Name: 9 일 된 마우스 신생아의 간외 담관 및 담낭 박리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 배우세요 9일 된 마우스 신생아의 간외 담관 전체 박리 기법으로 무손상 세포 제거 및 표본 무결성을 확보하는 방법입니다. 이 프로토콜은 담관 질환 연구의 재현성과 비교 가능성을 향상시킵니다.

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저자는 Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl 및 Magdalena Trochimiuk의 공헌을 인정합니다. Hans Christian Schmidt는 함부르크의 UKE에 있는 Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME 장학금(2021_EKPK.10)의 재정 지원을 받았습니다.

윤리적 승인(N045/2021)에 따라 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스 신생아를 9일령까지 관찰했습니다. 동물들은 독일 함부르크의 함부르크-에펜도르프 대학 의료 센터의 동물 시설에서 실험 목적으로 태어나 제공되었습니다. 신생아는 부모 동물과 함께 새장에 수용되었습니다. 환경 조건은 온도 (20-24 ° C), 12:12 h 명암 사이클 및 40 % -70 %의 상대 습도로 제어되었습니다.
1. 실험 준비
<ol><li>가위, 집게 등을 포함하여 외과 수술에 필요한 장비를 준비하십시오 ( 재료 표 참조).</li>
	<li>소독 및 오토클레이브된 기구를 수술 테이블 옆의 멸균 표면에 놓습니다.</li>
	<li>P9 세 신생아 마우스를 수술 가위로 참수하여 신속하게 안락사시킵니다. 안락사된 신생아 마우스의 시신을 멸균 수술장에 놓습니다. 생후 9일 된 마우스 신생아의 EBDS를 해부합니다(5단계). 참고: 설명된 해부 절차는 모든 과학자에게 신생아 및 노령 마우스에서 EBDS를 제거할 수 있는 적절한 도구를 제공합니다. 마우스가 오래 될수록 준비가 더 쉽습니다.</li>
</ol>2. 복강에 대한 접근
<ol><li>포셉으로 방광 위치 위의 피부를 잡으십시오. 복막과 기본 구조를 손상시키지 않고 가위를 사용하여 피부에 직경 2mm의 구멍을 절개하십시오. 왼쪽 앞 겨드랑이 선을 따라 참수 위치까지 절단을 확장합니다. 외상성 집게로 왼쪽에서 오른쪽으로 피부를 제거하십시오.</li>
	<li>비장을 둘러싼 복막을 잡으십시오. 복막이 텐트와 같은 구조와 비슷해질 때까지 부드럽게 들어 올리고 중앙에 직경 1mm의 구멍을 자릅니다. "복막 텐트"가 공기로 채워질 때까지 기다리십시오. 이 단계와 다음 단계에 10x 현미경 배율을 사용합니다.</li>
	<li>갈비뼈 아래쪽, 양쪽 측면 복부 및 아래쪽 방광 영역으로 둘러싸인 창에서 복막을 잘라 간, 담관 시스템, 위, 소장 및 결장에 완전히 접근 할 수 있도록합니다. 알림: 간에 대한 접근성을 향상시키기 위해 추가 절개를 수행하여 검상돌기, 열판 인대, 간 및 담관 구조를 그대로 유지하면서 가장 낮은 세 개의 갈비뼈를 제거할 수 있습니다. 간장의 견해는 쉽게 얻을 수 있습니다.</li>
</ol>3. 담낭 및 담관 검사
알림: 다음 모든 단계에서 정기적으로 샘플을 젖게 유지하십시오.
<ol><li>담즙 방광을 검사하기 위해 두개 복부 위치에서 xiphoid 과정을 조심스럽게 당깁니다. 알림: 이 동작으로 열판 인대의 장력이 증가하고 부착된 담낭이 보입니다.<ol><li>담관 시스템에서 담낭이 찢어질 수 있는 대열 인대의 통제할 수 없는 찢어짐을 피하기 위해 약간만 당기십시오. 다음 단계 전에 검상돌기의 당김을 해제합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>십이지장을 부드럽게 아래로 당겨 담관 시스템을 자유롭게합니다. 알림: 간십이지장 인대의 긴장이 증가함에 따라 담관 조직이 보입니다.</li>
</ol>4. 엔블록 절제술
<ol><li>아래 단계에 따라 하위 en-bloc-mobilization을 수행하십시오.<ol><li>담관 시스템을 십이지장에 연결하는 십이지장 유두를 확인하십시오.</li>
		<li>유두의 오른쪽 측면에서 약 2cm 떨어진 십이지장을 자릅니다.</li>
