Name: 칸디다 트로피칼리스 생물막에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 가용성 테트라졸륨 기반 환원 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 학습하세요 Candida tropicalis 생물막 대사 활성 평가를 위한 XTT 환원 분석법입니다. 96웰 플레이트 기반 고감도 고처리량 방법으로 항체 및 항진균제 효능을 정확하게 측정할 수 있습니다.

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이 연구는 Ramalingaswami 보조금 DBT-843-BIO (인도 정부 생명 공학부) 및 조기 경력 연구 상 SER-1058-BIO (인도 정부 과학 및 공학 연구위원회)의 지원을 받았습니다. 저자는 PC에 대한 ICMR-JRF 보조금과 PS에 대한 DBT-JRF 보조금을 인정합니다. 저자는 SEM 기간 동안 Pradeep Singh Thakur 씨의 원고 및 기술 지원에 대한 제안에 대해 Ravikant Ranjan 박사에게 감사드립니다.

BALB/c 마우스는 IIT Roorkee의 Small Animal Facility에 보관되었습니다. 모든 동물은 25°C에서 12h:12h 빛:다크 주기로 유지되었고, 펠릿 식이 및 물 adlibitum이 제공되었다. 모든 동물 절차는 IIT Roorkee의 기관 동물 윤리위원회 (IAEC)의 승인을 받았습니다.
1. C. 트로피칼리스의 제조
알림: 곰팡이 칸디다 트로피칼리스는 위험 그룹 2 병원체에 속하며 BSL2 미생물로 분류됩니다. 칸디다 종으로 작업 할 때는 항상 인증 된 클래스 II 생물 안전 캐비닛을 사용하십시오. C. tropicalis 로 작업하는 동안 무균 및 멸균 기술을 연습하고이 병원체의 적절한 폐기를 위해 권장되는 생물 안전 절차를 따르십시오.
<ol><li>줄무늬 C. 트로피칼리스 (ATCC 750 균주)를 사부라우 덱스트로스(SAB) 한천 플레이트 상으로.</li>
	<li>SAB 한천 플레이트의 단일 콜로니를 SAB 배지 10mL가 포함된 멸균 50mL 원뿔형 튜브에 접종하여 C. tropicalis 의 하룻밤 성장 배양물을 준비합니다. 또는 C. tropicalis 의 냉동 글리세롤 스톡을 사용하고 100μL의 글리세롤 스톡을 50mL의 SAB 배지가 포함된 멸균 250mL 원추형 플라스크에 접종합니다.</li>
	<li>C. tropicalis 배양물을 오비탈 셰이커에서 30°C에서 180rpm으로 24-48시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>진균 배양물(대수상의 세포)을 2,150 × g 에서 21°C에서 15분 동안 원심분리한다.</li>
	<li>상청액을 버리고 50mL의 멸균 1x PBS를 펠릿에 추가합니다. 부드러운 와류로 멸균 된 1x PBS에서 펠릿을 세척하고 재현 탁하십시오.</li>
	<li>2,150 × g 에서 21°C에서 15분 동안 다시 원심분리한다. 상청액을 버리고 진균 펠릿을 멸균 1x PBS 10mL에 재현탁시킨다.</li>
	<li>혈구 측정기로 계산하여 세포의 농도를 계산하십시오.</li>
	<li>RPMI 1640 모르폴린프로판술폰산(MOPS) 배지에서 1.0 × 106 cells/mL의 최종 밀도로 진균 스톡을 준비합니다. 단계 1.6의 세포 현탁액을 즉시 사용하십시오. 알림: 하나의 96웰 플레이트를 설정하기 위해 필요한 총 곰팡이 스톡 부피는 10mL(100μL/웰)입니다. 필요에 따라 크기를 조정합니다.</li>
</ol>2. C. 트로피칼리스 생물막 형성
<ol><li>앞서 설명한 대로 96웰 평평한 바닥 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트에서 칸디다 생물막을 준비합니다(그림 1)28,29.</li>
	<li>100μL의 C. tropicalis 배양액(10개의6 개 세포/mL 스톡에서 추출, 위와 같이 준비)을 멀티채널 피펫을 사용하여 96웰 마이크로타이터 플레이트에 추가합니다(그림 2A). 마지막 두 열(11 및 12)을 곰팡이 세포를 추가하지 않고 '곰팡이 및 혈청 없음' 및 '곰팡이 및 혈청 없음' 음성 대조군으로 유지합니다. 컬럼 11과 12를 100μL의 RPMI 1640 MOPS 배지만으로 채웁니다.</li>
	<li>마이크로타이터 플레이트를 뚜껑과 알루미늄 호일로 덮습니다. 플레이트를 정지 조건 하에 37°C에서 24시간 동안 배양한다.</li>
	<li>다음날, 다중 채널 피펫을 사용하여 배지를 조심스럽게 흡인합니다 (생물막을 만지거나 방해하지 않음). 블로팅 시트의 거꾸로 된 위치에서 플레이트를 부드럽게 두드려 잔류 매체를 제거합니다.</li>
	<li>멀티채널 피펫을 사용하여 200μL의 1x PBS(웰당)로 플레이트를 세척합니다. 생물막이 파괴되지 않도록 우물의 측벽을 따라 PBS를 매우 부드럽게 첨가하십시오. 다중 채널 피펫을 사용하여 PBS를 조심스럽게 흡입합니다. PBS 세척을 2회 반복합니다(총 3회 세척).</li>
	<li>과도한 PBS를 제거하려면 생물학적 안전 캐비닛 내부의 실온에서 30분 동안 플레이트(뚜껑 제외)를 자연 건조합니다.</li>
</ol>3. 항체에 의한 생물막 처리
