Name: 설치류 눈의 미세 해부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: 배우세요 설치류 눈의 미세 해부 기법으로 막눈을 활용한 안구 고정 및 전후부 안구 분리 방법을 익히세요. 이 기술은 망막층 분리와 조직 손상 최소화에 효과적입니다.

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미국 캘리포니아 데이비스 대학교 세포 생물학 및 인체 해부학과의 Alaknanda Mishra 박사는 뉴델리에 있는 국립 면역학 연구소에서 이 방법을 교육했습니다. 이 작업은 인도 정부의 생명공학부에서 뉴델리의 국립 면역학 연구소(National Institute of Immunology)에 받은 핵심 보조금의 지원을 받았습니다. 추신 : 생명 공학과에서 연구 펠로우쉽을 받았습니다.

이 절차는 뉴 델리 국립 면역학 연구소 (National Institute of Immunology)의 기관 동물 윤리위원회 (Institutional Animal Ethics Committee)의 승인을 받았습니다. 승인의 일련 참조 번호는 IAEC#480/18입니다. 실험은 SAF, NII의 전문 수의사의 감독하에 인도 정부 수산, 축산 및 낙농부 동물 실험 통제 및 감독 위원회의 규정 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 준비
<ol><li>각 눈에 0.8 % tropicamide와 5 % phenylephrine 점과 용액을 떨어 뜨려 설치류의 눈을 확장시킵니다. 시술 전에 동물을 어두운 곳에 30 분 동안 두십시오. 참고: 동물은 30분을 마친 직후 안락사되므로 진통제가 필요하지 않습니다. 동물의 눈을 어둡게 적응시키고 확장하면 관찰자가 시술 전에 안구 눈물과 손상을 확인할 수 있습니다. 또한, 팽창은 색소 안구 조직으로 작업하는 동안 유리합니다.</li>
	<li>5x 용량의 마취를 복강 내 투여하여 동물을 안락사시킵니다. 일반적인 용량은 10mg의 케타민과 1mg의 자일라진을 포함하는 PBS 200μL입니다. 참고: 동물을 안락사시키기 위한 용량은 400-500mg/kg 체중의 케타민과 50mg/kg 체중의 자일라진을 복강 주사합니다. 체중이 20g인 일반적인 마우스의 경우 용량은 케타민 10mg(100mg/mL 케타민 원액 100μL)과 자일라진 1mg(자일라진 원액 100μL)을 포함하는 PBS 200μL입니다.</li>
	<li>페달 반사를 검사하여 자극에 대한 반응이 완전히 부족한지 확인하십시오. 심장 박동과 호흡의 부재도 중요한 지표입니다.</li>
	<li>눈에 완전히 접근할 수 있도록 마우스를 옆으로 누운 상태로 놓습니다.</li>
	<li>Colibri 봉합 집게, 곡선 집게, 마이크로 블레이드(15°, 3mm 크기), 스프링 마이크로 가위 및 각진 스프링 마이크로 가위를 준비하여 시술 준비를 합니다.</li>
</ol>2. 세 번째 눈꺼풀과 함께 마우스 눈의 적출
<ol><li>눈에 완전히 접근할 수 있도록 마우스를 옆으로 누운 자세로 놓습니다. 집게로 바깥 쪽 눈꺼풀을 열어 세 번째 눈꺼풀을 최적으로 시각화합니다. 참고: 니티팅 멤브레인이라고도 하는 세 번째 눈꺼풀은 비강 접선의 위쪽 모서리를 향해 위치합니다(그림 1A).</li>
	<li>세 번째 눈꺼풀을 색소 경계가 있는 작은 반투명 돌출부로 식별합니다(그림 1B).</li>
	<li>구부러진 집게를 안구 주위에 놓고 꼬집어 외부 부착물로부터 눈을 떼십시오. 이렇게하면 주변 조직에서 눈으로 출혈하는 것을 최소화 할 수 있습니다.</li>
	<li>구부러진 집게를 스프링 마이크로 가위로 교체하고 세 번째 눈꺼풀이 부착된 안구 주위를 자릅니다. 작은 연속 절단을 사용하여 주변 조직 부착물에서 안구를 분리합니다.</li>
	<li>구부러진 스프링 마이크로 가위를 안구 아래에 놓아 시신경을 절단하여 눈을 자유롭게 합니다. 안구가 안구에서 완전히 분리되었는지 확인하십시오.</li>
</ol>3. 외부 조직 제거
<ol><li>안락사된 마우스의 적출된 눈을 pH 7.4의 인산염 완충 식염수(PBS) 완충액이 있는 페트리 접시에 넣고 안구가 PBS에 잠기도록 페트리 접시를 채웁니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 부착된 세 번째 눈꺼풀이 부착된 마우스의 적출된 안구를 한 손으로 고정합니다.</li>
	<li>보다 효율적인 취급을 위해 안구를 액체 매체에 매달아 두십시오. 일부 외안근이나 조직이 안구에서 떠오르기 시작합니다. 스프링 마이크로 가위를 사용하여 안구에서 잘라내어 제거하십시오.</li>
	<li>마이크로 가위를 사용하여 안구 기저부에서 시신경을 잘라내어 제거하여 전체 마운트 준비를 위해 망막을 더 잘 분리할 수 있도록 합니다. 참고: 조직 절편을 위해 시신경을 제거할 필요는 없습니다.</li>