		<li>유문 부위를 잘라냅니다. 위 내용물이 절단 위치와 십이지장 유두 사이의 유문 영역에 있는지 확인하십시오. 알림: 이것은 나중에 구강 및 천하 십이지장 부분의 올바른 위치에 대한 방향을 확보하기 위한 중요한 단계입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>상위 블록 동원을 수행하십시오.<ol><li>부드럽게 xiphoid 과정을 당기고 falciform 인대에 접근하십시오.</li>
		<li>담낭과 검상돌기 사이에 가능한 한 검상돌기에 가까운 열판 인대를 통해 1cm 길이의 절단을 수행하십시오. 담즙 방광을 손상시키지 않도록하십시오.</li>
		<li>간과 흉부 사이의 다음 연결 구조를 잘라냅니다 : 식도, 하대 정맥, 흉부 대동맥, 간장의 맨 부분을 둘러싸고있는 모든 인대 및 등쪽으로 남아있는 모든 조직 연결. 참고: en-bloc 샘플은 완전히 해부됩니다. 그것은 간, 담관 시스템 및 위의 유문 영역과 연결된 십이지장 코퍼스를 포함합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 최종 담낭 및 담관 박리
<ol><li>아래 단계에 따라 전체 준비를 수행하십시오.<ol><li>en-bloc 샘플을 일반적으로 탈수에 사용되는 폼 패드에 놓습니다. 이 단계와 다음 단계를 위해 최대 팁 크기가 6mm 인 20x 현미경 배율과 두 개의 미세 수술 무 외상성 겸자를 사용하십시오.</li>
		<li>폼 패드에 샘플을 조립하십시오. 올바른 해부학 적 위치에서 샘플을 재구성하십시오. 십이지장의 구강 및 구강 부분을 평평하게하여 부드러운 움직임을 수행하십시오.</li>
		<li>십이지장 유두에서 움직임을 시작하고 외상성 집게를 사용하여 절삭 날로 계속하십시오. 십이지장의 구강 부분에서만 발생하는 위장의 흰색 펄프 내용물을 부드럽게하십시오. 가능한 담관 회전을 배제하기 위해 십이지장의 구강 및 구강 부분을 식별해야합니다.</li>
		<li>담관의 해부를 시작하기 위해 간 조직의 큰 잔해를 잘라냅니다.</li>
	</ol></li>
	<li>최종 격리를 수행합니다.<ol><li>남은 간 조직을 거품 매트의 모공에 부드럽게 누릅니다. 긁는 움직임이 담관 시스템에서 시작하여 간 경계로 이어지는지 확인하십시오.</li>
		<li>다양한 방향으로 몇 번 긁은 후 샘플을 폼 매트의 더 깨끗한 위치로 옮깁니다. 백그라운드에서 덜 압착된 간 조직의 이점을 활용하여 EBDS와 원치 않는 세포 간의 최상의 분화를 위한 보기를 최적화합니다. 간 조직이 아무것도 또는 가능한 한 적게 남을 때까지 담관에서 간 조직을 긁어냅니다.</li>
		<li>격리 된 EBDS가 남아있을 때까지 간십이지장 인대를 처리하십시오. 간동맥, 문맥 및 작은 잔해와 같은 인대 내 혈관을 제거합니다. 이 섬세한 필라멘트를 부드럽게 당기고 세심한주의를 기울여 왼쪽 측면으로 제거하십시오. 이 해부 단계는 간 조직을 이전에 제거하는 동안 의도하지 않게 또는 부분적으로 완료되어 결국 동일한 결과를 초래합니다. 참고: 혈관은 십이지장 유두의 약 3-5mm 경구로 흰색의 매우 섬세한 필라멘트로 나오고 왼쪽 측면에서 간십이지장 인대에 합류하여 담관과 함께 글리소니아 트라이어드에 축적됩니다. 이 단계가 완료되면 최종 샘플이 완전히 분리됩니다. 기록이 필요한 경우 담관 구조를 해부학적 위치로 구성한 후 이미지를 캡처할 수 있습니다(그림 1). 폼 매트에서 마지막 준비 단계를 수행하는 것은 샘플이 작업 필드의 표면에 많이 달라붙지 않기 때문에 권장됩니다. 모공이 젖 으면 담관이 공중에 떠 있거나 떠 있습니다. 샘플을 이동할 때 작업 천에 준비할 때처럼 단단히 달라붙지 않아 샘플을 이동하는 동안 찢어지지 않습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>6. 조직 학적 분석을위한 준비
<ol><li>분리 된 샘플을 해부 후 가능한 한 빨리 완충 용액, 특수 배지 또는 포르말린 함유 정착액 ( 재료 표 참조)에 넣으십시오.</li>
	<li>계획된 추가 처리 단계에 따라 적합한 스토리지 솔루션을 선택했습니다. 주의 : 포르말린 함유 정착액은 급성 독성, 부식성 및 다양한 건강 위험 때문에 통풍구 아래에서만 사용하십시오. 참고: 제시된 연구에서 EBDS 샘플은 파라포름알데히드에 삽입되고 탈수되고 파라핀에 매립되었습니다. 그들은 실온에서 보관되고 절단되기 전에 냉각되었습니다. 온난화 캐비닛에서, 2 μm 슬라이스를 밤새 보관하고, 통상적인 헤마톡실린 및 에오신4 를 사용하여 염색하였다( 재료 표 참조).</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