참고: 이제 항체에 의한 생물막 성숙의 억제를 평가하기 위해 생물막을 처리할 수 있습니다. 뮤린 혈청을 다클론 항체의 공급원으로 사용하였다. 가짜 면역화된 마우스와 함께 Sap2-면역화된 Sap2-면역화된 다른 그룹(Sap2-알비칸스, Sap2-트로피칼리스 및 Sap2-파라프실로증)을 역-궤도로 출혈시키고 혈청을 앞서19에 설명된 바와 같이 분리하였다. 항-Sap2 항체의 존재는 앞서19에 기재된 바와 같이 Sap2-특이적 ELISA를 사용하여 확인하였다.
<ol><li>억제 활성에서 보체의 역할을 배제하기 위해 사용하기 전에 30분 동안 56°C에서 혈청(다클론 항체 공급원)의 열 불활성화를 수행합니다. 혈청 희석을 하기 전에 혈청을 열 비활성화합니다. 참고: 가짜 면역화된 마우스, 전면역 마우스 및 Sap2-특이적 항체가 고갈된 혈청의 혈청을 추가 대조군으로 사용하십시오19. 항체-고갈된 혈청은 이전 연구19에 따라 제조되었다. 이 프로토콜에서 시험된 혈청에 대한 연속 희석물(1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1,600, 1:3,200, 1:6,400 및 1:12,800) 중에서, 생물막 성숙의 억제는 1:25, 1:50, 및 1:100에서 관찰되었다; 따라서 억제와 혈청 소비 사이의 균형을 맞추기 위해 1:50을 선택했습니다.</li>
	<li>멸균 RPMI 1640 MOPS 배지(1:50)에서 열 불활성화된 혈청 샘플의 연속 희석을 준비합니다. 생물막 성숙의 억제에 대해 시험될 모든 혈청 샘플에 대해 일반적인 혈청 희석(1:50)을 사용한다(30).</li>
	<li>선택된 혈청 희석액 100μL를 96웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 각 샘플에 대해 첨부된 레이아웃에 따라 혈청 희석액을 중복으로 추가합니다(그림 2B).<ol><li>열 10에서 혈청 희석액을 추가하지 마십시오. 곰팡이 전용 양성 대조군에 대해 RPMI 1640 MOPS 배지만 추가합니다. 참고: 열 10, G1-G8 및 H1-H8 행은 처음에 RPMI-MOPS에 진균 세포를 가졌습니다. 그러나 RPMI-MOPS는 24시간 후에도 열 10에 추가되었지만 G1-G8행은 PBS 대조군으로, H1-H8행은 24시간 후에도 무혈청 대조군으로 사용되었습니다.</li>
		<li>열 11에서 모든 웰에 1:50 희석된 혈청을 추가하여 무균 플러스 혈청 음성 대조군 역할을 합니다.</li>
		<li>열 12에서는 혈청 희석액을 우물에 첨가하지 마십시오. 이것을 곰팡이 없음 혈청 음성 대조군으로 유지하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>뚜껑과 알루미늄 호일로 판을 덮으십시오. 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션한다.</li>
</ol>4. 생물막 대사 활성 추정
<ol><li>다음날, 다중 채널 피펫을 사용하여 혈청을 조심스럽게 흡인합니다 (생물막을 만지거나 방해하지 않음). 블로팅 시트의 거꾸로 된 위치에서 플레이트를 부드럽게 두드려 잔류 혈청을 제거합니다.</li>
	<li>멀티채널 피펫을 사용하여 200μL의 1x PBS(웰당)로 플레이트를 세척하고 생물막이 파괴되지 않도록 웰의 측벽을 따라 PBS를 추가합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 PBS를 조심스럽게 흡입하고 PBS 세척을 2회 반복합니다(총 3회 세척). 플레이트(뚜껑 제외)를 실온에서 30분 동안 자연 건조시키고 생물학적 안전 캐비닛 내부에서 과도한 PBS를 건조시킵니다.</li>
	<li>XTT / 메나 디온의 제조 :<ol><li>XTT를 멸균 링거 젖산염에 0.5g/L 용액으로 준비합니다. 25mg의 XTT를 필터 멸균된 링거 젖산 50mL에 녹입니다. 알루미늄 호일로 덮인 별도의 튜브에 10mL를 분취하고 -80°C에서 보관합니다.</li>
		<li>메나디온을 10mM 스톡으로 준비합니다. 8.6mg의 메나디온을 5mL의 아세톤에 녹이고 50μL를 100개의 개별 마이크로튜브에 분배합니다. 분취량을 -80°C에서 보관하십시오.</li>
		<li>XTT 10mL를 취하고 1μL의 메나디온을 추가하여 사용 직전에 XTT/메나디온 용액을 준비하여 1μM 작업 용액을 얻습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰당 XTT/메나디온 용액 100μL를 추가합니다. 뚜껑과 알루미늄 호일로 판을 덮으십시오. 플레이트를 암실에서 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>각 웰에서 착색된 상청액 80μL를 새로운 96웰 플레이트로 옮깁니다. 490 nm에서 플레이트를 읽습니다.</li>
	<li>컬럼 10(곰팡이 전용 양성대조군)에서 웰의 흡광도 값의 평균을 계산하고, 이는 수학식 1을 이용하여 각 혈청 시료에 의한 생물막 억제율을 계산하기 위한 기준값으로 작용한다. 생물막 억제율 % = 100 - <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64425/64425eq01.jpg" style="margin: auto;">× 100 (1)</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

