Name: 광시트 형광 현미경을 이용한 노화된 달팽이관 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: 배우세요 광시트 형광 현미경을 이용한 노화된 달팽이관 3D 이미징 방법을. 이 비파괴 기술은 청각 신경 세포 밀도 변화를 정량 분석하여 난청 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 청각 장애 및 기타 의사 소통 장애 연구소 (National Institute on Deafness and Other Communication Disorders), 켈로그 재단 (Kellogg Foundation)의 보조금과 브리짓 스펄 (Bridget Sperl)과 존 맥코믹 (John McCormick)의 개인 기부금으로 지원되었습니다. TSLIM은 독일 일메나우 공과대학교의 Matthias Hillenbrand, Kerstin John, Meike Lawin, Michel Layher, Tobias Schroeter, Peter Schacht, Oliver Dannberg 및 Julian Wuester의 멘토(Stefan Sinzinger 및 Rene Theska)와 James Leger의 탁월한 지원으로 개발되었습니다.

살아있는 동물의 모든 절차와 사용은 미네소타 대학 기관 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 검토 및 승인되었으며(프로토콜 ID #2010-38573A) 이러한 동물을 사용하는 조사관은 동물 시설에 접근하기 전에 연구 동물 자원(RAR) 수의사에 의해 철저히 훈련되고 테스트되었습니다. 이 연구에는 수컷과 암컷 마우스 모두 사용되었습니다.
1. 이미징을 위한 고정 및 조직 처리를 위한 달팽이관 제거
<ol><li>CO2 흡입을 사용하여 마우스를 안락사시킵니다. 가위로 마우스의 목을 베고 뇌를 통해 등쪽 복부 절개를하여 두개골을 절개합니다. 뇌를 제거하고, 두개골의 기저복부 부분에서 둥근 수포를 식별하고, 롱거로 수포를 열고, 달팽이관을 시각화하고 제거합니다.</li>
	<li>고정: 흄 후드 아래에서 5배 배율의 해부 현미경을 사용하여 이 절차를 수행합니다. 장갑과 보호복을 착용하십시오. 타원형 창에 구멍을 뚫고 날카로운 픽으로 등골을 제거하십시오. 둥근 창에 픽을 삽입하여 멤브레인에 구멍을 뚫습니다.</li>
	<li>2mL의 포르말린으로 채워진 1mL 주사기에 부착된 주입 세트의 절단된 끝으로 열린 둥근 창을 덮습니다. 포르말린이 열린 타원형 창을 통해 달팽이관을 빠져나가고 있음을 확인하면서 2분 동안 달팽이관의 외림프 공간을 통해 포르말린을 천천히 주입합니다. 달팽이관에서 여분의 조직을 잘라내고 10% 포르말린이 함유된 병에 담근 다음 밤새 회전근에 놓습니다.</li>
	<li>석회질 제거: PBS 3x에서 각각 5분 동안 달팽이관을 헹구고 10% EDTA(디소듐 에틸렌디아민테트라아세트산) 용액이 들어 있는 병에 4일 동안 회전하여 매일 용액을 교체합니다.</li>
	<li>탈수: PBS 3x로 달팽이관을 관류하고 교체 사이에 15분 동안 담그십시오. 에탄올 10 %, 50 %, 70 %, 95 %, 95 %, 100 %, 100 %의 오름차순 농도로 달팽이관을 탈수하십시오. 각 농도에서 30분 동안. 참고: EDTA가 에탄올에 침전되므로 탈수 전에 모든 EDTA를 제거하는 것이 중요합니다. 또한 달팽이관은 밤새 70% 이상의 에탄올 농도에 그대로 둘 수 있습니다.</li>
	<li>염색: 로다민 B 이소티오시네이트(100% 에탄올 중 5μg/mL) 용액에 밤새 회전하면서 담가 전체 달팽이관을 염색합니다. 100% 에탄올을 두 번 교체하고 각 5분씩 교체하여 달팽이관에서 과도한 염료를 제거합니다.</li>
	<li>클리어링: 염색된 달팽이관을 Spalteholz12 용액(5:3 메틸 살리실레이트:벤질 벤조에이트)의 두 가지 교체에 옮기고 각 교체마다 30분 동안 교체하고 회전하면서 세척 용액에 밤새 둡니다. 달팽이관은 Spalteholz 용액에 무한정 방치할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 달팽이관 영상
<ol><li>달팽이관을 타원형의 둥근 창 막 끝에 있는 표본 막대에 부착하여 세척액이 달팽이관 내에 남아 있고 기포가 형성되지 않도록 합니다(그림 2). 달팽이관 내에 기포가 형성되지 않도록 주의해야 하며, 기포는 제거하기 어렵고 조직에 남아 있으면 영상 아티팩트가 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>UV 활성화 접착제를 사용하여 젖은 달팽이관을 건조한 표본 막대에 부착합니다(그림 2). 타원형의 둥근 창 끝에 달팽이관을 부착하십시오. UV 광선으로 달팽이관 주위를 움직여 UV 접착제를 10초 동안 경화시킵니다. 알림: 달팽이관을 표본 막대에 느슨하게 부착하면 이미징 결함이 발생할 수 있습니다. 이 로드는 이 프로토콜을 위해 특별히 제조되었으며(자세한 내용은 Santi et al.8 참조) 당사의 광시트 현미경에만 적용됩니다.</li>
	<li>이미징을 위해 Spalteholz 용액으로 채워진 이미징 챔버에 달팽이관을 매달아 놓습니다. 시편 챔버는 광학적으로 투명한 석영 형광계 셀입니다(비디오 1).</li>
	<li>시편 로드를 XZ 변환 스테이지에도 부착된 회전 홀더에 부착합니다. 대부분의 스택은 XZ 평면에서 시편을 변환하여 얻을 수 있지만 회전 스택도 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>TSLIM 광학 절편: 형광 염색 유형에 따라 여기를 위해 청색 또는 녹색 레이저를 사용합니다. 초점을 맞추기 위해 조직 중앙에 라이트 시트를 배치하고 달팽이관의 전체 너비를 비추는 데 사용할 배율을 결정합니다. 그런 다음 맞춤형으로 설계된 프로그램을 사용하여 X축(이미지 스티칭)과 Z-스텝으로 표본을 가로질러 라이트 시트를 통해 표본을 이동하여 달팽이관 전체에 2D 이미지 스택을 만듭니다.</li>
	<li>첫 번째 이미지의 경우 라이트 시트의 빔 허리가 시편의 가장자리에 위치하고, 프로그램은 시편의 전체 너비를 스캔하여 데이터 열을 수집합니다(이미지 스티칭 참조; Santi et al.8)의 너비인 공초점 파라미터(그림 3)를 사용하여 시편의 너비에 걸쳐 최대 해상도의 합성 2D 이미지를 생성합니다. 이 프로그램은 시편이 완전히 이미지화될 때까지 각 Z 단계에 대한 이미지 스티칭을 자동화합니다.</li>
	<li>이미지 처리: 이미지 스택을 다른 컴퓨터로 전송하고 3D 재구성 및 정량화를 위해 3D 렌더링 프로그램에 로드합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Deafness and hearing loss. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss</a> (2021).</li>
<li>Vater, M., Kössl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+cochlear+functional+organization+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals.</a> Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).</li>
<li>Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digital+cytocochleogram%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The digital cytocochleogram.</a> Hearing Research. 192 (1-2), 75-82 (2004).</li>
