Name: Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex 및 재발 발열 Borrelia의 Spirochetes 재배 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 배우세요 Borrelia burgdorferi와 재발 발열 Borrelia의 체외 배양 방법을 통해 감염 진단 및 병원성 연구에 활용하세요. 이 프로토콜은 느리게 자라는 spirochete 균주의 생존성을 확인하는 데 필수적인 기술을 제공합니다.

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이 연구는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회와 캐나다 라임병 재단(AB 및 VL), 스웨덴 연구 위원회(SB, M-LF 및 IN), TAČR GAMA 2 프로젝트 - "생물학 센터 CAS에서 응용 가능성 검증 2.0 지원"(TP01010022)(MG 및 NR) 및 체코 보건부 NV19-05-00191(MG 및 NR)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 그림 4의 이미지에 대해 S. Vranjes(2021, Rudenko lab)에게, 그림 5의 이미지에 대해 J. Thomas-Ebbett(2021, Lloyd lab)에게 감사드립니다. 이 분야에 기여한 모든 연구자들에게 감사드리며, 지면의 제약으로 인해 인용하지 못한 분들께 사과드립니다.

이해 상충은 선언되지 않았습니다.

박테리아의 실험실 배양은 연구의 발판입니다. 배양 능력에 의해 부여되는 심오한 이점은 매독의 병인인 스피로헤타인 Treponema pallidum을 배양하기 위한100년 이상의 투쟁에서 예시됩니다 44. Borrelia spirochetes도 문화에 도전하지만 문화는 가능합니다 23,24,34,44,45,46,47,48,49.</s...

