설치류 눈의 미세 해부

초기의 안구 연구는 대부분 사망한 개인의 안구 조직에 의존했습니다. 그러나 수년에 걸쳐 많은 안과용 설치류 모델이 개발되었고 인간 안구 조직의 필요성이 감소했습니다. 설치류의 눈에서 크기가 작고 수술 영역이 제한되어 있기 때문에 안구 하위 부분에 대한 효과적인 접근이 심각하게 제한됩니다.

일반적으로 설치류의 눈을 수술하기 위해 시신경을 통해 눈을 고정시키고 해부를 수행합니다. 이 연습은 힘들고 해부 중에 구형 눈이 계속 움직이기 때문에 깨지기 쉬운 조직을 손상시킬 수 있습니다. 망막층의 다양한 부분을 분리하는 데 유익함에도 불구하고 이 기술은 조직 해부 시 조직의 공간적 방향을 구분할 수 없습니다.

또한, 표적 개입은 후방 및 전방 안구 컵의 균질한 세포 조립으로 인해 해부 후 위치를 찾기가 어렵습니다. 이 비디오에서는 미세 해부를위한 수정 된 수술 방법을 보여줍니다. 부착 된 니트 멤브레인 또는 세 번째 눈꺼풀의 존재는 독특하고 중요한 이점을 제공합니다.

이 방법에서는 먼저 안구를 세 번째 눈꺼풀로 적출한 다음 세 번째 눈꺼풀을 사용하여 눈을 고정시킵니다. 그런 다음 각막 윤부를 통해 안구를 뚫고 절개를 입구로 사용합니다. 그런 다음 원주를 따라 절단하여 전방 및 후방 안구 컵을 분리합니다.

뒤쪽 안구를 더 해부하면 신경 망막의 반투명 층이 식별되고 부드럽게 벗겨집니다. 따라서 신경 및 RPE 층은 추가 처리를 위해 얻어집니다. 세 번째 눈꺼풀은 눈 포스트 적출술의 공간적 방향을 구분할 수 있게 해줍니다.

이제 자세한 단계별 절차를 따르십시오. 0.8 % tropicamide와 5 % phenylephrine 점과 용액을 사용하여 설치류의 눈을 넓히고 시술 전에 30 분 동안 어두운 곳에 두십시오. 5회 용량의 마취를 복강 내 투여하여 동물을 안락사시킵니다.

일반적인 용량은 10mg의 케타민과 1mg의 자일라진을 함유하는 200마이크로리터 PBS입니다. 페달 반사를 검사하여 자극에 대한 반응이 완전히 부족한지 확인합니다. 눈에 완전히 접근할 수 있도록 마우스를 옆으로 누운 상태로 놓습니다.

Colibri 봉합 집게, 곡선 집게, 15도 3mm 크기의 마이크로 블레이드, 스프링 마이크로 가위 및 각진 스프링 마이크로 가위를 절차에 대비하십시오. 안구 주위에 구부러진 집게를 놓고 꼬집어 외부 부착물로부터 눈을 떼십시오. 니티팅 멤브레인이라고도 하는 세 번째 눈꺼풀은 비강 접선의 위쪽 모서리를 향해 위치하며 색소 경계가 있는 작은 반투명 돌출부로 식별할 수 있습니다.

다음으로 스프링 마이크로 가위를 사용하여 안구 주위를 자릅니다. 작고 연속적인 절단은 공막 부착물에서 안구를 방출합니다. 안구 아래에 구부러진 스프링 마이크로 가위를 놓아 시신경을 절단하여 눈을 자유롭게 합니다.

적출된 눈을 PBS 완충액이 들어 있는 페트리 접시에 넣어 안구가 PBS에 잠기도록 합니다. 일부 외안근이나 조직이 안구에서 떠오르기 시작합니다. 스프링 마이크로 가위를 사용하여 안구에서 잘라내어 제거하십시오.

그런 다음 안구 기저부에서 시신경을 제거하여 전체 마운트 준비를 위해 망막을 더 잘 분리할 수 있도록 합니다. 조직 절편을 위해 시신경을 제거 할 필요는 없습니다. 안구를 4% 파라포름알데히드 또는 PFA 1ml가 들어 있는 1.5ml 튜브에 옮깁니다.

조직 고정을 위해 섭씨 4도에서 2 시간 동안 보관하십시오. 섭씨 4도에서 최대 12시간 동안 PFA에 조직을 두어 이 단계에서 일시 중지할 수 있습니다. 그러나 살아있는 세포의 분리를 위해서는 고정 단계를 수행해서는 안되며 전체 절차를 연속체로 수행해야합니다.

