Name: 인간화 효모 모델을 이용한 α-시뉴클레인 독성 및 응집을 연구하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 배우세요 인간화 효모 모델을 이용한 α-시뉴클레인 독성 및 응집 연구 방법입니다. 형광 현미경과 웨스턴 블롯팅으로 세포 표현형을 모니터링하여 파킨슨병 치료 후보 물질을 선별하는 기초를 제공합니다.

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α-시누클레인을 함유한 플라스미드를 친절하게 공유해 주신 James Bardwell과 Tiago F. Outeiro에게 감사드립니다. 이창한은 한국 정부(MSIT)가 후원하는 한국연구재단(NRF)(보조금 2021R1C1C1C1011690), 교육부가 후원하는 NRF를 통한 기초과학 연구 프로그램(보조금 2021R1A6A1A10044950), 아주대학교 신임 교수 연구비로부터 자금을 지원받았다.

1. 매체 및 용액 준비
<ol><li>미디어 준비<ol><li>YPD 배지를 제조하기 위해, 50 g의 YPD 분말을dH2O에 용해시켜 1 L의 최종 부피를 만든다. 실온(RT)에서 보관하십시오.</li>
		<li>YPD 한천 배지를 만들려면 YPD 분말 50g과 한천 20g을 dH2O. 오토 클레이브 1L에 녹여 멸균하십시오. 식힌 후 페트리 접시에 붓습니다. 4 °C에서 보관하십시오.</li>
		<li>라피노스 (SRd) -Ura 배지로 SC를 만들려면 효모 질소 염기 6.7g을 황산 암모늄과 아미노산없이 dH2O 795mL에 녹입니다. 사용하기 전에 20% 라피노스 100mL, 20% 포도당 5mL, 10x -Ura 드롭아웃 100mL를 추가합니다.</li>
		<li>SD-Ura 한천 배지를 만들기 위해, 효모 질소 염기 6.7g을 황산 암모늄과 아미노산 및 한천 20g을 800mL의 dH 2O에 녹인다. 2L 이상의 부피를 갖는 플라스크에 오토 클레이브.20% 포도당 100mL와 10x -Ura 드롭 아웃 100mL를 첨가한다. 잘 섞어 페트리 접시에 붓습니다. 4 °C에서 보관하십시오.</li>
		<li>갈락토오스 (SG)-우라 한천 배지로 SC를 만들려면 효모 질소 염기 6.7g을 황산 암모늄과 아미노산이 없는 효모 질소 염기 20g을 dH 2O 800mL에 녹입니다.2L이상의 부피를 가진 플라스크에 오토클레이브. 20% 갈락토오스 100mL와 10x -Ura 드롭아웃 100mL를 추가합니다. 잘 섞고 페트리 접시에 붓는다. 4 °C에서 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>SD 미디어와 함께 사용할 스톡 솔루션<ol><li>20% 탄소원(포도당, 갈락토오스, 라피노스)을 만들기 위해 포도당, 갈락토오스 또는 라피노스 100g을dH2O에 녹여 최종 부피 500mL를 만듭니다. 오토 클레이브 및 RT에 보관하십시오.</li>
		<li>우라실이없는 10x 효모 합성 드롭 아웃 배지 보충제 (10x-Ura 드롭 아웃)를 만들려면 dH2O에 19.2g의 "우라실이없는 효모 합성 드롭 아웃 배지 보충제"를 녹여 최종 부피 1L. 오토 클레이브를 만들고 RT에 보관하십시오. 알림: 한천이 포함된 배지를 준비하려면 플라스크에 자석 교반 막대를 추가하여 페트리 접시에 붓기 전에 모든 용액을 잘 혼합합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 효모 변형
참고: pRS426 플라스미드는 α-시누클레인 유전자를 클로닝하는 데 사용되었으며 선택 가능한 마커로서 URA3 유전자를 포함했습니다. 심각한 질병 표현형 (예를 들어, 세포 독성)을 갖는 α- 시누 클레인의 가족 성 PD 관련 변이체가 있습니다. 이들 변이체는 또한 그들의 세포독성 및 응집된 초점 형성을 모니터링하기 위해 여기에서 사용되었다. 일관된 결과를 얻으려면 모든 실험에 동일한 효모 형질전환체 콜로니를 사용합니다.
