Name: 오가노이드의 배양 및 3D 이미징을 위한 고처리량 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 배우세요 마이크로텍스처 배양 접시를 이용한 오가노이드 고처리량 배양 및 3D 이미징 방법을 통해 암 연구와 신약 개발에 활용할 수 있는 생물학적 모델을 구축하는 기술을 익히세요.

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이 연구는 싱가포르 총리실의 국립 연구 재단이 지원하는 CALIPSO 프로젝트의 지원을 받아 연구 우수성 및 기술 기업을 위한 캠퍼스(CREATE) 프로그램에 따라 지원됩니다. V.V.는 NRF 조사자 NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI 시드 펀딩 및 ANR ADGastrulo의 지원을 인정합니다. AB와 G.G.는 MBI 핵심 자금의 지원을 인정합니다. A.B.는 BC43 현미경의 대여에 대해 Andor Technologies를 인정합니다.

참고: 이 프로토콜의 첫 번째 부분은 세포 배양 장치의 미세 가공에 대해 자세히 설명합니다. 피라미드 캐비티가 있는 원래의 1차 금형은 미세 가공 시설을 사용할 수 있는 경우 사내에서 생산하거나 외부 회사에 아웃소싱할 수 있습니다. 이 작업에 사용 된 기본 금형은 사내에서 생산되며 제조 공정 단계는 다른 곳에서 설명합니다11,13. 금형의 미세 가공을 위한 기본 프로토콜은 보충 파일 1에서 확인할 수 있습니다. 위험: 1-6단계의 작업은 먼지가 없는 환경에서 수행해야 합니다. 가능한 경우 층류 후드 또는 클린 룸이 선호됩니다. 이 모든 단계에서 장갑, 실험실 코트 및 보안경과 같은 개인 보호 장비(PPE)를 사용해야 합니다.
1. PDMS 금형의 다이싱
<ol><li>PDMS 금형의 작은 부분을 최종 장치에 필요한 치수로 절단합니다(예: 1cm x 1cm[그림 1B]). 배열의 XY 방향과 평행하게 자릅니다. 중요 : PDMS 금형을 1cm x 1cm 깍둑썰기로 절단할 때 절단을 한 단계로 실행하십시오. 단면 면도날을 사용하여 압력을 가하고 PDMS를 한 번에 절단합니다. 이는 금형 표면에 증착되어 복제 단계의 품질에 영향을 미칠 수 있는 PDMS의 작은 입자의 형성을 방지하기 위한 것입니다(단계 3).</li>
</ol>2. 평면 PDMS 기판의 제조
<ol><li>~15-20g의 PDMS 베이스 수지와 1.5-2g의 망상제(즉, 10:1의 비율)의 무게를 측정하고 조심스럽게 혼합한 다음 진공 용기에서 ~20분 동안 가스를 제거합니다.</li>
	<li>탈기된 PDMS를 직경 15cm의 플라스틱 페트리 접시에 천천히 붓습니다.</li>
	<li>페트리 접시를 65°C로 설정된 오븐에 2시간 동안 보관하여 PDMS를 경화합니다. 경화가 완료될 때까지 기다린 후 ~1.5mm 두께의 평평한 PDMS 필름(페트리 접시에 포함)을 사용할 준비가 됩니다(그림 2A).</li>
	<li>날카로운 칼날을 사용하여 PDMS에서 2cm x 2cm 조각을 자릅니다(그림 2B-D). 참고: 이 PDMS 시트의 정확한 두께는 중요하지 않습니다. ~ 1-2mm가 적합한 범위입니다. 절단의 치수는 질감이 있는 금형보다 커야 하지만 훨씬 크지 않아야 하므로 재료가 낭비될 수 있습니다.</li>
</ol>3. UV 경화형 접착제로 만든 질감 층의 생산
<ol><li>평평한 PDMS 절단부(2단계에서 준비됨) 위에 PDMS 금형 주사위 1개(1단계에서 준비한 대로)를 뒤집어 놓습니다(그림 3A,B). 노트: 금형의 피라미드 돌출부가 평평한 PDMS 기판을 향하고 잘린 피라미드의 상단 표면만 접촉하는지 확인하십시오. 광학 현미경으로 올바른 배치를 평가합니다(그림 3C,D).</li>
	<li>피펫을 사용하여 몰드의 한쪽면에 소량 (2 방울, 약 0.1-0.2mL)의 UV 경화 접착제를 떨어 뜨립니다 (그림 4A). 알림: 액체가 금형의 가장자리와 접촉하면 모세관 현상이 액체를 구동하여 금형 자체와 기판으로 사용되는 PDMS의 플랫 컷 사이의 캐비티를 채 웁니다.<ol><li>예를 들어, 10x 배율 대물렌즈가 있는 도립 광학 현미경을 사용하여 캐비티 내부의 액체 진행 상황을 추적합니다(그림 4B, C).</li>
	</ol></li>
	<li>UV 경화형 접착제를 UV 광선에 노출시켜 경화시킵니다. 사용된 UV 소스의 전력 밀도에 따라 노출 시간을 조정합니다(예: 전력 밀도가 35mW/cm2인 UV-LED 상자, 접착제를 완전히 경화시키기 위해 이 프로토콜에서 50% 전력으로 2분).</li>
	<li>한쪽 가장자리에 과도한 양의 접착제를 사용하여 손가락으로 부드럽게 눌러 평평한 PDMS 기판에 경화된 접착제를 고정합니다(그림 5A, B). 한편, 핀셋을 사용하여 누르고 있는 동일한 가장자리 옆에 있는 금형의 한쪽 모서리를 꼬집고 질감이 있는 필름도 들어 올려지지 않도록 하면서 천천히 떼어냅니다. 알림: 그림 5C는 적절한 금형 제거 절차의 결과를 보여줍니다. 그림 5E-G는 잘못된 절차를 보여줍니다.</li>
	<li>면도날을 사용하여 과도한 접착제와 과도한 PDMS 기판을 트리밍하여 경화되고 질감이 있는 접착제 층을 PDMS에 평평하게 남겨두고 한쪽 가장자리에만 과도한 PDMS를 남겨 둡니다(그림 5D).</li>
</ol>4. 커버슬립 기판 준비
알림: 최종 장치의 기판으로 직경 1.5mm의 표준 둥근 25H 커버슬립이 사용됩니다. 사용하기 전에 표면에서 먼지 및/또는 유기 잔류물을 제거하기 위해 청소해야 합니다.
