In Vitro (시험관 ) 표적 후성유전학적 침묵을 위한 엔지니어링된 전사 억제제 선택

우리가 개발한 후성유전학적 침묵 기술은 유전자 침묵 기술인 더 큰 기술 분야에 속합니다. 후성유전학적 침묵 필요성을 개발하기 전에 현장에는 두 가지 많은 대안이 있었습니다. 하나는 RNA 간섭에 의한 유전자 녹다운(knock-down)이고, 다른 하나는 인공 뉴클레아제(nuclease)에 의한 유전자 파괴(gene disruption)이다.

그리고 인공 뉴클레아제에 의한 유전자 파괴는 DNA 수준에서 작용합니다. 그래서 당신은 비활성화하고 싶은 표적 유전자를 가지고 있고, 세포에 인공 뉴클레아제를 전달하여 이중 끈 끊기를 유도합니다. 이러한 종류의 이중 스트링 브레이크는 최종적으로 비기능적 단백질의 퇴화 또는 동시에 전사 분해를 부과하는 퇴화 합, 프레임 시프트 돌연변이를 수행할 수 있습니다.

따라서 후성유전학적 침묵은 세포를 전달함으로써 작동하는데, 이른바 조작된 전사 억제자(engineered transcription repressor)라고 불립니다. 이것들은 표적 DNA에 결합할 수 있는 작은 단백질들이며, 소위 후성유전학적 마르크스(epigenetic marx)라고 불리는 표적 유전자에만 부과할 수 있습니다. 이것들은 DNA에 일단 증착되면 염색질 압축으로 이어질 수 있는 화학적 변형입니다.

염색질 압축은 전사 억제로 이어지므로 표적 유전자의 발현이 더 이상 없습니다. 그리고 매우 중요한 것은, 이런 종류의 전사 억압 상태가 세포에 의해 장기간 결합될 수 있다는 것입니다. 침묵시킬 표적 유전자를 발현하는 세포주를 식별하려면 Human Protein Atlas에서 표적 유전자를 탐색하고 세포주 섹션을 탐색하여 관심 체세포 조직을 대표하는 세포주를 식별합니다.

식별된 세포주에서 효율적인 일시적 유전자 전달 프로토콜을 사용할 수 있는 세포주의 우선 순위를 지정합니다. 그런 다음 유전자 뷰어를 열고 형광단 발현 카세트를 통합할 표적 유전자의 영역을 식별합니다. 그런 다음 CHOPCHOP을 사용하여 Beta-2M 유전자의 첫 번째 인트론에서 표적 부위를 절단하는 GNRA를 식별하고 선택합니다.

다음으로, 좌측 상동성 암(left homology arm), 프로모터 프리 전이유전자 발현 카세트(promoter free transgene expression cassette) 및 우측 상동성 암(right homology arm)으로 구성된 GNRA 절단 부위에 대한 donor template을 설계합니다. 제조업체의 지침에 따라 CRISPR Cas9 뉴클레아제 시스템과 공여체 템플릿을 K-562 세포주 내부에 전달하여 nucleofection을 제공합니다. K-562 세포를 최소 14일 동안 배양합니다.

유세포 분석기를 사용하여 시간 경과에 따른 형광 리포터의 발현 수준을 모니터링합니다. FICO etherin 채널을 활성화하여 tdTomato 리포터의 형광 강도를 측정합니다. UCSC 게놈 브라우저에서 표적 유전자를 탐색하고 H3K27 아세틸화를 위해 농축된 CpG 섬 및 부위와 같이 전사 활성을 잠재적으로 조절하는 영역의 뉴클레오티드 염기서열을 추출합니다.

선택한 시퀀스를 CHOPCHOP 온라인 도구에 붙여넣고 검색할 GNRA의 목적으로 억제를 선택합니다. CHOPCHOP은 관심 유전자 염기서열에 매핑된 GNRA 목록을 제공하고 오프 타겟 일치 횟수와 예측된 타겟 효율을 고려하여 점수에 따라 나열됩니다. 타겟 염기서열당 최소 10개의 GNRA를 선택합니다.

게놈 전체에 걸쳐 다른 유전자 간 염기서열과 완전히 일치하지 않고 통합될 전체 영역에 걸쳐 있는 GNRA를 선택하십시오. 화학적으로 적합한 E.coli 세포에서 ETRS를 위해 인코딩하는 플라스미드를 형질전환한 후, 제한 효소 분해 및 Sanger 염기서열분석을 통해 ETR 함유 플라스미드의 존재 여부를 콜로니를 스크리닝합니다. phU6 GNRA 백본 내부의 GNRA를 복제하려면 먼저 분자 생물학 설계 소프트웨어를 사용하여 올리고를 생성합니다.