Borrelia는 라임 보렐리오스(LB) 그룹, 재발열(RF) 그룹 및 파충류에 국한된 것처럼 보이는 덜 잘 특성화된 그룹의 세 가지 주요 분기군을 포함하는 스피로헤타 박테리아의 속입니다. Borrelia 분류학은 대부분의 다른 분류학적 그룹 1,2,3,4,5,6,7과 마찬가지로 게놈과 프로테옴 비교를 허용하는 분자 방법론의 출현과 함께 유동적입니다. LB 그룹(라임병 그룹이라고도 함)은 전통적으로 가장 특징적인 구성원인 Borrelia burgdorferi sensu stricto의 이름을 따서 Borrelia burgdorferi sensu lato라고 불렸습니다.  이 논문은 현재 가장 널리 사용되는 용어인 LB, RF 및 파충류 관련 그룹을 사용하고 LB 및 RF 그룹에 대한 배양 프로토콜을 설명합니다.
Spirochaetaceae 계통의 구성원에게 예상되는 바와 같이 Borrelia는 일반적으로 길이 20-30 μm, 너비 0.2-0.3 μm의 독특하고 길고 얇은 나선형 모양을 채택 할 수 있습니다. 그러나 Borrelia 세포는 매우 다형성이며 복잡한 세포 및 유전 구조의 결과로 배양 및 생체 내 1,8 모두에서 다른 많은 모양을 채택할 수 있습니다. 스피로헤탈 형태에서 평면 사인파 형태는 내막과 외막 사이의 주변세포질 공간에서 회전하는 축 방향 내편모충의 결과입니다. 이 구조는 세포가 숙주 조직과 상호 작용할 수 있도록 하는 단백질을 포함하는 외막과 함께 세포가 매우 운동성을 가질 수 있도록 합니다 9,10. 외막 단백질의 발현은 엄격하게 조절되며 숙주 조직 침습뿐만 아니라 숙주 면역계와의 상호 작용에도 영향을 미친다11. 이 복잡한 유전자 발현은 Borrelia 세포가 척추동물 숙주와 무척추동물 벡터의 매우 다른 환경 사이를 왕복할 수 있도록 합니다. Borrelia의 게놈은 원형 염색체가 아닌 선형 염색체로 구성된 원핵 생물 중에서 드뭅니다. 선형 염색체 외에도 Borrelia 종에는 7-21 개의 플라스미드가 포함되어 있으며 일부는 선형이고 일부는 원형입니다. 플라스미드는 숙주 적응 및 독성에 필요한 대부분의 유전자를 보유하고 있으며, 프로파지에서 유래한 원형 플라스미드는 스피로헤탈 세포 사이의 수평 유전자 흐름의 대부분을 담당하는 것으로 생각됩니다12,13. 숙주 적응에서의 역할과 일관되게, 라임 보렐리아증(Lyme borreliosis) 그룹의 일부, 아마도 많은 구성원 또는 전부가 배양에서 플라스미드를 잃는다14. 가장 잘 연구된 B. burgdorferi, B31의 "실험실 적응" 균주는 이 종의 야생 분리주에서 발견되는 9개의 플라스미드 중 7개만 가지고 있다15. 유사하게, B. garinii는 배양물16에서 플라스미드를 잃는다. 일부 연구에서는 RF종과 B. miyamotoi가 배양 시 플라스미드를 보유하는 것으로 나타났으나 14,17, 최근 연구에서는 장기간 체외 배양을 통해 플라스미드와 감염성이 변화된 것으로 나타났다18.
배양 기반 방법은 연구 및 임상 작업 모두에서 박테리아 감염의 실험실 검출을 위한 황금 표준으로 남아 있습니다14,17. 체액 또는 조직에서 병원체의 배양은 복제 병원체를 직접 감지하고 연구를위한 소스 자료를 제공합니다14,17. 이 프로토콜은 LB 그룹과 RF Borrelia 및 B. miyamotoi의 스피로헤타를 성공적으로 배양하는 데 필요한 방법론과 레시피를 보여줍니다. Borrelia spirochetes를 재배하기 위한 기본 배지는 오염된 원핵생물의 성장을 줄이기 위해 항생제를 사용하거나 사용하지 않는 Barbour-Stoenner-Kelly 배지(BSK-II 또는 상업적으로 이용 가능한 BSK-H)입니다. 이 매체는 원래 RF Borrelia19를 지원하는 데 사용된 매체에서 채택되었으며 Stoenner20과 Barbour21에 의해 추가로 수정되었습니다. 그 이후로 많은 변형이 개발되었으며, 각각은 성장, 감염성 및 병원성에 영향을 미칠 수 있는 박테리아 생리학에 영향을 미친다22. 이 배지는 확립된 배양균에서 스피로헤타의 성장을 안정적으로 지원하며, 진드기, 포유류, 임상 검체에서 스피로헤타를 분리하는 데 사용되어 왔다23. 보다 최근에 개발된 변형인 변형된 Kelly-Pettenkofer(MKP) 배지는 배양에 사용할 수 있는 샘플에 존재하는 스피로헤타의 수가23,24개 낮을 때 환경 샘플에서 새로운 Borrelia 분리주를 분리할 때 더 나은 분리 성공, 형태 및 운동성을 제공할 수 있습니다. 모든 경우에 재배의 성공 여부는 신선하게 준비된 배지와 적절한 재료의 사용에 크게 좌우됩니다. 모든 상업용 성분이 고품질 매체를 생산하는 것은 아닙니다. 접종된 배양물은 소량의 잔류 주변 산소의 존재 하에 통상적인 32-34°C 인큐베이터에서 진탕 없이 편리하게 인큐베이션될 수 있다. Borrelia spirochetes는 혐기성 세균이지만 본질적으로 산소 및 이산화탄소 농도의 변동에 노출되며 유전자 발현의 변화에 반응합니다26,27,28,29. 따라서 유전자 발현, 성장 및 기타 대사 연구는 산소 제어 인큐베이터 또는 혐기성 챔버를 사용하여 산소 및 이산화탄소 수준을 제어해야 합니다. 배양에서 배양은 암시야 현미경 또는 위상차 현미경을 사용하여 스피로헤타의 존재 여부를 매주 또는 더 자주 확인합니다. 배양 도말은 은 염색, 면역조직화학, 또는 형광 태그가 부착된 균주29,30을 사용하여 염색할 수 있습니다. PCR 후 DNA 시퀀싱은 Borrelia 종30,31,32,33을 검출하고 유전적으로 식별하거나 확인하는 민감하고 특이적인 방법입니다.
BSK-II에는 많은 사소한 변형이 존재하며 일부는 상업적으로 이용 가능합니다. 섹션 1에서 여기에 설명된 프로토콜은 Barbour(1984)21에서 채택되었습니다. 액체 MKP 배지는 보다 최근에 개발된 배지이며 섹션 2에 설명되어 있습니다. 이전에보고 된 프로토콜33,34에 따라 제조되며, BSK 배지와 유사하게 기본 배지 준비 및 완전 배지 준비의 두 단계로 구성됩니다. Borrelia 배양 배지는 섹션 3에 설명된 바와 같이 항생제를 사용하거나 사용하지 않고 제조할 수 있습니다. 항생제는 섹션 4에 설명된 대로 임상 또는 환경 샘플을 접종할 때 유입되는 오염 박테리아를 줄이는 역할을 합니다. 순수한 Borrelia sp. 배양액으로 접종하는 경우 항생제가 필요하지 않을 수 있습니다. 장기 Borrelia 주식을 만드는 것은 종종 중요하며 이를 위한 프로토콜은 섹션 5에 설명되어 있습니다. 섹션 6은 이러한 배지를 사용하여 임상 또는 환경 샘플에서 순수한 Borrelia sensu lato 클론을 분리하는 방법을 설명합니다. 가능한 여러 가지 접근법이 있습니다36; 아래는 효과적인 것으로 밝혀졌습니다. 이 프로토콜에 사용된 도금 매체는 BSK-II 도금 매체37 및 MKP 배지 34(토끼 혈청이 10%38로 증가)의 변형입니다.