	<li>PBS로 안구를 세척하고 조직 고정을 위해 4°C에서 최소 2시간 동안 4% 파라포름알데히드(PFA) 1mL가 들어 있는 1.5mL 튜브에 옮깁니다. 참고: 이 단계에서 조직을 12°C에서 최대 4시간 동안 PFA에 그대로 두어 절차를 일시 중지할 수 있습니다. 그러나 살아있는 세포의 분리를 위해서는 고정 단계를 수행해서는 안되며 전체 절차를 일시 중지없이 수행해야합니다.</li>
</ol>4. 전방 및 후방 안구를 얻기 위해 적출된 눈의 해부
<ol><li>PFA 고정 후(살아있는 세포를 채취하는 경우 안구 고정 없이 진행) 안구를 PBS가 들어 있는 페트리 접시에 옮기고 해부 현미경 아래에 두어 후속 절차를 수행합니다.</li>
	<li>Colibri 봉합 집게로 세 번째 눈꺼풀을 단단히 눌러 안구를 고정합니다.</li>
	<li>마이크로 블레이드를 사용하여 윤부를 뚫어 윤부에 작은 절개를 합니다. 윤부는 각막-공막 접합부입니다. 세 번째 눈꺼풀 반대쪽에 절개를 하여 스프링 마이크로 가위의 접근 지점을 만듭니다. 알림: 15° 및 3mm 크기의 마이크로블레이드를 사용하면 이 절개 깊이를 더 잘 제어할 수 있습니다.</li>
	<li>다음으로,이 절개를 시작점으로 사용하여 한 쌍의 미세 가위로 각막 공막 윤부의 둘레를 따라 작고 연속적인 절단을합니다. 먼저 절개 지점에서 세 번째 눈꺼풀까지 반원형의 절단을 완료합니다. 그런 다음 반대쪽에 나머지 반원 컷을 완성합니다. 마지막으로 세 번째 눈꺼풀 주위를 잘라 뒤쪽 컵과 앞쪽 컵을 분리합니다. 알림: 관심 있는 아이컵에 따라 니티팅 멤브레인은 전방 또는 후방 아이컵에 부착된 상태로 둘 수 있습니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 후방 컵에서 렌즈를 제거하여 신경 망막 및 망막 색소 상피(RPE) 층을 포함하는 후방 컵을 얻습니다. 따라서 수정체, 후안컵, 눈의 앞쪽 컵이 분리됩니다. 참고: 고정되지 않은 조직으로 작업하는 경우 전방 및 후방 컵을 효소로 소화하여 각막 또는 망막 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>조직을 고정하기 위해 이 컵을 4°C에서 12시간 동안 4% PFA 1mL가 들어 있는 1.5mL 튜브에 옮깁니다. 참고: 고정 후 조직을 적절한 배지에 삽입할 수 있으며 각막 또는 망막 절편을 얻기 위해 냉동 절편 또는 파라핀 절편을 수행할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 신경 망막 및 RPE 층의 분리
<ol><li>PBS 완충액이 들어 있는 페트리 접시에 후방 컵을 다시 넣어 조직을 잠급니다.</li>
	<li>신경 망막의 존재를 확인하십시오. 이것은 컵의 주변 둘레에 부착된 착색된 RPE 층의 불투명한 층으로 시각화할 수 있습니다.</li>
	<li>집게로 세 번째 눈꺼풀을 잡고 뒤쪽 컵을 고정하고 두 번째 집게를 사용하여 주변부에서 시작하여 신경 망막을 떼어냅니다. 알림: 조직을 손상시키지 않도록 손을 매우 부드럽고 약간 움직이는 것이 좋습니다. 시신경 출구에서 구부러진 스프링 가위를 신경 망막 아래에 삽입할 수 있으며, 그림 3과 같이 신경 망막이 부착된 상태로 남아 있는 경우 층을 완전히 해제하기 위해 절단할 수 있습니다. 선택적으로 부드러운 브러시를 사용하여 부드러운 스트로크로 망막을 풀거나 분리합니다. 그러나 조직학을 위해 망막을 수집하는 경우에는 그렇게 하는 것이 적절하지 않습니다. 참고: 따라서 세 번째 눈꺼풀이 있는 신경 망막과 색소 RPE 층이 얻어집니다.</li>
</ol>6. 전체 마운트를 위한 망막 및 RPE 층의 분할
<ol><li>PBS 완충액이 들어 있는 페트리 접시에 앞쪽 및 뒤쪽 컵을 다시 넣고 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다.</li>
	<li>세 번째 눈꺼풀을 눌러 앞쪽 컵을 고정합니다.</li>
	<li>각진 스프링 마이크로 가위를 사용하여 세 번째 눈꺼풀 옆에 있는 아이컵 직경의 약 3/4을 절단하고 주변에서 광학 중심을 향해 수직으로 절단합니다.</li>
	<li>세 번째 눈꺼풀을 잡고 첫 번째 눈꺼풀 옆에 자릅니다.</li>
	<li>두 번째 컷과 세 번째 눈꺼풀 사이에 비슷한 컷을 만듭니다. 알림: 이러한 등거리 컷을 3개 또는 4개 하면 반구형 컵이 꽃 모양으로 열리며 평평하게 떨어지고 쉽게 장착할 수 있습니다.</li>
	<li>세 번째 눈꺼풀을 눌러 뒤쪽 컵을 고정합니다.</li>
	<li>앞쪽 컵에서 절단할 때 주어진 것과 동일한 단계(6.3-6.5단계)에 따라 뒤쪽 컵에서 3개 또는 4개의 등거리 절단을 합니다. 참고: 5단계에서 분리된 신경 망막의 조직학을 위해 유사한 절단을 하여 표면에 평평하게 떨어지도록 합니다. 컵 중앙을 너무 깊게 자르면 잎 부분이 쉽게 떨어져 나가거나 분리될 수 있습니다.</li>
	<li>염색을 수행하고, 효과적인 시각화를 위해 조직을 전체적으로 장착한다 7,8. 참고: 니티팅 멤브레인의 존재는 전체 마운트에서 아이컵의 비강 쪽에 대한 지속적인 물리적 지표 역할을 합니다. 아이컵의 세 번째 눈꺼풀이 비강/복부 방향을 나타내기 때문에 아이컵의 등쪽/복부 쪽을 구분하는 데 도움이 됩니다.</li>
</ol>