<li>Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal-plane+fluorescence+optical+sectioning%3A+three-dimensional+imaging+of+macroscopic+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens.</a> Journal of Microscopy. 170, 229-236 (1993).</li>
<li>Voie, A. H., Spelman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+the+cochlea+from+two-dimensional+images+of+optical+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Computerized+Medical+Imaging+and+Graphics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections.</a> Computerized Medical Imaging and Graphics. 19 (5), 377-384 (1995).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).</li>
<li>Santi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-sheet+laser+imaging+microscopy+for+optical+sectioning+of+thick+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Thin-sheet laser imaging microscopy for optical sectioning of thick tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 287-294 (2009).</li>
<li>Schröter, T. J., Johnson, S. B., John, K., Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+thin-sheet+laser+imaging+microscopy+%28sTSLIM%29+with+structured+illumination+and+HiLo+background+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Scanning thin-sheet laser imaging microscopy (sTSLIM) with structured illumination and HiLo background rejection.</a> Biomedical Optics Express. 3 (1), 170-177 (2012).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Buytaert, J. A. N., Dirckx, J. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+quantitative+resolution+measurements+of+an+optical+virtual+sectioning+three-dimensional+imaging+technique+for+biomedical+specimens%2C+featuring+two-micrometer+slicing+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Design and quantitative resolution measurements of an optical virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring two-micrometer slicing resolution.</a> Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 014039(2007).</li>
<li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpalteholz%2C+W+%22On+making+human+and+animal+preparations+transparent%22">On making human and animal preparations transparent</a>. , S. Hierzel. Leipzig, Germany. (1914).</li>
<li>Johnson, S., Schmitz, H., Santi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TSLIM+imaging+and+a+morphometric+analysis+of+the+mouse+spiral+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">TSLIM imaging and a morphometric analysis of the mouse spiral ganglion.</a> Hearing Research. 278 (1-2), 34-42 (2011).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+of+Corti+surface+preparations+for+computer-assisted+morphometry%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry.</a> Hearing Research. 24 (3), 179-187 (1986).</li>
<li>Brown, D., Pastras, C., Curthoys, I., Southwell, C., Van Roon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endolymph+movement+visualized+with+light+sheet+fluorescence+microscopy+in+an+acute+hydrops+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Endolymph movement visualized with light sheet fluorescence microscopy in an acute hydrops model.</a> Hearing Research. 339, 112-124 (2016).</li>
<li>White, J. A., Burgess, B. J., Hall, R. D., Nadol, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+degeneration+of+the+spiral+ganglion+cell+and+its+processes+in+the+C57BL%2F6J+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Pattern of degeneration of the spiral ganglion cell and its processes in the C57BL/6J mouse.</a> Hearing Research. 141 (1-2), 12-18 (2000).</li>
<li>Grierson, K. E., Hickman, T. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+and+cholinergic+innervation+in+the+mouse+cochlea+after+noise-induced+or+age-related+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic and cholinergic innervation in the mouse cochlea after noise-induced or age-related synaptopathy.</a> Hearing Research. 422, 108533(2022).</li>
</ol>