칸디다 종에 의한 곰팡이 감염은 전 세계적으로 높은 이환율 및 사망률과 관련이 있습니다. 침습성 곰팡이 감염의 위협이 증가함에 따라 생명을 위협하는 질병의 조기 관리가 필요합니다. 대부분의 칸디다 감염은 다양한 의료 기기에 부착되고 병원 환경에서 곰팡이 감염의 지속과 재발을 담당하는 생물막의 형성을 포함합니다31. 생물막은 효모 또는 균사 세포로 구성되며, 이들은 대부분의 종래의 항진균제에 대해 상당한 내성을 나타낸다32. 칸디다 생물막에 의한 항진균 내성은 항진균 침투 감소, 세포외 기질의 존재, 약물-유출 펌프의 과발현, 변경된 세포막 스테롤 조성, 느린 성장 및 공간적 이질성, 다양한 신호 경로의 활성화, 및 약물 내성 지속성 세포의 존재를 포함하는 여러 메커니즘에 기인합니다33,34. ...

전신 칸디다증은 전 세계적으로 높은 이환율 및 사망률과 관련된 병원 감염의 네 번째 주요 원인입니다. 전 세계적으로 전신성 칸디다증은 약 700,000명의 개인에게 영향을 미칩니다1. 칸디다 종, 즉 C. 알비칸스, C. 트로피칼리스, C. 파라프실라증, C. 글라브라타, 및 C. 아우리스는 침습성 칸디다 감염의 가장 흔한 원인입니다2. 칸디다 종은 생물막을 생성하는 기회 주의적 병원체입니다3. 생물막은 주로 칸디다 균병과 관련이 있으며, 칸디다 균은 생물막 형성을 유도하여 산화 및 삼투압 스트레스 조건을 견딜 수 있습니다4. 생물막은 독성 인자 및 세포벽 성분의 발현을 추가로 조절하고 외중합체 보호 매트릭스를 형성하여 칸디다가 다른 숙주 틈새에 적응하도록 돕습니다4. 생물막은 숙주 조직 및 의료 기구에 대한 효모 부착에 기여합니다5. 이와 같이, 생물막 형성은 효모에 대한 이점과 연관되는데, 이는 생물막 내의 효모 세포가 숙주면역 반응을 회피할 수 있기 때문이다6. 생물막 형성은 또한 항진균제의 작용으로부터 병원성 효모를 보호합니다5. 암포테리신 B에 대한 C. 알비칸스 생물막의 감수성 감소는 Pierce et al.7,8에 의해 입증되었습니다. 또한, 생물막은 플루코나졸에 대한 항진균성 약물 내성을 입증하여 전신 칸디다증의 효과적인 관리를 손상시킵니다 9,10.
미생물은 다양한 생물 및 비 생물 적 표면에 부착하는 본질적인 경향을 가지고있어 생물막 형성을 초래합니다. 이형 곰팡이 인 칸 디다 알비 칸스 (Candida albicans)는 효모 및 균사 형태로 존재하며, 그의 생물막 형성은 다양한 시험관 내 및 생체 내 모델 시스템11에서 특성화되었다. 생물막 형성의 단계는 기질에 대한 칸디다 세포의 부착, 필라멘트화, 증식, 및 생물막 성숙(11)을 포함한다. 처음에는 효모 형태의 C. albicans가 의료 기기 및 인체 조직을 포함한 기질에 부착 된 다음 C. albicans의 필라멘트 화 및 균사 형태로 증식하고 마지막으로 세포 외 기질11에 내장 된 생물막이 성숙합니다. 생물막 형성은 C. albicans의 발병 기전 메커니즘에 크게 기여합니다12. 칸디다 종은 약물 내성 생물막을 형성하여 박멸을 어렵게 만듭니다13. C. albicans 생물막 생성 집단의 작은 하위 집합은 항진균제 암포테리신 B 및 클로르헥시딘14에 대해 매우 내성이 있는 것으로 설명되었습니다. 참고로, 생물막의 효모 세포는 플랑크톤 단계 및 증식 단계14의 효모 세포에 비해 다제 요법에 대해 높은 내성을 나타냅니다. 생물막에 존재하는 효모 세포는 항진균제에 대해 매우 내성이 있으며, 이는 생물막에서 C. albicans의 생존에 기여한다고 제안되었습니다14. 이들 기존 세포는 돌연변이14가 아닌 C. albicans의 표현형 변이체인 것으로 보고되었다. 더욱이, "지속성 세포"로 알려진 칸디다 생물막의 세포는 고용량의 암포테리신-B 치료에 내성이 있고 칸디다 생존에 기여하여 고위험 개인에서 재발하는 전신 칸디다 감염의 큰 부담을 초래합니다15.
