Name: 단편화, 균질화 및 연속 여과의 조합을 사용하여 소 난소에서 작은 전방 난포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 배우세요 소 난소에서 조직 절단기, 균질화 및 연속 여과를 이용한 기계적 분리법으로 생존 가능한 전기 전방 난포를 효율적으로 분리하는 방법을. 이 기술은 생식 생물학 및 생식력 보존 연구에 활용됩니다.

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이 프로젝트는 USDA 다중 상태 프로젝트 W4112와 UC Davis Jastro Shields 상을 SM에 의해 부분적으로 자금을 지원받았습니다.
저자는 모든 실험에 사용 된 소 난소를 제공 한 Central Valley Meat, Inc.에 감사를 표하고 싶습니다. 저자는 또한 난소 처리 및 난포 분리에 대한 도움을 준 Olivia Silvera에게 감사드립니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

본 프로토콜은 소 난소로부터 초기 단계의 preantral 난포, 특히 1 차 및 초기 2 차 단계에서 회수하는 재현 가능한 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 이전 보고서 20,25,30,34,35,36을 기반으로 하며 개별 난소에서 의미 있는 수의 난포를 분리하는 최적화를 제공합니다. 이 방법을 사용하여 분리된 전안구 난포는 실행 가능하며 단백질의 면역국소화 및 유전자 발현 분석을 위한 RNA 추출과 같은 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 분리된 모낭의 배양은 본 연구에서 시도되지 않았다. 그러나 현재 작은 소 전방 난포의 성공적인 장기 배양을 달성하기 위한 ...

