광시트 형광 현미경을 이용한 노화된 달팽이관 이미징

우리는 전체 달팽이관을 디지털화할 수 있는 광시트 현미경을 개발했습니다. 이 현미경은 작은 쥐의 달팽이관을 인간의 큰 측두골까지 이미지화할 수 있는 긴 작동 거리의 공기 장착 대물렌즈를 가지고 있습니다. 기계적 파괴를 일으키지 않고 레이저 빔으로 달팽이관을 연속적으로 절단합니다.

우리의 이미징 방법은 노화로 인한 유모 세포 및 나선형 신경절 뉴런의 손실과 같은 달팽이관의 병리학적 변화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 마우스를 안락사시키고 참수한 후 뇌를 통해 등-복부 절개를 하여 두개골을 반절개합니다. 뇌를 제거하고 두개골의 basoventral 부분에서 둥근 수포를 확인하십시오.

rongeurs로 bulla를 엽니 다. 그런 다음 달팽이관을 시각화하고 제거합니다. 해부 현미경으로 5배 배율로 타원형 창에 구멍을 뚫고 날카로운 곡괭이로 등골을 제거합니다.

그런 다음 둥근 창에 곡괭이를 삽입하여 멤브레인에 구멍을 뚫습니다. 고정을 수행하려면 2 밀리리터의 포르말린으로 채워진 1 밀리리터 주사기에 부착 된 주입 세트의 절단 팁으로 열린 둥근 창을 덮으십시오. 2분 동안 달팽이관의 외림프 공간을 통해 포르말린을 천천히 주입하여 포르말린이 열린 타원형 창을 통해 달팽이관에서 빠져나가도록 합니다.

달팽이관에서 과도한 조직을 잘라냅니다. 10% 포르말린이 함유된 병에 담그고 밤새 회전근에 놓습니다. 석회질 제거를 위해 PBS에서 달팽이관을 각각 5분 동안 세 번 헹굽니다.

EDTA의 10 % 용액이 들어있는 병에 담그십시오. 회전하면서 4 일 동안 배양하여 매일 용액을 바꿉니다. 그런 다음 PBS로 달팽이관을 세 번 관류하고 변경 사이에 15분 동안 담그면 모든 EDTA가 제거됩니다.

세척 후, 각 농도에서 30 분 동안 에탄올의 오름차순 농도로 달팽이관을 탈수하십시오. 로다민 B 용액에 밤새 회전하여 담가 전체 달팽이관을 얼룩지게 합니다. 100% 에탄올을 두 번 교체하여 달팽이관에서 과도한 염료를 제거하고 각 변화에 대해 5분 동안 배양합니다.

염색된 달팽이관을 Spalteholz 용액의 두 가지 변화로 옮길 때마다 30분 동안 교체합니다. 회전하면서 청소 용액에 밤새 두십시오. 달팽이관을 타원형의 둥근 창 막 끝에 있는 표본 막대에 부착합니다.

세척액이 달팽이관 내에 남아 있고 기포가 형성되지 않았는지 확인하십시오. UV 활성화 접착제를 사용하여 젖은 달팽이관의 타원형 및 둥근 창 끝을 건조한 표본 막대에 부착합니다. UV 광선으로 달팽이관 주위를 움직여 UV 접착제를 10초 동안 경화시킵니다.

Spalteholz 용액으로 채워진 광학적으로 투명한 석영 형광계 셀의 이미징 챔버에 달팽이관을 매달고 표본 막대를 X/Z 번역 스테이지에도 부착된 회전 홀더에 부착합니다. 그런 다음 맞춤형으로 설계된 프로그램을 사용하여 X축 및 Z 단계의 광판을 통해 표본을 이동하고 달팽이관 전체에 2D 이미지 스택을 만듭니다. 이미지를 처리하려면 이미지 스택을 다른 컴퓨터로 전송하고 3D 재구성 및 정량화를 위해 3D 렌더링 프로그램에 로드합니다.

쥐 달팽이관의 직접 부피 렌더링은 타원형의 둥근 창, 유모 세포가 있는 Corti 기관, Rosenthal의 운하가 분할되고 부피가 렌더링되었으며 길이를 따라 나선형 신경절 뉴런(SGN)을 보여주었습니다. TSLIM을 사용하여 생후 3개월 된 어린 쥐와 23개월 된 쥐의 달팽이관을 이미지화하고 SGN을 계산했습니다. 선형 플롯에 묘사된 Rosenthal의 운하 거리의 함수로서의 SGN 세포 수는 나이든 동물에 비해 달팽이관의 중간 및 정점 끝에 있는 어린 동물에서 더 큰 SGN을 보여주었습니다.

SGN의 이러한 명백한 손실은 클러스터 분석 및 3D 렌더링 소프트웨어를 사용하여 시각화되었습니다. SGN 밀도 차이는 고밀도 클러스터가 노란색이고 파란색이 저밀도 영역을 나타내는 색상 스케일로 묘사되었습니다. 클러스터 분석은 Rosenthal 운하의 길이를 따라 세포 밀도가 낮은 영역을 명확하게 묘사했습니다.

광시트 현미경은 구조물의 3D 볼륨 렌더링을 생성할 수 있는 잘 정렬된 이미지 스택을 생성하도록 설계되었습니다. 3D 렌더링 프로그램을 사용하면 구조와 다양한 구조 간의 해부학적 관계를 정량적으로 평가할 수 있습니다. 그러나 3D 렌더링 프로그램은 다양한 사용자 매개변수를 제공하기 때문에 이러한 프로그램을 효과적으로 사용하려면 상당한 학습 곡선이 있습니다.