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달팽이관 구조 검사를 위한 광시트 현미경에 의한 광학 절편은 다른 전통적인 조직학적 방법처럼 기계적으로 파괴적이지 않으며 서로에 대한 달팽이관 구조에 대한 완전한 디지털 보기를 제공합니다. Corti14 기관의 표면 준비와 같은 이전 방법은 기저막의 길이를 따라 유모 세포 손실 지도를 제공했지만 조직이 해부되어 Corti 기관이 드러났기 때문에 SGN 손실을 평가할 수 없었습니다. 또는 달팽이관의 중간 모드 마이크로 톰 섹션은 Rosenthal 운하 전체에 걸쳐 SGN 상태의 매우 작은 샘플만을 제공합니다. TSLIM을 사용하면 모든 달팽이관 구조가 기기의 분해능 수준(즉, 세포 이하)에서 디지털화됩니다. 달팽이관의 완전한 이미지 스택을 통해 여기에 표시된 여러 달팽이관 구조의 정량화 및 시각화가 가능하며, 이는 전통적인 조직학적 방법으로는 얻을 수 없었습니다. 예를 들어, 클러스터링 알고리즘을 사용하여 본 조사는 Rosenthal의 운하 내에서 SGN 세포 밀도를 보고 정량화하고 노화...

달팽이관은 포유류의 청각을 위한 말초 감각 기관입니다. 그것은 소리 진동을 감지하고 청각을 위해 뇌로 전달하도록 해부학적으로 특화된 감각 및 지지 세포를 반복하는 복잡한 나선형 해부학을 가지고 있습니다. 주요 감각 요소는 내부 및 외부 유모 세포와 세포체가 Rosenthal의 운하 내에 있는 나선형 신경절을 구성하는 신경 분포 신경 섬유입니다(그림 1). 이러한 감각 및 신경 구조는 고주파 소리가 달팽이관 기저부에서 전달되고 저주파 소리가 달팽이관 정점에서 전달되도록 강압적으로 배열되어 있습니다2. 지지 기저막의 나선형 길이를 따라 분포된 감각 세포 분포의 해부학적 지도를 세포달팽이관(cytocochleogram)3 이라고 하며, 청력도에 묘사된 바와 같이 주파수의 함수로서 청력 손실과 비교할 수 있습니다.
빽빽한 뼈로 둘러싸인 달팽이관의 막 미로는 한 번에 둘 이상의 달팽이관 구조를 검사하는 것을 기술적으로 어렵게 만듭니다. 따라서 광시트 현미경을 개발하는 이유는 3D 재구성에서 모든 달팽이관 구조를 서로에 대해 검사할 수 있도록 전체 달팽이관의 잘 정렬된 직렬 섹션을 생성하는 것입니다. Voie et al.4 와 Voie 및 Spelman5 는 전체 달팽이관을 광학적으로 절편하기 위해 OPFOS(직교면 형광 광학 절편) 현미경이라고 하는 최초의 광판 현미경을 설계했습니다. 그러나 이 현미경은 상업적으로 개발된 적이 없습니다. 그래서 우리의 목표는 얇은 시트 레이저 이미징 현미경(TSLIM; 그림 2). TSLIM의 설계 및 시공 세부 사항은 이전에 발표되었습니다8. TSLIM은 이미지 수집을 위해 저조도 디지털 카메라와 CCD 카메라를 사용하는 것, 라이트 시트를 통한 표본의 정확하고 재현 가능한 이동을 위해 광학적으로 인코딩된 마이크로포지셔너, 상업적으로 이용 가능한 광학적으로 투명한 표본 챔버 사용, 조직 내 얼룩 침전을 방지하기 위해 투명 용액이 아닌 에탄올에서 로다민 염색을 사용하는 등 OPFOS에 비해 몇 가지 개선 사항을 이루었습니다. SPIM6 과 같은 광시트 현미경의 상업적 개발은 살아 있는 작고 투명한 표본의 고해상도 이미징에 중점을 두었지만 적절한 작동 거리가 부족하기 때문에 전체 달팽이관 이미징에는 적합하지 않습니다. 다른 광판 현미경의 개발에 대한 리뷰는 Santi7에 의해 발표되었습니다. 달팽이관을 검사하는 다른 조직학적 방법에 비해 TSLIM의 주요 이점은 검체의 무결성을 보존하면서 3D 재구성을 위해 조직을 광학적으로 절단하여 다른 조직학적 방법으로 사용할 수 있다는 것입니다. TSLIM 이미징의 또 다른 장점은 컨포칼 현미경에서와 같이 레이저에 노출된 전체 조직 두께에 비해 레이저에 의해 생성된 얇은 광시트만 조직에 노출된다는 것입니다. 광 산란을 최소화하기 위한 조직 투명화와 조직의 작은 부분만 레이저에 노출된다는 사실은 광시트 레이저 이미징으로 최소한의 형광색 퇴색(광표백)을 초래합니다. 그러나 고정, 탈수 및 제거 과정은 달팽이관 구조의 형태를 변경하고 생체 조직에 비해 조직 수축을 초래합니다. 발생하는 실제 조직 수축량은 결정되지 않았습니다.