난소 난포는 난소의 기능 단위로, 배우자 (난 모세포)의 생산뿐만 아니라 생식 기능과 전반적인 건강에 중요한 호르몬을 담당합니다. 원시 난포는 태아 발달 중 또는 종1에 따라 신생아기에 난소에서 형성되며 여성의 난소 예비를 구성합니다. 여포 성장은 휴식 풀을 떠나 성장 단계로 들어가는 원시 모낭의 활성화로 시작됩니다. 전두엽 발달 이전의 모든 난포 단계를 포함하는 전안구 모낭 생성은 이 두 세포 유형 2,3 간의 긴밀한 통신에 의해 구동되는 난모세포와 주변 과립막 세포에서 동기식 형태학적 및 대사적 변화를 필요로 하는 매우 역동적인 과정입니다. Preantral 난포는 주어진 시간에 난소에서 발견되는 난포 단위의 대부분을 구성합니다4. 난포 발달 전 단계를 통한 발달은 전방 발달5,6보다 몇 주 더 긴 것으로 추정되며, 이 시기는 난모세포와 체세포가 발달의 최종 단계(즉, 항문 단계)에 진입하고 배란, 수정 및 배아 발달을 준비하기에 충분한 성숙을 얻는 데 필요합니다7,8,9.
난소 전 난포 형성에 대한 현재 지식의 대부분은 마우스 모델10,11,12,13에서 비롯되며, 이는 부분적으로 더 작고 섬유질이 적은 난소에서 많은 수의 난포를 쉽게 회복 할 수 있기 때문입니다. 소 난소에서 많은 수의 전방 난포를 분리했다는 보고는 약 30년 전으로 거슬러 올라갑니다.14, 이러한 초기 단계의 난포의 발달을 조절하는 과정에 대한 보다 완전한 이해는 실현되지 않은 상태로 남아 있습니다., 특히 발달 초기 단계에서 충분한 수의 생존 가능한 전두엽 난포를 회수할 수 있는 최적화되고 효율적이며 반복 가능한 방법이 부족하기 때문입니다. 인간의 보조 생식에 대한 미래의 사용을 위해 난소 예비력을 보존하는 것에 대한 관심이 증가함에 따라, 소는 더 유사한 난소 구조15로 인해 매력적인 모델이됩니다. 그러나, 소 난소는 마우스 난소16에 비해 콜라겐이 현저히 풍부하여, 마우스에 대해 기술된 방법을 사용한 기계적 분리를 매우 비효율적으로 만든다. 생식력 보존 기술을 확장하기 위한 노력에는 전안구 난포의 완전한 시험관 내 성장, 밀폐된 난모세포의 시험관 내 성숙(IVM), 체외 수정(IVF), 배아 생산 및 이식이 포함됩니다17. 지금까지, 이 전체 과정은 마우스18에서만 달성되었다. 소에서, 시험관 내에서 난포 성장을 향한 진전은 배양 시작시 가변 난포 단계와 프로토콜17,19 사이의 다양한 배양 기간을 갖는 몇 가지 보고서로 제한됩니다.
소 난소에서 preantral 난포의 수확을위한 문헌에 설명 된 방법은 대부분 분리 또는 조합된 기계적 및 효소 기술을 사용했습니다 2,14,17,20. 소 전신난포 분리를 위한 프로토콜의 첫 번째 보고는 전체 난소를 처리하기 위해 조직 균질화기 및 직렬 여과를 사용하였다20. 이 연구는 콜라게나제14를 활용한 기계적 및 효소적 절차를 결합한 보고로 이어졌습니다. 난소 조직을 소화하기 위해 콜라게나제를 사용할 때 반복되는 주제는 난포 생존력을 손상시킬 수 있는 난포 기저막의 손상에 대한 잠재적 위험입니다 14,21,22,23. 따라서, 조직 초퍼의 사용 및 반복 피펫팅 또는 균질화20,24,25,26과 결합된 조직 초퍼의 사용과 같은 기계적 방법의 상이한 조합이 사용되었다. 설명된 또 다른 기계적 기술은 바늘을 사용하여 난소 조직에서 직접 전안구 난포를 해부하는데, 이는 더 큰(>200μm) 2차 난포를 분리하는 데 특히 유용합니다. 그러나 이 과정은 시간이 많이 걸리고 더 작은 전엽 난포를 분리하는 데 비효율적이며 소 난소에서 시도할 때 스킬셋에 의존합니다 19,27,28.
문헌에 설명된 다양한 기술을 활용하여 이 프로토콜은 효소 용액에서 배양을 피하는 간단하고 일관되며 효율적인 방식으로 단일 소 난소에서 전후 난포의 분리를 최적화하는 것을 목표로 했습니다. 전방 모낭을 분리하는 방법을 개선하면 이 모낭 형성 단계에 대한 이해를 높이고 전방 난포를 항문 단계로 발전시키는 효과적인 배양 시스템을 개발할 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다. 소 종과 같은 대형 포유동물로부터 전치모낭의 단리를 위해 본원에 기재된 상세한 절차는 인간에게 번역될 수 있는 비뮤린 종에서 초기 모낭 발생을 연구하고자 하는 연구자에게 필수적일 것이다.