이 기사는 안락사된 신생아 마우스의 EBDS를 제거하기 위한 새로운 외과적 접근법의 생성 및 검증을 보고하고 논의했습니다. 현미경 및 조직학적 결과는 이 접근법이 EBD를 신속하게 감지하고 신생아 마우스에서도 덕트 가장자리 근처에서 해부한다는 것을 보여줍니다. 설명 된 프로토콜에는 수술 도구와 20 배 배율의 현미경 만 필요합니다. 또한 이 접근 방식을 통해 전체 EBDS를 격리할 수 있습니다. 이 기술은 매우 효율적이고 간단하며 복제가 간단합니다.
담도 폐쇄증, PSC 및 PBC와 같은 담관 질환의 연구를 위해 전체 담관 시스템의 기계적 추출이 자주 필요합니다. 크기가 작기 때문에, 특히 신생아의 경우 해부, 처리 및 분석이 어렵습니다. 생후 1일 된 신생아 마우스 EBD의 간외 유관 세포의 분리는 이미 확립되어 있지만, 이 방법은 어려운 것으로 설명되었습니다. 일반적으로이 절차를 처음 접하는 개인은 해부 기술과 작은 담관 5의 정화에 대한 기술적 문제로 인해 어려움을<sup ...

담도 폐쇄증, 원발성 경화성 담관염(PSC) 및 원발성 담즙성 담관염(PBC)과 같은 담관병증의 기원과 진행은 알려지지않았거나 불완전합니다1,2. 이러한 질병의 기원과 진행에 대한 제한된 이해는 치료 옵션의 부족으로 이어집니다3. 신생아 담관 장애를 연구하는 데 가장 어려운 장애물은 병태생리학에 대한 분자적 이해를 얻는 것입니다. 분자 병리학을 더 잘 이해하기 위한 필수 열쇠 중 하나는 영향을 받은 조직을 최대한 관찰하는 것입니다. 담도 폐쇄증4의 잠재적 인 바이러스 병인을 관찰하는 것과 같은 연구 간의 비교 가능성 및 불일치 감소를 피하기 위해, 수행 된 해부 기술의 최상의 준비 및 공유가 필요합니다. 표적 조직의 순수한 준비는 나중에 현미경 조사 또는 세포 및 3D 오가노이드 배양 육종에 필요합니다. 그러나 쥐 신생아 장애에서 조직 샘플은 드물고 크기가 매우 작기 때문에 소량 만 발생합니다. 담관 장애와 관련하여 쥐 신생아에서 담관을 깨끗하게 준비하는 데 어려움이 설명되었습니다5. 신생아 발달 단계로 인해 조직 분화가 지나치게 진행되지 않아 성인 샘플 준비에 비해 준비가 복잡해지고 어려움이 증가합니다. 따라서 운영 작업 그룹은 신생아 마우스 모델에서 EBDS를 준비하기 위한 새로운 전략을 조사했습니다. 본 연구에서이 기술은 효율적입니다각 샘플의 해부.
담관 시스템은 간에서 발생하는 오른쪽 상복부에 복강 내 배치됩니다. 담낭은 간 우엽의 내장 표면 아래에 있습니다. 담관은 문맥 및 간동맥과 함께 간십이지장 인대에 내장되어 있습니다. 간과 십이지장을 직접 연결하고 담즙액을 십이지장6으로 배출합니다. 해부학 적으로 담관은 오른쪽 및 왼쪽 간관, 총 간관, 낭성 관 및 낭성 관과 총 간관의 합류에 의해 형성되는 담관7로 나뉩니다. 이것은 결국 담액과 타액을 췌관에서 Vater의 팽대부를 통해 십이지장으로 비웁니다.
담관 세포는 담관 내 및 간외로 늘어서 있으며 담즙 생성과 항상성을 돕는 복잡한 해부학 적 틈새에 거주합니다8. 담액은 이러한 특수 상피 세포를 매일 고농도로 통과합니다. 특히, HCO3-우산 유지는 담즙산 독성으로부터 보호하기 위해 매우중요하다9. 담관 세포는 예를 들어 내강 미생물10에 대한 간 담도계의 첫 번째 방어선입니다. 독성 공격에 대한 담관 세포의 방어 효능은 유전 적 소인에 의해 약화 될 수 있습니다. 독성 과부하는 손상과 파괴를 유발하므로 담관 병증을 유발할 수 있습니다. 더욱이, 발달중인 담관은 모든 자기 보호 메커니즘을 완전히 할 수 없으며, 신생아 담관11에서 환경 독소에 대한 더 높은 감수성을 유도합니다.

