA54000</td><td></td></tr><tr><td>Pan Myosin Heavy Chain 항체&nbsp;</td><td>DSHB</td><td>MF-20</td><td></td></tr><tr><td>폴리(에틸렌이민)</td><td>Sigma</td><td>P3143</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 억제제</td><td>StemCell Technologies</td><td>Y-27632</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>골격근 성장 매체 (SkGM-2)</td><td>Lonza</td><td>CC-3245</td><td></td></tr><tr><td>표준 24-웰 플레이트</td><td>Greiner</td><td>M8812&nbsp;</td><td>다른 제조업체의 플레이트는 맞지 않습니다.</td></tr><tr><td>표준 6웰 플레이트</td><td>: ThermoFisher</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>스트롬 배지(DMEM + 20% FBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T175 필터 플라스크</td>, <td>ThermoFisher</td><td>159910</td><td></td></tr><tr><td>T225 필터 플라스크</td>, <td>ThermoFisher</td><td>159934</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin,</td><td></td><td>Sigma T4648</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution, 0.4%</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A1217702</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (1x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>12563011</td><td></td></tr></tbody></table>

확장 가능한 3d 엔지니어링 근육 조직의 전임상 약물 테스트

Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

체외에서 건강 및 질병 상태를 정확하게 모델링하는 것은 새로운 치료 전략 및 치료법 개발에 매우 중요합니다. 심장 및 골격근 질환의 경우 수축력과 동역학이 근육 기능을 평가하기 위한 핵심 지표를 구성합니다. 유도 만능 줄기 세포로부터 조작된 근육 조직(EMT)을 생성하는 새롭고 개선된 방법은 수축 조직에 대한 시험관 내 질병 모델링을 보다 신뢰할 수 있게 만들었습니다. 그러나 부유 세포 배양에서 조직을 재현 가능하게 제작하고 수축성을 측정하는 것은 어려운 일입니다. 이러한 기술은 종종 높은 고장률로 어려움을 겪고 복잡한 계측 및 맞춤형 데이터 분석 루틴이 필요합니다. 3D EMT를 무표지, 고도의 병렬 및 자동화 친화적인 수축성 분석과 함께 활용하는 새로운 플랫폼 및 장치는 이러한 많은 장애물을 우회합니다. 이 플랫폼을 사용하면 거의 모든 셀 소스를 사용하여 3D EMT를 쉽고 재현 가능하게 제작할 수 있습니다. 그런 다음 복잡한 소프트웨어 분석 루틴 없이 24개의 조직을 동시에 측정하는 기기를 통해 조직 수축성을 측정합니다. 이 기기는 마이크로뉴턴의 힘 변화를 안정적으로 측정할 수 있으므로 용량 의존적 화합물 스크리닝을 통해 약물 또는 치료제가 수축 출력에 미치는 영향을 측정할 수 있습니다. 이 장치로 만든 조작된 조직은 완전히 기능하여 전기 자극 시 경련 및 파상풍 수축을 생성하며 몇 주 또는 몇 달에 걸쳐 배양에서 종단으로 분석할 수 있습니다. 여기에서는 예상치 못한 심장 독성으로 인해 환자 사망 후 임상 시험에서 가져온 약물(BMS-986094)을 포함하여 알려진 독성 물질을 급성 및 만성 투여 중인 심장 근육 EMT의 데이터를 보여줍니다. 미오신 억제제 치료에 대한 반응으로 조작된 조직에서 변경된 골격근 기능도 제시됩니다. 이 플랫폼을 통해 연구원은 최소한의 추가 교육이나 기술로 복잡하고 정보가 풍부한 생체 공학 모델 시스템을 약물 발견 워크플로에 통합할 수 있습니다.