<ol><li>커버슬립 청소<ol><li>초음파가 가해지는 동안 커버슬립을 비눗물에 5분 동안 담그십시오(40kHz, 110W 음파 출력).</li>
		<li>커버슬립을 깨끗한 탈이온수(DI)로 먼저 담그고 마지막으로 수도꼭지에서 흐르는 DI 물로 세척합니다. N2 가스 블로우 건으로 커버 슬립을 말리십시오.</li>
		<li>커버 슬립을 아세톤 욕조에 5 분 동안 담그십시오. 즉시 2-프로판올(IPA) 수조로 5분 더 이동합니다.</li>
		<li>스퀴즈 병을 사용하여 깨끗한 IPA로 커버슬립을 헹굽니다. N2 가스 블로우 건으로 커버 슬립을 말리십시오. 알림: 이 절차를 사용하여 청소한 커버슬립은 필요할 때까지 밀폐된 용기에 보관할 수 있습니다. 표면에 습기가 쌓이지 않도록 건조한 캐비닛에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>사용할 준비가 되면 짧은 O 2 플라즈마 공정으로 깨끗한 커버슬립을 처리하여 친수성을 개선합니다: O2 20 sccm, 3 mbar 압력, RF 발전기에서 60 W 및 60 s 지속 시간.</li>
	<li>플라즈마 활성화 직후, 표준 스핀 코터의 진공 척에 커버슬립을 놓고 커버슬립 중앙에 접착제 한 방울을 부어 UV 경화형 접착제의 얇은 층을 스핀 코팅합니다(그림 6). 스핀 코팅 공정을 실행합니다: 500rpm에서 5초 동안 살포, 3,000rpm에서 45초 동안 코팅(가속 및 감속을 100rpm/s로 설정).<ol><li>스핀 코팅을 사용할 수 없는 경우 다음 대체 방법을 사용하여 커버슬립에 UV 접착제 박막을 생성합니다.<ol><li>깨끗한 커버슬립에 피펫을 사용하여 ~0.1mL의 UV 경화 접착제를 떨어뜨립니다(그림 7A).</li>
			<li>두 번째 커버슬립을 가져다가 첫 번째 커버슬립 위에 올려 액체 접착제가 두 커버슬립 사이에 고르게 퍼지도록 합니다(그림 7B-D).</li>
			<li>퍼짐 접착제가 커버슬립의 가장자리에 도달하면 하나를 다른 위로 밀어 부드럽게 분리합니다. 분리되면 두 커버슬립은 얇은 액체 접착제 층으로 완전히 코팅됩니다(그림 7E). 알림: 부드럽고 지속적인 움직임으로 분리가 수행되지 않는 경우에만 코팅이 균일하고 매끄럽지 않을 수 있습니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>UV 경화형 접착제의 사전 경화<ol><li>스핀 코팅 후 UV에 노출하여 접착제를 사전 경화합니다. 사용 된 UV 소스의 전력 밀도에 따라 노출 시간을 조정하십시오 (여기서 전력 밀도가 35mW / cm2 인 UV-LED 박스를 1 % 전력에서 50 분 동안 사용). 중요 : 여기에 사용 된 접착제는 광학 접착제입니다. 경화를위한 에너지 선량과 관련된 핵심 사항에 대한 토론을 참조하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 질감 필름을 최종 기판으로 이송
<ol><li>질감이 있는 필름(3단계에서 준비) 중 하나를 가져와 접착 코팅된 커버슬립(4단계에서 준비)과 접촉시킵니다. 커버슬립의 부분적으로 경화된 접착제와 질감이 있는 필름 사이의 접촉이 가능한 한 균일한지 확인하십시오(그림 8A-C). 중요 : 이 단계에서 커버 슬립의 접착제는 리플 로우를 방지 할 수있을만큼 충분히 견고해야하며, 이는 접촉했을 때 질감이있는 필름의 피라미드 구멍을 채울 수있을뿐만 아니라 질감이있는 필름을 부드럽게 눌러 접촉을 최적화 할 수있을만큼 충분히 플라스틱 및 접착제이어야합니다.</li>
	<li>커버슬립에 코팅된 접착제층이 완전히 경화될 때까지 커버슬립을 자외선에 노출시킵니다. 이렇게 하면 커버슬립의 질감 필름이 밀봉되고 피라미드 캐비티 사이에 누출 방지 격리가 제공됩니다.</li>
	<li>마지막으로 PDMS 플랫 기판을 벗겨냅니다(그림 8D-F). 핀셋을 사용하여 트리밍 후 여분의 재료가 남은 가장자리의 한쪽 모서리에 PDMS를 집습니다(3.5단계). 이러한 방식으로 질감이 있는 필름 층은 세포 파종을 위해 상단에 열린 접근이 있는 커버슬립에 접착제로 남게 됩니다. 중요 : 평평한 PDMS를 벗길 때 질감이있는 필름이 커버 슬립에 잘 부착되어 있어야합니다. 텍스처 필름이 아무런 노력 없이 UV에 최종 노출된 후 커버슬립에서 벗겨질 수 있는 경우 접착 실패를 쉽게 확인할 수 있습니다.</li>
</ol>6. 세포 배양을 위한 세포 배양 커버슬립의 장기 패시베이션
참고: 패시베이션은 세포막에서 인지질의 극성 그룹과 유사한 구조를 갖는 생체모방 공중합체의 컨포멀 및 연속 코팅을 생성함으로써 달성됩니다. 이 컨포멀 코팅은 세포 배양 장치에 대한 세포 부착을 방지합니다.
<ol><li>순수한 에탄올에 용해된 생체모방 공중합체의 0.5%(w/v)로 용액을 준비한다. 나중에 사용할 수 있도록 용액을 4 ° C에 보관하십시오.</li>
	<li>세포 배양 커버슬립을 35mm 페트리 접시에 넣고 생체모방 공중합체 용액으로 완전히 덮습니다.</li>
	<li>5분 후, 생체모방 공중합체 용액으로 용기로부터 세포 배양 커버슬립을 제거하고, 이를 생물안전 후드(>1시간)에서 최종 접시 내부의 실온에서 건조되도록 방치한다. 참고: 코팅 용액 내의 생체모방 공중합체의 농도를 증가시킴으로써 더 두꺼운 코팅을 생성할 수 있고; 더 두꺼운 코팅의 결과는 명시야 현미경에서 볼 수 있습니다(그림 9A).</li>
</ol>7. 세포 파종