TSLIM은 Shane Johnson과 8명의 독일 광공학도에 의해 개발되었습니다( 감사의 말 참조). TSLIM 구조 세부 사항은 Santi et al.8 에 의해 제공되었고 스캐닝 버전(sTSLIM)은 Schröter et al.9에 의해 제공되었습니다. TSLIM은 표본을 광학적으로 절편하는 비파괴 마이크로톰과 달팽이관의 전체 너비와 두께를 통해 2D 직렬 절편을 수집하는 현미경 역할을 합니다. TSLIM은 작은(mm) 및 큰(cm) 두꺼운 표본을 모두 이미지화할 수 있습니다. 렌즈는 해부 현미경에서 1x 및 2x의 수집 목표로 긴 작동 거리를 허용하도록 공기 장착됩니다. 해부 현미경에는 TSLIM이 세포의 세포 내 및 시냅스 구조를 분해할 수 있도록 하는 줌 광학 장치도 있습니다. TSLIM에는 조명용 청색(473nm) 및 녹색(532nm) 레이저가 모두 장착되어 있어 다양한 형광 프로브를 이미징에 사용할 수 있습니다. TSLIM의 목표는 달팽이관 조직의 완전한 디지털 재구성을 위해 전체 달팽이관을 통해 잘 정렬된 2D 광학 섹션을 생성하는 것입니다. 형광 방법이기 때문에 리간드와 면역조직화학을 사용하여 특정 달팽이관 구조를 식별할 수도 있습니다.
처음에는 원통형 렌즈를 사용하여 두 개의 대향 가우스 광 시트를 생성했지만 흡수 이미징 아티팩트를 생성했습니다. Keller et al.10의 작업으로 인해 고정 원통형 렌즈는 스캐닝 검류계 거울로 대체되어 라이트 시트9를 생성했습니다. 또한 라이트 시트의 중심이 빔 허리에서 가장 얇기 때문에 시편 너비에 걸쳐 X축 열의 합성 데이터를 수집하여 sTSLIM 2D 이미지를 생성합니다(그림 3). 이 방법은 Buytaert와 Dircks11에 의해 처음 설명되었습니다. 이미지를 구동하고 수집하는 TSLIM 맞춤형 소프트웨어는 기기 제어를 위한 그래픽 프로그램을 사용하여 개발되었습니다. 라이트 시트는 표본을 통과하여 조직 내의 형광면을 비춥니다. 이 형광면은 투명 표본을 통해 직각으로 투사되고 해부 현미경으로 수집됩니다. 광학적으로 인코딩된 마이크로포지셔너는 X축의 빔 허리를 통해 스캔하여 단일 복합 2D 이미지를 수집한 다음 Z축 마이크로포지셔너가 표본을 조직 내의 더 깊은 평면으로 이동하여 일련의 단면화된 2D 이미지 스택을 얻을 수 있도록 합니다(비디오 1, 그림 4). 달팽이관의 전체 너비, 두께 및 길이를 통해 번역 이미지 스택이 수집되며 이미지 스티칭이 필요하지 않습니다(비디오 2). 이미지 스택은 다른 컴퓨터로 전송되어 3D 재구성 및 정량화를 위해 3D 렌더링 프로그램에 로드됩니다. 이미지 스택에는 현미경 해상도에서 달팽이관의 형태에 대한 모든 디지털 정보가 포함되어 있습니다. 그러나 더 높은 해상도가 필요한 경우 온전한 달팽이관은 마이크로톰 절편, 스캐닝 및 투과 전자 현미경과 같은 파괴적인 조직학적 방법으로 추가 처리할 수 있습니다.
3D 렌더링 프로그램은 3D 렌더링 및 정량 분석을 위해 다양한 달팽이관 구조를 분할하는 데 사용됩니다. 분할을 위해 스택의 모든 2D 이미지에 있는 각 구조는 그래픽 태블릿과 펜으로 다른 색상을 사용하여 추적됩니다(그림 5). 현재까지 20개의 서로 다른 달팽이관 구조가 분할되었습니다(그림 6). 분할 후 다양한 3D 분석을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 3D 렌더링 소프트웨어는 구조물의 중심을 따라 모든 평면에서 달팽이관을 가상으로 절제할 수 있습니다. 비디오 3 은 기저막의 길이를 따라 유모 세포를 드러내는 Corti 기관에 접하는 절편을 보여줍니다. 이 프로세스에는 먼저 관심 있는 구조를 수동으로 분할해야 합니다. 다음으로, 구조의 중심은 밑면에서 정점까지 구조의 중심을 따라 배치된 스플라인 점의 최소 제곱 맞춤을 기반으로 계산되므로 구조의 길이를 근사화할 수 있습니다(비디오 4). 스켈레톤화(skeletonization)라고 하는 유사한 프로세스를 사용하여 색상 맵을 사용하여 길이를 따라 구조의 반경 방향 너비를 시각화할 수 있습니다(비디오 4). 