<table><tbody><tr><td>5-3/4" 소다 라임 일회용 유리 파스퇴르 피펫</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>63A54</td><td>파스퇴르 피펫은 페트리 접시 내부를 검색하는 동안 파편에서 모낭을 제거하는 데 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td>4%로 희석; 면역 염색을 위한 여포 고정</td></tr><tr><td>20mL 루어락 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>Z116882-100EA</td><td>주사기는 18 G 바늘과 함께 40 &mu에서 여포를 쫓아내기 위하여 이용된다; m cell strainer</td></tr><tr><td>#21 멸균 메스 블레이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-365-023</td><td>난소를 절단하고 수질을 제거하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>40 &mu; m 세포 여과기</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>22-363-547</td><td>300 &mu에서 여과액을 필터링하는 데 사용됩니다. m 세포 여과기</td></tr><tr><td>104 mm 플라스틱 깔때기</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>10-348C</td><td>크기는 다를 수 있지만, 치즈 천이 적절하게 절단되고 난소 호모겐산염이</td></tr><tr><td>300 &mu 이상 흘러내리지 않도록 하십시오; m 세포 여과기</td><td>pluriSelect&nbsp;</td><td>43-50300-03</td><td>치즈 천에서 여과액을 여과하는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>치즈 천에서 여과물을 잡는 데 사용되는</td> <td>500 mL Erlenmeyer Flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB500500</td> 퍼널과 플라스크;</tr><tr><td>Air-Tite 멸균 바늘 18 G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-817-151</td><td>18 G는 40 &mu; m 세포 여과기</td></tr><tr><td>Air-Tite 멸균 바늘 27 G 13 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-171</td><td>난포가 붙어있는 어떤 잔해도 조작할 수 있는 바늘</td></tr><tr><td>BD Hoechst 33342 솔루션</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB561908</td><td>형광 DNA 염색</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G&nbsp;</td><td>여포 세척 매체의 성분</td></tr><tr><td>치즈 천</td><td>전자 현미경 과학</td><td>71748-00</td><td>큰 조직 파편을 제거하기위한 난소 균질 화의 첫 번째 필터링 단계</td></tr><tr><td>Classic Double Edge Safety Razor Blade</td><td>Wilkinson Sword</td><td>N / A</td><td>McIlwain Tissue Chopper에 가장 적합하고 빨리 무뎌지지 않는 면도날</td></tr><tr><td>Donkey-Anti-Rabbit 2 차 항체, Alexa Fluor 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td>면역 염색을 위한 보조 항체</td></tr><tr><td>Eisco 라텍스 피펫 전구</td><td>Fisher Scientific</td><td>S29388</td><td>파스퇴르 피펫과 함께 사용하는 고무 전구</td></tr><tr><td>HEPES 버퍼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>모낭 세척 매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>Homogenizer</td><td>VWR</td><td>10032-336</td><td>난소 조직을 균질화하여 모낭을 방출합니다&nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji</td><td>NIH</td><td>v2.3.1</td><td>형광 분석에 사용되는 소프트웨어-면역국소화</td></tr><tr><td>McIlwain 조직 초퍼</td><td>Ted Pella</td><td>10184</td><td>균질화를 위해 충분히 작은 난소 조직을 절단하는 데 사용</td></tr><tr><td>현미경 - 입체경</td><td>Olympus</td><td>SZX2-ILLT</td><td>여과액에서 난포를 검색하고 수확하는 데 사용되는 해부 현미경</td></tr><tr><td>현미경 - 인버티드</td><td>니콘</td><td>Diaphot 300</td><td>도립 현미경은 고립 된 여포의 고배율 명시야 시각화에 사용됩니다</td></tr><tr><td>현미경 - 고</td><td>배율 표시 명시야 및 고립 된 여포의 epifluorescence 시각화에 사용되는</td>Inverted <td>ECHO</td><td>Revolve R4</td> 도립 현미경</tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410-1L</td><td>검색 중 증발을 방지하기 위해 여포 세척 매체의 방울을 덮는 오일</td></tr><tr><td>비필수 아미노산(NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>여포 세척 매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-001</td><td>면역염색 차단 완충액용 시약</td></tr><tr><td>IVF용 Nunc 4-well Dish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>144444</td><td>난포 분리 및 세척을 위한 4-well Dish</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액 100x</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td>여포 세척 매체의 구성</td></tr><tr><td>요소 페트리 접시 60 mm OD x 13.7 mm</td><td>Ted Pella</td><td>10184-04</td><td>McIlwain Tissue Chopper</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>에 가장 잘 맞는 페트리 접시<td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td>난소 및 여포용 세척 버퍼</td></tr><tr><td>플라스틱 도마</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-002-24A</td><td>안전하게 절단하기에 충분한 크기의 도마 난소</td></tr><tr><td>폴리비닐피롤리돈 (PVP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-100</td><td>PVP (0.1% w/v)를 PBS에 추가하면 모낭이 플레이트에 붙거나 서로 붙는 것을 방지합니다&nbsp;</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>형광 표지된 세포 또는 조직용 마운팅 배지</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>RNA 컬럼 클린업 키트</td></tr><tr><td>R</td><td>The R Foundation</td><td>v4.1.2</td><td>통계 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody</td><td>Abcam</td><td>ab181701</td><td>Cx37 primary antibody 면역 염색용</td></tr><tr><td>RevertAid RT 역전사 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1691</td><td>cDNA 합성 키트</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>RStudio, PBC</td><td>v2021.09.2</td><td>통계 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>수산화나트륨 용액(1N/인증)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td>배지 pH를 7.6-7.8로 높이는 데 사용</td></tr><tr><td>피루브산나트륨(NaPyr)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>모낭 세척 매체의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>사각 페트리 접시 100 mm x 15 mm&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60872-310</td><td>격자 모양의 페트리 접시는 모낭의 더 효율적인 식별을 가능하게 합니다&nbsp;</td></tr><tr><td>PCR 반응용</td> <td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>1725271</td> Mastermix</tr><tr><td>Steritop Threaded Bottle Top Filter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2GPT02RE</td><td>여포 세척 매체</td></tr><tr><td>SYBR-safe DNA 젤 염색</td>을 살균하는 데 사용 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td> Hank' with <td>Hank'를 사용한 아가로스 젤</td></tr><tr><td>TCM199의 시각적 PCR 산물에 염색 s Salts</td><td>Gibco</td><td>12-350-039</td><td>여포 세척 매체의 구성</td></tr><tr><td>요소 Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>면역 염색 투과 완충액용 세제</td></tr><tr><td>Trizol 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>15596026 RNA 분리 시약</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15-250-061</td><td>분리된 여포의 생존력 테스트에 사용</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td></td><td></td><td>Detergent for immunostaining wash buffer</td></tr><tr><td>Warmer Plate Universal</td><td>WTA</td><td>20931</td><td>Warm plate는 모낭을 38.5 &deg로 유지합니다; C 현미경으로 검색하는 동안</td></tr><tr><td>Wiretrol II Calibrated Micropipets</td><td>Drummond</td><td>50002-005</td><td>난포를 조작하기위한 유리 마이크로 피펫</td></tr></tbody></table>