<ol><li>탈기 및 살균<ol><li>세포 파종 직전에 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)를 세포 배양 접시(일반적으로 35mm 페트리 접시의 경우 1mL)에 분주합니다. ~10분 동안 초음파 장치를 사용하여 멸균된 PBS로 접시를 탈기한 다음 여러 차례의 피펫팅을 수행하여 모든 거품을 제거합니다. 중요 : 공기가 피라미드 구멍 내부에 갇히면 세포가 피라미드 구멍으로 들어가는 것을 방지합니다. 세포 파종 전에 피라미드에 공기가 갇히지 않도록 하려면 이러한 공동에 공기가 없는지 육안으로 확인하는 것이 좋습니다(벤치탑 명시야 현미경에서 10배 또는 20배 배율).</li>
		<li>PBS를 멸균 배양 배지로 교체하고 세포 배양 후드 아래에서 30분 동안 UV 광으로 플레이트를 멸균합니다. 알림: 이 단계부터 접시는 멸균된 것으로 간주하고 멸균 기술을 사용하여 조작해야 합니다. 세포 배양 장치에서 갇힌 공기를 제거하는 또 다른 방법은 진공 펌프가 있는 진공 용기를 사용하는 것입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포 현탁액 준비 참고: 세포는 단일 또는 작은 세포 응집체로 시딩하고 상단 조리개를 통해 샘플 웰로 들어갈 수 있습니다. 시간이 지남에 따라 삽입된 세포는 샘플 웰 내부에서 응집되어 조리개 크기보다 큰 크기의 스페로이드로 성장합니다. 검증된 세포주 모델로 권장 배양액(ATCC 지침)에서 유지되는 HCT116(CCL-247 ATCC) 또는 MCF7(HTB-22 ATCC) 암세포를 사용합니다.<ol><li>세포 현탁액을 준비한다 (예를 들어, ATCC 가이드라인에 따른 트립신화 공정을 사용하여). 관심 세포에 대한 트립신화/세포 현탁액 준비 권장 사항을 따르십시오.</li>
		<li>권장 배양 배지에서 세포 농도를 0.5 × 106 cells/mL로 계산하고 조정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포 분주<ol><li>35mm 세포 배양 접시에서 PBS 완충액을 제거한 다음 조정된 세포 현탁액 1mL를 분주합니다. 적절한 세포 밀도 및 균질성을 갖는 세포 파종 절차의 광학 현미경 이미지는 도 11A 를 참조한다.</li>
		<li>세포 배양 접시를 세포 배양기(37°C, 5%CO2 및 100% 습도)에 10분 동안 다시 놓습니다. 약 80-100 개의 세포가 각 피라미드 구멍으로 들어갑니다. 참고: 세포 농도 또는 세포 현탁액 제거 전에 소요된 시간을 증가시켜 세포 배양 접시당 세포 수를 늘릴 수 있습니다. 일반적으로 스페로이드 형성은 세포 파종 후 몇 시간(세포 유형에 따라 다름)이 걸리며 명시야 현미경(4x - 40x 대물렌즈; 그림 11). 여기에서 배양 배지, 세포외 매트릭스 및 분화 성장 인자를 변경하거나 며칠, 몇 주 또는 몇 달 동안 지속될 수 있는 일반적인 분화 프로토콜에 따라 스페로이드를 포함하는 세포 배양 접시에 추가할 수 있습니다.</li>
		<li>10분 배양 후 인큐베이터에서 세포 배양 접시를 회수하고 세포 현탁액을 부드럽게 흡인하여 포획되지 않은 세포를 제거합니다. 35mm 접시에 배양 배지 1mL를 넣고 세포 배양기에 다시 넣습니다. 중요 : 이 단계에서는 스페로이드가 아직 형성되지 않았기 때문에 세포 손실을 초래할 강한 흡인이나 분배를 피하는 것이 매우 중요합니다. 이 단계에서는 벤치탑 명시야 현미경을 사용한 시각적 제어를 적극 권장합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>8. 면역 염색 및 이미징
<ol><li>고정 및 염색 참고: 고정 및 면역 염색의 다른 고전적인 절차는 세포 배양 접시와 완전히 호환됩니다. 한 가지 일반적인 프로토콜이 여기에 설명되어 있습니다.<ol><li>세포 배양 접시에 오가노이드/스페로이드를 실온에서 4% 파라포름알데히드에 20분 동안 고정합니다.</li>
		<li>오비탈 쉐이커 상의 4°C에서 멸균 PBS 중 1% 계면활성제 용액에서 24시간 동안 오가노이드를 투과화하고, 오비탈 쉐이커 상에서 4°C의 블로킹 완충액(2% 소 혈청 알부민[BSA] 및 멸균 PBS 중 1% 계면활성제)에서 24시간 동안 배양한다.</li>
		<li>항체 희석 완충액(멸균 PBS에서 2% BSA 및 0.2% 계면활성제)에서 1/50에서 1/200 사이(또는 제조업체의 권장 사항에 따라)로 관심 있는 1차 항체와 함께 샘플을 4°C에서 48시간 동안 인큐베이션합니다.</li>
		<li>오비탈 셰이커(멸균 PBS 중 3% NaCl 및 0.2% 계면활성제)에서 세척 완충액으로 샘플을 3배 헹구고 항체 희석 완충액(1/100에서 1/300 사이의 희석 또는 제조업체의 권장 사항에 따라), 0.5μg/mL 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 및 0.2μg/mL Alexa Fluor 647 또는 488 팔로이딘에서 4°C에서 오비탈 셰이커에서 24시간 동안 인큐베이션하고, PBS로 5 단계 헹굼. 임의로, 37°C로 예열된 수용성 투명화제를 사용하여 샘플을 장착한다.</li>
	</ol></li>
	<li>이미징 참고: 이 단계에서 마이크로웰 플레이트의 오가노이드는 이미징을 위해 고정 및 염색된 샘플을 포함하는 일반 배양 접시로 간주될 수 있습니다: 모든 표준 이미징 절차는 적응이나 수정 없이 사용할 수 있습니다. 그림 12 는 40x 공기 대물렌즈(개구 0.75)를 가진 스피닝 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 얻은 이미지 및 3D 재구성의 대표적인 결과를 보여줍니다.<ol><li>다음 설정으로 자동 이미지 획득 프로세스에 컨스트럭터 소프트웨어를 사용하십시오: 노출 시간 = 50ms, Z 전동 스테이지를 사용하여 z 스택(1μm Z 스텝, 총 높이 70μm).</li>