<table><tbody><tr><td>1.7 mL 튜브</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td>표준 품목 - 어떤 공급업체든지</td></tr><tr><td>0.2&nbsp; &마이크로; m 멸균 주사기 필터&nbsp;</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>표준 품목 - 모든 공급 업체는</td></tr><tr><td>10 &micro; L 장벽 피펫 팁</td><td>Neptune</td><td>BT10XLS3</td><td>표준 품목 - 모든 공급업체가</td></tr><tr><td>10 mL 혈청학 피펫을 할 것입니다&nbsp;</td><td>Celltreat</td><td>229011B</td><td>표준 품목 - 모든 공급 업체는</td></tr><tr><td>1000 &micro; L 배리어 피펫 팁</td><td>Neptune</td><td>BT1000.96</td><td>표준 품목 - 모든 공급업체가</td></tr><tr><td>15 mL 튜브</td><td>Celltreat</td><td>188261</td><td>표준 품목을 수행합니다 - 모든 공급업체가</td></tr><tr><td>20 &micro를 수행합니다. L 장벽 피펫 팁</td><td>Neptune</td><td>BT20</td><td>표준 품목 - 모든 공급업체가</td></tr><tr><td>20 mL 멸균 주사기를 할 것입니다&nbsp;</td><td>BD</td><td>309661</td><td>표준 품목 - 모든 공급 업체는</td></tr><tr><td>200 &micro; L 배리어 피펫 팁</td><td>Neptune</td><td>BT200</td><td>표준 품목 - 모든 공급업체는</td></tr><tr><td>25mL 스크류 캡 배양 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-933C</td><td>표준 품목 - 모든 공급업체는</td></tr><tr><td>25mL 혈청학적 피펫</td><td>Celltreat</td><td>229025B</td><td>표준 품목 - 모든 공급업체는</td></tr><tr><td>3mL 멸균 주사기</td><td>BD</td><td>309657</td><td>표준 품목 - 모든 공급업체는</td></tr><tr><td>35% BSA를 수행합니다.&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A-7409</td><td>소스가 중요합니다 - 참고 사항</td></tr><tr><td>참조 5 mL 혈청학 피펫&nbsp;</td><td>Celltreat</td><td>229006B</td><td>표준 품목 - 모든 공급업체는</td></tr><tr><td>50 mL 튜브</td>를 할 것이고 <td>Celltreat</td><td>229421</td><td>표준 품목 - 어떤 공급업체는</td></tr><tr><td>6.5 ml MKP 유리관을 할 것입니다&nbsp;</td><td>Schott</td><td>Schott Nr. 26 135 115</td><td>표준 품목 - 모든 공급업체가</td></tr><tr><td>Amikacine</td><td>Sigma</td><td>PHR1654</td><td>표준 품목을 할 것입니다 - 어떤 공급업체가</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma</td><td>A9528-100MG</td><td>표준 품목을 할 것입니다 - 어떤 공급업체가</td></tr><tr><td>Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole</td><td>Sigma</td><td>PHR1126-1G</td><td>표준 품목을 할 것입니다 - 어떤 공급업체가</td></tr><tr><td>BBL 브루셀라 육수를 할 것입니다&nbsp;</td><td>BD</td><td>211088</td><td>표준 항목 - 모든 공급업체가</td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td>Labconco</td><td>302419100</td><td>표준 항목을 수행합니다 - 모든 공급업체가</td></tr><tr><td>혈액 채취 튜브 (노란색 상단 - ACD)</td>를 수행합니다. <td>Fisher Scientific</td><td>BD&nbsp; Vacutainer 유리 혈액 수집 튜브와 산성 시트레이트 덱스트로오스 (ACD)</td><td>표준 품목 - 모든 공급업체가</td></tr><tr><td>BSK-H 매체 [w 6% 토끼 세럼]</td>을 할 것입니다.<td>Darlynn biologicals</td><td>BB83-500</td><td>표준 품목 - 어떤 공급업체든지</td></tr><tr><td>원심분리기를 할 것입니다&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>모델 5430</td><td>표준 품목 - 모든 공급업체가</td></tr><tr><td>Citric acid TrisodiumSaltDihydrate</td><td>Sigma</td><td>C-8532 100 g</td><td>표준 품목 - 모든 공급업체가</td></tr><tr><td>CMRL</td><td>Gibco BRL</td><td>21540 500 mL</td><td>표준 품목 - 모든 공급업체가</td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>Gibco</td><td>21-510-018</td><td>표준 품목 - 모든 공급업체가</td></tr><tr><td>Cryogenic Tubes (Nalgene)</td><td>Fisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td>표준 품목 - 모든 공급업체는</td></tr><tr><td>100 mm &times; 25 mm</td><td>Sigma</td><td>P7741</td> 표준 품목을 사용하여 Deep Petri를 수행합니다. - <td>모든 공급업체는</td></tr><tr><td>디지털 인큐베이터</td><td>VWR</td><td>모델 1545</td><td>표준 품목을 수행합니다 - 모든 공급업체는</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ThermoFisher</td><td>D12345</td><td>표준 품목을 수행합니다 - 모든 공급업체는</td></tr><tr><td>필터 살균</td><td>을 위한 필터를 할 것입니다.