단편화, 균질화 및 연속 여과의 조합을 사용하여 소 난소에서 작은 전방 난포의 분리

Isolation of Small Preantral Follicles from the Bovine Ovary Using a Combination of Fragmentation, Homogenization, and Serial Filtration

포유류 모낭 생성의 전체 과정을 이해하는 것은 가축, 인간 및 멸종 위기에 처한 종의 보조 생식 기술을 개선하는 데 중요합니다. 연구는 특히 소 종과 같은 대형 포유류에서 더 작은 전방 모낭의 분리가 어렵 기 때문에 대부분 전방 및 큰 전방 모낭으로 제한되었습니다. 이 연구는 단일 소 난소에서 많은 수의 작은 전방 난포를 회수하는 효율적인 접근 방식을 제시합니다. 개별 소 난소의 피질을 조직 초퍼를 사용하여 500μm 입방체로 절단하고 10mm 프로브를 사용하여 9,000-11,000rpm에서 6분 동안 균질화했습니다. 큰 파편은 치즈 천을 사용하여 균질액으로부터 분리하고, 이어서 300 μm 및 40 μm 세포 스트레이너를 통한 연속 여과하였다. 40μm 스트레이너에 남아있는 내용물을 검색 접시로 헹구어 모낭을 식별하고 배지 한 방울로 수집했습니다. 수집된 모낭의 생존력은 트리판 블루 염색을 통해 시험하였다. 이 방법은 약 90 분 안에 단일 소 난소에서 많은 수의 생존 가능한 작은 preantral 난포를 분리 할 수 있습니다. 중요하게도,이 방법은 완전히 기계적이며 모낭을 손상시킬 수있는 조직을 해리하기 위해 효소를 사용하지 않습니다. 이 프로토콜을 사용하여 얻은 난포는 RT-qPCR을 위한 RNA 분리, 특정 단백질의 면역 국소화 및 시험관 내 배양과 같은 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