각 구조물의 총 부피는 분할 후 프로그램에 의해 계산되지만, 상대 거리는 3D 렌더링 소프트웨어에서 컬러 맵으로 정량화하고 시각화할 수도 있습니다(그림 7). 분할된 구조를 내보내 확대된 솔리드 플라스틱 모델 렌더링을 생성할 수도 있습니다(그림 8). 또한 3D 렌더링 소프트웨어를 사용하여 반자동 세포 계수를 수행할 수도 있습니다(그림 9). 면역조직화학 및 리간드 결합은 특정 달팽이관 구조를 염색하는 데 사용할 수 있으며, 이러한 구조는 세포달팽이관 생성과 같은 형태학적 평가를 위해 다른 달팽이관 구조에서 분리할 수 있습니다(그림 10). 모든 달팽이관 구조의 길이, 너비, 표면, 부피 및 개수를 3D 모델에서 확인할 수 있으므로 이 접근 방식은 달팽이관 손상을 기능 장애에 매핑하는 데 이상적입니다. 특히, 노화, 소음으로 인한 외상 또는 기타 손상으로 인한 달팽이관 손상은 2D 광학 섹션의 3D 달팽이관 재구성으로 표시되고 정량화될 수 있습니다. 달팽이관이 디지털화되면 해부학적 레지스트리에서 달팽이관 내 조직의 달팽이관 손상을 다른 달팽이관 조직에 평가하는 데 사용할 수 있는 수많은 이미징 알고리즘이 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Amira 3D 렌더링 소프트웨어</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>주소: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433</td></tr><tr><td>벤질 벤조에이트(W213810)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>주소: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Bondic&nbsp;</td><td>본다이&nbsp;</td><td></td><td>주소: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 캐나다</td></tr><tr><td>에탄올 95% 및 100%&nbsp;</td><td>미네소타</td><td></td> 대학교 <td>주소: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 디소듐 염 이수화물(EDTA)&nbsp; (E5134)</td><td>시그마-알드리치, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>주소: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>LabVIEW 그래픽 프로그램 및 Vision</td><td>National Instruments</td><td></td><td>주소: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504</td></tr><tr><td>methyl salicylate (M6742)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>주소: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Olympus MVX10 해부 현미경</td><td>Olympus Corp</td><td></td><td>주소: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034</td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocynate, (283924)&nbsp;</td><td>시그마-알드리치, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>주소: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Starna Flurometer Cell (3-G-20)</td><td>Starna Cells</td><td></td><td>주소: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423</td></tr></tbody></table>