밀리포어 0.22&mu; m GPExpressPLUS 멤브레인</td><td>SCGPU05RE</td><td>표준 품목 - 모든 공급업체가</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Difco BD</td><td>214340 500 g</td><td>표준 품목을 수행합니다 - 모든 공급업체가</td></tr><tr><td>Glass Culture Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>99449-20</td><td>표준 품목 - 모든 공급업체가</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G-7021 1 kg</td><td>표준 품목을 수행합니다 - 모든 공급업체가</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>을 수행합니다.표준 품목 - 모든 공급 업체는</td></tr><tr><td>Hemafuge (Hematocrit & 면역 혈액학 원심분리기 )</td><td>Labwissen</td><td>모델 3220</td><td>표준 품목 - 모든 공급업체가</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma를 수행합니다.</td><td>H-3784 100 g</td><td>표준 아이템 - 모든 공급업체는</td></tr><tr><td>N-아세틸글루코시민</td><td>시그마를 할 것입니다&nbsp;</td><td>A-3286 25 g</td><td>표준 아이템 - 어떤 공급업체든지</td></tr><tr><td>Neopeptone</td><td>Dipco를 할 것입니다. BD</td><td>211681 500 g</td><td>표준 품목 - 모든 공급업체가</td></tr><tr><td>Neubauer 혈구분석기</td><td>Sigma를 할 것입니다&nbsp;</td><td>Z359629</td><td>표준 품목 - 모든 공급업체가</td></tr><tr><td>위상차 현미경을 할 것입니다&nbsp;</td><td>Leitz</td><td></td><td>표준 품목 - 모든 공급 업체는</td></tr><tr><td>Phosphomycin</td><td>Sigma</td><td>P5396-1G</td><td>표준 품목을 수행합니다 - 모든 공급 업체는</td></tr><tr><td>Phosphomycine</td><td>Sigma</td><td>P5396</td><td>표준 품목을 수행합니다 - 모든 공급 업체는</td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Integra</td><td></td><td>표준 품목을 수행합니다 - 모든 공급 업체는</td></tr><tr><td>Precision Standard Balance</td><td>OHAUS</td><td>모델 TS200S</td><td>표준 품목을 수행합니다 - 모든 공급 업체는 모든 것을 수행합니다. 공급 업체는</td></tr><tr><td>Pyruvic acid (Na salt)</td> <td>Sigma</td><td>P-8574 25 g</td><td>표준 품목을 할 것입니다 - 모든 공급 업체는</td></tr><tr><td>토끼 세럼을</td> 할 것입니다.<td>Gibco</td><td>16-120-032</td><td>소스가 중요합니다&nbsp;</td></tr><tr><td>토끼 세럼&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R-4505&nbsp; 100mL</td><td>공급이 중요합니다&nbsp;</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma</td><td>R3501-1G</td><td>표준 품목 - 모든 공급업체가 할 것입니다</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Sigma</td><td>S-5761&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 500 g</td><td>표준 아이템 - 모든 공급업체가</td></tr><tr><td>Sufametaxazole을 할 것입니다&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>PHR1126</td><td>표준 아이템 - 어떤 공급업체든지</td></tr><tr><td>TC Yeastolate</td><td>Difco를 할 것입니다&nbsp; BD</td><td>255752 100 g</td><td>표준 품목 - 모든 공급 업체가</td></tr><tr><td>Pipettes VWR</td><td></td><td>470225-044</td><td>표준 품목을 수행합니다 - 모든 공급 업체가</td></tr><tr><td>Trimethoprim</td><td>Sigma</td><td>PHR1056</td><td>표준 품목을 수행합니다 - 모든 공급 업체가 수행합니다</td></tr></tbody></table>.