칸디다 균주에서 항진균제 내성이 증가함에 따라 새로운 항진균제 및 면역 요법에 대한 연구가 필요합니다. 위에서 언급 한 연구에서 분명히 알 수 있듯이 칸디다 생물막은 항진균제에 대한 감수성이 감소한 것으로 나타났습니다. 따라서, 칸디다 생물막 형성을 조절하기 위한 개선된 면역요법이 필요하다. 이전 연구에 따르면 CAGTA는 시험관 내16에서 C. albicans의 생물막 형성을 억제함으로써 전신 칸디다 감염에 대한 효과적인 보호를 제공 할 수 있습니다. 또 다른 연구에서는 C. albicans rAls3-N 단백질로 마우스를 면역화하면 시험관 내17에서 C. albicans 생물막 형성을 방해하는 높은 항체가를 유도한다고 보고했습니다. 항-Als3-N 항체는 또한 생물막으로부터 C. 알비칸스 분산에 억제 효과를 발휘하였다17. C. albicans를 기반으로 한 NDV-3A 백신은 현재 임상 시험 중이며 항 -NDV-3A 혈청도 C. auris 생물막 형성18을 감소시키는 것으로 밝혀졌습니다. 최근 연구에서는 전신 칸디다증의 쥐 모델에서 보호 메커니즘으로 Sap2- 항체에 의한 생물막 형성 억제를 확인했습니다19.
이 논문은 미리 형성된 칸디다 트로피칼리스 생물막에 대한 다양한 그룹의 Sap2 백신 접종 마우스에서 얻은 다클론 혈청에 존재하는 항원 특이적 항체의 효과를 평가하기 위한 자세한 시험관 내 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 이를 달성하기 위해 XTT 환원 분석을 기반으로 하는 방법이 실험실에서 최적화 및 개발되었으며, 이는 항체의 유무에 관계없이 빠르고 민감하며 처리량이 높은 방식으로 생물막 생존율을 측정할 수 있습니다.
XTT 분석은 세포 생존력, 세포 증식 및 세포 독성20의 지표로서 세포 대사 활성을 측정하는 데 사용됩니다. 이 비색 분석은 황색 테트라졸륨 염, 나트륨 3'-[1-(페닐아미노카르보닐)-3,4-테트라졸륨]-비스(4-메톡시-6-니트로)벤젠술폰산 수화물(XTT)을 대사 활성 세포에 의한 주황색 포르마잔 염료로 환원시키는 것을 기반으로 합니다. 생존 가능한 세포 만이 XTT를 감소시킬 수 있기 때문에, 감소 된 XTT 포르 마잔의 양은 색의 강도 및 세포 생존력에 비례한다. 형성된 포르마잔 염료는 수용성이며 플레이트 리더를 사용하여 직접 정량됩니다. 수용성 특성으로 인해 XTT 분석은 생물막 구조를 방해하지 않고 손상되지 않은 생물막을 연구하고 생물막 약물 감수성을 검사할 수 있습니다(21). 또한이 방법은 사용 용이성, 속도, 정확성, 높은 처리량 및 높은 재현성 7,22로 인해 칸디다 곰팡이 생존력 평가에서 구현됩니다.
XTT 감소 분석 외에도 생물막 양 측정을 위한 수많은 대체 기술이 확인되었습니다. 이들 중 일부에는 MTT 환원 분석, 크리스탈 바이올렛 염색, DNA 정량화, 정량적 PCR, 단백질 정량화, 건조 세포 중량 측정 및 생존 가능한 콜로니 계수의 사용이 포함됩니다. 이러한 절차는 시간 및 비용 요구 사항 측면에서 매우 다양합니다. Taff 등은 7개의 서로 다른 칸디다 생물막 정량 분석의 비교 분석을 수행했으며 XTT 분석이 C. albicans의 생물막23의 정량적 추정을 위한 가장 재현 가능하고 정확하며 효율적인 방법을 제공한다는 것을 발견했습니다. 크리스탈 바이올렛과 같은 염색 기술에는 특정 제한이 있습니다. 크리스탈 바이올렛 테스트는 크리스탈 바이올렛 염색 생물막 매트릭스 및 세포의 광학 밀도를 측정하여 간접적으로 생물막의 양을 결정합니다. 크리스탈 바이올렛 분석은 생물막 질량의 양호한 측정을 제공하지만, 미생물 세포 및 세포외 매트릭스(24) 모두를 염색하기 때문에 생물막 생존율의 척도를 제공하지 않는다. Dhale 등은 XTT 환원 분석이 크리스탈 바이올렛 분석25와 비교하여 생물막 생성을 검출하는 가장 민감하고 재현 가능하며 정확하고 효율적이며 구체적인 방법이라고 추가로 보고했습니다. 문헌 보고서에 따르면 XTT 분석은 CFU 계수 방법의 CFU/mL 매개변수와 잘 연관되어 있습니다. 그러나 XTT 분석에 비해 CFU 방법은 노동 집약적이며 느립니다26. 더욱이, 분리된 살아있는 세포의 분획은 초기 생물막 집단(27)을 대표하지 않을 수 있다. XTT 감소 분석이 생존력을 정량화하는 데 가장 적합한 옵션으로 보이지만 이 기술에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. XTT 방법은 하나의 곰팡이 균주와 관련된 비교에 유용하지만 다른 곰팡이 균주 및 종을 비교할 때 사용이 제한될 수 있습니다. 균주 간 비교는 상세한 표준화가 없을 때 어려울 수 있는데, 이는 상이한 균주가 상이한 능력21을 갖는 기질을 대사하기 때문이다.