세포는 2-포스트 소모성 플레이트에서 조작된 근육 조직으로 캐스팅되었습니다(그림 1). 성공적인 EMT는 균일하게 나타나고 매트릭스는 기둥 사이에 고르게 분포됩니다(그림 2A). 매트릭스는 또한 두 기둥을 감싸서 조직에 대한 동등한 앵커 포인트를 생성해야 합니다. 이 방법에서는 주조 실패가 드물며 일반적으로 육안 검사로 분명합니다. 실패한 EMT 생산은 포스트에서 조직 분리(그림 2B)와 같은 치명적인 실패에서 기포 및 포스트에 대한 느슨한 부착과 같은 보다 미묘한 구조적 결함(그림 2C, D)에 이르기까지 다양할 수 있습니다. 경미한 결함이 있는 조직은 여전히 실행 가능할 수 있지만 이러한 조직의 데이터를 주의 깊게 검사하여 손상되지 않은 EMT와 비교할 수 있는지 확인해야 합니다. 예를 들어, EMT 내의 기포는 시간이 지남에 따라 조직이 압축됨에 따라 압착되어 수축 결함 없이 완전한 기능을 하는 구조를 만들 수 있습니다. 그러나 이러한 조직은 기포의 위치가 기능 회복에 영향을 미칠 수 있으므로 사례별로 평가해야 합니다. 예를 들어, 기둥에서 생성된 기포는 조직 부착에 영향을 미쳐 기둥에 대한 장기적인 부착을 방해할 수 있습니다.
조직은 세포가 하이드로겔 내의 매트릭스를 리모델링함에 따라 처음 24시간 이내에 압축되기 시작합니다(그림 3). 압축은 점진적인 과정이며 일반적으로 배양의 처음 2-4 주 동안 진행됩니다. 전반적으로 조직 압축은 기술적 복제물과 생물학적 복제물 간에 일관됩니다(그림 4). 일부 세포주는 시간이 지남에 따라 조직이 성숙함에 따라 다른 세포주보다 매트릭스를 더 압축하는 것이 정상입니다. 작제물 내의 근형성 세포의 비율은 EMT 압축의 속도 및 전반적인 정도에 영향을 미친다. 심장 및 골격근 세포주의 총 근형성 함량은 조작된 조직 간의 변화를 최소화하기 위해 80% 이상이어야 합니다. 이는 세포주 전반에 걸쳐 수축력과 동역학을 비교할 때 특히 중요합니다.
캐스팅 후 처음 며칠 이내에 심근 세포는 배양에서 자발적으로 뛰기 시작하여 각 근육 수축과 함께 유연한 포스트를 리드미컬하게 구부립니다. 골격근 구조는 분화 시작 후 7일까지 전기 자극에 반응하여 수축합니다. 현장 자극은 맞춤형 24웰 전극 뚜껑에 부착된 외부 자극기를 통해 골격근 조직에 적용되었습니다. 각 웰에 대해 한 쌍의 탄소 전극으로 제작 된 뚜껑은 24 웰 조직 플레이트 위에 놓여 있으며 동시에 각 EMT를 자극하여 근육 수축을 유도합니다. 조직은 기능 측정 동안 1Hz에서 10ms 펄스 지속 시간 동안 10V 자극을 사용하여 속도를 조절했습니다. 수축 조직은 융합된 골격 근모세포를 나타내며, 기능적 육관과 수축 기계로 완성된 근관을 형성합니다. 골격 EMT는 미오신 중쇄(MyHC)에 대해 양성으로 염색되고 디스트로핀은 근관막에 국한되어 단면 면역조직화학 분석에서 고전적인 고리 모양을 나타냅니다(그림 5). EMT가 작동하면 자기 감지 장비에서 수축성을 매일 측정할 수 있으며, 시간이 지남에 따라 구조가 발달하고 성숙함에 따라 추적력과 동역학을 추적할 수 있습니다. 심장 및 골격근 조직은 모두 3D 배양에서 몇 주에서 몇 달 동안 수축 상태를 유지하며(그림 6) 광범위한 수축성 연구에 사용할 수 있습니다.
자기 검출 접근법은 독소루비신(그림 7) 및 BMS-986094(그림 8)와 같은 구조적 심장 독성 물질과 근육 수축력에 영향을 미치는 기타 약물의 급성 및 만성 영향을 동시에 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 수축 감지의 광학 추적 방법도 사용할 수 있지만 측정이 순차적으로 수행되어야 하므로 급성 약물 효과를 연구할 때는 주의해야 합니다. 3D 배양에서 심장 및 골격 EMT의 수명이 연장되어 이러한 조직에서 장기적인 약물 연구가 가능합니다. 이를 통해 사용자는 독소루비신에서 발생하는 것처럼 시간이 지남에 따라 심장 독성 효과를 나타낼 수 있는 화합물에 대한 지속적이고 장기간 노출뿐만 아니라 반복 투여의 효과를 탐색할 수 있습니다. 독소루비신(Doxuruvicin, dox)은 항암화학요법 약물이다17. 환자에게 투여되는 약물의 양은 암의 유형, 환자의 나이, 환자의 키와 몸무게 및 기타 요인에 따라 다릅니다. 이러한 이유로 광범위한 농도 및 전달 일정에 걸쳐 dox의 효과를 테스트하는 것이 중요합니다. 여기에서 심장 EMT는 27일 동안 세 가지 개별 농도(0.1μM, 1μM 및 10μM)의 dox로 처리되었습니다(그림 7). 그룹은 각 농도에서 EMT를 볼루스 처리 또는 72시간마다 중간 교체와 함께 연속 투여로 처리하여 추가로 계층화되었습니다. dox의 볼루스 치료를 받은 웰은 3개의 개별 시점에서 약물에 노출되어 투여 사이에 회복이 가능했습니다. 두 번의 가장 높은 용량의 볼루스와 지속적인 노출은 연구 전반에 걸쳐 수축력 생성의 즉각적이고 장기간의 중단을 보여주었습니다. 중간 농도와 가장 낮은 농도는 투여 방법에 따라 조직에 다양한 영향을 미쳤다. 약물의 가장 낮은 농도에서, bolus 그룹은 대조군과 차이를 보이지 않았다. 