프로토 스페이서의 업스트림에 5개의 뉴클레오티드 서열을 추가하고 이 25개의 뉴클레오티드 긴 올리고를 라벨링합니다. 유사하게, 프로토 스페이서의 역보체의 5개의 뉴클레오티드 서열과 그 하류의 시토신을 첨가하여 25개의 뉴클레오티드 긴 올리고를 생성하고 표지합니다. 이 올리고를 100 마이크로몰의 물에 재현탁된 무염 단일 가닥 DNA 올리고로 합성합니다.

각 올리고 1마이크로리터를 어닐링 완충액 2마이크로리터와 물 16마이크로리터에 첨가합니다. 용액을 섭씨 95도의 열순환기에 10분 동안 두어 올리고 어닐링을 수행합니다. 그런 다음 45분에 걸쳐 섭씨 25도까지 서서히 식힙니다.

어닐링된 올리고 1마이크로리터를 뉴클레아제가 없는 물 99마이크로리터로 희석합니다. 그런 다음 이 희석액 1마이크로리터를 이전에 Bsa1 제한 효소로 절단한 phU6 GNRA 플라스미드 50나노그램으로 결찰합니다. 20 마이크로리터의 화학적으로 유능한 대장균 세포를 2 마이크로리터의 결찰 산물로 형질전환시켰습니다.

플라스미드 DNA 생산을 위해 여러 콜로니를 선택하고 Sanger 염기서열분석을 통해 프로토 스페이서의 성공적인 클로닝을 확인합니다. 리포터 세포주에서 GNRA 및 CRISPR dCas9 기반 DTR을 배열로 전달하기 위해 먼저 각 플라스미드의 500나노그램이 포함된 별도의 튜브를 준비하고 테스트할 서로 다른 GNRA 인코딩 플라스미드의 125나노그램을 추가합니다. GNRA 및 ETR이 없는 뉴클레오펙션 조건을 모의 처리 샘플로 포함합니다.

표본당 최소 3회의 기술 반복실험을 준비합니다. 튜브당 5 번 10 번 Beta-2M tdTomato K-562 세포를 5 번 펠렛화하고 플라스미드 혼합물로 핵을 생성합니다. 이전에 데워진 RPMI 1640 포유류 세포 배양 배지 200마이크로리터에 세포를 재현탁시키고 인큐베이터에 넣습니다.

유세포 분석을 사용하여 ETR 전달 후 서로 다른 시점에서 침묵하는 세포의 비율을 측정합니다. Flora 4 코팅 서열이 없는 야생형 세포를 사용합니다. 리포터 네거티브 셀의 임계값을 설정합니다.

모의 처리된 샘플을 사용하여 리포터 양성 세포에 대한 게이트를 설정합니다. 장기 침묵 효율성 측면에서 상위 3개의 GNRA를 식별합니다. 사실을 사용하여 해당 표본에서 안정적으로 유지되는 보고자 음성 하위 모집단을 선택합니다.

또한 후속 분석에서 적절한 비교를 허용하기 위해 동일한 처리에서 모의 처리된 샘플의 사실을 수행합니다. tdTomato 형광 리포터는 CRISPR Cas9 유도 단층 촬영 지시 수리에 의해 인간 Beta-2M 유전자의 첫 번째 인트론에 통합되었습니다. 리포터 양성 K-562 세포는 통합 후 처리된 샘플에 나타납니다.

GNRA와 함께 삼중 ETR 조합의 일시적인 전달 시, 형광 리포터의 발현을 평가하기 위해 종방향 유세포 분석을 수행했습니다. 급성 분석에서 리포터 억제에서 피크가 관찰되었으며, 이는 시간이 지남에 따라 ETR-인코딩 플라스미드의 유사분열 희석으로 인해 부분적으로 재흡수되었습니다. ETR의 GNRA 조합에 의한 표적 유전자좌에 대한 CpG 메틸화의 효과적인 증착은 처리된 세포의 상당 부분에서 리포터의 영구적인 억제에 의해 분명했습니다.

서로 다른 GNRA는 다양한 장기 침묵 효율을 보여주었습니다. 영구적이고 효율적인 후성유전체 침묵을 달성하기 위한 가장 중요한 단계 중 하나는 효과적인 단일 gRNA를 식별하는 것입니다. 모든 종류의 응용 프로그램을 수행하려면 전사 조절자를 위한 다른 사이트의 promoter 및 answer를 포함하여 가장 반응이 빠른 염기서열을 식별하는 것부터 시작해야 합니다.

반응성이 가장 뛰어나고 효과적인 영역이 확인되면 누구나 다양한 종류의 단일 gRNA를 개별 또는 단일 gRNA의 조합으로 테스트하도록 설계해야 합니다. 후성유전체 편집의 가장 명백한 응용 분야 중 하나는 기능적 돌연변이의 이득에 대한 전임상 번역이며, 이 유전자의 침묵은 특정 질병을 치료하는 데 유용할 수 있습니다. 대안으로, 우리는 주어진 프로모터의 후성유전학적 조절을 특이적으로 변화시키는 능력이 임상 및 기초 중개 과학 모두에 매우 유용한 도구가 될 수 있다는 것을 명심해야 합니다.