		<li>이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 3D 재구성을 수행합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>9. 유기체의 방출 및 수집
참고: 세포 배양 접시의 질감이 있는 접착층은 커버슬립에서 분리되어 피라미드 캐비티 내부에 포함된 살아있는 스페로이드/오가노이드(고정 전)를 방출하여 RNA 시퀀싱, -omic 접근, 시험관 내 실험 및 생체 이식 과 같은 다른 절차로 세포를 분석할 수 있습니다.
<ol><li>샘플을 페트리 접시와 생물 안전 후드에 넣은 상태에서 메스와 같은 칼날을 사용하여 질감이있는 접착제 층의 모서리를 자릅니다.</li>
	<li>핀셋을 사용하여 질감이 있는 접착제 층을 절단 가장자리에 집고 유리 커버슬립에서 부드럽게 떼어내되 매체에 담그십시오(일부 오가노이드는 접착층에 남아 있을 수 있음, 그림 13).</li>
	<li>배양 배지로 3x 헹구고 피펫팅으로 오가노이드를 수집합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids%3A+model+systems+for+human+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li>
<li>Takebe, T., Wells James, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li>
<li>Kratochvil, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+materials+for+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineered materials for organoid systems.</a> Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).</li>
<li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+potential+in+organoid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li>
<li>O'Connell, L., Winter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+past+learning+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Organoids: past learning and future directions.</a> Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).</li>
<li>Vives, J., Batlle-Morera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+developing+human+3D+organoids+into+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">The challenge of developing human 3D organoids into medicines.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72(2020).</li>
<li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+and+challenges+of+patient-derived+organoids+in+guiding+the+multimodality+treatment+of+upper+gastrointestinal+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies.</a> Open Biology. 10 (4), 190274(2020).</li>
<li>Lukonin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+intestinal+organoid+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration.</a> Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).</li>
<li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+organoids%3A+a+bright+future+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li>
<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li>
<li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+3D+imaging+method+for+quantitative+characterization+of+organoid+development+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high-speed+3D+imaging+of+organoid+cultures+with+multi-scale+phenotypic+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification.</a> Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).</li>
</ol>