그러나 수축력은 2주간의 연속 노출 후에 감소했습니다. 약물의 중간 범위 농도는 흥미로운 효과가있었습니다. 연속 투여는 치료 첫 이틀 동안 힘을 감소시키고 실험 내내 지속되었지만, 볼루스 그룹은 3일 후에 약물이 씻겨 나갔을 때 수축력이 대조군 수준으로 회복되는 것으로 나타났습니다. 그러나 약물의 두 번째 볼루스는 힘의 완전한 중단을 일으킨 후 회복되지 않았으며(그림 7), 이는 이 농도로 반복적으로 투여하면 이 약물로 치료받은 환자에게 심장 독성 효과가 있을 수 있음을 나타냅니다. 이 연구의 광범위한 범위는 시간 및 실험 조건 모두에서 독성 스크리닝에서 3D 엔지니어링 조직의 유용성을 강조하며, 이는 수축성을 유지하고 장기간에 걸쳐 화학 물질 노출에 반응하여 단일 근육 조직 세트 내에서 장기적인 약물 연구를 가능하게 하기 때문입니다. 이는 만성 노출로 인해 심장 독성 효과를 가질 수 있는 화합물을 식별할 뿐만 아니라 잠재적인 심장 독성 투여 시기를 감지하는 데 도움이 됩니다.
조작된 인간 근육 조직의 체외 독성 테스트는 임상 시험에서 인간 환자를 안전하게 보호하는 데 도움이 되는 한 가지 방법입니다. BMS-986094는 C형 간염 치료에 사용되는 뉴클레오티드 중합효소(NS5B) 억제제입니다. 이 약물은 Bristol-Myers Squibb가 환자18,19의 예상치 못한 심부전 사례로 인해 개발을 중단했을 때 2 상 임상 개발 중이었습니다. 여기에서 BMS-986094를 심장 EMT에 적용하여 3D 엔지니어링 근육 조직이 약물에 대한 심장 독성 반응을 일으키는지 여부를 테스트했습니다(그림 8). 세 가지 다른 농도의 약물을 적용하고 13일 동안 조직을 모니터링했습니다. 수축력은 용량 의존적 방식으로 약물의 첨가와 함께 감소하였다(도 8A). Twitch 빈도는 또한 박동률이 느려지고 심장 독성 화합물에 계속 노출되면 예상대로 중단됨에 따라 상당한 영향을 받았습니다(p &lt; 0.05, 그림 8B). 이러한 결과는 3D 공학적 인간 근육 조직이 어떻게 신약 출시를 촉진하고 심장 독성으로 인해 결국 실패하는 화합물에 플래그를 지정하는 데 사용될 수 있는지 보여줍니다. 더욱이 이 기술은 위험한 약물이 임상 시험에서 환자에게 투여되기 전에 노출시켜 잠재적으로 생명을 구할 수 있습니다.
인간 수축 조직에 대한 급성 및 만성 적용 약물의 효과를 측정하는 능력은 안전성과 효능에 대한 치료법을 조사할 때 중요한 첫 번째 단계입니다. 그러나 적용되는 약물의 농도가 생리학적으로 적절하고 체외 테스트에 적합하다는 것을 아는 것이 중요합니다. 골격근 조직은 가득 차있는 복용량 반응 곡선에 있는 2,3-Butanedione monoxime (BDM)를 위한IC50 가치를 확립하기 위하여 이용되었습니다. 이 약물은 골격근 myosin-II20의 잘 특성화 된 ATPase 억제제입니다. BDM은 육종에서 액틴 필라멘트와 함께 미오신 교차 다리 형성을 방지하여 근육 수축을 억제합니다21. 여기에 표시된 결과는 약물을 적용했을 때 절대 힘의 용량 의존적 감소와 약물이 씻겨 나갔을 때 수축력의 완전한 회복을 보여 주며, 일시적인 효과가 단순히 조직 내 세포를 죽이는 것이 아니라 근육 수축을 방지한다는 것을 나타냅니다(그림 9A). 또한, 조사된 7개 농도에 걸쳐 전체 용량-반응 곡선을 측정하여 이들 인간 미세조직에서 3.2mM의IC50 을 확립하였다(도 9B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig01.jpg"> 그림 1: 2-post Mantarray 소모품 24웰 플레이트에서의 EMT 주조 . (A) Myogenic 및 stromal 세포는 조직 캐스팅 전에 2D 표면에서 배양되었습니다. (B) 세포는 2D 표면에서 들어 올려지고 세포외 기질 단백질과 함께 혼합되어 삽입물에 표시된 개별 플레이트 캐스팅 웰에서 하이드로겔을 형성합니다. (C) 모든 웰에 조작된 조직을 포함하는 24웰 플레이트. (D) 자기 기둥의 변위를 비교하는 이완되고 수축된 공학적 근육을 보여주는 대표적인 조직(녹색 막대). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig02.jpg"> 그림 2: EMT 캐스팅 성공 및 실패 . (A) 조직 전체에 걸쳐 균질한 세포/매트릭스 구성으로 기둥 주위를 균일하게 압축한 24시간 후 캐스팅에 이상적인 엔지니어링 근육 조직. (B) 플렉시블 포스트로부터 하이드로겔의 분리를 보여주는 실패한 EMT. (C) 조직 전체에 걸쳐 기포를 포함하는 EMT. (D) 두 기둥 주위에 불균등한 조직 침착. 조직은 한쪽의 유연한 포스트에 느슨하게 고정되어 있습니다. 스케일 바는 1mm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig03.jpg"> 그림 3: 시간 경과에 따른 조작된 근육 조직의 압축. (A) 캐스팅 1일 후에 나타난 EMT 구성물. 