PFA 고정 후 안구를 PBS가 들어있는 페트리 접시에 옮기고 해부 현미경으로 올려 후속 절차를 수행합니다. Colibri 봉합 집게로 세 번째 눈꺼풀을 단단히 눌러 안구를 고정합니다. 윤부는 각막 공막 접합부입니다.

마이크로 블레이드를 사용하여 윤부를 뚫어 윤부에 작은 절개를하십시오. 절개는 바람직하게는 세 번째 눈꺼풀의 반대쪽에 이루어진다. 다음으로, 이 절개를 시작점으로 사용하여 미세 가위로 이 각막 공막 윤부 둘레를 따라 작고 연속적인 절단을 합니다.

먼저 절개 부위부터 세 번째 눈꺼풀까지 반원형으로 절단합니다. 그런 다음 다른 쪽의 나머지 반원 절단을 완료하십시오. 마지막으로 세 번째 눈꺼풀 주위를 잘라 뒤쪽 컵과 앞쪽 컵을 분리합니다.

집게를 사용하여 후방 컵에서 수정체를 제거하여 신경 망막과 RPE 층으로 구성된 후방 컵과 각막 전방 컵을 얻습니다. 고정되지 않은 조직으로 작업하는 경우 전방 및 후방 컵을 효소로 소화하여 각막 또는 망막 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다. 조직을 고정하기 위해 이 컵을 섭씨 4도에서 12시간 동안 4% PFA 1ml가 들어 있는 1.5ml 튜브에 옮깁니다.

고정 후, 조직은 적절한 배지에 포매될 수 있고, 각막 또는 망막 절편을 얻기 위해 냉동 절편 또는 파라핀 절편이 수행될 수 있다. PBS 완충액이 들어 있는 페트리 접시에 후방 컵을 다시 넣습니다. 착색된 RPE 층의 불투명한 층은 신경 망막입니다.

두 번째 집게를 사용하여 신경 망막을 떼어냅니다. 조직을 손상시키지 않도록 매우 부드럽고 약간의 손 움직임이 좋습니다. 시신경이 빠져 나올 때, 구부러진 스프링 가위는 신경 망막 아래에 삽입 될 수 있으며, 신경 망막이 부착 된 상태로 유지되면 층을 완전히 자유롭게하기 위해 절단을 할 수 있습니다.

망막은 부드러운 브러시로 부드럽게 쓰다듬어 풀거나 분리할 수도 있습니다. PBS 버퍼가 들어 있는 페트리 접시에 전방 및 후방 컵을 다시 넣습니다. 각진 스프링 마이크로 가위를 사용하여 세 번째 눈꺼풀 옆을 주변에서 시신경 중심을 향해 수직으로 자릅니다.

세 번째 눈꺼풀을 잡고 첫 번째 눈꺼풀 옆에 자릅니다. 두 번째 컷과 세 번째 눈꺼풀 사이에 비슷한 컷을 만듭니다. 3 개 또는 4 개의 등거리 절단은 반구형 컵을 꽃 모양으로 열어 평평하게 떨어지고 쉽게 장착 할 수 있습니다.

잎 부분이 쉽게 떨어지거나 분리될 수 있으므로 컵 중앙까지 너무 깊게 자르지 마십시오. 액체 매질은 전방 아이컵이 곡선 구조를 얻을 수 있도록 합니다. 뒤쪽 컵을 절단할 때 주어진 것과 동일한 단계를 수행하여 앞쪽 컵에 3개 또는 4개의 등거리 절단을 만듭니다.

이제 조직은 추가 염색을 할 준비가 되었습니다. 이 그림에서는 전방 컵의 전체 마운트가 표시됩니다. 각막 소엽의 부착된 결막 조직 내의 림프관을 드러내기 위해 각막 조직을 기재된 바와 같이 미세 해부하였다.

이 그림에는 신경 망막의 전체 마운트가 표시됩니다. 신경 망막의 망막 맥관 구조는 Isolectin으로 염색되었으며 녹색 혈관으로 보입니다. 이 방법에서는 효과적이고 쉬운 취급을 위해 부착된 세 번째 눈꺼풀로 생쥐의 적출된 안구를 얻습니다.

세 번째 눈꺼풀은 안구를 완전히 고정시키고 박리가 쉽고 최소한의 오류로 진행되도록합니다. 이 방법은 안구 조직 특이적 절편, 단일 세포 분석 및 전체 마운트에 유리합니다. 그러나 반복적인 조직 고정의 필요성으로 인해 조직은 세포 배양 또는 이러한 살아있는 세포 필수품에 사용할 수 없게 됩니다.

따라서 이 절차는 생세포 분리를 위해 연속체로 수행되어야 합니다.