개요 및 중요 단계 이 프로토콜을 사용하면 작은 소 preantral 난포를 실험적으로 관련된 숫자로 단일 난소에서 안정적으로 분리 할 수 있습니다. 총 30 번의 반복에서 복제 당 평균 41 개의 난포가 얻어졌으며 범위는 11-135 개입니다 (그림 4A). 14번의 반복에서, 모낭은 실체현미경 하에 1 μm 현미경 보정 슬라이드를 사용하여 난포 직경을 측정함으로써 앞서26 과 같은 발달 단계를 특성화하였다. 이 방법을 사용하여 총 476개의 난포를 1차(40-79μm 크기의 난포), 초기 2차(80-119μm) 또는 2차(≥120μm) 난포(그림 4B)로 분류했습니다. 원시 모낭은 40 μm 여과 단계로 인해 제외되었다. 난포 생존율은 앞서30에 기재된 바와 같이 트리판 블루 배제 시험을 사용하여 평...

전후 난포 생성에 대한 연구를 발전시키기 위해서는 단일 난소에서 난포를 분리하는 효율적인 방법이 필요합니다. 여기에 제시된 것은 조직 초퍼와 균질화를 사용하여 소 난소에서 난포를 분리하기위한 간소화 된 기계적 프로토콜입니다. 이 방법은 단일 난소에서 많은 수의 생존 가능한 전방 난포를 수집 할 수있게합니다.

Understanding the full process of mammalian folliculogenesis is crucial for improving assisted reproductive technologies in livestock, humans, and ...