<ol><li>효모 발현 플라스미드의 형질전환을 위해, 빈 벡터(pRS426)를 대조군으로 사용하고 α-시누클레인-함유 플라스미드를 사용한다. 표준아세트산리튬(LiAc) 방법11을 참조하여, 6개의 적격 세포를 준비하고, 각 플라스미드 0.5 μg을 제조하고, 형질전환을 수행한다.</li>
	<li>플라스미드를 함유하는 효모 형질전환체를 선택하려면, 우라실(SD-Ura)이 없는 합성 정의 배지(SD 배지)를 사용하고, 플레이트를 30°C에서 2-3일 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>추가 실험을 위해 플라스미드를 포함하는 세포를 선택하기 위해 SD-Ura 한천 플레이트에 3개의 단일 콜로니를 패치합니다. 참고 : 정확하고 신뢰할 수있는 결과를 생성하기 위해 균주 당 최소 3 개의 생물학적 복제를 조사했습니다.</li>
</ol>3. 스포팅 분석
참고: 높은 복제 수 플라스미드에서 GFP 태그가 부착된 α-시누클레인의 발현은 효모10의 세포독성과 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다.
<ol><li>플라스미드를 함유하는 효모의 선택적 성장을 위해 균주 당 3개의 패치된 효모 형질전환체를 GAL1 프로모터 및 0.1% 글루코스 하에서 α-시누클레인의 유도를 억제하기 위한 2% 라피노스로 3mL의 SRd-Ura에 접종한다. 세포 배양물을 200 rpm에서 교반 하에 30°C에서 배양한다. 참고: 다른 콜로니로 모든 실험을 반복하는 것이 중요합니다. 3개 이상의 독립적인 식민지에서 동일한 결과를 얻는다는 것은 결과가 신뢰할 수 있음을 의미합니다.</li>
	<li>다음날, 밤새 배양된 세포를 0.2의OD600 에 3 mL의 신선한 SRd-Ura에 접종하고, 200 rpm에서 교반 하에 30°C에서 6 h 동안 배양하였다.</li>
	<li>OD600 이 0.6-0.8에 도달하면 다음과 같이 스포팅 분석을 위해 96웰 플레이트에서 세포를 희석합니다.<ol><li>모든 샘플의 OD600을 측정하고, 샘플을 96-웰 플레이트의 레인 1에서 멸균dH2O(혼합 부피는 100μL)로 0.5의OD600으로 희석하여 각 배양물에서 세포의 수를 균등화한다.</li>
		<li>다음 5개 레인에 160μL의 멸균dH2O를 첨가하여 효모 세포의 5배 연속 희석을 수행한다. 각 레인에서 세포를 연속 희석할 때 총 부피가 40μL인지 확인하십시오. 참고: 낮은 희석 계수는 샘플 간에 더 큰 차이를 생성할 수 있습니다. 연속 희석을 수행할 때 균일한 혼합을 보장하기 위해 충분한 피펫팅이 필요합니다. 피펫 팁은 모든 희석 지점에서 교체해야 합니다. 그렇지 않으면 팁 표면에 부착 된 세포가 다음 웰로 옮겨져 세포 번호에 영향을 줄 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 10μL를 옮겨 대조군을 위한 SD-Ura 한천 플레이트에서 샘플을 발견하고 SG-Ura 한천 플레이트에서 샘플을 추출하여 독성을 모니터링합니다. 알림: 발견 된 샘플이 플레이트에 완전히 흡수 될 때까지 플레이트를 건조시켜야합니다.</li>
	<li>점박이 플레이트를 30°C에서 거꾸로 4일 동안 배양합니다.</li>
	<li>4일째까지 24시간마다 플레이트의 이미지를 촬영한 다음 눈으로 발견한 균주 간의 성장 차이를 비교하여 데이터를 분석합니다. 가장 희석된 샘플의 개별 콜로니를 계산하거나, 각 균주에 대한 원래 배양에서 생존 가능한 세포의 수를 계산하거나, 단일 콜로니의 크기를 비교합니다.</li>
</ol>4. 마이크로플레이트 리더를 이용한 효모 성장 측정