<table><tbody><tr><td>15 mL 원뿔형 원심분리기 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>546021</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>-</td><td>실험실에서 준비</td>됨 <td>NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4:&nbsp; 0.72 g KH2PO4 : 0.12 g 물 500 mL. pH를 7.4로 조정</td></tr>, <tr><td>50mL 코니컬 원심분리기 튜브</td>, <td>BD Falcon</td><td>546041</td><td></td></tr>, <tr><td>96웰 마이크로타이터 플레이트</td>, <td>Nunc</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>, 일반</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Menadione</td><td>, Sigma</td><td>M5625</td><td></td></tr>, <tr><td>마이크로타이터 플레이트 리더</td><td>, 일반,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멀티채널 피펫 및 팁</td>, <td>일반</td><td></td>,<td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Tarson</td><td>460090</td><td></td></tr><tr><td>Ringers Lactate</td><td>-</td><td>실험실에서 준비:</td><td>염화나트륨 0.6g, 젖산나트륨 0.312g, 염화칼륨 0.035g, 염화칼슘 0.027g, 물 100mL. pH 7.0으로 조정&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 MOPS</td><td>Himedia</td><td>AT180</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud 덱스트로스 Agar</td><td>SRL</td><td>24613</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud 덱스트로스 브로스</td><td>SRL</td><td>24835</td><td></td></tr><tr><td>XTT&nbsp;</td><td>인비트로젠</td><td>X6493</td><td></td></tr></tbody></table>

칸디다 트로피칼리스 생물막에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 가용성 테트라졸륨 기반 환원 분석