<table><tbody><tr><td>탈수제로 사용되는</td> <td>2-프로판올</td><td>CHEMSOLUTE</td><td>11365000</td></tr><tr><td>30 G canula</td><td>B Braun/Sterican, Melsungen Germany</td><td>4656300</td> 샘플 에어 벤트 C + P M&ouml<td>의 수화를 위한 캐뉼라</td></tr><tr><td></td><td>; 벨시스템 GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany</td><td>Tec-Ononmic AZ 1200</td><td>에어 벤트의 사용은 포르말린 함유 고정제의 흡입을 방지하는 데 도움이 됩니다</td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia Braun</td><td>B Braun, Melsungen, Germany</td><td>2351744</td><td>식염수; 용기: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, 멸균</td></tr><tr><td>더 큰 미세 수술 겸자</td><td>DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland</td><td>FD253R</td><td>스트레이트, 180 mm (7"), 플랫폼 팁, 원형 핸들, 너비: 0,800 mm, 다이아몬드 분진 코팅, 비멸균, 관찰을 위한 재사용 가능한 옵션 도구 및 최종 준비를 제외한 모든 준비 단계; 복막의 피부를 나누는</td></tr><tr><td>카메라 " 스마트캠 5" &nbsp;</td><td>Basler and Vision Engineering, Send, 영국</td><td>EVC131A</td><td>옵션 Lynx Exo 카메라 모듈: 센서 유형: CMOS, 해상도 2560 x 1920 픽셀, 센서 크기: 1/2"; 비디오 제작 및 기술 평가에 사용됩니다</td></tr>. 탈<tr><td>수 기계/Citadel 2000 조직 처리기</td><td>Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany</td><td>12612613</td><td>자동 탈수, 짧은 프로그램 (약 4.8시간)에 사용됩니다</td></tr>. 탈<tr><td>수 스폰지&nbsp;</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>TT56.1</td><td>스폰지는 최종 해부 단계를 위한 것이며, 인치당 최소 기공 크기가 60 기공인 다른 스폰지/폼 패드도 적합합니다. &nbsp; 임베딩 카세트 당 두 개의 폼 패드를 사용하여 샘플을 아래와 위에서 커버하여 임베딩 카세트</td></tr><tr><td>Dulbecco&acute의 천공을 통해 미끄러지는 것을 방지하는 것이 권장됩니다. s 포스팟 완충 식염수(PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>급성&급성; t 함유 칼듐 또는 마그네슘, 500 mL</td></tr><tr><td>임베딩 카세트</td><td>Engelbrecht GmbH, Ederm&uuml; nde, Germany</td><td>17990</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td><td>41-6660-00</td><td>염색 용액, 바로 사용 가능한</td></tr><tr><td>Fine Scissors CeramaCut</td><td>FST, 하이델베르크 독일</td><td>14959-09</td><td>팁: Sharp-Sharp, 합금 / 재질: 세라믹 코팅 스테인리스강, 톱니 모양:, 예; 특징 : CeramaCut, 팁 모양 : 스트레이트, 절삭 날 : 22mm, 길이 : 9cm; 피부 절개, 복막 창 절개</td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>FST, 하이델베르크 독일</td><td>11051-10</td><td>길이 : 10cm, 팁 모양 : 곡선, 톱니 모양, 팁 너비 : 0.8mm, 팁 크기 : 0.8 x 0.7 mm, 