<ol><li>Choi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cancer+immunotherapy+using+patient-derived+xenografts+%28PDXs%29+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice.</a> Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li>
<li>Sutherland, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection+of+Highly+Pure+Trabecular+Meshwork+from+Mouse+Eyes+for+Gene+Expression+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis.</a> J Vis Exp. (136), e57576(2018).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li>
<li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997(2018).</li>
<li>Claybon, A., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+a+mouse+eye+for+a+whole+mount+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2563(2011).</li>
<li>Steven, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+induction+and+three-dimensional+two-photon+imaging+of+conjunctiva-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).</li>
<li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50546(2013).</li>
<li>Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+wholemount+technique%3A+A+window+to+understanding+the+brain+and+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour.</a> Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).</li>
<li>Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatics+and+lymphangiogenesis+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye.</a> Journal of Ophthalmology. 2012, 783163(2012).</li>
<li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood-derived+monocytes+show+neuronal+properties+and+integration+in+immune-deficient+rd1+mouse+model+upon+phenotypic+differentiation+and+induction+with+retinal+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412(2020).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

설치류의 눈은 크기가 작고 구형이기 때문에 안구 미세 해부는 어려운 작업인 것으로 밝혀졌으며, 설치류의 눈은 효율적인 취급을 위한 혁신적인 기술이 필요하다8. 
현재 시연된 방법에서, 적출된 마우스 안구는 효과적이고 쉬운 취급을 위해 세 번째 눈꺼풀이 부착된 상태에서 얻어집니다. 세 번째 눈꺼풀을 사용하면 안구를 완전히 고정시킬 수 있으므로 해부를 쉽고 오류를 최소화 할 수 있습니다. 또한, 제 3 눈꺼풀의 존재는 눈의 하위 부분의 방향을 묘사한다. 따라서 안구는 세 번째 눈꺼풀로 해부되어 전방 및 후방 안구를 얻습니다. 균일하고 깨끗한 절단을 허용하기 위해 가위 입구에 슬릿을 사용하면 눈의 구형 특성으로 작업하기가 더 쉬워집니다. 또한, 후방 아이컵을 추가로 해부하여 신경 망막의 반투명 층을 부드럽게 벗겨냄으로써 조직 특이적 연구를 위한 신경 망막 및 RPE 층을 얻을 수 있습니다.
또...