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

칸디다 종은 전신 병원 감염의 네 번째로 흔한 원인입니다. 전신 또는 침습성 칸디다증은 종종 이식 된 장치 또는 카테터에 생물막 형성을 수반하며, 이는 독성 및 사망률 증가와 관련이 있습니다. 다른 칸디다 종에 의해 생성 된 생물막은 다양한 항진균제에 대해 향상된 내성을 나타냅니다. 따라서, 칸디다 생물막에 대한 효과적인 면역요법 또는 보조 치료법을 개발할 필요가 있다. 세포 면역의 역할은 항 칸디다 보호에서 잘 확립되어 있지만 체액 면역의 역할은 덜 연구되었습니다.
생물막 형성 및 성숙의 억제는 보호 항체의 주요 기능 중 하나이며, 칸디다 알비칸스 생식관 항체(CAGTA)는 C. 알비칸스의 시험관 내 성장 및 생물막 형성을 조기에 억제하는 것으로 나타났습니다. 이 논문은 C. tropicalis에 의해 형성된 생물막에 대한 항체의 역할을 평가하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜의 방법론은 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 C. tropicalis 생물막을 형성한 다음 항원 특이적 항체의 존재 또는 부재 하에서 배양한 다음 생물막에서 진균 세포의 대사 활성을 측정하기 위한 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-5-카르복사닐리드-2H-테트라졸륨(XTT) 분석을 포함합니다.
특이성은 Sap2-특이적 항체-고갈된 혈청을 포함하는 적절한 혈청 대조군을 사용하여 확인하였다. 상기 결과는 면역화된 동물의 혈청에 존재하는 항체가 시험관내에서 칸디다 생물막 성숙을 억제할 수 있음을 입증한다. 요약하면, 이 논문은 침습성 칸디다증 동안 생물막에 대한 새로운 면역 요법 및 시너지 또는 보조 치료법을 개발하는 데 있어 항체의 잠재력에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 이 시험관 내 프로토콜은 생물막에서 칸디다 종 세포의 대사 활성에 대한 잠재적 인 새로운 항진균 화합물의 효과를 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

칸디다 트로피칼리스 생물막은 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 성장시키고 도립 현미경을 사용하여 40x에서 이미징했습니다(그림 1A). 생물막을 크리스탈 바이올렛을 사용하여 추가로 염색하고 도립 현미경을 사용하여 40x에서 관찰했습니다 (그림 1B). 주사 전자 현미경은 C. tropicalis 생물막의 대표 이미지를 보여줍니다 (그림 1C). 생물막 억제 분석을 수행하기 위해, 레이아웃에 따라 시간 0에서 칸디다균의10 5 세포를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하였다(도 2A). 24시간 후, 플레이트를 세척하고, 혈청 샘플을 예비형성된 생물막에 첨가하였다. 파일럿 연구 및 이전에 발표된 보고서 30에 따라 Sap2 면역화 및 가짜 면역...

C. tropicalis에 의해 형성된 생물막에 대한 항체의 효과를 연구하기 위해 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-5-카르복사닐리드-2H-테트라졸륨(XTT) 환원 분석을 사용하는 96웰 마이크로타이터 플레이트 기반 프로토콜이 본원에 설명되어 있습니다. 이 시험관 내 프로토콜은 생물막에서 칸디다 종 세포의 대사 활성에 대한 잠재적 인 새로운 항진균 화합물의 효과를 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

Candida species are the fourth-most common cause of systemic nosocomial infections. Systemic or invasive candidiasis frequently involves biofilm formation ...