합금 / 재질 : 스테인레스 스틸</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td><td>41-5130-00</td><td>염색 용액, 사용 준비 완료</td></tr><tr><td>Highresolotion microscope</td><td>Vision Engineering, 영국 보내기</td><td>에보503&nbsp;</td><td>최대 60배 확대 가능, 6배에서 20배 확대만 사용되었습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus Optical CO, Ltd., 함부르크, 독일</td><td>BX60F5</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 유리</td><td>Marienfeld, Lauda-K&ouml; nigshofen, 독일</td><td>101244</td><td>폭 60mm, SCHOTT D 263 유리</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td>로 제작 <td>R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany</td><td>03-0060</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica, Nu&szlig; loch, 독일</td><td>SM2010R</td><td>절편용 도구(2 &마이크로; m-슬라이스)&nbsp;</td></tr><tr><td>Omnifix-F 1 mL 주사기</td><td>B Braun, Melsungen, Germany</td><td>9161406V</td><td>주사기(캐뉼라</td></tr> 제외) <tr><td>Sakura</td><td>Finetec, Torrance, USA</td><td>4511</td><td>Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, DMSO</td></tr><tr><td>파라핀 제외 임베딩 머신</td><td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td><td>TES 99</td><td>이 연구에 사용된 임베딩 기계에는 TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600의 세 가지 개별 모듈이 포함되어 있습니다. 검체는 탈수 직후 파라핀에 삽입해야 하며, 냉장고의 수축 및 습기 가능성으로 인해 냉장고에 중간 보관해서는 안 됩니다.</td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>Morphisto</td><td>1176201000</td>간 <td>검체의 경우 2 mL Eppendorf conical tube에 1 mL 부분 표본을 준비하고, 간외 담관 검체의 경우 1 mL Eppendorf conical Tube에 0.5 mL 부분 표본을 준비합니다. PBS ph 7.4&nbsp에서 4%;</td></tr><tr><td>작은 미세수술용 집게&nbsp;</td><td>EPM(Erich Pfitzer Medizintechnik), B&uuml; tthard, 바이에른, 독일</td><td>(00)165</td><td>라운드 핸들, 스트레이트, 0.3mm 팁, 관찰 및 준비의 모든 단계용 도구, 최종 준비에 특히 유용</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 통치자</td><td>Agntho의 AB, Liding&ouml;, 스웨덴</td><td>30085-15</td><td>150mm 미터법 및 인치 졸업식</td></tr><tr><td>수술용 가위 &ndash; 참수를 위한 날카롭고 뭉툭</td>한 <td>FST, 하이델베르크 독일</td><td>14001-14</td><td>참수 장치</td></tr><tr>온<td>난화 캐비닛</td><td>Haraeus, Hanau, Germany</td><td>T 6060</td><td>얇게 썬 샘플은 현미경 슬라이드에 샘플의 부착을 보장하기 위해 보온 캐비닛에 보관해야 합니다</td></tr></tbody></table>.