이 프로토콜은 단일 소 난소에서 초기 단계의 전방 난포를 효율적이고 반복 가능한 분리를 허용하고 비 소 종에서 난소 난포 형성을 연구하기위한 새로운 기회를 창출합니다. 단일 난소에서 더 많은 수의 난포를 사용함으로써이 기술은 난소 수확 전에 생체 내 치료를 가능하게하거나 난소 생검을 통해 동일한 동물로부터 시간이 지남에 따라 여러 샘플을 채취 할 수 있습니다. 초기 단계의 전방 난포의 분리 및 냉동 보존은 화학 요법과 같은 생식선 독성 치료를받는 젊은 여성의 생식력 보존과 멸종 위기에 처한 종의 생식 질 보존을위한 귀중한 옵션이 될 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 Stephanie McDonnell, Amanda Morton 및 Juliana Candelaria, 내 실험실의 박사 과정 학생이 될 것입니다. 시작하려면 실험실의 난소를 Pen-Strep이 포함 된 따뜻하고 멸균 된 PBS로 옮기고 작은 antral 난포가 많고 눈에 띄는 황체가없는 난소를 선택하십시오. 가위를 사용하여 난소에서 과도한 결합 조직과 지방을 제거하십시오.하나의 난소를 벤치 용지의 도마로 옮깁니다. 메스를 사용하여 한 인대 부착 부위에서 반대쪽 부착 부위까지 세로로 난소를 반으로 자릅니다. 처리 할 도마에 난소의 절반을 유지하고 난소의 나머지 절반을 Pen-Strep이 들어있는 따뜻한 PBS에 다시 넣습니다.수질을 제거하려면 노출 된 수질이 위쪽을 향하도록 피질을 절단하지 않고 표면에서 약 2mm 떨어진 난소의 곡률을 따라 자릅니다. 수질의 대부분을 제거하기 위해 컷을 잘라냅니다. 상피가 위쪽을 향하도록 난소를 반으로 뒤집고 메스를 사용하여 피질에서 수질 절단을 완료하고 인대에 연결된 난소 조각 가장자리 주위에 남아있는 흰색 결합 조직을 잘라냅니다.수질의 대부분이 제거되면 메스를 사용하여 피질을 약 1mm 두께로 자르고 메스를 앞뒤로 작은 동작으로 조작하여 나머지 수질을 면도 한 다음 각 난소 피질 절반을 두 조각으로 자릅니다. 자를 준비가 될 때까지 Pen-Strep이 들어있는 따뜻한 PBS에 피질 조각을 보관하십시오. 피질 한 조각을 티슈 초퍼의 페트리 접시로 옮기고 Pen-Strep이 들어있는 따뜻한 PBS 서너 방울로 티슈를 적십니다.한 쌍의 집게로 티슈 조각을 안정적으로 잡고 재설정 버튼을 한 번 눌러 티슈 초퍼를 시작합니다. 피질의 전체 조각을 스트립으로 자른 후 블레이드 홀더 손잡이를 사용하여 페트리 접시에서 블레이드를 들어 올리고 집게를 사용하여 블레이드에서 조직을 제거합니다. 플레이트 홀더를 90도 회전시킨 후 다시 재설정 버튼을 누르고 블레이드를 티슈 스트립에 완전히 통과시킵니다.블레이드 홀더 손잡이를 사용하여 페트리 접시에서 블레이드를 들어 올리고 집게를 사용하여 앞에서 설명한 대로 블레이드에서 티슈를 제거합니다. 전사 피펫과 Pen-Strep이 포함 된 따뜻한 PBS를 사용하여 잘게 잘린 티슈를 예열 된 50 밀리리터 원추형 튜브로 씻습니다. 원추형 튜브를 물이나 구슬 욕조로 되돌려 다진 조직을 따뜻하게 유지하면서 난소의 다른 세 반쪽과 함께 자르기 절차를 반복합니다.최상의 절단 결과를 얻으려면 너트 드라이버를 사용하여 절단 암에서 너트를 제거하고 와셔와 블레이드 걸쇠를 제거하십시오. 집게를 사용하여 도마에서 날을 제거하십시오. 사용하지 않은 가장자리가 페트리 접시를 향하도록 뒤집고 다시 다마 위에 놓습니다.균질화기 장치가 연결되어 있고 속도가 두 번째 막대로 설정되어 있는지 확인한 후 제조업체의 사양에 따라 10mm 발생기 프로브를 장치에 삽입합니다. 다음으로, 1 분 동안 타이머를 설정하고 프로브를 하나의 난소에서 잘게 잘린 피질 조직을 포함하는 50 밀리리터 원추형 튜브에 삽입하고 Pen-Strep이 포함 된 PBS가 들어있어 튜브를 25 밀리리터 라인까지 채 웁니다. 