조직은 분화 배지로 옮겨지고, 세포 융합 및 하이드로겔 압축의 0일째를 시작한다. (B-E) 7일차부터 21일차까지의 동일한 EMT는 시간이 지남에 따라 두 기둥 사이의 전체 길이가 약간 짧아지고 EMT의 중간 부분을 통해 측정할 때 너비가 더 작아집니다. 스케일 바는 1mm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig04.jpg"> 그림 4: 시간 경과에 따른 EMT 직경. 21일 동안 4개의 조직 플레이트를 추적하여 압축 전반에 걸쳐 EMT 직경을 비교했습니다. 각 조직은 광학 현미경을 사용하여 매주 중간 섹션을 통해 측정되었습니다. 시점은 플레이트 사이에 일관된 EMT 크기를 보여줍니다. 매트릭스 리모델링이 안정화됨에 따라 21일째에 최대 압축에 도달합니다. 표는 조직의 각 플레이트 내 압축의 표준 편차(전체의 %)와 모든 플레이트에 대한 평균 편차를 보여줍니다. 컬러 막대는 개별 플레이트입니다. 오차 막대는 플레이트 내의 EMT의 SD입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig05.jpg"> 그림 5: 조작된 골격근 조직의 면역조직화학. EMT는 배양 10일째에 고정되고 파라핀에 포매되었습니다. 얇은 단면(7μm)을 이미징 전에 미오신 중쇄 및 디스트로핀에 대한 항체로 염색했습니다. 녹색 = MyHC, 빨간색 = 디스트로핀, 파란색 = DAPI. 대물 배율은 40X입니다. 스케일 바는 50μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig06.jpg"> 그림 6: 시간 경과에 따른 조작된 근육 조직의 수축력. (A) 배양에서 7일째부터 63일째까지 심장 EMT에서 측정한 평균 절대 경련력; n = 그룹당 3개. (B) 배양 7일째부터 53일째까지 일차 세포주로부터 유래된 골격 EMT의 평균 절대 트위치 힘; n = 3입니다. 오차 막대는 두 그래프 모두 SD입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig07.jpg"> 그림 7: 조작된 근육 조직에서의 급성 및 만성 독소루비신 치료. 0.1μM, 1μM 및 10μM의 세 가지 개별 용량 농도의 dox를 일시 투여하거나 27일 동안 조작된 근육 조직에 지속적으로 투여했습니다. 약물의 볼루스 용량은 0일, 12일 및 24일의 배지 변경 시 추가되었으며 X축의 녹색 화살표로 표시되었습니다. 약물은 연속 투여를 위해 모든 배지 교체에서 배지에 첨가되었으며, X축에 검은색 및 녹색 화살표로 표시되었습니다. 기준선 값(약물 전 치료)에서 힘의 변화율은 Y축에 있고 치료 일수(일)는 X축에 있습니다. 밝은 주황색 = DMSO 연속 제어, 짙은 주황색 = DMSO 볼루스 제어, 밝은 녹색 = 0.1μM dox 연속, 짙은 녹색 = 0.1μM dox 볼루스, 밝은 파란색 = 1μM dox 연속, 진한 파란색 = 1μM Dox 볼루스, 밝은 노란색 = 10μM Dox 연속, 짙은 노란색 = 10μM Dox 볼루스. 오차 막대는 SD입니다. 조건당 n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig08.jpg"> 그림 8: 조작된 근육 조직에서 BMS-986094를 사용한 만성 치료. EMT는 13일 동안 0.4μM(녹색), 2μM(진한 파란색) 및 10μM(연한 파란색) BMS-986094로 처리되었습니다. (A) 수축성 경련력(Y축)은 처음 2일 동안 모든 약물 농도에서 감소하는 반면, DMSO의 대조군 조직은 시간이 지남에 따라 계속 강해집니다(X축). (B) 심장 박동률 또는 경련 빈도는 그래프 A에 표시된 수축력의 중단과 함께 용량 의존적 방식으로 중단됩니다. DMSO(회색)의 대조군 조직은 실험 내내 규칙적인 박동수를 유지합니다. 오차 막대는 SD입니다. 조건당 n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64399/64399fig09.jpg"> 그림 9: 조작된 골격근 조직에서 BDM에 대한 용량 반응 . (A) 1차 세포 유래 EMT가 3D 배양에서 16일째 2,3-부탄디온 모노심(BDM)에 노출될 때 절대 경련력은 용량 의존적 방식으로 감소합니다. 절대 경련력은 약물이 씻겨 나갈 때 거의 기준선 값으로 돌아갑니다. (B) 기준선 값으로 정규화된 절대 트위치 힘은 전체 용량-반응 곡선 및IC50 값을 산출하는 BDM에 노출될 때 용량 의존적 방식으로 감소합니다. 투여량당 n = 4. 오차 막대는 SD입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64399/64399fig09large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 3D 엔지니어링된 심장 및 골격근 조직을 생성하는 방법을 제공하고 전임상 약물 스크리닝 양식에서의 사용을 설명합니다. 설명된 방법은 자기 감지 시스템을 사용하여 24개의 조직을 동시에 동시에 평가할 수 있습니다.