이러한 시험관내, 96-웰-플레이트 기반 프로토콜은 칸디다 생물막에서 진균 세포의 대사 활성에 대한 새로운 항진균제에 대한 항체의 억제 효과를 시험하기 위해 사용될 수 있다. 다른 방법과 비교할 때, 이것은 칸디다 생물막의 발달에 대한 항체 또는 항진균제의 효과를 평가하기 위한 매우 민감하고 정확하며 처리량이 높고 재현 가능하며 사용자 친화적이며 비용 효율적인 기술입니다. 이 분석은 침습성 칸디다증의 중증도와 관련된 칸디다 생물막에 대한 백신 후보뿐만 아니라 새로운 약물 기반 또는 항체 기반 치료제의 효능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.이 방법은 상이한 진균 균주 또는 항체 공급원을 사용하여 상이한 환경에서 생물막 형성 또는 성숙 동안 새로운 항진균제 또는 항체의 효과를 시험하기 위해 적용될 수 있다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 일하는 박사 과정 연구원 인 Pankaj Chandley가 될 것입니다. 시작하려면 100 마이크로 리터의 칸디다 트로피칼리스 배양 물을 96 웰 마이크로 타이터 플레이트에 추가하십시오.다중 채널 피펫을 사용하여 마지막 두 컬럼을 100마이크로리터의 RPMI 1640 MOPS 배지로만 채웁니다. 마이크로타이터 플레이트를 뚜껑과 알루미늄 호일로 덮고 고정 상태에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다. 다음날, 다중 채널 피펫을 사용하여 배지를 조심스럽게 흡인하십시오.블로팅 시트에서 플레이트를 부드럽게 뒤집고 두드려 잔류 매체를 제거합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 200 마이크로리터의 1X PBS로 플레이트를 세척합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 PBS를 조심스럽게 흡입하고 PBS로 두 번 세척합니다.과도한 PBS를 제거하려면 생물학적 안전 캐비닛 내부의 실온에서 30분 동안 플레이트를 자연 건조합니다. 멸균 RPMI 1640 MOPS 배지에서 열 불활성화 혈청 샘플의 연속 희석액을 준비합니다. 선택된 혈청 희석액 100 마이크로리터를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 첨가한다.열 10에서 곰팡이 전용 양성 대조군에 대해 RPMI 1640 MOPS 배지만 추가합니다. 11번 컬럼의 모든 웰에 1-50 희석된 혈청을 추가하여 무곰팡이 플러스 혈청 음성 대조군으로 사용합니다. 플레이트를 뚜껑과 알루미늄 호일로 덮은 후 섭씨 37도에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.다음 날, 다중 채널 피펫을 사용하여 혈청을 조심스럽게 흡인 한 후 거꾸로 된 플레이트를 부드럽게 두드려 잔류 혈청을 제거합니다. PBS 세척을 3회 반복하고, 플레이트를 생물학적 안전 캐비닛 내부의 실온에서 30분 동안 공기 건조시켜 임의의 과량의 PBS를 건조시켰다. 그런 다음 25 밀리그램의 XTT를 필터 멸균 된 링거 젖산 50 밀리리터에 녹입니다.별도의 튜브에 10 밀리리터를 분취합니다. 알루미늄 호일로 덮고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 다음으로 8.6 밀리그램의 메나 디온을 5 밀리리터의 아세톤에 녹입니다.그리고 100개의 개별 마이크로튜브에 50마이크로리터를 분배한 후 분취량을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. XTT 10 밀리리터를 취하고 1 마이크로 리터의 메나 디온을 추가하여 1 마이크로 몰 작업 용액을 얻습니다. 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰당 100마이크로리터의 XTT 메나디온 용액을 추가합니다.다음으로, 플레이트를 뚜껑과 알루미늄 호일로 덮은 후, 어둠 속에서 섭씨 37도에서 2 시간 동안 플레이트를 배양한다. 마지막으로, 각 웰에서 80 마이크로 리터의 착색 된 상청액을 새로운 96 웰 플레이트로 옮기고 490 나노 미터에서 플레이트를 읽습니다. Sap2-parapsilosis 면역화 마우스의 혈청은 Sap2-albicans의 혈청에서 45%, Sap2-트로피칼리스 면역화된 마우스의 혈청에서 55%에 비해 미리 형성된 칸디다 트로피칼리스 생물막의 성숙을 65%까지 방지할 수 있습니다.일반적으로 Sap2 면역 혈청에 의한 생물막 억제는 가짜 면역 혈청에 의한 것보다 훨씬 높았으며, 이는 사전 면역 혈청에서 16% 및 13%입니다. 생물막 억제는 PBS를 사용하고 혈청 대조군을 사용하지 않을 때 무시할 수 있는 수준에 가까웠습니다. 생물막의 파괴를 방지하기 위해 세척 단계를 수행하는 동안 최대한주의를 기울여야합니다.XTT 용액은 사용 직전에 준비하고 즉시 플레이트에 추가해야합니다. 이 절차에 따라 사용자는 다양한 진균 균주를 사용하는 다양한 연구 환경에서 칸디다 생물막 형성 및 성숙 동안 새로운 항진균제, 백신 후보 또는 항체의 효과를 평가할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 형성을위한 간단하고 신속하고 강력한 방법을...

모니터링 형성과 Antifungal 자화율 테스트를위한 96 자 Microtiter 플레이트 기반 방법 캔디다 albicans Biofilms

분석은 박테리아와 곰팡이의 초기 biofilm 형성을 측정하는 빠른 방법을 설명합니다. 이 방법은 미생물의 biofilm 형성에 대한 하층으로 microtiter 접시를 사용하고, biofilm은 크리스탈 바이올렛 스트레인을 사용하여 시각입니다. 분석도 초기 biofilm 형성에 대한 질적 양적 분석 또는를 제공합니다.

Microtiter 디시 Biofilm 형성 분석

우리의 3 차원 나노 biofilms 구성된 고밀도 microarray 플랫폼을...