프로브가 삽입되는 깊이는 챔버 바닥에서 측정 한 액체 높이의 1/3이어야합니다.타이머가 시작되면 균질화기를 켜서 프로브의 바닥이 튜브에 닿지 않도록 하고 균질화기가 켜져 있는 동안 튜브를 가만히 유지합니다. 균질화 1 분 후 튜브에서 프로브를 제거한 다음 집게를 사용하여 로터 나이프와 로터 튜브 사이의 공간에서 통풍구를 막는 결합 조직 또는 프로브에 붙어있는 피질 조각을 제거하고 튜브에 다시 넣습니다. 분산된 조직을 치즈천으로 덮인 깔때기에 붓고 삼각 플라스크에 삽입하고 따뜻한 PBS를 사용하여 튜브의 내용물을 깔때기로 헹굽니다.마지막으로 따뜻한 PBS로 치즈 천을 헹굽니다. 작은 조각의 액체가 조직 조각 주위의 치즈 천을 아래로 비틀고 치즈 천에서 과도한 액체와 조직이 모두 제거 될 때까지 짜서 천의 구멍을 통과하도록합니다. 깔때기 위의 치즈 천을 다시 연 후 전사 피펫을 사용하여 Pen-Strep이 포함 된 PBS로 치즈 천을 헹구고 다시 천을 통해 잔류 조직 조각을 짜십시오.지혈제를 사용하여 300 마이크로 미터 세포 여과기를 200 밀리리터 비커 위에 놓고 세포 여과기를 통해 Erlenmeyer 플라스크에 여과액을 붓습니다. 셀 스트레이너가 티슈로 막히면 비커에 부드럽게 두드린 다음 스트레이너를 거꾸로 뒤집고 큰 티슈 파편을 벤치 페이퍼에 두드립니다. 조직 조각이 남지 않을 때까지 Pen-Strep이 포함 된 따뜻한 PBS를 사용하여 플라스크의 내용물을 헹구고 세포 여과기에 붓습니다.다음으로, 두 번째 200 밀리리터 비이커 위에 지혈제로 40 마이크로 미터 세포 스트레이너를 잡고, 첫 번째 200 밀리리터 비커에 존재하는 모든 초기 여과액을 스트레이너를 통해 부은 다음, 조직 조각이 남지 않을 때까지 Pen-Strep이 함유 된 따뜻한 PBS를 사용하여 비커의 내용물을 헹구고 세포 스트레이너에 부어 넣습니다. 18 게이지 바늘을 20 밀리리터 주사기에 장착 한 후 주사기에 여포 세척 매체를 채 웁니다. 지혈제를 사용하여 40마이크로미터 세포 여과기를 정사각형 페트리 접시 위에 거꾸로 잡고 주사기를 사용하여 세포 여과기의 내용물을 접시에 씻어냅니다.정사각형 페트리 접시를 따뜻한 무대가 섭씨 38.5도로 설정된 스테레오스코프에 옮기고 배율을 1.25배에서 3.2배 사이로 설정합니다. 사각 페트리 접시에서 모낭을 확인한 후, 마이크로 피펫을 사용하여 모낭을 세척 배지 방울로 옮깁니다. 6분 조직 균질화를 사용하여 복제당 단리된 전-전-전-난포의 총 수는 11 내지 135개의 난포에 이르는 복제당 평균 41개의 난포를 나타낸다.476 개의 분리 된 난포의 발달 단계를 평가 한 결과, 대다수가 발달의 주요 단계에 있었으며, 입방체 과립구 세포의 한 층을 포함하는 40-79 마이크로 미터를 측정했습니다. 6 분 동안 난소 피질의 균질화는 동일한 속도로 균질화의 5 분에 비해 더 많은 수의 전 개미 난포를 산출했다. 모낭에서 과립막 세포 마커 FSH 수용체 및 생식 세포 마커 DAZL의 전사체 발현은 역전사 정량 PCR을 사용하여 평가되었으며, 이는 1차 및 초기 2차 난포 모두 FSH 수용체 및 DAZL 전사체를 발현한다는 것을 입증합니다.1 차 및 초기 2 차 단계에서 분리 된 전 전방 난포에서 CX37의 면역 형광 국소화는 CX37이 O 부위의 핵과 과립막 세포의 막에 부재 한 O 혈장에 국한되었음을 보여줍니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 피질 조직의 얇은 층을 적절하게 해부하고, 조직을 올바른 크기로 자르고, 적절한 균질화는 조직에서 생존 가능한 모낭의 방출을 보장하는 중요한 단계입니다. 분리 된 전 전방 난포는 전 전방 난포 성장 조절 및 과립구 세포와 난 모세포 간의 상호 작용의 특성과 같은 질문에 답하는 데 사용할 수있어보다 효율적인 배양 조건의 개발을 촉진합니다.