9 일 된 마우스 신생아의 간외 담관 및 담낭 박리

Extrahepatic Bile Duct and Gall Bladder Dissection in Nine-Day-Old Mouse Neonates

쥐 신생아 담관의 해부는 어려운 것으로 묘사되었습니다. 설명 된 표준 수술 절차의 주요 목적은 준비 중에 담관을 손상시키지 않고 마우스 신생아에서 간외 담관 (EBD)을 분리하는 것입니다. 담관 세포 세포주와 비교하여 예외적으로 가까운 준비 및 전체 간외 담관 시스템 (EBDS)의 수확으로 인해 설명 된 접근법은 담도 폐쇄증과 같은 신생아 담관 장애의 동물 모델을 연구하는 데 매우 유용합니다. 안락사 후 복강에 접근하고 담관 시스템, 십이지장 및 간을 독특한 En-bloc-Reclause (EbR)로 추출했습니다. 추출된 샘플을 폼 매트 위에 놓고 EBD를 오염된 세포에서 해부하여 필요한 접촉 없이 외상으로 제거합니다. 전체 EBDS의 해부는이 방법의 중요한 이점입니다. 담관 조직의 크기와 양이 작기 때문에주의를 기울여야합니다. 설명 된 기술을 사용하면 담관 세포에 손상이 없습니다. 또한, 기술의 순도는 재현 가능하다 (n = 10). 따라서 최적으로 비교 가능한 샘플을 수확 할 수 있습니다. 또한 담관 조직에는 담즙 조직이 손상되지 않는데, 이는 준비 중에 담관 시스템과의 접촉을 피할 수 있기 때문에 담낭 내부에 담액이 남습니다. 가장 중요한 것은 최종 담낭 및 담관 박리를 수행하는 동안 외상성 미세 도구를 압박하지 않고 담관의 약간 측면에서만 사용했습니다. 이것은 깨끗하고 손상되지 않은 샘플의 핵심이며 추가 조직 학적 조사 또는 담관 세포의 분리에 필수적입니다. 요약하자면, 설명된 혁신적인 해부 기술을 통해 필요한 장비를 갖춘 특히 경험이 없는 작업자가 EBDS를 가능한 한 깨끗하게 격리할 수 있습니다.

도 1A 는 뮤린 신생아의 EBDS를 보여주며, 이는 기술된 기술로 해부되었다. 현미경으로 볼 때 더 이상 간 조직이 보이지 않습니다. 간 조직은 프로토콜의 최종 분리 단계에서 제거되었으며 색상 및 일관성과 관련하여 담관 조직과 쉽게 구별 될 수 있습니다. 그림 1B 는 밀리미터 스케일과 비교하여 분리된 샘플을 보여줍니다. EBD의 길이(담낭에서 십이지장 유두까지 측정)는 10mm 미만입니다. 매우 섬세한 Ductus choledochus의 직경은 0.05-0.2 mm로 다양했습니다. 그림 2 는 열린 내강을 가진 EBDS의 세로 섹션의 헤 마톡실린-에오신 염색을 보여줍니다. 담관 세포는 내강을 단층으로 둘러싸고 더 어둡게 염색 될 수 있습니다. 현미경 검사는 20x 배율을 사용하여 수행하였다. 그림은 설명된 해부 프로토콜을 사용하면 작업자가 신생아 마우스에서도 덕트 가...