높은 처리량 Antifungal 약물 검사를위한 칸디다 albicans Biofilm 칩 (CA BChip)

영양 배지에 박테리아 현탁액을 사용하는 것부터 시작하세요.서스펜션을 멀티웰 플레이트에 추가하고 인큐베이팅하세요.배지 내 영양분은 박테리아의 성장과 부착을 촉진합니다.부착된 박테리아는 다당류, 단백질, DNA로 이루어진 세포외 고합물질을 분비하여 바이오필름 층을 형성합니다.버퍼로 여러 번 세척해서 결합하지 않은 박테리아를 제거하세요.플레이트를 뒤집어 우물에서 잔류 액체가 제거되고 바이오필름이 건조되도록 합니다.바이오필름의 세포 성분을 보존하기 위해 고정제로 처리하세요.바이오필름의 음전하를 띤 세포외 고분자 성분에 결합하는 양이온 염료를 첨가합니다.버퍼로 세척하고 여러 번 반복해서 결합되지 않은 염료를 제거하세요.용매를 넣어 바이오필름에 결합된 염료를 방출합니다.플레이트 리더기를 사용해 방출된 염료의 색 강도를 박테리아가 바이오필름 형성을 나타내는 지표로 측정합니다.

양이온 염료 기반 분석법을 이용한 박테리아 바이오필름 형성 평가

출처: Tay, S. B. 외 조작된 쿼럼 소환 락토나제를 이용한 병원성 바이오필름의 항병원성 파괴.  J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 병원성 박테리아에서 바이오필름 생체량을 정량화하는 방법을 시연하며, 처리되지 않은 대조군과 쿼럼 소환 효소로 처리된 샘플을 비교합니다. 이 효소는 초기 배양 과정에서 박테리아의 신호를 방해하여 세포 부착을 감소시킵니다. 세척 후 추가 배양 후 대조 우물은 밀도가 높은 바이오필름을 형성하는 반면, 처리된 우물은 형성이 감소합니다. 양이온염료를 사용해 바이오필름을 염색하고, 흡수도를 측정하여 생체량을 평가합니다.

병원성 박테리아에서 효소 유도 바이오필름 억제의 정량화

출처: Bucher, T. 외 B. subtilis 바이오필름을 소분자 바이오필름 억제제 특성 모델로 연구하는 방법론. J. Vis. 경험 (2016).이 영상은 바이오필름 매트릭스 무결성이 세균의 에탄올 내성에 미치는 영향을 미처리된 및 억제제 파괴된 바이오필름의 군락 형성 단위를 비교하여 보여줍니다. 억제제 처리 샘플에서 감소된 CFU는 세포외 기질이 바이오필름 내장된 세포를 항균 스트레스로부터 보호하는 데 필수적임을 보여줍니다.

바이오필름 매트릭스 무결성 평가를 위한 에탄올 저항성 분석법

이 비디오는 곰팡이 생물막에 대한 항체의 효과를 연구하는 시험관 내 기술을 보여줍니다. 병원성 진균 Candida tropicalis는 aspartyl proteinase 2 (Sap2)를 분비하는 독성 인자를 분비하여 생물막 형성을 촉진합니다. 생물막 성숙을 억제하는 Sap2 특이적 항체를 함유한 열 불활성화 혈청을 도입하면 발색 분석을 사용하여 곰팡이 세포의 생존력을 평가합니다.

Candida tropicalis Biofilm에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 체외 분석

생물막 감염은 화학요법에 대한 내성이 높습니다. 단일 분석법으로 생물막의 복잡성을 파악할 수 없습니다. 대신, 보완적인 분석이 필요합니다. 우리는 생존력, 바이오매스 및 생물막 매트릭스에 대한 분석을 결합한 스크리닝 플랫폼(S. aureus를 위해 개발됨)을 제시합니다. 이를 통해 장기적인 화학 요법 효과 평가를 포함한 항생물막 약물 발견을 할 수 있습니다.

천연 화합물 라이브러리의 탐험에 적합 안티 바이오 필름 분석 실험의 플랫폼

이 프로토콜에서는 호스트 생리 적 조건 하에서 Candida albicans 에 biofilm 형성을 시각화 하는 사용자 지정 가능한 자동화 된 미세 장치를 사용 하 여를 설명 합니다.

Candida albicans 자동 미세 장치를 사용 하 여에서 Biofilm 형성의 시각화

항진균 성 화합물 및 추출 물 심사는 간단 하 고 융통성 있는 국물 microdilution 방법입니다.

심사에 생체 외에서 국물 Microdilution: 새로운 항진균 성 화합물을 감지 하는 쉽고 빠른 방법

학습하세요 Candida tropicalis 생물막 대사 활성 평가를 위한 XTT 환원 분석법입니다. 96웰 플레이트 기반 고감도 고처리량 방법으로 항체 및 항진균제 효능을 정확하게 측정할 수 있습니다.

칸디다 트로피칼리스 생물막에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 가용성 테트라졸륨 기반 환원 분석

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