isolation-small-preantral-follicles-from-bovine-ovary-using

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

3D 섬유소 - 알지네이트요 interpenetrating 네트워크에 난소 대과의 캡슐에 대한 새로운 방법을 설명합니다. 이 시스템은 성숙 oocytes을 만들어 미숙 모공의 개발을 지원하기 위해 proteolytic 저하로 구조적 지원을 결합한 제품입니다. 이 방법은 확장을 제한하지 않고 세포 세포 접촉을 유지하기 위해 문화 셀 집계에 적용될 수 있습니다.

Proteolytically 분해 3 차원 시스템에서 난소 대과의 캡슐화 및 문화에 대한 방법

이 비디오는 갓 채취한 쥐 난소에서 전방 난모세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 이러한 전방 난모세포는 추가 특성화 및 발달 연구에 사용할 수 있습니다.

마우스 전방 난모세포 분리: 갓 수확한 마우스 난소에서 전방 난모세포를 분리하는 방법

이 동영상은 돼지 난소에서 적운-난모 세포 복합체 또는 COC를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 분리된 온전한 COC는 불임 치료법을 개발하기 위한 보조 생식 기술인 체외 수정을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

Porcine Cumulus Oocyte Complex Isolation: 체외 수정을 위해 돼지 난포 난포에서 Cumulus Oocyte 복합체를 분리하는 기술

여기에 제시 된 3D 문화 조건에서 돼지 난모세포의 캡슐화를위한 두 가지 프로토콜이 있습니다. 첫 번째, 적수-oocyte 복합체 (COC) 피브린-알자네이트 구슬에 캡슐화 된다. 두 번째, 그들은 불소 에틸렌 프로필렌 분말 입자로 동봉되어 (미생물 반응기). 두 시스템 모두 최적의 조건을 통해 3D 조직을 유지관리합니다.

포르신 오시테 캡슐화를 위한 프로틸분해 된 알기네이트 하이드로겔 및 소수성 미생물 반응기

우리는 발달의 초기 단계에서 난소 여포에서 성장 난모세포의 분리절차뿐만 아니라 완전히 자란 단계까지 성장과 차별화를 지원할 수있는 체외 문화 시스템의 설정에 대해 설명합니다.

가축의 초기 개국 여포에서 온수에 대한 생체 외 문화 전략

여기서는 제브라피시 난소 여포에 여포 세포와 난소 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시하여 제브라피시의 난소 발달에 대한 조사를 용이하게 합니다.

얼룩말 피시의 난소 여포에서 여포 세포와 난소 세포의 분리

여기에서 우리는 전방 난포에서 난소 세포를 식별하고 정제하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 피질 스트립의 냉동 보존을 위해 전체 난소를 처리하는 동시에 과립구, 테카, 내피, 조혈 및 기질 세포를 포함한 여러 난포 상주 세포 유형을 유리하기 위해 효소로 처리되는 온전한 전방 난포를 수확하는 방법에 대해 자세히 설명합니다.

인간 Antral Follicles에서 계통 특이적 세포의 추출, 표지 및 정제

여기에서는 유전자 발현 분석을 수행하기 위해 냉동 해동된 피질 조직에서 인간 난포를 분리하는 방법을 설명하는 프로토콜을 설명합니다.

인간 난포의 유전자 발현 분석

여기에서는 조류 배란 전 여포에서 난황, 과립층 세포 및 테카 세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이러한 정밀한 취급을 통해 생식 기능에서 이러한 층의 역할에 대한 중요한 조사를 수행할 수 있으며, 농업 수확량 및 생물 의학적 통찰력을 향상시키기 위해 여포 발달, 호르몬 조절 및 질병 연구에 대한 이해를 돕습니다.

다운스트림 응용을 위한 조류 배란 전 여포 granulosa 및 Theca 세포층 분리

이 프로토콜은 티라민 결합 히알루로난 하이드로겔을 사용하여 마우스 난소에서 전방의 여포를 캡슐화하고 배양하는 새로운 3차원(3-D) 배양 모델을 설명합니다. 또한 유리화(vitrification)에 의한 난소 여포 동결 보존에 대한 두 가지 접근 방식에 대해서도 자세히 설명합니다.

3차원 난포 배양을 위한 새로운 히알루로난 하이드로겔의 응용 및 마우스 난포 동결 보존을 위한 방법론

이 기사에서는 소 테카 세포와 과립막 세포의 공동 배양 모델을 제시합니다. 이 방법은 난포 내 체세포 사이의 측분비 통신 및 기질 수송 연구에 초점을 맞춘 분석을 위한 신뢰할 수 있는 기초가 될 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

소 난소에서 과립-테카 세포 상호작용을 이해하기 위한 수정된 공동 배양 시스템

배우세요 소 난소에서 조직 절단기, 균질화 및 연속 여과를 이용한 기계적 분리법으로 생존 가능한 전기 전방 난포를 효율적으로 분리하는 방법을. 이 기술은 생식 생물학 및 생식력 보존 연구에 활용됩니다.

단편화, 균질화 및 연속 여과의 조합을 사용하여 소 난소에서 작은 전방 난포의 분리

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