안구 박리는 안과 연구에서 중요한 기술이며 연구자가 표적 연구를 위해 눈의 부분에 접근할 수 있도록 했습니다. 이전에 안구 연구자들은 연구를 위해 병에 걸린 개인의 안구 조직에 의존했습니다. 그러나, 수년에 걸쳐 점진적으로 증가하는 안과용 설치류 모델1 균주의 수는 인간 안구 조직에 대한 필요성을 감소시켰다. 이러한 마우스 균주는 안구 질환 및 중재에 대한 더 깊은 이해를 가능하게 했습니다. 그러나 그들은 또한 안구 미세 해부의 혁신적인 기술에 대한 필요성을 불러일으켰습니다. 작은 크기와 제한된 작동 영역은 안구 하위 부분에 대한 효과적인 접근을 심각하게 제한합니다. 또한, 후방 및 전방 안구재의 균질한 세포 조립으로 인해 해부 후 표적 중재를 수행하기 어렵습니다. 레이저2 및 외과 미세 해부 3,4의 현재 미세 해부 기술은 안구 연구의 이러한 요구 사항을 충족시키기에 부적절합니다. 레이저 미세 해부는 단일 세포 분석에 매우 효과적이지만 레이저 시술 전에 특정 조직을 미세 해부해야 합니다2. 이 기술은 분자 분석을 위해 사전 해부된 조직에서 작은 관심 영역을 분리할 수 있습니다. 따라서 이 기술은 전체 마운트를 준비하거나 최적의 시각화를 위해 축 방향으로 채워진 안구 층을 분리하는 데 적합하지 않습니다.
수술 방법은 가장 널리 사용되는 기술입니다. 이 방법은 시신경(5)을 통해 눈을 고정시킨 다음 해부를 수행하는 것이다. 이 연습은 힘들고 해부 중에 구형 눈이 계속 움직이기 때문에 깨지기 쉬운 조직을 손상시킬 수 있습니다. 망막층의 다양한 부분을 분리하는 데 유익함에도 불구하고 이 기술은 해부 시 조직의 공간적 방향을 구분할 수 없습니다.
해부하는 동안 부착된 니티팅 멤브레인 또는 세 번째 눈꺼풀(그림 1)의 존재를 유지하면 독특하고 중요한 이점이 있습니다. 이 방법에서는 먼저 세 번째 눈꺼풀로 안구를 적출합니다. 그 후, 세 번째 눈꺼풀을 사용하여 눈(6)을 고정시킨다(도 2A). 그런 다음 각막 윤부를 통해 안구를 뚫고 절개 부위를 진입 지점으로 사용합니다(그림 2B, C). 그런 다음 아이컵을 앞뒤로 원주를 따라 절단하여 분리합니다(그림 2D-G). 후방 아이컵을 더 해부하면 신경 망막의 반투명 층을 식별하고 부드럽게 벗겨낼 수 있습니다. 그런 다음 얻어진 반구형 전방 및 후방 컵에 3개 또는 4개의 등거리 절단이 이루어지며, 이를 통해 이 꽃 모양의 컵이 슬라이드에 평평하게 떨어질 수 있습니다(그림 2H).
세 번째 눈꺼풀은 해부 중 쉽고 효율적인 취급을 지원하므로 다양한 안구층에 접근하고 전체 마운트를 생성할 때 조직의 손상을 최소화합니다. 또한, 세 번째 눈꺼풀의 존재는 시각화 중에 국소 적 개입을 찾고 검사하는 데 도움이됩니다.
우리 실험실에서 절차는 모든 성별의 P28에서 CBA/J 또는 rd1 마우스 균주에 대해 수행되었습니다. 이 절차는 동물의 모든 균주, 연령 또는 성별에 대해 수행 할 수 있으며 이러한 특성에 따라 편견이 없습니다.
동물들은 상업적 공급원으로부터 조달되었고( 재료의 표 참조) 국립 면역학 연구소(NII)의 소동물 시설(SAF)에서 유지되었습니다. 그들은 개별 환기 케이지(IVC)에 보관되었고 산성화된 오토클레이브 물과 음식에 대한 임의로 접근했습니다. 그들은 21-23 ° C에서 14 시간 / 10 시간 명암 주기로 유지되었습니다.
아래는 마우스 눈의 미세 절개를 위한 수정된 수술 방법입니다.