쥐 신생아 담관 장애를 관찰하려면 손상되지 않은 담관과 효율적인 준비가 필요합니다. 따라서 쥐 신생아에서 전체 간외 담관 시스템을 분리하기위한 새로운 접근법이 담관의 완전성을 유지하면서 성공적으로 개발되었습니다.

The dissection of murine neonatal bile ducts has been described as difficult. The main aim of the described standard operating procedure is the isolation ...

간외 담즙 시스템을 평가하는 많은 보고서에서 샘플을 얻었지만 어떻게 얻었는지는 보고하지 않아 비교 가능성에 대한 문제가 제기되었습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 전체 간외 담즙 시스템을 해부 할 수 있고 오염 세포를 무 외상으로 제거 할 수 있다는 것입니다. 우리의 해부 프로토콜은 일반적으로 간외 담도 시스템의 해부를 목표로하는 쥐 신생아 담관 장애에 대한 실험적 접근법에 적용될 수 있습니다.예를 들어, 십이지장에 부착 된 위를 떠나는 것과 같은 프로토콜의 일부 기능은 위장에 의해 표현 된 부분적으로 소화 된 우유에 의한 올바른 방향을 허용하는 십이지장 폐쇄증 연구에 유용 할 수 있습니다. 처음에는 기술이 훈련에 약간의 시간이 필요할 수 있습니다. 단계별 접근 방식을 연습하고 따르면 속도와 결과가 향상됩니다.시작하려면 소독 및 고압 멸균 된기구를 작업 테이블 옆의 멸균 표면에 놓습니다. 복막을 자른 후 왼쪽 정면 겨드랑이 선을 따라 참수 위치로 절단을 확장하십시오. 외상성 집게로 왼쪽에서 오른쪽으로 피부를 제거하십시오.현미경으로 비장을 둘러싼 복막을 잡으십시오. 복막이 텐트와 같은 구조와 비슷할 때까지 부드럽게 들어 올리고 중앙에 1 밀리미터의 구멍을 자릅니다. 복막 텐트가 공기로 채워질 때까지 기다리십시오.아래쪽 갈비뼈, 양쪽 측면 복부 및 아래쪽 방광 영역으로 둘러싸인 창에서 복막을 잘라냅니다. 간, 담관 시스템, 위, 소장 및 결장에 대한 완전한 접근을 보장합니다. 두개골 복부 위치에서 xiphoid 과정을 조심스럽게 당겨 담낭과 담관을 검사하십시오.담관 시스템에서 담낭이 찢어 질 수있는 falciform 인대의 찢어짐을 피하십시오. 그런 다음 검상돌기의 당김을 해제합니다. 십이지장을 부드럽게 아래로 당겨 담관 시스템을 자유롭게합니다.그런 다음 담관 시스템을 십이지장에 연결하는 십이지장 유두를 식별하여 하부 En-bloc 동원을 수행하십시오. 유두의 오른쪽 측면으로 약 2 센티미터의 십이지장을 자릅니다. 그런 다음 유문 부위를 자릅니다.위의 내용물이 절단 위치와 십이지장 유두 사이의 유문 영역에 있는지 확인하십시오. 상부 En-bloc 동원을 수행하려면 검상돌기를 부드럽게 당기고 팔시 폼 인대에 접근하십시오. 담낭 사이의 falciform 인대를 통해 1 센티미터 절단하고 xiphoid 과정에 가깝게 만듭니다.식도, 하대 정맥, 흉부 대동맥 및 간의 맨 부분을 둘러싸고있는 모든 인대와 같은 간과 흉부 사이의 연결 구조를 잘라냅니다. 또한 등쪽에 남아있는 모든 조직 연결을 절단하십시오. 현미경 배율의 20배에서 En-bloc 샘플을 폼 패드에 놓습니다.