확장 가능한 3D 엔지니어링 근육 조직의 전임상 약물 테스트

당사의 플랫폼은 3D 엔지니어링 근육 조직과 자기 감지 하드웨어를 사용하여 24개의 웰에서 동시에 수축성을 측정합니다. 이는 인간 근육 조직을 사용하여 시험관 내에서 새로운 치료제를 평가하기 위한 더 높은 처리량 방법을 제공합니다. 당사의 주조 방법은 3D 엔지니어링 근육 조직을 제작할 때 일관성과 재현성을 향상시킵니다.

우리는 플랫폼에서 수축성 측정 및 분석을 위해 자기 감지 하드웨어가 장착된 소모품 24웰 주조 플레이트를 설계했습니다. 이 방법은 수축성에 영향을 미치는 모든 근육 질환에 대한 체외 질병 모델링, 약물 발견 및 유전자 치료에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 우리는 현재 운동 뉴런을 3D 구조에 통합하여 신경근 접합 모델도 만들고 있습니다.

시작하려면 미리 냉각된 조직 캐스팅 키트를 세포 배양 후드 내부의 차가운 블록이나 얼음 위에 놓습니다. 캐스팅 플레이트를 얼음 위에 평평하게 놓습니다. 기본 배지에 트롬빈을 추가하여 트롬빈 용액을 만들고 포스트 격자를 캐스팅 플레이트에서 새로운 멸균 24웰 플레이트로 이동합니다.

50 마이크로리터의 트롬빈 용액을 캐스팅 플레이트의 미리 냉각된 각 웰에 피펫팅하고 격자를 키트에 다시 놓습니다. 캐스팅 키트를 얼음 위에 따로 보관하십시오. 다음으로, 500 밀리리터의 RPMI 배지, 10 밀리리터의 B27 및 2.5 그램의 아미노 카프로 산 (ACA)을 첨가하여 심장 EMT 배지를 준비한다.

조직을 주조하는 데 사용할 EMT 배지를 꺼내 10 마이크로 몰 ROCK 억제제를 첨가하십시오. 1차 근모세포에 대해 50ml의 F10 배지와 0.25g의 아미노카프로산(ACA)을 추가하여 골격 EMT 배지를 준비합니다. IPSC 유래 근모세포에 0.1g의 ACA를 사용하십시오.

이어서, ACA를 함유하는 주조 매체를 멸균 여과한다. 세포 배양 등급 해리 시약과 동일한 부피의 EMT 배지를 섭씨 37도까지 따뜻하게 합니다. 이 데워진 EMT 배지는 해리 시약을 희석하는 데 사용됩니다.

PBS로 세포를 세척하고 데워진 해리 시약을 첨가하여 세포를 들어 올립니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 또는 세포가 들어 올려질 때까지 배양하고 플레이트 측면을 두드려 2-3분마다 배양을 확인합니다. 세포가 들어 올려지면 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다.

단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 P-1000 피펫으로 분쇄합니다. 플레이트 및 플라스크를 추가 EMT 배지로 세척하여 나머지 세포를 수집하고 이들을 원뿔형 튜브에 첨가한다. 다시, 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 세포를 분쇄합니다.

EMT 배지를 추가하여 해리 과정을 종료한 다음 세포 계수를 위해 세포 현탁액 샘플을 채취합니다. 자동 세포 계수기 또는 트리판 블루의 혈구계를 사용하여 세포 계수를 수행합니다. 세포를 200G에서 4분 동안 회전시키고, 상청액을 흡인하고, 세포를 EMT 염기 배지의 5밀리리터에 재현탁하여 잔류 해리 시약을 제거한다.

4분 동안 다시 원심분리한 후, 상청액을 흡인하고 적절한 밀도로 세포 현탁액을 준비한다. 원하는 수의 조직을 구성하는 데 필요한 각 세포 용액의 부피를 계산하고 계산된 세포 부피를 15밀리리터 원뿔형 튜브에 피펫팅합니다. EMT 당 10 마이크로 리터의 피브리노겐을 세포 현탁액에 첨가하고 얼음 위에 놓으십시오.