<table><tbody><tr><td>아세트아미노펜(Biocetamol)</td><td>EG Pharmaceuticals</td><td></td><td>특정 카탈로그 번호 없음(현지 조달)</td></tr><tr><td>알칼리성 포스파타아제 키트(DEA)</td><td>Coral Clinical System, 인도</td><td></td><td>특정 카탈로그 번호 없음(현지 구매)</td></tr><tr><td>자동화 분석기</td><td>Tulip, Alto Santracruz, India</td><td>Screen Maaster 3000</td><td>간 기능 검사용 생화학 분석기</td></tr><tr><td>베타딘( 포비돈-요오드 용액)</td><td>Win-Medicare; &nbsp; 인도</td><td></td><td>특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)</td></tr> <tr><td>생물 안전 캐비닛 (클래스 I)</td> <td>카르토스 국제; 인도</td><td></td><td>특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)</td></tr><tr><td>명시야 현미경</td><td>올림푸스, 일본</td><td>LX51</td><td></td></tr><tr><td>CBA / J 근친 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>재고 번호 000654</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaxime (Taxim)</td><td>AlKem ; 인도</td><td></td><td>cefotaxime sodium injection, 특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)</td></tr> <tr><td>Cell Strainer</td><td>Sigma ; US</td><td>CLS431752</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 유형 I</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>17100-017</td><td></td></tr><tr><td>면봉</td><td>순수 면봉 Pvt Ltd; 인도</td><td></td><td>특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)</td></tr><tr><td>DPX Mountant</td><td>Sigma ; US</td><td>6522</td><td></td></tr><tr><td>Drape Sheet</td><td>JSD Surgicals, 델리, 인도</td><td></td><td>특정 카탈로그 번호 없음(현지 조달)</td></tr><tr><td>Eosin Y 솔루션, 알코올</td>성 <td>시그마 ; 미국</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>주요 외과; 인도</td><td></td><td>특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)</td></tr><tr><td>가스 마취 시스템</td><td>Ugo Basile; 이탈리아</td><td>211000</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Himedia, India</td><td>GRM077</td><td></td></tr><tr><td>헤어 리무딩 크림 (Veet)</td><td>Reckitt Benckiser , India</td><td></td><td>특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)</td></tr> <tr><td>Hematoxylin Solution, Mayer's</td><td>Sigma ; 미국</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 나트륨 염</td><td>Himedia; 인도</td><td>RM554</td><td></td></tr><tr><td>양 고환 시그마에서 히알루로니다아제</td><td>; US</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>I.V. 캐뉼라(Plusflon)</td><td>Mediplus, 인도</td><td>Ref 1732411420</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>BD ; US</td><td>REF 303060</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란(Forane)</td><td>Asecia Queenborough</td><td>No B506</td><td>흡입 마취</td></tr><tr><td>케타민(Ketamax)</td><td>Troikaa Pharmaceuticals Ltd.</td><td></td><td>케타민 염산염 IP, 특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)</td></tr><tr><td>Meloxicam (Melonex)</td><td>Intas Pharmaceuticals Ltd; 인도</td><td></td><td>특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)</td></tr> <tr><td>마이크로 니들 홀더 스트레이트 & 곡선</td><td>Mercian ; &nbsp; 잉글랜드</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 니들 홀더 스트레이트 & 곡선</td><td>Mercian ; &nbsp; 영국</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Histo-Line Laboratories, 이탈리아</td><td>MRS3500</td><td></td></tr><tr><td>나일론 스레드</td><td>마이티; 인도</td><td></td><td>특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)</td></tr> <tr><td>파라 포름 알데히드</td><td>Himedia; India</td><td>GRM 3660</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Refresh Tears/Eyemist Gel</td><td>Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India</td><td>P3060</td><td>특정 카탈로그 번호</td></tr><tr><td>없음 RPMI</td><td>Himedia; 인도</td><td></td><td>특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)</td></tr> <tr><td>메스</td><td>주요 외과; 인도</td><td></td><td>특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)</td></tr><tr><td>가위</td><td>주요 외과; 인도</td><td></td><td>특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)</td></tr> <tr><td>SGOT (ASAT) KIT</td><td>Coral Clinical System, 인도</td><td></td><td>특정 카탈로그 번호 없음 (현지 구매)</td></tr><tr><td>SGPT (ALAT) KIT</td><td>Coral Clinical System, 인도</td><td></td><td>특정 카탈로그 번호 없음 (현지 구매)</td></tr><tr><td>Shandon Cryotome E Cryostat</td><td>Thermo Electron Corporation ; 미국</td><td></td><td>특정 카탈로그 번호 없음</td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마 ; US</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Blade No. 22</td><td>La Medcare, India</td><td></td><td>특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)</td></tr> <tr><td>Surgical Board</td><td>현지에서 제작</td><td></td><td>특정 카탈로그 번호 없음 (현지 조달)</td></tr> <tr><td>Surgical White Tape</td><td>3M India ; 인도</td><td>1530-1</td><td>미세공 수술 테이프</td></tr><tr><td>봉합</td>사 <td>Ethicon, Johnson & Johnson, India</td><td>NW 5047</td><td></td></tr><tr><td>주사기 (1ml, 26 g)</td><td>Dispo Van; 인도</td><td></td><td>특정 카탈로그 번호 없음 (현지 구매)</td></tr><tr><td>트리머 (클리퍼)</td><td>Philips</td><td>NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005</td><td></td></tr><tr><td>계량 기계</td><td>Braun</td><td></td><td>특정 카탈로그 번호 없음 (현지 구매)</td></tr><tr><td>William's E Media</td><td>Himedia; 인도</td><td>AT125</td><td></td></tr><tr><td>자일라진(자일락신)</td><td>Indian Immunologicals Limited</td><td></td><td>진정제, 마취 전, 진통제 및 근육 이완제</td></tr></tbody></table>

설치류 눈의 미세 해부

Microdissection of the Rodent Eye

설치류 눈의 안구 미세 박리는 전방 및 후방 안구를 얻기 위해 부착된 니티팅 막 또는 세 번째 눈꺼풀과 함께 적출된 안구를 분할하는 것을 포함합니다. 이 기술을 사용하면 각막 조직, 신경 조직, 망막 색소 상피(RPE) 조직 및 수정체를 포함한 눈의 하위 부분을 특정 안구 조직의 전체 마운트, 냉동 절개 및/또는 단일 세포 현탁액에 대해 얻을 수 있습니다. 세 번째 눈꺼풀의 존재는 눈의 방향 유지에 도움이 되기 때문에 독특하고 중요한 이점을 제공하며, 이는 국소 개입 후 또는 눈의 공간 지형과 관련된 안구 분석과 관련된 연구에서 눈 생리학을 이해하는 데 중요합니다.
이 방법에서는 외안근을 조심스럽게 천천히 절단하고 시신경을 절단하여 세 번째 눈꺼풀과 함께 소켓의 안구를 적출했습니다. 안구는 마이크로 블레이드를 사용하여 각막 윤부를 관통했습니다. 절개 부위를 진입 지점으로 사용하여 절개 지점을 통해 미세 가위를 삽입하여 각막-공막 접합부를 따라 절단할 수 있었습니다. 컵이 분리될 때까지 원주를 따라 작고 연속적인 절단이 이루어졌습니다. 이들은 신경 망막 및 RPE 층을 얻기 위해 Colibri 봉합 겸자를 사용하여 신경 망막의 반투명 층을 부드럽게 벗겨냄으로써 추가로 해부할 수 있습니다. 또한, 시신경에 도달 할 때까지 주변부에서 시신경에 수직으로 3/4 개의 등거리 절단이 이루어졌습니다. 이렇게 하면 반구형 컵이 작은 꽃 모양으로 열려 평평하게 떨어지고 쉽게 장착할 수 있습니다. 이 기술은 각막 전체 마운트 및 망막 섹션에 대해 실험실에서 사용되었습니다. 세 번째 눈꺼풀의 존재는 비강-측두엽 방향을 묘사하여 이식 후 다양한 세포 치료 개입을 연구할 수 있으므로 이러한 연구에서 시각화 및 정확한 표현에 필수적인 표적 생리학적 검증을 가능하게 합니다.