국제 특허 출원이 공개 번호 WO 2021/167535 A1로 공개되었다.

고밀도 오가노이드 배양 및 분화를 허용하는 마이크로웰 배양 접시의 제조 절차가 이 백서에 설명되어 있습니다. 미세 공동의 형상과 배열로 인해 수천 개의 스페로이드를 재료 손실 없이 장기간(몇 주 이상) 동안 단일 플레이트에서 배양하고 염색할 수 있습니다. 비교를 위해 세포 배양 플레이트의 4mm x 2mm 영역에는 면적이 12cm x 8cm인 단일 384웰 플레이트만큼 많은 스페로이드가 포함될 수 있습니다. 
미세공동의 규칙적인 분포와 기질로 사용되는 평평한 표준 커버슬립을 통해 배양 용기와 이미징 지지체 사이에서 복잡하고 시간이 많이 소요되는 샘플 조작 없이 수천 개의 살아있는 유기체 또는 고정된 오가노이드를 3D로 모니터링할 수 있습니다. 베이스보다 상단이 작은 피라미드 모양으로 인해 배지 교환 중 피펫팅 단계, 세포외 매트릭스 분주 또는 염색 절차로 인한 오가노이드 손실이 없습니다. 이러한 모든 단계는 기존의 오가노이드 생성 기술(예: 매달린 액적, 낮은 부착 플레이트, A...