borrelia burgdorferi sensu lato complex 및 재발 발열 borrelia의 spirochetes 재배 방법

Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia

Borrelia는 B. burgdorferi sensu lato (sl)라고도 알려진 라임 보렐리 아증 (LB) 그룹의 세 그룹으로 구성되며 최근에는 Borreliella, 재발 열 (RF) 그룹 Borrelia 및 세 번째 파충류 관련 스피로 체타 그룹으로 재 분류되었습니다. 배양 기반 방법은 체액 또는 조직에서 병원체를 배양하여 복제 병원체를 직접 감지하고 연구를 위한 소스 자료를 제공하기 때문에 연구 및 임상 작업 모두에서 실험실 박테리아 감염 검출을 위한 황금 표준으로 남아 있습니다. Borrelia와 Borreliella spirochetes는 까다롭고 느리게 자라기 때문에 일반적으로 임상 목적으로 배양되지 않습니다. 그러나 연구에는 문화가 필요합니다. 이 프로토콜은 B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis 및 RFspirochetes, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis 및 B. miyamotoi. LB 및 RF 스피로헤타를 성장시키기 위한 기본 배지는 Barbour-Stoenner-Kelly(BSK-II 또는 BSK-H) 배지로, 기존 배양에서 스피로헤타의 성장을 안정적으로 지원합니다. 접종물에서 초기 스피로헤타 수가 적은 진드기 또는 숙주 유래 샘플에서 새로 분리된 Borrelia 분리물을 성장시킬 수 있으려면 변형된 Kelly-Pettenkofer(MKP) 배지가 선호됩니다. 이 배지는 또한 B. miyamotoi 의 성장을 지원합니다.RF 스피로헤타 재배의 성공 여부는 성분의 품질에 크게 좌우됩니다.

Borrelia 배양 배지 BSK 및 MKP 및 변종은 순차적으로 준비하고 멸균해야 하는 성분이 포함된 풍부한 배양 배지입니다. 올바르게 준비되면 BSK 배지는 빨간색-주황색이고 투명해야 합니다(그림 1). 온난화 후에도 지속되는 탁도와 강수량은 문제가있는 성분, 중간 생산 또는 오염을 나타냅니다. 이러한 매체는 폐기하는 것이 가장 좋습니다. 젤라틴이 BSK와 MKP에 첨가되면 냉장 보관시 배지가 젤라틴이됩니다. 온난화하면 약간 점성이 있지만 액체가됩니다.
순수한 Borrelia 문화의 성장은 배지의 탁도를 변화시키지 않습니다. 그러나 박테리아 배양 물, Borrelia 및 오염 물질의 성장은 pH 표시기의 결과로 중간 색상으로 변합니다. 다른 박테리아에 의한 과증식은 탁도와 응집된 물질을 생성합니다(그림 2).
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시험관 내 배양은 살아있는 박테리아의 존재에 대한 직접적인 검출 방법입니다. 이 프로토콜은 Borrelia burgdorferi sensu lato complex, 재발 열 Borrelia 종 및 Borrelia miyamotoi를 포함하여 다양한 Borrelia spirochetes의 배양 방법을 설명합니다. 이 종은 까다 롭고 느리게 자라지 만 배양 할 수 있습니다.

Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex 및 재발 발열 Borrelia의 Spirochetes 재배 방법

The Borrelia consists of three groups of species, those of the Lyme borreliosis (LB) group, also known as B. burgdorferi sensu lato (s.l.) and recently ...

Borrelia는 세 가지 주요 종류를 포함하는 스피로헤타 박테리아의 속입니다. 라임 보렐리오스 그룹, 재발열 그룹, 파충류에서 발견되는 덜 잘 특성화된 그룹. 많은 Borrelia 종은 병원성입니다.박테리아 배양은 감염 검출을 위한 황금 표준입니다. 이것은 연구와 임상 작업 모두에 해당됩니다. 체액과 조직에서 박테리아를 배양하면 박테리아가 생존 가능하고 복제할 수 있음을 확인할 수 있습니다.이 프로토콜은 스피로헤타, 재발 발열 보렐리아 및 보렐리아 미야모토이의 라임 보렐리오스 그룹을 성공적으로 배양하고 보존하는 데 필요한 방법론과 레시피를 보여줍니다. 이전에 분리된 종 및 균주의 배양뿐만 아니라 환경 또는 포유류 공급원으로부터 새로운 분리주 및 단클론 분리물을 위한 방법이 제공됩니다. 이 절차를 시연하는 것은 박사후 연구원 인 Marie-Line Faucillion과 Bergstrom Lab의 기술자 인 Ingela Nilsson, Lloyd Lab의 연구원 인 Anne Berthold, Rudenko Lab의 연구원 인 Maryna Golovchenko입니다.시작하려면 1리터의 Barbara-Stoner-Kelly 또는 BSK-II 배지를 준비하는 데 필요한 시약을 구하십시오. 물을 저어 비커에 BSA를 녹이는 것으로 시작하십시오. 그런 다음 모든 건조 화학 물질을 첨가하고 CMRL을 첨가하기 전에 용해시킵니다.배지의 pH를 7.6으로 조정합니다. 필요한 경우 1 몰 수산화 나트륨을 사용하십시오. 다음으로, 6-10%의 농도로 배지에 토끼 혈청을 첨가합니다.박테리아 성장이 강하지 않은 경우 배지에 2% 혈청에 다른 하나를 추가합니다.그런 다음 0.22 미크론 기공 필터를 사용하여 배지를 멸균합니다. 100 또는 400 밀리리터 부분 표본으로 배지의 주식을 동결하십시오. 재발 열 균주의 경우 100 밀리리터의 7 % 멸균 젤라틴을 BSK-II 배지 400 밀리리터에 첨가하십시오.표면과 모든 물질을 7 % 에탄올로 소독하고 즉시 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다. UV는 작업 시작 전에 5 분 동안 모든 비 생물학적 물질을 살균합니다. 배양을 시작하려면 인큐베이터에서 배지를 예열하십시오.그런 다음 글리세롤 스톡에서 해동 된 Borrelia 배양 물 1 밀리리터를 예열 된 BSK 배지 5-15 밀리리터에 첨가하십시오. 튜브를 닫기 전에 미세 또는 혐기성 분위기를 만들기 위해 튜브를 거의 완전히 채우십시오. 섭씨 37

cultivation-methods-spirochetes-from-borrelia-burgdorferi-sensu-lato

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

라임 질병 연구 조사는 종종 병원체 Borrelia burgdorferi, 일반적으로 몇 주 정도 소요 프로세스에 감염된 진드기의 생성을 필요로합니다. 여기 시간 이내에 수행할 수 있습니다 microinjection 기반 틱 감염 절차를 보여줍니다. 우리는 또한 진드기 이내 B. burgdorferi의 현장 지방화에 대한 immunofluorescence 방법을 보여줍니다.

틱 굿 내에서 빠른 전송과 라임 질병 병원균의 현지화을위한 방법

출처: Eggers, CH 라임병 스피로헤타 보 렐리아 부르크도르페리의 파지 매개 유전자 조작. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 항생제 내성 유전자를 운반하는 휴면 박테리오파지 DNA로 조작된 유전자 변형 보렐리아 부르그도르페리 배양의 준비를 보여줍니다. 항생제 선택 및 배양 후 화학적 유도제는 DNA 손상을 유발하여 내성 유전자를 포함하는 새로운 비리온의 절제, 복제 및 조립을 유도합니다. 두 번째 원심분리 및 재현탁 후, 성숙한 바이러스 입자를 포함하는 박테리아 세포는 다운스트림 적용을 위한 준비가 됩니다.