확장 가능한 3D 엔지니어링 근육 조직의 전임상 약물 테스트

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

당사의 플랫폼은 3D 엔지니어링 근육 조직과 자기 감지 하드웨어를 사용하여 24개의 웰에서 동시에 수축성을 측정합니다. 이는 인간 근육 조직을 사용하여 시험관 내에서 새로운 치료제를 평가하기 위한 더 높은 처리량 방법을 제공합니다. 당사의 주조 방법은 3D 엔지니어링 근육 조직을 제작할 때 일관성과 재현성을 향상시킵니다.우리는 플랫폼에서 수축성 측정 및 분석을 위해 자기 감지 하드웨어가 장착된 소모품 24웰 주조 플레이트를 설계했습니다. 이 방법은 수축성에 영향을 미치는 모든 근육 질환에 대한 체외 질병 모델링, 약물 발견 및 유전자 치료에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 우리는 현재 운동 뉴런을 3D 구조에 통합하여 신경근 접합 모델도 만들고 있습니다.시작하려면 미리 냉각된 조직 캐스팅 키트를 세포 배양 후드 내부의 차가운 블록이나 얼음 위에 놓습니다. 캐스팅 플레이트를 얼음 위에 평평하게 놓습니다. 기본 배지에 트롬빈을 추가하여 트롬빈 용액을 만들고 포스트 격자를 캐스팅 플레이트에서 새로운 멸균 24웰 플레이트로 이동합니다.50 마이크로리터의 트롬빈 용액을 캐스팅 플레이트의 미리 냉각된 각 웰에 피펫팅하고 격자를 키트에 다시 놓습니다. 캐스팅 키트를 얼음 위에 따로 보관하십시오. 다음으로, 500 밀리리터의 RPMI 배지, 10 밀리리터의 B27 및 2.5 그램의 아미노 카프로 산 (ACA)을 첨가하여 심장 EMT 배지를 준비한다.조직을 주조하는 데 사용할 EMT 배지를 꺼내 10 마이크로 몰 ROCK 억제제를 첨가하십시오. 1차 근모세포에 대해 50ml의 F10 배지와 0.25g의 아미노카프로산(ACA)을 추가하여 골격 EMT 배지를 준비합니다. IPSC 유래 근모세포에 0.1g의 ACA를 사용하십시오.이어서, ACA를 함유하는 주조 매체를 멸균 여과한다. 세포 배양 등급 해리 시약과 동일한 부피의 EMT 배지를 섭씨 37도까지 따뜻하게 합니다. 이 데워진 EMT 배지는 해리 시약을 희석하는 데 사용됩니다.PBS로 세포를 세척하고 데워진 해리 시약을 첨가하여 세포를 들어 올립니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 또는 세포가 들어 올려질 때까지 배양하고 플레이트 측면을 두드려 2-3분마다 배양을 확인합니다. 세포가 들어 올려지면 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다.단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 P-1000 피펫으로 분쇄합니다. 플레이트 및 플라스크를 추가 EMT 배지로 세척하여 나머지 세포를 수집하고 이들을 원뿔형 튜브에 첨가한다. 다시, 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 세포를 분쇄합니다.EMT 배지를 추가하여 해리 과정을 종료한 다음 세포 계수를 위해 세포 현탁액 샘플을 채취합니다. 자동 세포 계수기 또는 트리판 블루의 혈구계를 사용하여 세포 계수를 수행합니다. 세포를 200G에서 4분 동안 회전시키고, 상청액을 흡인하고, 세포를 EMT 염기 배지의 5밀리리터에 재현탁하여 잔류 해리 시약을 제거한다.4분 동안 다시 원심분리한 후, 상청액을 흡인하고 적절한 밀도로 세포 현탁액을 준비한다. 원하는 수의 조직을 구성하는 데 필요한 각 세포 용액의 부피를 계산하고 계산된 세포 부피를 15밀리리터 원뿔형 튜브에 피펫팅합니다. EMT 당 10 마이크로 리터의 피브리노겐을 세포 현탁액에 첨가하고 얼음 위에 놓으십시오.