광시트 형광 현미경을 이용한 노화된 달팽이관 이미징

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

난청은 가장 흔한 감각 장애로, 세계보건기구(WHO)에 따르면 전 세계적으로 약 5%인 4억 3천만 명에게 영향을 미칩니다1. 노화 또는 노안은 감각신경성 난청의 주요 원인이며 유모 세포, 나선형 신경절 뉴런(SGN) 및 선조체 혈관의 손상을 특징으로 합니다. 이러한 구조는 달팽이관 내에 있으며, 달팽이관은 액체에 매달려 있고 뼈로 둘러싸인 막 조직의 복잡한 나선형 해부학적 구조를 가지고 있습니다. 이러한 특성으로 인해 조직병리학적 변화를 조사하고 정량화하는 것이 기술적으로 어렵습니다. 이러한 요구를 해결하기 위해 우리는 내이의 구조-기능 관계에 대한 연구를 용이하게 하기 위해 전체 달팽이관을 이미지화하고 디지털화할 수 있는 광시트 현미경(TSLIM)을 개발했습니다. 전체 달팽이관의 잘 정렬된 연속 절편은 3차원(3D) 볼륨 렌더링을 위한 이미지 스택과 3D 시각화 및 정량 분석(즉, 길이, 너비, 표면, 부피 및 수)을 위한 개별 구조의 분할을 생성합니다. 달팽이관은 최소한의 처리 단계(고정, 석회질 제거, 탈수, 염색 및 광학 투명화)가 필요하며, 이 모든 단계는 주사 및 투과 전자 현미경에 의한 후속 고해상도 이미징과 호환됩니다. 모든 조직이 스택에 존재하기 때문에 각 구조는 개별적으로 또는 다른 구조와 비교하여 평가할 수 있습니다. 또한 이미징은 형광 프로브를 사용하기 때문에 면역조직화학 및 리간드 결합을 사용하여 달팽이관 내의 특정 구조와 3D 부피 또는 분포를 식별할 수 있습니다. 여기에서 우리는 TSLIM을 사용하여 노화된 쥐의 달팽이관을 검사하여 유모 세포와 나선형 신경절 뉴런의 손실을 정량화했습니다. 또한 고급 분석(예: 클러스터 분석)을 사용하여 3D 부피를 따라 Rosenthal 운하에서 나선형 신경절 뉴런의 국소 감소를 시각화했습니다. 이러한 접근법은 달팽이관 내부 및 달팽이관 사이의 구조-기능 관계를 정량화하는 TSLIM 현미경의 능력을 보여줍니다.

이번 특집호의 주제는 달팽이관의 노화 효과를 영상화하는 것이기 때문에 어린 달팽이관(3개월령, HS2479, CBA 균주 마우스)과 노화된(23개월령, HS2521, C57 균주 마우스) 달팽이관을 예로 사용합니다. TSLIM은 인간, 포유류, 기타 설치류, 어류의 달팽이관뿐만 아니라 뇌와 같은 다른 기관의 달팽이관을 포함한 다양한 표본을 이미징할 수 있다는 점에 유의해야 합니다.
Johnson et al. 13 은 TSLIM을 사용하여 어린(3주령) CBA 마우스의 SGN에 대한 논문을 발표했습니다. 모든 SGN은 5마리의 마우스에서 계수되었으며 평균 Rosenthal의 길이가 2.0mm인 8,408-8,912개의 SGN 범위가 있었습니다. 본 연구에서, 우리는 2.0 mm의 Rosenthal의 운하 길이에 7,913 개의 SGN을 포함하는 3 개월 된 CBA 마우스에서 SGN을 계산했습니다. 23개월 된 C57BL6 마우스에는 Ros...

전체 달팽이관을 이미지화하고 디지털화하기 위해 광시트 현미경이 개발되었습니다.