바이러스 입자 생산을 위한 Borrelia burgdorferi 배양의 준비 및 유도

Source: Berthold, A., et al. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp.(2022)This video demonstrates the cultivation of pathogenic spirochetes from infected skin tissue to model dermal infection. It highlights their localization in the dermis, interaction with the extracellular matrix, and survival during selective culture conditions.

Cultivation of Pathogenic Spirochetes to Investigate Skin Infection

라임 병은 북미에서 가장 일반적으로보고 된 벡터 매개 질병입니다. 원인 물질은 보렐리 아 burgdorferi는 Ixodid 진드기에 의해 전송 spirochete 박테리아입니다. 동물 모델에서 감염의 전송 및 검출은 우리가 여기에서 설명하는 진드기의 먹이의 사용에 최적화되어 있습니다.

라임 병 연구의 변속기 및 Xenodiagnosis에 대한 동물에 진드기의 먹이

중첩 된 PCR 틱 보렐 리아 burgdorferi, Lyme 질병의 원인이 되는 에이전트에 대 한 조사를 DNA 추출에 적용 될 수 있는 민감한, 특정, 그리고 간단한 기술입니다. 초기 PCR 실험 유전자 특정 뇌관을 사용 하 여 내부 뇌관을 사용 하 여 후속 반응에 대 한 템플릿 되 긴 amplicons 생성.

중첩된 한 PCR를 사용 하 여 틱에서 라임 질병 스피로, 보렐 리아 Burgdorferi, 감지

시험관 내 전사 분석은 Borreliella burgdorferi의 전사 조절 메커니즘을 해독할 수 있습니다. 이 프로토콜은 B. burgdorferi RNA 중합효소를 정제하고 시험관 내 전사 반응을 수행하는 단계를 설명합니다. 시험관 전사 분석을 사용하는 실험적 접근법은 활성 RNA 중합효소의 신뢰할 수 있는 정제 및 보관을 필요로 합니다.

Borreliella (Borrelia) burgdorferi의 필수 성분 In Vitro Transcription Assays

박테리아 세포 사이에서 DNA를 이동하는 박테리오파지의 능력은 박테리아 숙주의 유전자 조작에 효과적인 도구입니다. 여기에 제시된 것은 보렐리아 부르그도르페리의 박테리오파지인 φBB-1을 유도, 회수 및 사용하여 라임병 스피로체의 다른 균주 사이에서 이종 DNA를 형질도입하는 방법론입니다.

라임병 스피로체테 보렐리아 부르그도르페리의 파지 매개 유전자 조작

유럽과 북미에서 라임 보렐리아증을 유발하는 다양한 보렐리아 종의 여러 항원에 대해 유도된 IgG 및 IgM에 대한 혈청 샘플을 동시에 평가하는 비드 기반 다중 면역분석을 개발하기 위해 3채널 이중 리포터 형광 흐름 분석 시스템을 사용했습니다.

다중 혈청학적 검사에서 다양한 항체 등급의 동시 검출

이 기사에서는 임상 연구를 위해 인간을 유충 Ixodes scapularis 에 노출시키는 방법을 제시합니다. 이 기술은 비교적 간단하고 연구 지원자가 견딜 수 있으며 실험적 필요에 따라 수정할 수 있습니다. 인간 피험자를 대상으로 하는 이러한 연구는 해당 규제 당국이 승인한 임상 연구 프로토콜에 따라 수행되어야 합니다.

유충 Ixodes scapularis 진드기에 대한 인간의 실험적 노출을 위한 모델

우리는 활막의 급성 염증, 감염, 구조적 변화를 평가할 수 있는 인간 체외 트랜스웰 시스템을 개발했습니다.

기능과 구조가 보존된 체 외 인간 낙액 조직을 이용한 전임상 접속 모델

배우세요 Borrelia burgdorferi와 재발 발열 Borrelia의 체외 배양 방법을 통해 감염 진단 및 병원성 연구에 활용하세요. 이 프로토콜은 느리게 자라는 spirochete 균주의 생존성을 확인하는 데 필수적인 기술을 제공합니다.

Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex 및 재발 발열 Borrelia의 Spirochetes 재배 방법

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