각 EMT가 최종 조직 구조에 90 마이크로 리터의 세포 현탁액, 10 마이크로 리터의 피브리노겐 및 50 마이크로 리터의 트롬빈 용액을 가지고 있는지 확인하십시오. 세포 배양 후드에서 조직 주조 키트의 뚜껑을 제거하고 기둥 격자가 얼음 위에 평평하게 놓인 주조 플레이트를 놓습니다. 세포 피브리노겐 혼합물을 혼합하고 P-200 피펫으로 100 마이크로 리터를 끌어 올립니다.50 마이크로리터의 트롬빈 용액으로 준비된 웰에 100 마이크로리터의 혼합물을 첨가하고 잘 섞이도록 5회 분쇄한다. 기포가 생기지 않도록 피펫을 첫 번째 스톱 지점으로 밀지 말고 분쇄 후 팁을 제거하십시오. 모든 조직을 캐스팅하기 전에 원추형 튜브에 세포 현탁액을 혼합하십시오.한 손의 포인터 손가락과 엄지 손가락을 사용하여 격자와 주조 우물 판을 동시에 잡고 격자의 움직임을 피하거나 판을 얼음 위에 평평하게 놓고 얼음 양동이를 흔들어 주조 판을 들여다보십시오. 모든 조직이 주조될 때까지 각 조직에 대해 새로운 P-200 팁으로 반복합니다. 시드 키트를 인큐베이터로 조심스럽게 옮기고 섭씨 37도에서 80분 동안 배양합니다.다음으로, 심장 조직을 위한 EMT 배지의 웰 당 2밀리리터를 갖는 새로운 24-웰 플레이트를 준비하고, 플레이트를 섭씨 37도에서 인큐베이션하여 배지를 가온한다. 80분 배양 후, EMT 배지 1밀리리터를 주조 웰의 가장자리에 부드럽게 첨가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 추가로 배양합니다. 10 분 배양 후, 포스트 격자를 조심스럽게 들어 올리고 주조 플레이트에서 따뜻한 배지로 준비된 24 웰 플레이트로 조직을 옮깁니다.마지막으로 조직이 있는 플레이트를 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 실패한 EMT 생산은 기둥에서 조직 분리와 같은 치명적인 실패에서 기포 및 두 기둥 주변의 불균등한 조직 침착과 같은 보다 미묘한 구조적 결함에 이르기까지 다양할 수 있습니다. 캐스팅 후 1일 후의 EMT 구조체가 여기에 표시됩니다.골격근 조직은 세포 융합 및 하이드로겔 압축의 제로일째부터 분화 배지로 옮겨졌다. 7 일째부터 28 일째까지 동일한 EMT는 EMT의 중간 부분을 통해 측정했을 때 두 기둥 사이의 전체 길이가 약간 짧고 너비가 더 작았습니다. 21일 동안 4개의 조직 플레이트를 추적하여 압축 전반에 걸쳐 EMT 직경을 비교했습니다.시점은 플레이트 사이에 일관된 EMT 크기를 보여줍니다. 매트릭스 리모델링이 안정화됨에 따라 21일째에 최대 압축에 도달합니다. EMT의 면역 조직 화학이 여기에 설명되어 있습니다.EMT는 배양 10일째에 고정되고 파라핀에 포매되었습니다. 얇은 단면을 이미징 전에 미오신 중쇄 및 디스트로핀에 대한 항체로 염색했습니다. 이 그래픽 이미지는 시간 경과에 따른 심장 EMT 및 골격 EMT에서 측정된 평균 절대 경련력을 나타냅니다.조작된 심장 조직에서의 급성 및 만성 독소루비신 치료가 여기에 나와 있습니다. 세 가지 다른 용량 농도의 Dox를 일시 투여하거나 27일 동안 조작된 심장 조직에 지속적으로 투여했습니다. 조작된 골격근 조직에서 BDM에 대한 용량 반응이 이 그림에 나와 있습니다.심장 박동수 또는 경련 빈도는 EMT가 이 화합물에 노출될 때 심장 독성을 나타내는 수축력의 중단과 함께 용량 의존적 방식으로 중단됩니다. 조직을 주조할 때 기억해야 할 가장 중요한 사항은 세포 현탁액과 시약을 포함하여 모든 것을 항상 차갑게 유지하고 주조가 시작되면 포스트 격자를 완전히 고정시키는 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