오가노이드라고 하는 유기형 3D 세포 배양에서 줄기세포는 실제 장기와 강력한 형태학적 및 기능적 유사성을 공유하는 공간 구조로 분화하고 자가 조직화됩니다. 오가노이드는 인체 생물학과 신체 외부의 발달을 연구하는 데 유용한 모델을 제공합니다 1,2,3. 간, 뇌, 신장, 폐 및 기타 여러 기관을 모방하는 모델이 점점 더 많이 개발되고 있습니다 2,4,5. 유기체의 분화는 가용성 성장 인자와 세포 외 기질을 정확한 시간 순서로 첨가함으로써 결정됩니다. 그러나, 기관과 현저한 대조적으로, 유기체의 발달은 상당히 이질적이다.
수많은 생물학적 과제6,7 외에도 오가노이드 배양은 세포 배양 방법, 전사체학의 특성화 및 이미징 측면에서 기술적 과제를 제기합니다. 생체내 기관 발달은 세포 배열의 매우 진부한 자기조직을 초래하는 생물학적 환경에서 일어난다. 모든 표현형 변화는 병든 상태를 진단하기위한 대용으로 사용될 수 있습니다. 대조적으로, 오가노이드는 세포 배양 조건과 호환되는 최소한으로 제어되는 미세 환경에서 시험관 내에서 발달하여 각 개별 오가노이드의 발달 경로 및 모양 형성에 큰 변동성을 초래합니다.
최근 연구8는 몇 가지 유전자 마커의 평가와 결합된 오가노이드 모양(표현형 설명자)의 정량적 이미징이 표현형 발달 환경의 정의를 허용한다는 것을 보여주었습니다. 틀림없이, 오가노이드에서 게놈 발현의 다양성을 표현형 행동과 연관시키는 능력은 유기체형 배양의 잠재력을 최대한 발휘하기 위한 주요 단계입니다. 따라서 3D 9,10에서 세포 하, 다세포 및 전체 오가노이드 규모에서 오가노이드 특징을 특성화할 수 있는 전용 고콘텐츠 이미징 접근 방식의 개발이 필요합니다.
당사는 간소화된 오가노이드 배양(분리된 인간 배아 줄기 세포[hESC], 인간 유도 만능 줄기 세포[hIPSC] 또는 일차 세포에서 3D, 다세포, 분화된 오가노이드까지) 및 빠른 비침습적 3D 이미징을 가능하게 하는 다목적 고함량 스크리닝(HCS) 플랫폼을 개발했습니다. JeWells 칩(이하 칩 )이라고 하는 차세대 소형 3D 세포 배양 장치를 통합하고 있으며, 여기에는 단일 대물 라이트 시트 현미경으로 빠른 3D 고해상도 이미징이 가능한 45° 미러 옆에 수천 개의 잘 배열된 마이크로웰이 포함되어있습니다11. 모든 표준 상용 도립 현미경과 호환되는 이 시스템은 300개의 오가노이드를 3D로 이미징할 수 있으며 <1시간 내에 세포하 분해능을 제공합니다.
세포 배양 장치의 미세 가공은 정사각형 베이스와 베이스에 대해 45°의 측벽을 가진 수백 개의 마이크로 피라미드(그림 1A)를 포함하는 기존의 미세 구조화된 몰드에서 시작됩니다. 도 1C는 이러한 구조의 전자 현미경(EM) 이미지를 나타낸다. 금형 자체는 폴리 (디메틸 실록산) (PDMS)로 만들어지며 표준 소프트 리소그래피 절차를 사용하여 해당 기능 (공동)이있는 1 차 금형 (여기에 표시되지 않음)의 복제 주조로 만들 수 있습니다. 기본 금형은 다른 절차로 생산할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용 된 것은 Galland 등에보고 된 바와 같이 실리콘 습식 에칭을 사용하여 만들어졌습니다. 11; 1 차 금형 제작 절차는이 프로토콜에 중요하지 않습니다. 피라미드는 X 및 Y 방향에 대해 동일한 피치를 가진 제곱 배열로 배열됩니다 (이 경우 피치는 350μm입니다).
예시로서, 개념 증명 실험(12 )은 칩이 웰의 초기 세포 수를 정확하게 정의하면서 장기 배양(개월) 및 분화 프로토콜을 허용한다는 것을 입증하기 위해 출판되었다. 다수의 오가노이드의 개별 개발은 표준 명시야 및 3D 광시트 형광 현미경을 사용하여 실시간으로 자동 모니터링할 수 있습니다. 또한, 오가노이드를 검색하여 추가 생물학적 조사(예: 전사체 분석)를 수행할 수 있습니다. 이 백서는 세포 배양 커버슬립 제작, 형광 현미경을 위한 파종 및 염색 절차, 오가노이드 검색에 대한 자세한 프로토콜을 간략하게 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>2-프로판올</td><td>Thermofisher 과학</td><td>AA19397K7</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Thermofisher 과학</td><td>AA19392K7</td><td></td></tr><tr><td>BC43 벤치탑 컨포칼 현미경</td><td>Andor Technology</td><td></td><td>회전 디스크 컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민&nbsp;</td><td>Thermofisher scientific</td><td>37525</td><td></td></tr><tr><td>완충 산화물 에칭 용액</td><td>Merck</td><td>901621-1L</td><td></td></tr><tr><td>CEE Spin Coater</td><td>Brewer Science</td><td>200X</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DAPI Thermofisher scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>개발자 AZ400K</td><td>Merck</td><td>18441223164</td><td></td></tr><tr><td>DI Milliq water</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Marienfled</td><td>117650</td><td>1.5H, 원형 25mm 직경</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 소프트웨어</td><td>BitPlane</td><td></td><td>이미지 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>반전 투과 광학 현미경</td><td>Nikon</td><td>TSF100-F</td><td></td></tr><tr><td>Labsonic M</td><td>Sartorius Stedium Biotech</td><td></td><td>초음파 균질화</td></tr><tr><td>Lipidure</td><td>NOF America</td><td>CM5206</td><td>생체 모방 공중합</td></tr>체 <tr><td>NOA73</td><td>Norland 제품</td><td>17-345</td><td>UV 경화 가능한 접착제</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td>A12379</td><td>Alexa Fluor</td></tr><tr><td>Phosphate 버퍼 솔루션</td><td>Thermofisher 과학</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>포토 레지스트 AZ5214E</td><td>Merck</td><td>14744719710</td><td></td></tr><tr><td>Pico Plasma 도구</td><td>Diener Electronic GmbH + Co. KG</td><td>Pico Plasma</td><td>O2 플라즈마 처리용</td></tr><tr><td>RapiClear 1.52</td><td>Sunjin lab</td><td>RC 152001</td><td>수용성 투명화제</td></tr><tr><td>RCT Hot Plate/Stirrer</td><td>IKA (MY)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>반응성 이온 에칭 도구</td><td>Samco Inc. (JPN)</td><td>RIE-10NR</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>HCT116 세포용</td><td>Invitrogen</td><td>11875093</td> 배양 배지</tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td>Polydimethylsiloxane 또는 간단히 PDMS</td></tr><tr><td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td>계면활성제</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Thermofisher 과학</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>초음파 세척기</td><td>Bransonic</td><td>CPX2800</td><td></td></tr><tr><td>UV-KUB 2</td><td>KLOE</td><td></td><td>UV-LED 광원, 365nm 파장, 35mW/cm2 전력 밀도</td></tr><tr><td>UV 마스크 얼라이너</td><td>SUSS 마이크로텍 세미컨덕터 (DE)</td><td>MJB4</td><td></td></tr></tbody></table>