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

우리는 전체 달팽이관을 디지털화할 수 있는 광시트 현미경을 개발했습니다. 이 현미경은 작은 쥐의 달팽이관을 인간의 큰 측두골까지 이미지화할 수 있는 긴 작동 거리의 공기 장착 대물렌즈를 가지고 있습니다. 기계적 파괴를 일으키지 않고 레이저 빔으로 달팽이관을 연속적으로 절단합니다.우리의 이미징 방법은 노화로 인한 유모 세포 및 나선형 신경절 뉴런의 손실과 같은 달팽이관의 병리학적 변화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 마우스를 안락사시키고 참수한 후 뇌를 통해 등-복부 절개를 하여 두개골을 반절개합니다. 뇌를 제거하고 두개골의 basoventral 부분에서 둥근 수포를 확인하십시오.rongeurs로 bulla를 엽니 다. 그런 다음 달팽이관을 시각화하고 제거합니다. 해부 현미경으로 5배 배율로 타원형 창에 구멍을 뚫고 날카로운 곡괭이로 등골을 제거합니다.그런 다음 둥근 창에 곡괭이를 삽입하여 멤브레인에 구멍을 뚫습니다. 고정을 수행하려면 2 밀리리터의 포르말린으로 채워진 1 밀리리터 주사기에 부착 된 주입 세트의 절단 팁으로 열린 둥근 창을 덮으십시오. 2분 동안 달팽이관의 외림프 공간을 통해 포르말린을 천천히 주입하여 포르말린이 열린 타원형 창을 통해 달팽이관에서 빠져나가도록 합니다.달팽이관에서 과도한 조직을 잘라냅니다. 10% 포르말린이 함유된 병에 담그고 밤새 회전근에 놓습니다. 석회질 제거를 위해 PBS에서 달팽이관을 각각 5분 동안 세 번 헹굽니다.EDTA의 10 % 용액이 들어있는 병에 담그십시오. 회전하면서 4 일 동안 배양하여 매일 용액을 바꿉니다. 그런 다음 PBS로 달팽이관을 세 번 관류하고 변경 사이에 15분 동안 담그면 모든 EDTA가 제거됩니다.세척 후, 각 농도에서 30 분 동안 에탄올의 오름차순 농도로 달팽이관을 탈수하십시오. 로다민 B 용액에 밤새 회전하여 담가 전체 달팽이관을 얼룩지게 합니다. 100% 에탄올을 두 번 교체하여 달팽이관에서 과도한 염료를 제거하고 각 변화에 대해 5분 동안 배양합니다.염색된 달팽이관을 Spalteholz 용액의 두 가지 변화로 옮길 때마다 30분 동안 교체합니다. 회전하면서 청소 용액에 밤새 두십시오. 달팽이관을 타원형의 둥근 창 막 끝에 있는 표본 막대에 부착합니다.세척액이 달팽이관 내에 남아 있고 기포가 형성되지 않았는지 확인하십시오. UV 활성화 접착제를 사용하여 젖은 달팽이관의 타원형 및 둥근 창 끝을 건조한 표본 막대에 부착합니다. UV 광선으로 달팽이관 주위를 움직여 UV 접착제를 10초 동안 경화시킵니다.Spalteholz 용액으로 채워진 광학적으로 투명한 석영 형광계 셀의 이미징 챔버에 달팽이관을 매달고 표본 막대를 X/Z 번역 스테이지에도 부착된 회전 홀더에 부착합니다. 그런 다음 맞춤형으로 설계된 프로그램을 사용하여 X축 및 Z 단계의 광판을 통해 표본을 이동하고 달팽이관 전체에 2D 이미지 스택을 만듭니다. 이미지를 처리하려면 이미지 스택을 다른 컴퓨터로 전송하고 3D 재구성 및 정량화를 위해 3D 렌더링 프로그램에 로드합니다.쥐 달팽이관의 직접 부피 렌더링은 타원형의 둥근 창, 유모 세포가 있는 Corti 기관, Rosenthal의 운하가 분할되고 부피가 렌더링되었으며 길이를 따라 나선형 신경절 뉴런(SGN)을 보여주었습니다. TSLIM을 사용하여 생후 3개월 된 어린 쥐와 23개월 된 쥐의 달팽이관을 이미지화하고 SGN을 계산했습니다. 선형 플롯에 묘사된 Rosenthal의 운하 거리의 함수로서의 SGN 세포 수는 나이든 동물에 비해 달팽이관의 중간 및 정점 끝에 있는 어린 동물에서 더 큰 SGN을 보여주었습니다.SGN의 이러한 명백한 손실은 클러스터 분석 및 3D 렌더링 소프트웨어를 사용하여 시각화되었습니다. SGN 밀도 차이는 고밀도 클러스터가 노란색이고 파란색이 저밀도 영역을 나타내는 색상 스케일로 묘사되었습니다. 클러스터 분석은 Rosenthal 운하의 길이를 따라 세포 밀도가 낮은 영역을 명확하게 묘사했습니다.광시트 현미경은 구조물의 3D 볼륨 렌더링을 생성할 수 있는 잘 정렬된 이미지 스택을 생성하도록 설계되었습니다. 3D 렌더링 프로그램을 사용하면 구조와 다양한 구조 간의 해부학적 관계를 정량적으로 평가할 수 있습니다. 그러나 3D 렌더링 프로그램은 다양한 사용자 매개변수를 제공하기 때문에 이러한 프로그램을 효과적으로 사용하려면 상당한 학습 곡선이 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

손의 발달 과정 10 일 임시 그라데이션에서 작동하기 때문에 배아 포유류의 달팽이관의 라이브 영상은 도전이다. 여기에서 우리는 오일을 통해 형광 기자 마우스에서 촬영 배아 인공 절편 조직을 이미징 한 후 배양 및 방법을 제시한다.

마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

일차 섬모는 다양한 신호 경로에 영향을 미칩니다. 포유류 달팽이관은 평면 세포 극성(PCP) 신호 전달을 검사하는 데 이상적입니다. 섬모 기능 장애는 달팽이관 성장, 세포 패터닝 및 유모 세포 방향, PCP 판독에 영향을 미칩니다. 우리의 목표는 표현형 분석, 면역조직화학 및 주사 전자 현미경을 통해 마우스 달팽이관의 PCP 신호 전달을 분석하는 것입니다.