병든 상태의 전방/각막 조직에서 잠재적인 림프 혈관 신생을 연구하기 위해 rd1 마우스 눈/각막 조직의 전체 마운트를 준비했습니다. 세 번째 눈꺼풀에서 부착 된 결막 조직은 각막에 림프관이 없기 때문에 양성 대조군으로 작용했습니다. 연구를 위해 각막 조직을 결막으로 해부하고 4% PFA로 고정한 후 투과화 및 차단했습니다. 그런 다음 조직을 림프 내피 마커(LYVE1)9에 대한 1차 항체로 염색했습니다. 그 후 Alexa Fluor 488(녹색)로 표지된 2차 항체로 인큐베이션했습니다. 대표적인 이미지(그림 4)는 형광 현미경을 사용하여 4x 및 10x에서 캡처되었습니다.
망막 형태학적, 구조적, 기능적 연구를 위해 망막 맥관 구조를 시각화하기 위해 후방 안구재의 신경 망막 전체를 준비했습니다7. 맥락막-RPE 층에서 신경 망막을 조심스럽게 ...

이 논문은 설치류의 안구 미세 해부에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 과정에는 니티팅 멤브레인(즉, 세 번째 눈꺼풀)과 함께 안구의 적출술이 포함됩니다. 그런 다음 후방 안구 컵과 전방 안구 컵을 분리합니다.

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...