<ol><li>균주 당 3개의 패치된 효모 형질전환체를 3mL의 SRd-Ura에 접종하고, 200rpm의 교반 하에 30°C에서 밤새 배양한다. 참고: α-시누클레인을 발현하는 인간화 효모 균주의 각 콜로니 표현형을 이해하려면 모든 실험에 동일한 형질전환체를 사용하십시오.</li>
	<li>다음날, 밤새 배양된 세포를 총 200μL의 신선한 SD-Ura와 SG-Ura를 96웰 플레이트에 접종합니다. 세포를 포함한 최종 부피를 200 μL로 조정하고, 초기 세포OD600 을 0.05로 조정한다.<ol><li>목표 온도를 30 ° C로 설정하고, 흔들림 (선형) 지속 시간을 890 초로 설정하고, 흔들림 (선형) 진폭을 5mm로 설정하고, 간격 시간을 00:15:00으로 설정하고, 측정을 600nm에서 흡광도로 설정합니다. </li>
		<li>모든 균주가 마이크로플레이트 리더에서 고정상에 도달하기 위해 플레이트를 2-3일 동안 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>성장 곡선을 플로팅하여 데이터를 분석합니다(예: Workbook 사용). 세 가지 생물학적 반복실험에서 흡광도 값을 평균화하여 데이터 포인트를 수집하고 오차 막대를 나타냅니다. 배지의 흡광도 값만 대조군으로 사용하고 배양된 세포의 값에서 이 값을 뺍니다(선택 사항).</li>
</ol>5. 형광 현미경
<ol><li>패치된 효모 형질전환체를 3mL의 SRd-Ura에 접종하고, 200rpm으로 교반 하에 30°C에서 밤새 배양한다. 참고 : 표현형과 세포 독성 및 초점 형성의 상관 관계를 확인하려면 실험에 동일한 콜로니를 사용하십시오.</li>
	<li>다음날, 밤새 배양된 세포를 3mL의 신선한 SRd-Ura에 0.003의OD600 이 되도록 재접종합니다. OD600 이 200 rpm (~ 18 h)의 교반하에 30 ° C에서 0.2에 도달 할 때까지 배양물을 배양합니다.</li>
	<li>0.2의 OD600이 달성되면, 20% 갈락토스 300μL를 첨가하고,200rpm 에서 교반 하에 30°C에서 6시간 더 배양한다.</li>
	<li>세포를 800 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 수집하고, 상청액을 버린다.</li>
	<li>30μL의 증류수에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다.</li>
	<li>재현탁된 세포 5μL를 슬라이드 글라스에 로드합니다. 아가로스 겔 패드(12 )를 준비하고, 로딩된 세포 위에 올려 고르게 퍼지도록 한다.</li>
	<li>명시야 및 GFP 형광 필터를 모두 사용하여 100x 대물렌즈로 현미경 이미징을 수행합니다.<ol><li>먼저 명시야를 사용하여 이멀젼 오일을 사용하여 100x 대물렌즈로 셀에 초점을 맞춥니다. 프로그램을 사용하여 이미지를 생성하기위한 화면 캡처 옵션을 사용하십시오.</li>
		<li>GFP 형광 필터로 전환합니다. 이미지 노출 시간을 50ms에서 300ms 사이로 조정하여 신호 대 잡음비의 균형을 조정하여 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. 프로그램을 사용하여 이미지를 화면 캡처합니다.</li>
		<li>하나가 아닌 여러 지점에서 많은 셀을 이미지화합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>분석 소프트웨어를 사용하여 α-시누클레인 응집체의 초점을 포함하는 세포의 백분율을 계산하여 이미지를 분석합니다. 가용성 GFP 단백질 신호와 초점 형성 GFP 신호 간의 차이와 A30P 변이체 형태의 α-시누클레인으로 GFP의 확산을 관찰합니다. 참고: 초점 형성은 α-시누클레인의 야생형, E46K 및 A53T 변이체에서 관찰됩니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