각 EMT가 최종 조직 구조에 90 마이크로 리터의 세포 현탁액, 10 마이크로 리터의 피브리노겐 및 50 마이크로 리터의 트롬빈 용액을 가지고 있는지 확인하십시오. 세포 배양 후드에서 조직 주조 키트의 뚜껑을 제거하고 기둥 격자가 얼음 위에 평평하게 놓인 주조 플레이트를 놓습니다. 세포 피브리노겐 혼합물을 혼합하고 P-200 피펫으로 100 마이크로 리터를 끌어 올립니다.

50 마이크로리터의 트롬빈 용액으로 준비된 웰에 100 마이크로리터의 혼합물을 첨가하고 잘 섞이도록 5회 분쇄한다. 기포가 생기지 않도록 피펫을 첫 번째 스톱 지점으로 밀지 말고 분쇄 후 팁을 제거하십시오. 모든 조직을 캐스팅하기 전에 원추형 튜브에 세포 현탁액을 혼합하십시오.

한 손의 포인터 손가락과 엄지 손가락을 사용하여 격자와 주조 우물 판을 동시에 잡고 격자의 움직임을 피하거나 판을 얼음 위에 평평하게 놓고 얼음 양동이를 흔들어 주조 판을 들여다보십시오. 모든 조직이 주조될 때까지 각 조직에 대해 새로운 P-200 팁으로 반복합니다. 시드 키트를 인큐베이터로 조심스럽게 옮기고 섭씨 37도에서 80분 동안 배양합니다.

다음으로, 심장 조직을 위한 EMT 배지의 웰 당 2밀리리터를 갖는 새로운 24-웰 플레이트를 준비하고, 플레이트를 섭씨 37도에서 인큐베이션하여 배지를 가온한다. 80분 배양 후, EMT 배지 1밀리리터를 주조 웰의 가장자리에 부드럽게 첨가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 추가로 배양합니다. 10 분 배양 후, 포스트 격자를 조심스럽게 들어 올리고 주조 플레이트에서 따뜻한 배지로 준비된 24 웰 플레이트로 조직을 옮깁니다.

마지막으로 조직이 있는 플레이트를 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 실패한 EMT 생산은 기둥에서 조직 분리와 같은 치명적인 실패에서 기포 및 두 기둥 주변의 불균등한 조직 침착과 같은 보다 미묘한 구조적 결함에 이르기까지 다양할 수 있습니다. 캐스팅 후 1일 후의 EMT 구조체가 여기에 표시됩니다.

골격근 조직은 세포 융합 및 하이드로겔 압축의 제로일째부터 분화 배지로 옮겨졌다. 7 일째부터 28 일째까지 동일한 EMT는 EMT의 중간 부분을 통해 측정했을 때 두 기둥 사이의 전체 길이가 약간 짧고 너비가 더 작았습니다. 21일 동안 4개의 조직 플레이트를 추적하여 압축 전반에 걸쳐 EMT 직경을 비교했습니다.

시점은 플레이트 사이에 일관된 EMT 크기를 보여줍니다. 매트릭스 리모델링이 안정화됨에 따라 21일째에 최대 압축에 도달합니다. EMT의 면역 조직 화학이 여기에 설명되어 있습니다.

EMT는 배양 10일째에 고정되고 파라핀에 포매되었습니다. 얇은 단면을 이미징 전에 미오신 중쇄 및 디스트로핀에 대한 항체로 염색했습니다. 이 그래픽 이미지는 시간 경과에 따른 심장 EMT 및 골격 EMT에서 측정된 평균 절대 경련력을 나타냅니다.

조작된 심장 조직에서의 급성 및 만성 독소루비신 치료가 여기에 나와 있습니다. 세 가지 다른 용량 농도의 Dox를 일시 투여하거나 27일 동안 조작된 심장 조직에 지속적으로 투여했습니다. 조작된 골격근 조직에서 BDM에 대한 용량 반응이 이 그림에 나와 있습니다.

심장 박동수 또는 경련 빈도는 EMT가 이 화합물에 노출될 때 심장 독성을 나타내는 수축력의 중단과 함께 용량 의존적 방식으로 중단됩니다. 조직을 주조할 때 기억해야 할 가장 중요한 사항은 세포 현탁액과 시약을 포함하여 모든 것을 항상 차갑게 유지하고 주조가 시작되면 포스트 격자를 완전히 고정시키는 것입니다.