초기의 안구 연구는 대부분 사망한 개인의 안구 조직에 의존했습니다. 그러나 수년에 걸쳐 많은 안과용 설치류 모델이 개발되었고 인간 안구 조직의 필요성이 감소했습니다. 설치류의 눈에서 크기가 작고 수술 영역이 제한되어 있기 때문에 안구 하위 부분에 대한 효과적인 접근이 심각하게 제한됩니다.일반적으로 설치류의 눈을 수술하기 위해 시신경을 통해 눈을 고정시키고 해부를 수행합니다. 이 연습은 힘들고 해부 중에 구형 눈이 계속 움직이기 때문에 깨지기 쉬운 조직을 손상시킬 수 있습니다. 망막층의 다양한 부분을 분리하는 데 유익함에도 불구하고 이 기술은 조직 해부 시 조직의 공간적 방향을 구분할 수 없습니다.또한, 표적 개입은 후방 및 전방 안구 컵의 균질한 세포 조립으로 인해 해부 후 위치를 찾기가 어렵습니다. 이 비디오에서는 미세 해부를위한 수정 된 수술 방법을 보여줍니다. 부착 된 니트 멤브레인 또는 세 번째 눈꺼풀의 존재는 독특하고 중요한 이점을 제공합니다.이 방법에서는 먼저 안구를 세 번째 눈꺼풀로 적출한 다음 세 번째 눈꺼풀을 사용하여 눈을 고정시킵니다. 그런 다음 각막 윤부를 통해 안구를 뚫고 절개를 입구로 사용합니다. 그런 다음 원주를 따라 절단하여 전방 및 후방 안구 컵을 분리합니다.뒤쪽 안구를 더 해부하면 신경 망막의 반투명 층이 식별되고 부드럽게 벗겨집니다. 따라서 신경 및 RPE 층은 추가 처리를 위해 얻어집니다. 세 번째 눈꺼풀은 눈 포스트 적출술의 공간적 방향을 구분할 수 있게 해줍니다.이제 자세한 단계별 절차를 따르십시오. 0.8 % tropicamide와 5 % phenylephrine 점과 용액을 사용하여 설치류의 눈을 넓히고 시술 전에 30 분 동안 어두운 곳에 두십시오. 5회 용량의 마취를 복강 내 투여하여 동물을 안락사시킵니다.일반적인 용량은 10mg의 케타민과 1mg의 자일라진을 함유하는 200마이크로리터 PBS입니다. 페달 반사를 검사하여 자극에 대한 반응이 완전히 부족한지 확인합니다. 눈에 완전히 접근할 수 있도록 마우스를 옆으로 누운 상태로 놓습니다.Colibri 봉합 집게, 곡선 집게, 15도 3mm 크기의 마이크로 블레이드, 스프링 마이크로 가위 및 각진 스프링 마이크로 가위를 절차에 대비하십시오. 안구 주위에 구부러진 집게를 놓고 꼬집어 외부 부착물로부터 눈을 떼십시오. 니티팅 멤브레인이라고도 하는 세 번째 눈꺼풀은 비강 접선의 위쪽 모서리를 향해 위치하며 색소 경계가 있는 작은 반투명 돌출부로 식별할 수 있습니다.다음으로 스프링 마이크로 가위를 사용하여 안구 주위를 자릅니다. 작고 연속적인 절단은 공막 부착물에서 안구를 방출합니다. 안구 아래에 구부러진 스프링 마이크로 가위를 놓아 시신경을 절단하여 눈을 자유롭게 합니다.적출된 눈을 PBS 완충액이 들어 있는 페트리 접시에 넣어 안구가 PBS에 잠기도록 합니다. 일부 외안근이나 조직이 안구에서 떠오르기 시작합니다. 스프링 마이크로 가위를 사용하여 안구에서 잘라내어 제거하십시오.그런 다음 안구 기저부에서 시신경을 제거하여 전체 마운트 준비를 위해 망막을 더 잘 분리할 수 있도록 합니다. 조직 절편을 위해 시신경을 제거 할 필요는 없습니다. 안구를 4% 파라포름알데히드 또는 PFA 1ml가 들어 있는 1.5ml 튜브에 옮깁니다.조직 고정을 위해 섭씨 4도에서 2 시간 동안 보관하십시오. 섭씨 4도에서 최대 12시간 동안 PFA에 조직을 두어 이 단계에서 일시 중지할 수 있습니다. 그러나 살아있는 세포의 분리를 위해서는 고정 단계를 수행해서는 안되며 전체 절차를 연속체로 수행해야합니다.PFA 고정 후 안구를 PBS가 들어있는 페트리 접시에 옮기고 해부 현미경으로 올려 후속 절차를 수행합니다. Colibri 봉합 집게로 세 번째 눈꺼풀을 단단히 눌러 안구를 고정합니다. 윤부는 각막 공막 접합부입니다.마이크로 블레이드를 사용하여 윤부를 뚫어 윤부에 작은 절개를하십시오. 절개는 바람직하게는 세 번째 눈꺼풀의 반대쪽에 이루어진다. 다음으로, 이 절개를 시작점으로 사용하여 미세 가위로 이 각막 공막 윤부 둘레를 따라 작고 연속적인 절단을 합니다.먼저 절개 부위부터 세 번째 눈꺼풀까지 반원형으로 절단합니다. 그런 다음 다른 쪽의 나머지 반원 절단을 완료하십시오. 마지막으로 세 번째 눈꺼풀 주위를 잘라 뒤쪽 컵과 앞쪽 컵을 분리합니다.집게를 사용하여 후방 컵에서 수정체를 제거하여 신경 망막과 RPE 층으로 구성된 후방 컵과 각막 전방 컵을 얻습니다. 고정되지 않은 조직으로 작업하는 경우 전방 및 후방 컵을 효소로 소화하여 각막 또는 망막 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다. 조직을 고정하기 위해 이 컵을 섭씨 4도에서 12시간 동안 4% PFA 1ml가 들어 있는 1.5ml 튜브에 옮깁니다.고정 후, 조직은 적절한 배지에 포매될 수 있고, 각막 또는 망막 절편을 얻기 위해 냉동 절편 또는 파라핀 절편이 수행될 수 있다. PBS 완충액이 들어 있는 페트리 접시에 후방 컵을 다시 넣습니다. 착색된 RPE 층의 불투명한 층은 신경 망막입니다.두 번째 집게를 사용하여 신경 망막을 떼어냅니다. 조직을 손상시키지 않도록 매우 부드럽고 약간의 손 움직임이 좋습니다. 시신경이 빠져 나올 때, 구부러진 스프링 가위는 신경 망막 아래에 삽입 될 수 있으며, 신경 망막이 부착 된 상태로 유지되면 층을 완전히 자유롭게하기 위해 절단을 할 수 있습니다.망막은 부드러운 브러시로 부드럽게 쓰다듬어 풀거나 분리할 수도 있습니다. PBS 버퍼가 들어 있는 페트리 접시에 전방 및 후방 컵을 다시 넣습니다. 각진 스프링 마이크로 가위를 사용하여 세 번째 눈꺼풀 옆을 주변에서 시신경 중심을 향해 수직으로 자릅니다.세 번째 눈꺼풀을 잡고 첫 번째 눈꺼풀 옆에 자릅니다. 두 번째 컷과 세 번째 눈꺼풀 사이에 비슷한 컷을 만듭니다. 3 개 또는 4 개의 등거리 절단은 반구형 컵을 꽃 모양으로 열어 평평하게 떨어지고 쉽게 장착 할 수 있습니다.잎 부분이 쉽게 떨어지거나 분리될 수 있으므로 컵 중앙까지 너무 깊게 자르지 마십시오. 액체 매질은 전방 아이컵이 곡선 구조를 얻을 수 있도록 합니다. 뒤쪽 컵을 절단할 때 주어진 것과 동일한 단계를 수행하여 앞쪽 컵에 3개 또는 4개의 등거리 절단을 만듭니다.이제 조직은 추가 염색을 할 준비가 되었습니다. 이 그림에서는 전방 컵의 전체 마운트가 표시됩니다. 각막 소엽의 부착된 결막 조직 내의 림프관을 드러내기 위해 각막 조직을 기재된 바와 같이 미세 해부하였다.이 그림에는 신경 망막의 전체 마운트가 표시됩니다. 신경 망막의 망막 맥관 구조는 Isolectin으로 염색되었으며 녹색 혈관으로 보입니다. 이 방법에서는 효과적이고 쉬운 취급을 위해 부착된 세 번째 눈꺼풀로 생쥐의 적출된 안구를 얻습니다.세 번째 눈꺼풀은 안구를 완전히 고정시키고 박리가 쉽고 최소한의 오류로 진행되도록합니다. 이 방법은 안구 조직 특이적 절편, 단일 세포 분석 및 전체 마운트에 유리합니다. 그러나 반복적인 조직 고정의 필요성으로 인해 조직은 세포 배양 또는 이러한 살아있는 세포 필수품에 사용할 수 없게 됩니다.따라서 이 절차는 생세포 분리를 위해 연속체로 수행되어야 합니다.