인간의 다양한 세포 시스템의 복잡성을 감안할 때, 인간 신경 퇴행성 질환을 연구하기위한 모델로서 효모를 사용하는 것이 유리하다. 효모를 사용하여 인간 뇌의 복잡한 세포 상호 작용을 조사하는 것은 거의 불가능하지만, 단일 세포 관점에서 효모 세포는 게놈 서열 상 동성 및 근본적인 진핵 세포 과정 8,13 측면에서 인간 세포와 높은 수준의 유사성을 갖는다. 또한, 유전자 조작의 용이성을 감안할 때, 효모는 복잡하고 까다로운 인간 시스템의 연구를 용이하게 할 수 있습니다. 따라서 효모는 진핵 세포 과정과 다양한 질병의 발병 기전을 이해하는 모델 시스템으로 널리 사용되어 왔습니다14,15,16. 특히, α-시누클레인17을 포...

파킨슨병(PD)은 전 세계적으로 고령화 사회에 심각한 문제입니다. α-시누클레인의 응집은 PD와 밀접한 관련이 있으며, α-시누클레인의 단백질 응집체는 질병진단을 위한 분자 바이오마커로 널리 사용됩니다1. α- synuclein은 3 개의 도메인, 즉 N 말단 지질 결합 α- 나선, 아밀로이드 결합 중심 도메인 (NAC) 및 C- 말단 산성 꼬리2를 갖는 작은 산성 단백질 (길이 140 아미노산)이다. α-synuclein의 잘못 접힘은 자발적으로 발생할 수 있으며 결국 Lewybody3라고하는 아밀로이드 응집체의 형성으로 이어집니다. α-시누클레인은 여러 면에서 PD의 발병기전에 기여할 수 있다. 일반적으로, 프로토피브릴이라고 하는 그의 비정상적이고 용해성 올리고머 형태는 시냅스 기능3을 포함한 다양한 세포 표적에 영향을 주어 신경 세포 사멸을 유발하는 독성 종으로 생각된다.
신경 퇴행성 질환을 연구하는 데 사용되는 생물학적 모델은 게놈 및 세포 생물학과 관련하여 인간과 관련이 있어야합니다. 가장 좋은 모델은 인간 신경 세포주입니다. 그러나, 이들 세포주는 배양물의 유지의 어려움, 형질감염의 낮은 효율, 및 높은 비용4과 같은 몇몇 기술적 문제와 연관된다. 이러한 이유로이 연구 분야의 진행을 가속화하려면 쉽고 신뢰할 수있는 도구가 필요합니다. 중요한 것은 이 도구가 수집된 데이터를 분석하는 데 사용하기 쉬워야 한다는 것입니다. 이러한 관점에서, 초파리, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, 효모 및 설치류5를 포함한 다양한 모델 유기체가 널리 사용되었습니다. 그 중에서도 효모는 유전자 조작이 쉽고 다른 모델 유기체보다 저렴하기 때문에 최고의 모델 유기체입니다. 가장 중요한 것은 효모가 인간 ortholog에 대한 60% 서열 상동성 및 인간 질병 관련 유전자6와 25% 밀접한 상동성과 같이 인간 세포와 높은 유사성을 가지며 근본적인 진핵 세포 생물학도 공유한다는 것입니다. 효모는 인간 세포와 유사한 서열 및 유사한 기능을 가진 많은 단백질을 함유하고 있습니다7. 실제로, 인간 유전자를 발현하는 효모는세포 과정을 해명하기 위한 모델 시스템으로서 널리 사용되어 왔다8. 이 효모 균주는 인간화 효모라고 불리며 인간 유전자의 기능을 탐구하는 데 유용한 도구입니다9. 인간화 효모는 유전자 조작이 효모에서 잘 확립되어 있기 때문에 유전적 상호 작용을 연구하는 데 장점이 있습니다.
이 연구에서는 효모 사카로 마이 세스 세레 비시 애를 PD의 발병 기전을 연구하기위한 모델 유기체로 사용했으며, 특히 α- 시누 클레인 응집체 형성 및 세포 독성을 조사했습니다10. 출아 효모에서 α-시누클레인의 발현을 위해, W303a 균주를 α-시누클레인의 야생형 및 가족성 PD-관련 변이체를 암호화하는 플라스미드로 형질전환에 사용하였다. W303a 균주는 URA3에 영양요구성 돌연변이가 있기 때문에 URA3가 있는 플라스미드를 포함하는 세포의 선택에 적용할 수 있습니다. 플라스미드에서 암호화된 α-시누클레인의 발현은 GAL1 프로모터 하에서 조절된다. 따라서, α-시누클레인의 발현 수준을 조절할 수 있다. 또한, α- 시누 클레인의 C- 말단 영역에서 녹색 형광 단백질 (GFP)의 융합은 α- 시누 클레인 초점 형성의 모니터링을 가능하게한다. α-synuclein의 가족성 PD 관련 변이체의 특성을 이해하기 위해, 우리는 또한 효모에서 이러한 변이체를 발현하고 그들의 세포 효과를 조사하였다. 이 시스템은 α-시누클레인의 세포독성에 대한 보호 역할을 나타내는 화합물 또는 유전자를 스크리닝하기 위한 간단한 도구입니다.

