칸디다 트로피칼리스 생물막에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 가용성 테트라졸륨 기반 환원 분석

이러한 시험관내, 96-웰-플레이트 기반 프로토콜은 칸디다 생물막에서 진균 세포의 대사 활성에 대한 새로운 항진균제에 대한 항체의 억제 효과를 시험하기 위해 사용될 수 있다. 다른 방법과 비교할 때, 이것은 칸디다 생물막의 발달에 대한 항체 또는 항진균제의 효과를 평가하기 위한 매우 민감하고 정확하며 처리량이 높고 재현 가능하며 사용자 친화적이며 비용 효율적인 기술입니다. 이 분석은 침습성 칸디다증의 중증도와 관련된 칸디다 생물막에 대한 백신 후보뿐만 아니라 새로운 약물 기반 또는 항체 기반 치료제의 효능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

이 방법은 상이한 진균 균주 또는 항체 공급원을 사용하여 상이한 환경에서 생물막 형성 또는 성숙 동안 새로운 항진균제 또는 항체의 효과를 시험하기 위해 적용될 수 있다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 일하는 박사 과정 연구원 인 Pankaj Chandley가 될 것입니다. 시작하려면 100 마이크로 리터의 칸디다 트로피칼리스 배양 물을 96 웰 마이크로 타이터 플레이트에 추가하십시오.

다중 채널 피펫을 사용하여 마지막 두 컬럼을 100마이크로리터의 RPMI 1640 MOPS 배지로만 채웁니다. 마이크로타이터 플레이트를 뚜껑과 알루미늄 호일로 덮고 고정 상태에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다. 다음날, 다중 채널 피펫을 사용하여 배지를 조심스럽게 흡인하십시오.

블로팅 시트에서 플레이트를 부드럽게 뒤집고 두드려 잔류 매체를 제거합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 200 마이크로리터의 1X PBS로 플레이트를 세척합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 PBS를 조심스럽게 흡입하고 PBS로 두 번 세척합니다.

과도한 PBS를 제거하려면 생물학적 안전 캐비닛 내부의 실온에서 30분 동안 플레이트를 자연 건조합니다. 멸균 RPMI 1640 MOPS 배지에서 열 불활성화 혈청 샘플의 연속 희석액을 준비합니다. 선택된 혈청 희석액 100 마이크로리터를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 첨가한다.

열 10에서 곰팡이 전용 양성 대조군에 대해 RPMI 1640 MOPS 배지만 추가합니다. 11번 컬럼의 모든 웰에 1-50 희석된 혈청을 추가하여 무곰팡이 플러스 혈청 음성 대조군으로 사용합니다. 플레이트를 뚜껑과 알루미늄 호일로 덮은 후 섭씨 37도에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.

다음 날, 다중 채널 피펫을 사용하여 혈청을 조심스럽게 흡인 한 후 거꾸로 된 플레이트를 부드럽게 두드려 잔류 혈청을 제거합니다. PBS 세척을 3회 반복하고, 플레이트를 생물학적 안전 캐비닛 내부의 실온에서 30분 동안 공기 건조시켜 임의의 과량의 PBS를 건조시켰다. 그런 다음 25 밀리그램의 XTT를 필터 멸균 된 링거 젖산 50 밀리리터에 녹입니다.

별도의 튜브에 10 밀리리터를 분취합니다. 알루미늄 호일로 덮고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 다음으로 8.6 밀리그램의 메나 디온을 5 밀리리터의 아세톤에 녹입니다.

그리고 100개의 개별 마이크로튜브에 50마이크로리터를 분배한 후 분취량을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. XTT 10 밀리리터를 취하고 1 마이크로 리터의 메나 디온을 추가하여 1 마이크로 몰 작업 용액을 얻습니다. 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰당 100마이크로리터의 XTT 메나디온 용액을 추가합니다.

다음으로, 플레이트를 뚜껑과 알루미늄 호일로 덮은 후, 어둠 속에서 섭씨 37도에서 2 시간 동안 플레이트를 배양한다. 마지막으로, 각 웰에서 80 마이크로 리터의 착색 된 상청액을 새로운 96 웰 플레이트로 옮기고 490 나노 미터에서 플레이트를 읽습니다. Sap2-parapsilosis 면역화 마우스의 혈청은 Sap2-albicans의 혈청에서 45%, Sap2-트로피칼리스 면역화된 마우스의 혈청에서 55%에 비해 미리 형성된 칸디다 트로피칼리스 생물막의 성숙을 65%까지 방지할 수 있습니다.

일반적으로 Sap2 면역 혈청에 의한 생물막 억제는 가짜 면역 혈청에 의한 것보다 훨씬 높았으며, 이는 사전 면역 혈청에서 16% 및 13%입니다. 생물막 억제는 PBS를 사용하고 혈청 대조군을 사용하지 않을 때 무시할 수 있는 수준에 가까웠습니다. 생물막의 파괴를 방지하기 위해 세척 단계를 수행하는 동안 최대한주의를 기울여야합니다.

XTT 용액은 사용 직전에 준비하고 즉시 플레이트에 추가해야합니다. 이 절차에 따라 사용자는 다양한 진균 균주를 사용하는 다양한 연구 환경에서 칸디다 생물막 형성 및 성숙 동안 새로운 항진균제, 백신 후보 또는 항체의 효과를 평가할 수 있습니다.