설계 근육 조직은 질병 모델로 또한 고기에 대한 대체 소스로, 재생 의료에 큰 가능성이 있습니다. 여기 마우스 myoblast의 전구 세포, 및 전기 펄스에 의해 자극에서이 경우에, 근육 구조의 기술에 대해 설명합니다.

전기 자극의 손쥐 Myoblast의 전구 세포 및 응용에서 공학 골격근 조직도

테스트 시스템으로 인간의 3D 종양 조직을 만들 수있는 방법이 설명되어 있습니다. 이러한 기술은 decellularized 생물 혈관을 비계 (BioVaSc), 인간의 기본 세포와 흐름 생물 반응기의 동적 조건에서뿐만 아니라 정적에서 배양 할 수있는 종양 세포 라인을 기반으로합니다.

인간의 3 차원의 조직 공학<em&gt; 시험관</em&gt; 종양 테스트 시스템

비소세포폐암(NSCLC) 표적 치료에 대한 민감도를 연구하기 위해 생물학적 콜라겐 골격을 기반으로 하는 3차원(3D) 폐암 모델을 제시합니다. 우리는 증식 지수, 세포사멸 및 상피-중간엽 전이(EMT) 상태를 결정하기 위해 다양한 판독 기술을 보여줍니다. 수집된 데이터는 약물 민감성 예측을 위해 인실리코(in silico) 모델에 통합됩니다.