<table><tbody><tr><td>96 웰 플레이트</td><td>SPL</td><td>30096</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>TAESHIN</td><td>0158</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>호흡이 쉬운</td><td>다양한 생명 공학</td><td>BEM-1</td><td>마이크로 타이터 플레이트 커버 안경 용 가스 투과성 밀봉 멤브레인</td></tr><tr><td></td><td>Marienfeld</td><td></td><td>24 x 60 mm</td></tr><tr><td>배양 튜브</td><td>SPL</td><td>40014</td><td></td></tr><tr><td>큐벳</td><td>ratiolab</td><td>2712120</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-갈락토스</td><td>시그마</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-글루코스</td><td>시그마</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-라피노스 펜타하이드레이트</td><td>대정</td><td>6638-4105</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터 (쉐이킹)</td><td>랩트론</td><td></td><td>모델: SHI1</td></tr><tr><td>인큐베이터 (정적)</td><td>비전 사이언티픽</td><td></td><td>모델: VS-1203PV-O</td></tr><tr><td>LiAc</td><td>시그마</td><td>L6883</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>Tecan</td><td>30050303 01</td><td>모델: Infinite 200 pro</td></tr><tr><td>멀티채널 피펫 20-200 &마이크로; L</td><td>gilson</td><td>FA10011</td><td></td></tr><tr><td>멀티채널 피펫 2-20 &마이크로; L</td><td>gilson</td><td>FA10009</td><td></td></tr><tr><td>올림푸스 현미경</td><td>올림푸스</td><td>IX-53</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>시그마</td><td>P4338</td><td>평균 mol wt 3,350</td></tr><tr><td>Petridish</td><td>SPL</td><td>10090</td><td></td></tr><tr><td>pRS426</td><td></td><td></td><td>Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. 다기능 효모 고 복제 수 셔틀 벡터. 유전자. 110 (1), 119-122 (1992).</td></tr><tr><td>pRS426 GAL1 promoter &alpha; - synuclein A30P</td><td></td><td></td><td>Outeiro, T.F. & Lindquist, S. 효모 세포는 알파 synuclein 생물학 및 병리생물학에 대한 통찰력을 제공합니다. 과학. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td></tr><tr><td>pRS426 GAL1 프로모터 &알파;-synuclein A53T</td><td></td><td></td><td>Outeiro, T.F. & Lindquist, S. 효모 세포는 알파 synuclein 생물학 및 병리생물학에 대한 통찰력을 제공합니다. 과학. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td></tr><tr><td>pRS426 GAL1 promoter &alpha; -synuclein E46K</td><td></td><td></td><td>Outeiro, T.F. & Lindquist, S. 효모 세포는 알파 synuclein 생물학 및 병리생물학에 대한 통찰력을 제공합니다. 과학. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td></tr><tr><td>pRS426 GAL1 promoter &alpha; -synuclein WT</td><td></td><td></td><td>Outeiro, T.F. & Lindquist, S. 효모 세포는 알파 synuclein 생물학 및 병리생물학에 대한 통찰력을 제공합니다. 과학. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td></tr><tr><td>Reservoir</td><td>SPL</td><td>23050</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>eppendorf</td><td>6131 05560</td><td></td></tr><tr><td>W303a</td><td></td><td></td><td>James Bardwell</td></tr><tr><td>효모 질소 베이스 w/o 아미노산</td><td>Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>효모 합성 드롭아웃 매체 보충제 우라실</td><td>시그마</td><td>Y1501</td><td></td></tr><tr><td>YPD</td><td>콘달랩</td><td>1547.00</td><td></td></tr></tbody></table>

인간화 효모 모델을 이용한 α-시뉴클레인 독성 및 응집을 연구하는 방법

A Method to Study &#945;-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model

파킨슨 병은 두 번째로 흔한 신경 퇴행성 질환이며 잘못 접히고 응집 된 α- 시누 클레인을 포함하는 Lewy 체의 형성으로 인한 진행성 세포 사멸을 특징으로합니다. α-시누클레인은 시냅스 소포 트래피킹을 조절하는 풍부한 시냅스 전 단백질이지만 단백질성 개재물의 축적은 신경독성을 초래합니다. 최근 연구에 따르면 박테리아 샤페론을 포함한 다양한 유전적 요인이 시험관 내에서 α-시누클레인 응집체의 형성을 감소시킬 수 있음이 밝혀졌습니다. 그러나, 이를 환자에 대한 잠재적인 치료법으로 적용하기 위해 세포에서 항응집 효과를 모니터링하는 것도 중요하다. 신경 세포를 사용하는 것이 이상적이지만 이러한 세포는 다루기가 어렵고 응집 방지 표현형을 나타내는 데 오랜 시간이 걸립니다. 따라서, 생체내 항응집 활성의 추가 평가를 위해 신속하고 효과적인 생체내 도구가 필요하다. 여기에 설명된 방법은 인간 α-시누클레인을 발현하는 인간화 효모 사카로마이세스 세레비시아에에서 항응집 표현형을 모니터링하고 분석하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜은 α-시누클레인 유도 세포 독성과 세포에서 α-시누클레인 응집체 형성을 모니터링하는 데 사용할 수 있는 생체 내 도구를 보여줍니다.