Ciliopathy 마우스 돌연변이 달팽이관의 평면 셀 극성 표현형의 평가

우리는 세 가지 그대로 인공 회전 (정점, 중,베이스)로 코르티 성인 기관을 분리하는 방법을 제시한다. 또한 형광 태그 항체 면역 염색을위한 절차를 보여준다. 함께 이들 기술은 달팽이관 검색된 유모 세포,지지 세포 및 다른 세포 유형의 연구를 허용한다.

전체 마운트 해부 및 성인 마우스 달팽이관의 면역 형광

여기, 우리가 모터 뉴런 프로젝션과 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 배아에서 축 삭 arborization 시각화에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 모터 뉴런에 대 한 immunostaining, 후 우리는 후속 정량 분석에 대 한 이미지 배아를 빛 시트 형광 현미경 검사 법 사용. 이 프로토콜은 중앙 신경 조직에 있는 다른 신경 탐색 프로세스에 적용 됩니다.

모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 Arborization의 정량화의 시각화

zebrafish 모델 시스템을 포함 한 광학 선명도, 급속 한 외부 개발, 많은 귀중 한 기능을가지고 있으며, 청각과 균형의 분야에 특별 한 중요성의 외부 감각 머리 세포 이다. 이 문서 설명 어떻게 유전자 변형 zebrafish 토토 mechanosensation 머리 세포와 연 접 기능을 시험 하는 데 사용할 수 있습니다.

애벌레 Zebrafish의 측면 라인 세포의 생체 내 칼슘 이미징

이 원고는 정상 마우스에서 리본 시냅스의 형태학적 특성 및 기능 상태를 평가하기 위한 실험 프로토콜을 설명합니다. 본 모델은 또한 소음 유발 및 노화 관련 달팽이관 시냅토병 제한 모델에 적합합니다. 이전 마우스 연구의 상관 결과 또한 논의.

마우스 달팽이관의 특정 주파수 영역에서 리본 시냅스의 형태학적 및 기능적 평가

여기서, 우리는 기능성 메카노트랜스덕션 채널을 가진 청각 모발 세포에서 3 kDa 텍사스 레드 라벨 덱젠의 섭취를 시각화하는 방법을 제시한다. 또한, 3-10 kDa의 덱스 트랜스는 모발의 내분비증과 코르티 장기의 지지 세포를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

라이브 및 기능성 뮤린 달팽이관 모발 세포의 덱젠 라벨링 및 섭취량

여기서 우리는 호핑 프로브 이온 전도 현미경 검사법 (HPICM)에 대한 프로토콜을 제시, 라이브 청각 헤어 셀에서 스테레오실리의 나노 스케일 이미징을 허용하는 비 접촉 스캐닝 프로브 기술.

살아있는 포유류 청각 머리 세포에 있는 나노 규모 해상도를 가진 스테레오실리모들 화상 진찰

구심성 시냅스 구조 및 모발 세포를 면역표지하고, 노화된 조직에서 자가형광을 담금질하고, 달팽이관의 길이를 해부 및 추정하고, 공초점 영상으로 얻은 이미지 스택에서 시냅스를 정량화함으로써 젊은 성인 및 노인 게르빌 달팽이관을 처리하기 위한 프로토콜이 제시된다.

젊은 성인과 노인 Gerbil Cochleae의 면역 표지 및 카운팅 리본 시냅스

병아리는 다양한 연구를 위해 비용 효율적이고 접근 가능하며 널리 이용 가능한 모델 유기체입니다. 여기에서는 조류 내이 발달 및 재생의 기초가되는 분자 메커니즘을 이해하기 위해 일련의 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다.

조류 내이 발달을 연구하는 Ovo 및 Ex Ovo 방법에서

여기서는 소음성 난청(NIHL)의 마우스 모델에 대한 프로토콜을 제시합니다. NIHL을 유도하기 위해 골판지 플라스틱, 쥐덫 케이지 및 스피커를 사용하여 새롭고 간단한 장치를 개발했습니다. 청각 뇌간 반응과 면역형광 영상을 각각 사용하여 청력 기능과 외부 유모 세포 손상을 평가했습니다.

생쥐의 소음성 난청에 대한 수정된 실험 조건 및 청력 기능 및 외부 유모 세포 손상 평가

배우세요 광시트 형광 현미경을 이용한 노화된 달팽이관 3D 이미징 방법을. 이 비파괴 기술은 청각 신경 세포 밀도 변화를 정량 분석하여 난청 연구에 활용됩니다.

광시트 형광 현미경을 이용한 노화된 달팽이관 이미징

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