오가노이드의 배양 및 3d 이미징을 위한 고처리량 플랫폼

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

다양한 해상도 스케일에서 다수의 3차원(3D) 유기형 배양(오가노이드)의 특성 분석은 현재 표준 이미징 접근 방식에 의해 제한됩니다. 이 프로토콜은 최소한의 조작으로 최대 300개의 오가노이드/h 이미징 처리량을 지원하는 사용자 친화적인 기기에서 멀티스케일 3D 라이브 이미징을 가능하게 하는 미세 제작된 오가노이드 배양 칩을 준비하는 방법을 설명합니다. 이러한 배양 칩은 공기 및 침지 대물렌즈(공기, 물, 오일 및 실리콘) 및 광범위한 일반 현미경(예: 스피닝 디스크, 포인트 스캐너 공초점, 광시야 및 명시야)과 호환됩니다. 또한 단일 대물렌즈, 단일 평면 조명 현미경(SPIM) 기술(soSPIM)과 같은 라이트 시트 양식과 함께 사용할 수 있습니다. 
여기에 설명된 프로토콜은 미세가공 배양 칩의 제조와 오가노이드의 배양 및 염색을 위한 자세한 단계를 제공합니다. 익숙해지는 데 짧은 시간 만 필요하며 소모품과 장비는 일반 바이오 실험실에서 쉽게 찾을 수 있습니다. 여기서 3D 이미징 기능은 상용 표준 현미경(예: 3D 재구성을 위한 스피닝 디스크 및 일상적인 모니터링을 위한 광시야 현미경)으로만 시연됩니다.

도 8F는 성공적인 제조 후의 세포 배양 커버슬립의 전형적인 양상을 나타낸다. UV 경화형 접착제 층은 평평하게 보이고 커버 슬립에 잘 부착됩니다. 커버슬립의 층이 과경화되거나 평평한 PDMS 기판의 제거가 잘못 수행된 경우 커버슬립의 접착층 전사가 실패할 수 있습니다(그림 8G,H 참조). 두 경우 모두 질감이 있는 필름이 커버슬립으로 전달되지 않기 때문에 실패가 분명합니다.
마이크로웰이 작동하려면 생성된 질감 필름(프로토콜 단계 3에 설명된 대로)이 피라미드의 상단과 하단을 모두 열어 7단계에서 파종하는 동안 세포가 공동으로 들어가 오가노이드가 형성되기 시작하면 포함된 상태로 유지될 수 있도록 해야 합니다. 도 9는 코팅 용액 중의 생체모방 공중합체의 농도 증가에 의한 코팅의 두께 증가를...

이 논문은mm2당 수백 개의 마이크로컨테이너를 사용하는 새로운 유형의 배양 기질에 대한 제조 프로토콜을 제시하며, 이 배양에서 오가노이드는 고해상도 현미경을 사용하여 배양 및 관찰할 수 있습니다. 세포 파종 및 면역 염색 프로토콜도 자세히 설명되어 있습니다.

오가노이드의 배양 및 3D 이미징을 위한 고처리량 플랫폼

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

이 프로토콜은 재료에 대한 지식이 있고 현미경과 완벽하게 호환되는 수백 개의 오가노이드의 성장을 위해 설계된 미세 질감 세포 배양 접시를 보여줍니다. 당사의 기술은 장기 이미징 및 장기 세포 배양과 완벽하게 호환되는 수천 개의 유기체를 효율적으로 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 약물 스크리닝 파이프라인 및 암 연구 영역과 같은 생물 의학 응용 분야에 큰 관심을 받고 있습니다.이 프로토콜에 제시된 기술은 실험실 절차 및 광학 현미경 검사에 경험이있는 사람이라면 누구나 몇 번 시도하면 쉽게 마스터 할 수 있습니다. 시작하려면 PDMS 금형의 작은 부분을 최종 장치에 필요한 치수로 절단하십시오. 배열의 XY 방향과 평행하게 자릅니다.준비된 PDMS 몰드 주사위 중 하나를 평평한 PDMS 섹션에 뒤집어 놓습니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 약 0.1 내지 0.2 밀리리터의 UV 경화성 접착제를 몰드의 한쪽면에 첨가한다. 10X 배율의 도립 광학 현미경을 사용하여 캐비티 내부의 액체 진행을 따르십시오.접착제를 UV 광선에 노출시켜 경화시킵니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 UV 소스의 전력 밀도에 따라 노출 시간을 조정합니다. 한쪽 가장자리에 과도한 양의 접착제를 사용하여 경화된 접착제를 손가락으로 부드럽게 눌러 평평한 PDMS 기판에 고정합니다.한편, 핀셋을 사용하여 누르고 있는 동일한 가장자리 옆에 몰드의 한쪽 모서리를 집고 질감이 있는 필름이 들리지 않도록 하면서 몰드를 천천히 떼어냅니다. 면도날을 사용하여 과도한 접착제와 PDMS 기판을 트리밍하여 경화, 질감 및 접착층을 PDMS에 평평하게 놓고 여분의 기판은 한쪽 가장자리에만 둡니다. 짧은 산소 플라즈마 공정으로 깨끗한 커버슬립을 처리하여 친수성을 개선하십시오.플라즈마 활성화 후, 표준 스핀 코터의 진공 척에 커버슬립을 놓고 커버슬립 중앙에 작은 접착제 방울을 부어 UV 경화 접착제의 얇은 층을 스핀 코팅합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 스핀 코팅 프로세스를 실행합니다. 스핀 코팅을 사용할 수 없는 경우 피펫을 사용하여 깨끗한 커버슬립에 약 0.1ml의 UV 경화 접착제를 떨어뜨립니다.두 번째 커버슬립을 가져다가 첫 번째 커버슬립 위에 올려 액체 접착제가 두 커버슬립 사이에 고르게 퍼지도록 합니다. 접착제가 커버슬립의 가장자리에 도달하면 하나를 다른 위로 밀어 부드럽게 분리합니다. 분리되면 두 커버슬립은 얇은 액체 접착제 층으로 완전히 코팅됩니다.스핀 코팅