α-시누클레인의 높은 발현은 PD의 모델 시스템에서 신경 세포 사멸 및 PD와 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다. 이 연구는 α- 시누 클레인의 세포 독성과 효모에서 응집 된 α- 시누 클레인의 초점 형성을 모니터링하는 세 가지 방법을 설명합니다. 여기에서는 효모에서 α-시누클레인이 과발현되었고, 야생형 α-시누클레인의 표현형과 PD의 가족성 돌연변이체로 알려진 α-시누클레인의 3가지 변이체를 조사했습니다(그림 1 및 재료 표).
pRS426 벡터에서 GAL1 프로모터 하의 α-시누클레인 발현은 유도제로 갈락토오스를 함유하는 한천 플레이트에서 상당한 성장 지연을 보였다(그림 2). α-시누클레인 발현에 의한 성장의 차이는 액체 배양에서도 관찰되었습니다(그림 3). 두 배양 ...

α-시누클레인의 생체 내 생리학적 모델은 파킨슨병의 발병기전을 연구하고 이해하는 데 필요합니다. 인간화 효모 모델을 사용하여 α-synuclein의 세포 독성 및 응집체 형성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy ...

이것은 R-pass 핵의 세포 표현형과 특징을 모니터링하는 간단한 방법입니다. 또한 R-pass 핵의 안정성에 영향을 미치는 유전적 요인을 찾기 위해 게놈 전체 연구에서 종종 회수될 수 있습니다. 이것은 잘 확립 된 운동 유기체이기 때문에이 기술은 쉽고 인간 세포주 또는 동물 모델을 사용하는 것에 비해 많은 시간과 노력이 필요하지 않습니다.R- 패스 핵의 응집은 파킨슨 병과 밀접한 관련이 있습니다. R-pass 핵의 안정성에 영향을 미칠 가능성이 있는 단백질 또는 화학 물질은 이 인간화 효모 모델에서 테스트할 수 있습니다. 시작하려면 알파-시누클레인 플라스미드를 포함하는 세포를 선택하기 위해 SD-URA 한천 플레이트에 3개의 단일 콜로니를 패치합니다.이어서, 3-패치된 효모 형질전환체를 3 밀리리터의 SRD-URA에 접종하여 플라스미드를 함유하는 효모의 선택적 성장을 위해 Gal1 프로모터 및 0.1% 글루코스 하에서 알파-시누클레인의 유도를 억제하기 위한 2% 라피노스로 플라스미드를 함유한다. 접종된 배양물을 분당 200회전으로 교반 하에 섭씨 30도에서 배양한다. 다음날, 밤새 배양 된 세포를 600 나노 미터에서 0.2의 광학 밀도에 도달 할 때까지 3 밀리리터의 신선한 SRD-URA에 접종합니다.이어서, 배양물을 분당 200 회전으로 교반 하에 섭씨 30도에서 6시간 동안 배양한다. 분광 광도계를 사용하여 600 나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다. 다음으로, 샘플을 96-웰 플레이트의 레인 1에 멸균 증류수로 600 나노미터에서 0.5의 광학 밀도로 희석하여 각 배양물에서 세포의 수를 균등화한다.다음 5개 레인에 160마이크로리터의 멸균 증류수를 추가하여 효모 세포의 5배 연속 희석을 수행하고 각 레인에서 세포를 연속 희석할 때 총 부피가 40마이크로리터가 되도록 합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 10마이크로리터를 옮겨 대조군용 SD-URA 한천 플레이트에서 샘플을 추출하고 SG-URA 한천 플레이트에서 샘플을 추출하여 독성을 모니터링합니다. 발견 된 판을 섭씨 30도에서 거꾸로 4 일 동안 배양하십시오.4일째까지 24시간마다 플레이트의 이미지를 촬영한 다음 눈으로 발견한 균주 간의 성장 차이를 비교하여 데이터를 분석합니다. 균주당 3개의 패치된 효모 형질전환체를 3밀리리터의 SRD-URA에 접종하고 밤새 분당 200회전으로 교반 하에 섭씨 30도에서 배양합니다. 다음날, 600 나노미터에서 밤새 배양한 세포의 광학 밀도를 측정하고 세포를 총 200 마이크로리터의 신선한 SD-URA와 SG-URA를 96-웰 플레이트에 접종하였다.세포를 포함하는 최종 부피를 200 마이크로리터로 조정하고, 초기 세포 광학 밀도를 600 나노미터에서 0.05로 조정한다. 마이크로타이터 플레이트에서 프로그램 설정을 조정합니다. 목표 온도를 섭씨 30도, 간격 시간을 15분, 진동 지속 시간을 890초, 진동 진폭을 5mm로 설정하고 600나노미터에서 흡광도로 측정합니다.모든 균주가 마이크로플레이트 리더에서 고정상에 도달하기 위해 플레이트를 2-3일 동안 배양합니다. 성장 곡선을 플로팅하여 데이터를 분석합니다. 