결합 된 3 차원 조직은 엔지니어링<em&gt; 체외</em&gt; /<em&gt; 인 실리코</em특정 돌연변이 배경에서 약물의 효과를 예측&gt; 폐 종양 모델

유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)이 심근를 - 유래에서 여기, 우리는 인간의 조작 된 심장 조직의 생성을 보여줍니다. 우리는 HERG 채널 저해제 인 E-4031에 의해 수축력과 수축 패턴의 예시적인 변화를 분석하는 방법을 제시한다. 이 방법은 심장 약물 스크리닝 견고성과 높은 수준의 적합성을 나타낸다.

심장 약물 안전 검사를위한 인간 공학 심장 조직의 자동 수축 분석

이 프로토콜 cryogelation 기술로 제작을 통합 하 여 탄력 있는 3D macroporous microcryogels의 제작을 설명 합니다. 재생 치료를 촉진 하기 위하여 쉽게 주입된 비보 수 또는 생체 외에서 높은 처리량 마약 검사에 대 한 배열로 조립 셀 로딩 시 3D microtissues 생성 됩니다.

주 사용 재생 치료와 높은 처리량 마약 검사에 대 한 3D Microtissues

이 프로토콜은 약물 을 평가하기 위해 증식, 세포 독성 테스트, 유세포 분석, 면역 형광 염색 및 공초점 이미징의 정량화를 포함한 환자 유래 스페로이드 생성 및 하류 분석을 설명합니다. 반대로 신생물 치료제로 후보자의 잠재력. 이 프로토콜은 각 환자 및 질병 단계에 대한 특정 약물을 식별하여 정밀 의학을 지원합니다.

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

여기서, 우리는 미리 분화된 인간 유도만능 줄기 세포 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포로 구성된 3D 자가 조립 심장 미세 조직 배열을 생성하는 사용하기 쉬운 방법론을 기술합니다. 심장 미세 조직을 생성하는 기술을 요구하는 이 사용자 친화적이고 낮은 세포는 질병 모델링 및 약물 개발의 초기 단계를 위해 구현될 수 있습니다.

인간 iPSC 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포를 사용하여 3D 심장 미세 조직 배열의 제조

이 원고는 수축력 및 칼슘 취급 분석을 포함하여 기능분석에서 3D 인간 골격 근 미세 조직 및 최소 침습 다운스트림의 배열을 생성하는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

인간 골격 근육 미세 조직에서 골격 근육 건강의 기능 메트릭 평가

우리는 인간 공학 골격근 조직과 광유전학적 모토뉴런을 사용하여 신경근 접합 기능을 특성화하기 위한 재현 가능하고 자동화되고 편향되지 않은 이미징 시스템을 설명합니다. 이 시스템은 시간이 지남에 따라 신경 근육 연결성의 기능적 정량화를 허용하고 신경 독소 및 중증 근무력증 환자 혈청으로 인한 감소 된 신경 근육 기능을 감지합니다.

인간 신경근 접합부의 광유전학 모델의 공학 및 특성화

여기에 제시된 것은 고처리량, 다차원 형식으로 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 심장 스페로이드(CS)의 생성 및 냉동 보존을 위한 일련의 프로토콜입니다. 이 3차원 모델은 질병 모델링, 고처리량 스크리닝을 위한 강력한 플랫폼 역할을 하며 냉동 보존 후에도 기능을 유지합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심장 스페로이드의 생성, 고처리량 스크리닝 및 바이오뱅킹

여기서는 iPSC 유래 뉴런 및 성상세포의 3D 바이오프린팅 공동 배양을 생산하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 하이드로겔 스캐폴드 내에서 96웰 또는 384웰 형식으로 생성된 이 공동 배양 모델은 7일 이내에 높은 인쇄 후 생존율과 신경돌기 성장을 입증하고 두 세포 유형 모두에 대한 성숙 마커의 발현을 보여줍니다.

스크리닝 응용 분야를 위한 인간 iPSC 유래 뉴런-성상세포 공동 배양의 3차원 바이오프린팅

배우세요 3D 엔지니어링 근육 조직을 이용한 고처리량 약물 스크리닝 방법을 자기 감지 시스템으로 24개 샘플을 동시에 분석하여 심장 및 골격근 질환의 신약 개발과 질병 모델링에 활용할 수 있습니다.

확장 가능한 3D 엔지니어링 근육 조직의 전임상 약물 테스트

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