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

장기의 전체 3D 구조 및 세포 함량뿐만 아니라 원래 조직과 의학적 유사성은 여기에 설명된 단세포 분해능 3D 이미징 프로토콜을 사용하여 포획될 수 있다. 이 프로토콜은 원기, 크기 및 모양이 다양한 광범위한 오르가노이드에 적용할 수 있습니다.

단세포 분해능 3차원 알래기 알코노이드

여기에서 자사는 100μm에서 수 밀리미터 범위의 고정 3차원 세포 배양 모델의 염색 및 세포내 분해능 이미징을 수행하기 위한 상세하고 강력하며 보완적인 프로토콜을 제공하여 형태, 세포 유형 구성 및 상호 작용을 시각화할 수 있습니다.

3차원 오가노이드 및 스페로이드 모델의 염색 및 고해상도 이미징

매우 정확한 체외 고처리량 분석 시스템은 암 조직과 유사하지만 96웰 및 384웰 플레이트를 가진 체외 고처리량 분석 시스템에 적합하지 않은 환자 유래 종양 오르가노이드(PdOs)를 사용하여 항암제를 평가하기 위해 개발되었다.

환자 유래 종양 오르가노이드를 사용하여 시험관 분석에서 높은 처리량

이 프로토콜은 종양 내 이질성을 포착하기 위해 다중 매개변수, 단일 오가노이드 약물 반응을 정량화하고 시각화하기 위한 중간 및 고처리량 오가노이드 약물 스크리닝 및 현미경에 구애받지 않는 자동 이미지 분석 소프트웨어를 위한 반자동 방법을 설명합니다.

벌크 및 단일 오가노이드 분석을 위한 광시야 라이브 셀 이미징을 사용한 다중 파라미터 종양 오가노이드 약물 스크리닝

본 연구는 다양한 현미경으로 전체 스페로이드 및 오가노이드를 배양, 냉동, 해동, 가공, 염색, 라벨링 및 검사하는 방법론을 설명하지만 다목적 장치 내의 하이드로겔에 그대로 유지됩니다.

배양, 냉동, 처리 및 전체 오가노이드 및 스페로이드의 이미징 상태를 하이드로겔에 있는 동안

이 프로토콜은 처리량이 많은 스캐폴드 기반 배양 플랫폼인 SPOT의 제작 및 조립을 96웰 및 384웰 형식으로 문서화합니다. 또한 수동 및 상업적으로 이용 가능한 액체 처리기를 사용하여 SPOT의 파종 프로세스에 대해 자세히 설명합니다.

고처리량 스캐폴드 기반 배양 플랫폼으로서의 SPOT의 재현 가능한 제조

우리는 저간섭 홀로단층촬영을 사용하여 오가노이드의 고해상도, 무표지 및 3차원 이미징을 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 오가노이드 배양 준비, 이미징 획득 및 전산 이미지 분석을 자세히 설명하여 살아있는 오가노이드의 구조 역학 및 약물 반응을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

저간섭성 홀로토마그래피를 통한 장내 오가노이드의 무표지, 고해상도 3D 이미징 및 머신러닝 분석

우리는 시험 관내 CNS 축삭 - glia의 상호 작용 연구를위한 새로운 다중 구획 신경 공동 문화 microsystem 플랫폼을 개발했습니다. 플랫폼은 병렬 여섯 독립적인 실험까지 실시 수 있으며, 새로 개발된 마이크로 / 매크로 하이브리드 제조 방법을 사용하여 가공했습니다.

다중 구획 CNS 뉴런 - glia 공동 문화 Microfluidic 플랫폼

세포의 Lensfree 온 - 칩 이미징 및 특성은 그림이다. 이 온칩 세포 이미징 접근 방식은 자원 가난한 설정을 위해 특히 적합, 의료 진단 및 높은 처리량 세포 생물학 애플 리케이션을위한 소형 및 비용 효율적인 도구를 제공합니다.

셀 Lensless 온 - 칩 영상은 높은 처리량 세포 생물학 및 의료 진단을위한 새로운 도구를 제공합니다

우리는 공부에 대한 강력한 생화학 및 미세 방법을...

에서 지방 질량의 생화학 및 높은 처리량 미세 평가<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

배우세요 마이크로텍스처 배양 접시를 이용한 오가노이드 고처리량 배양 및 3D 이미징 방법을 통해 암 연구와 신약 개발에 활용할 수 있는 생물학적 모델을 구축하는 기술을 익히세요.

오가노이드의 배양 및 3D 이미징을 위한 고처리량 플랫폼

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