패치된 효모 형질전환체를 3밀리리터의 SRD-URA에 접종하고 분당 200회전으로 교반 하에 섭씨 30도에서 밤새 배양합니다.다음날, 밤새 배양 된 세포를 3 밀리리터의 신선한 SRD-URA에 600 나노 미터에서 0.003의 광학 밀도로 재 접종 한 다음 광학 밀도가 0.2에 도달 할 때까지 분당 200 회전으로 교반하에 섭씨 30도에서 배양합니다. 그런 다음 300 마이크로 리터의 20 % 갈락토스를 추가 한 다음 분당 200 회전으로 교반 하에서 섭씨 30도에서 6 시간 더 배양합니다. 800g에서 5분 동안 원심분리하여 세포 배양액 1 밀리리터를 수집하고 상청액을 버린다.30마이크로리터의 증류수에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 유리 슬라이드에 아가 로스 겔 패드를 준비하십시오. 세포를 재현탁시키고, 5 마이크로리터의 세포 재현탁액을 유리 슬라이드 상에 로딩하고, 절단된 아가로스 패드를 사용하여 세포를 검사용으로 덮는다.100x 대물렌즈로 현미경 이미징을 수행하려면 프로그램을 사용하여 이미지를 생성하는 화면 캡처 옵션을 사용하고 명시야를 선택하여 이멀젼 오일을 사용하여 100x 대물렌즈로 셀의 초점을 맞춥니다. GFP 형광 필터로 전환하고 이미지 노출 시간을 50밀리초에서 300밀리초 사이로 조정하여 신호 대 노이즈 비율의 균형을 조정하여 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. 이미지 파일을 열고 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 세포의 초점 수를 기준으로 세포를 계수하여 데이터를 분석합니다.PRS426 벡터에서 Gal1 프로모터 하의 시누클레인 발현은 유도제로서 갈락토오스를 함유하는 한천 플레이트에서 현저한 성장 지연을 보였다. 시누클레인 발현에 의한 성장의 차이는 또한 액체 배양물에서 관찰되었다. 두 배양 조건 모두에서 야생형 시누클레인 및 E46K 또는 A53T 돌연변이가 있는 변이체는 시누클레인 독성으로 인한 성장 결함을 보였다.그러나, 응집체를 형성하지 않는 synuclein A30p 변이체는 무독성 표현형을 보였다. 심각한 세포 독성을 나타내는 균주는 시누 클레인 응집체의 초점을 보였지만 A30p 변종에서는 독성이 적은 형태의 시누 클레인이 세포 전체에 확산되었습니다. 재현 가능한 결과를 얻으려면 특히 시누클레인 관련 표현형을 모니터링할 때 각 실험에서 동일한 성장 단계의 세포를 사용하는 것이 중요합니다.형광 현미경 데이터에서 볼 수 있듯이 synuclein은 더 큰 응집체를 형성 할 수 있습니다. 따라서, 원심분리에 의해 간단히 분획될 수 있고, 시누클레인-특이적 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 정량화될 수 있다. 이 기술은 synuclein의 응집에 영향을 미치는 새로운 유전 인자 및 화합물을 찾기 위한 고처리량 스크리닝에 적용할 수 있습니다.따라서 우리는 파킨슨 병에 대한 새로운 치료 후보를 찾기를 희망합니다.

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Research

연구

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Biology

생물학

본 원고는 효모에 polyglutamine의 독성 (polyQ) - 확장 단백질을 평가 삼 보완적인 프로토콜을...

성장 Assays은 효모에서 Polyglutamine 독성을 평가하기 위해

효모 단백병증 모델은 질병과 관련된 단백질의 독성 및 응집을 평가하는 데 유용한 도구입니다. 여기에서는 Hsp104 변이체 라이브러리에서 독성 억제제를 스크리닝하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 효모에서 독성이 있는 단백질의 독성 억제자에 대해 모든 단백질 라이브러리를 스크리닝하는 데 적용할 수 있습니다.

효력을 더 Hsp104 변종 사용 효모 Proteinopathy 모델을 분리

계량 misfolded 단백질의 집계 하는 방법을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 세부 사항을 lentiviral 안정적인 셀 라인 생성, 자동된 confocal 영상, 및 단백질의 이미지 분석을 유도 한다. 설명 응용 프로그램으로 우리는 SOD1 집계 시간 복용량에 따라 방식에서 홍보에 작은 분자의 효과 공부 했습니다.