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

마우스 눈 해부의 정식 데모는 망막 안료 상피의 전체 마운트의 결과.

망막 안료 상피의 전체 마운트를위한 마우스 아이의 해부

분해 기술은 높은 처리량 화면에서 phenotyping을 수행 할 조직 고정에 대한 마우스 눈의 핵의 제거를 보여줍니다.

원격 높은 처리량 Phenotyping에 마우스 눈 핵의 제거

이 보고는 면역성 화학을 위한 동결된 마우스 망막 단면도를 준비하기 위한 포괄적인 방법을 기술합니다 (IHC).  설명된 방법은 안구 후방 컵의 해부, 파라포름알데히드 고정, 최적 절삭 온도(OCT) 매체 및 조직 배향에 포함, 단면화 및 면역 염색을 포함한다.

면역 조직 화학을 위한 마우스 망막 극저온 단면도 단면도의 준비

이 프로토콜은 단백질 분석을 위해 뮤린 막대 광수용체의 세포 하부 구획을 분리하는 두 가지 기술을 제시합니다. 첫 번째 방법은 살아있는 망막과 셀룰로오스 여과지를 사용하여 막대 외부 세그먼트를 분리하는 반면, 두 번째 방법은 동결 건조 된 망막과 접착 테이프를 사용하여 막대 내부 및 외부 세그먼트 층을 제거합니다.

단백질 분석을 위한 마우스 망막에서 광수용체 세포 구획의 단리를 위한 두 가지 박리 방법

이 프로토콜의 목표는 아급성 안구 고혈압을 유발하는 변연 혈관 신경총의 360° 열 소작을 기반으로 하는 녹내장 신경 퇴행의 새로운 모델을 특성화하는 것입니다.

설치류의 외과적으로 유도된 녹내장에 대한 Limbal Vascular Plexus의 전체 원형 소작

이 원고는 설치류 안구에서 슬라이드의 조직학적 준비를 위한 프로토콜을 제시합니다. 제안된 방법을 사용하면 광학 현미경으로 내부 망막을 쉽게 시각화하고 평가할 수 있습니다. 절차는 생쥐와 쥐의 안구에 대해 제시됩니다.

망막을 평가하기 위한 쥐와 쥐 안구의 조직학적 슬라이드의 준비 및 분석

망막 색소 상피(RPE)는 맥락막과 망막 사이의 중요한 장벽 역할을 하여 광수용체와 같은 망막 세포 유형의 건강과 기능을 촉진합니다. 여기에서, 우리는 성인 쥐 RPE를 분리하고 배양하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

이 프로토콜은 전체 마운트 마우스 망막을 분리하고 모든 망막 신경절 세포(RGC)를 표지하기 위해 면역염색을 수행하는 절차를 설명합니다. 그 다음에는 AI 기반 소프트웨어를 사용하여 망막 신경절 세포를 이미징하고 자동으로 계수하여 전체 마우스 망막에서 망막 신경절 세포를 정량화하는 간단하고 빠르며 정확한 방법을 제공합니다.

Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells(전체 마운트 면역염색 및 마우스 망막 신경절 세포의 자동 계수)

마우스 망막 동결절편을 준비하고 광수용체에서 면역염색을 수행하기 위한 프로토콜이 설명됩니다. 이 논문을 통해 연구자들은 잘 보존된 형태와 고품질 면역염색 결과를 가진 마우스 망막 동결 절편을 일관되게 생성할 수 있습니다.

마우스 망막의 동결 절편 및 면역 염색

망막은 층류 구조 전반에 걸쳐 복잡한 공간 조직을 나타냅니다. 현대의 공간 전사체학 및 염기서열분석 기술에는 20μm 두께&lt; 조직 절편이 필요하기 때문에 망막 연구 적용이 제한됩니다. 이 신선 냉동 냉동 절편 방법은 평면 공간 관계를 유지하면서 마우스 망막의 얇은 표면 부분을 생성하여 층판 전반에 걸쳐 포괄적인 분자 매핑을 가능하게 합니다.

En 얼굴 High-dimensional Spatial Molecular Analysis (고차원 공간 분자 분석을 위한 마우스 망막의 동결 절편)

배우세요 설치류 눈의 미세 해부 기법으로 막눈을 활용한 안구 고정 및 전후부 안구 분리 방법을 익히세요. 이 기술은 망막층 분리와 조직 손상 최소화에 효과적입니다.

설치류 눈의 미세 해부

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