샘플을 올바른 해부학 적 위치로 재구성하여 조립하십시오. 부드러운 움직임을 사용하여 십이지장의 구강 및 구강 부분을 평평하게하십시오. 외상성 집게를 사용하여 십이지장 유두에서 평평한 움직임을 시작하고 절삭 날로 계속하십시오.그런 다음 십이지장의 구강 부분에서 위의 흰색 펄프 내용물을 부드럽게하십시오. 가능한 담관 회전을 배제하기 위해 십이지장의 구강 및 구강 부분을 식별하십시오. 담관을 해부하기 전에 간 조직의 큰 잔해를 잘라냅니다.몇 번의 스크래핑 동작 후 샘플을 폼 매트의 더 깨끗한 위치로 옮깁니다. 백그라운드에서 덜 압착된 간 조직을 사용하여 EBDS와 원치 않는 세포 간의 구별을 위한 보기를 최적화합니다. 격리 된 EBDS가 남아있을 때까지 간십이지장 인대를 처리하십시오.십이지장 유두에서 약 3-5mm 떨어진 흰색의 매우 섬세한 필라멘트로 발생하는 간동맥과 문맥을 관찰하십시오. 조심스럽게 왼쪽 측면을 부드럽게 당겨이 섬세한 필라멘트를 제거하십시오. 긁는 움직임이 담관 시스템에서 시작하여 간 경계로 이어지는지 확인하십시오.이 프로토콜을 사용하여 EBDS는 9 일 된 쥐 신생아에서 해부되었습니다. 담낭에서 십이지장 유두까지 분리 된 EBDS의 길이는 10 밀리미터 미만이었고, 섬세한 덕트 콜레 도쿠스의 직경은 0.05에서 0.2 밀리미터까지 다양했다. 헤마톡실린 에오신 염색은 개방 내강으로 EBDS의 종방향 단면에서 수행하였다.담관 세포는 단층으로 내강을 둘러싸고 확인되었으며 더 어둡게 염색되었습니다. 연구원은 해부 및 주사 프로토콜과 같은 운영 기술을 공유하고 표준화하여 연구 및 결과의 비교 가능성과 신속한 유용성을 개선해야 합니다. 선행 해부는 세포 배양 오염의 감소를 초래하기 때문에 담관내 및 담관외 세포의 분리와 같은 조직학적 및 단일세포 접근법에 유리할 것이다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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공구 한정 담즙산 흡수 장애를 진단 및 생체 내 담즙산 수송을 측정한다. 살아있는 동물에서 혁신적인 접근 결합 양성자 (1H) - 플러스 불소 (F 19), 자기 공명 영상을 이용하는 것이 기재되어있다; 이 새로운 방법은 임상에서 담즙산 흡수 불량을 선별하는 병진 가능성이있다.

멀티 플루오르 담즙 산 및 사용<em&gt; 생체</em&gt; 자기 공명 영상은 측정하는 담즙 산 전송

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담도 폐쇄증 연구를 위한 만성 간 섬유증의 마우스 모델

정상 체온 생체 외 간 관류(NEVLP) 시스템이 마우스 간을 위해 만들어졌습니다. 이 시스템은 미세 수술에 대한 경험이 필요하지만 재현 가능한 관류 결과를 허용합니다. 마우스 간을 활용하는 능력은 새로운 관류액 첨가제를 식별하기 위한 분자 경로의 조사를 용이하게 하고 장기 복구에 중점을 둔 실험의 실행을 가능하게 합니다.

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9 일 된 마우스 신생아의 간외 담관 및 담낭 박리

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