살아있는 세포에 Sod1 돌연변이 단백질 집계 형성의 높은 콘텐츠 정량화에 대 한 분석 결과 개발

단백질 집계 세포 산화 스트레스 elicits. 이 프로토콜 amyloidogenic 단백질의 세포내 주와 관련 된, cytometry 사용 하 여 산화 스트레스 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 접근은 아 밀 로이드 β 펩 티 드의 가용성과 집계 경향이 이체의 동작을 연구 하는 데 사용 됩니다.

효 모 세포 산화 스트레스에 단백질 집단의 영향 평가

이 프로토콜의 목표는 vivo에서집계 하는 알파 synuclein의 형성을 복제 하는 셀 기반 시스템을 제공 하는입니다. 세포내 알파 synuclein 포함은 국제화에 의해 주 뉴런에 시드는 고 세의 전파 관리 네이티브 microsomes 관련 알파 synuclein 집계 병 알파 synuclein 유전자 변형 쥐에서 분리.

소 대형의 강력한 셀 모델로 기본 신경 하 Microsomes 관련 알파 synuclein 집계의 외 인 관리

이 문서는 기준점과 플라스 미드 라이브러리를 사용 하 여 신진 효 모에 overexpression 심사를 용이 하 게 하 짝짓기 기반 메서드를 제공 합니다.

효 모에 짝짓기 기반 Overexpression 라이브러리 심사

이 문서에서는 집계에 형광 단백질의 효과 형광 기자 들의 맥락에서 새로 새롭거나 형광 단백질의 급속 한 평가 misfolded polyglutamine 확장의 독성을 평가 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다.

효 모에 Polyglutamine 독성 분석 실험을 사용 하 여 퓨전 파트너에 형광 단백질의 영향

이 프로토콜의 히스톤 포스트 번역 상 수정 (PTM) ALS와 파 킨 슨 병에 관련 된 단백질의 overexpression 관련 하 여 발생 하는 수준에서 게놈 넓은 변화 하는 실험 절차 설명 Saccharomyces cerevisiae 모델입니다. SDS 페이지 분리 후 개별 히스톤 PTM 수준은 통해 서 부 럽 수정-특정 항 체와 검색 됩니다.

효 모 신경 Proteinopathy 모델에서 특성화 히스톤 포스트 번역 상 수정 변경

이 프로토콜은 인간 신경 배양이 돌연변이 인간 타우를 코딩 하는 렌 티 바이러스 컨스트 럭 트와 형질 도입 하는 절차를 자세히 설명 합니다. 형질 도입 배양은 타우 응집 체 및 관련 병 리를 표시 합니다.

인간 뉴런의 렌 티 바이러스 매개 된 형질 도입을 이용한 타우 응집 연구를 위한 시험관 내 모델

여기서, 우리는 1 차 마우스 도파민 뉴런에 신경 α-synuclein 축적을 연구하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시합니다. 뉴런의 인광α-시뉴클레인 골재는 미리 형성된 α-시뉴클레인 피브릴로 유도된다. 면역형으로 표지된 세포와 편견없는 이미지 분석의 자동화된 이미징은 α-synuclein 축적을 억제하는 약물의 중간-고처리량 스크리닝에 적합한 강력한 프로토콜을 만듭니다.

1 차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런에서 사전 형성 된 피브릴 유도 α-시뉴클레인 축적 연구

여기에서는 인간 γ-세크레타아제를 재구성하는 효모 시스템에 대해 설명합니다. 이 시스템을 통해 활성에 영향을 미치는 돌연변이를 식별 및 연구하고 γ-secretase 억제제(GSI)를 스크리닝할 수 있습니다. 가족성 알츠하이머병 돌연변이의 기능 상실 특성을 활용하여 γ-secretase 조절제(GSM)를 스크리닝할 수 있습니다.

Saccharomyces cerevisiae γ-Secretase에 의한 아밀로이드 베타 생산에 영향을 미치는 유전자, 돌연변이 및 화학 물질을 스크리닝하는 알츠하이머병 모델

배우세요 인간화 효모 모델을 이용한 α-시뉴클레인 독성 및 응집 연구 방법입니다. 형광 현미경과 웨스턴 블롯팅으로 세포 표현형을 모니터링하여 파킨슨병 치료 후보 물질을 선별하는 기초를 제공합니다.

인간화 효모 모델을 이용한 α-시뉴클레인 독성 및 응집을 연구하는 방법

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