Name: 탈세포화된 기관 이식편을 위한 저선량 감마선 멸균 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 배우세요 저선량 감마선 조사를 이용한 기관 이식편 멸균 프로토콜로 Oryctolagus cuniculus 기관의 특성을 보존하며 완전한 멸균을 달성하는 방법을 확인하세요.

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이 논문은 2018년 스페인 흉부외과 학회(Spanish Society of Thoracic Surgery)의 지원을 받아 국립 다중심 연구(National Multicentric Study)[Néstor J.Martínez-Hernández에게 수여된 180101번] 및 Instituto de Salud Carlos III의 PI16-01315[Manuel Mata-Roig에게 수여됨]의 지원을 받았습니다. CIBERER는 VI National R & D & I Plan 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Program, CIBER Actions 및 Instituto de Salud Carlos III의 지원을 받아 유럽 지역 개발 기금 (European Regional Development Fund)의 지원을 받고 있습니다.

실험 동물의 관리 및 사용에 대한 유럽 지침 20170/63/EU를 준수했으며 연구 프로토콜은 발렌시아 대학교 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(법률 86/609/EEC 및 214/1997 및 코드 2018/VSC/PEA/0122 스페인 발렌시아 정부).
1. 기관 탈세포화
참고: 탈세포화 방법은 다른 곳에서 보고된 바있다 20.
<ol><li>기증자 수컷 성인 뉴질랜드 백색 토끼(Oryctolagus cuniculus)를 체중 3.5-4.1kg과 133mg/kg 펜토바르비탈 나트륨으로 안락사시키고 가장자리 귀 정맥을 통해 200mg/mL 주사합니다.</li>
	<li>무균 상태를 유지하면서 중앙 세로 자궁 경부 절개술을 시행하고 자궁 경부 근육을 해부하고 기관에 접근하십시오. 장기를 원주 방향 및 세로로 해부하십시오. 마지막으로, 첫 번째 고리 아래와 카리나 바로 위에 횡단합니다.</li>
	<li>메스로 기관을 2cm 조각으로 나눕니다. 가위로 주변 결합 조직과 내부 점막층6을 제거합니다.</li>
	<li>2% 소듐 도데실 설페이트(SDS), 5% 페니실린-스트렙토마이신 및 5% 암포테리신 B를 함유한 12mL의 인산염 완충 식염수(PBS) 용액에 표본을 담그십시오.</li>
	<li>기관지를 실온에서 5주 동안 400rpm의 자기 교반기로 일정하게 교반합니다. 기관을 증류수에 담그는 방법으로 2시간 삼투압 충격 후 매주 탈세포화 용액을 교체하십시오.</li>
	<li>-80°C의 냉동 용기에서 80% 소 태아 혈청(FBS)과 20% 디메틸 설폭사이드(DMSO)의 혼합물 12mL를 사용하여 검체를 극저온 분석합니다.</li>
	<li>기관을 사용할 때(13-15일 후) 37°C의 수조에서 해동하고 해동이 완료된 후 PBS에 담가 세척합니다.</li>
</ol>2. 살균
<ol><li>방사선 조사<ol><li>총 부피가 30mL가 될 때까지 PBS로 채워진 T25 배양 플라스크에 메타크릴레이트 20mL에 각각 2cm 크기의 기관 조각 4개 배치를 놓습니다. 공기-액체 계면에서 에너지 확산을 일으킬 수 있는 기포가 형성되지 않도록 주의하십시오.</li>
		<li>선형 가속기를 사용하여 10MV의 공칭 에너지의 광자가 필터 프리 빔을 평평하게 하여 조사를 수행합니다. 등중심에서 분당 2,400 모니터 단위의 선량률을 적용하고, 10cm x 10cm의 방사선장에 대해 2.5cm의 피사계 심도로 방사선을 조사할 소스 표면 거리 100cm에 기관을 배치하여 전체 용기를 덮도록 합니다.</li>
		<li>각 4개 배치로 복용량을 확대합니다. 살균에 도달 할 때까지 4 개, 0.5 kGy, 4 개에서 1 kGy, 4 개에서 2 kG 등을 받게됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>문화<ol><li>항생제나 항진균제 없이 비활성화된 10% FBS가 있는 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM) 30mL에 조각을 넣습니다.</li>
		<li>37°C 및 5%CO2의 표준 조직 인큐베이터에서 2주 동안 배양하고 24시간마다 검사합니다. 참고: 오염 매개변수는 배양 배지의 pH 변화와 그에 따른 배지의 색상 및 탁도 변화입니다. 기관은 병에 걸리지 않은 무균 lagomorphs에서 수확되었으므로 기관에 혐기성 박테리아가 없을 것으로 예상됩니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 조직학적 분석
참고: 헤마톡실린과 에오신21, 마손의 삼색, 오르세인22를 사용하여 조각을 얼룩지게 합니다.
<ol><li>DAPI 염색<ol><li>DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)를 사용하여 조직 생존력을 결정합니다. 이 청색 형광 염색은 DNA 서열의 아데닌 및 티민이 풍부한 영역에 강하게 결합하므로 형광 현미경을 통해 DNA를 볼 수 있습니다.</li>
		<li>조직 샘플을 최적 절단 온도(OCT) 화합물에 삽입합니다.</li>
		<li>저온 유지 장치를 사용하여 샘플을 자릅니다.</li>
		<li>염색하고자 하는 시료를 증류수로 3회 세척하여 OCT를 제거하고 30 nM DAPI 용액이 포함된 마운팅 배지에 넣는다.</li>
		<li>형광 현미경을 사용하여 형광을 시각화합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>DNA 함량 분석<ol><li>메스를 사용하여 약 3mm 길이의 기관 부분을 자릅니다.</li>
		<li>proteinase K (재료 표)에서 2 시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 DNA 추출 키트로 DNA를 추출합니다.</li>
		<li>분광 광도계를 사용하여 260/280에서 흡광도를 측정하여 DNA 농도를 결정합니다.</li>
		<li>바이오분석기와 함께 모세관 크로마토그래피를 사용하여 추출된 DNA 샘플의 크기를 측정합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 생체 역학 연구
참고: 종방향 및 횡방향 힘에 대한 기관 저항은 축 방향 인장 및 반경 방향 압축 시험23을 통해 측정됩니다.
<ol><li>기관 측정<ol><li>버니어 캘리퍼스를 사용하여 기관 길이, 벽 두께 및 외경을 측정합니다.</li>
		<li>각 변수에 대한 세 개의 랜덤 측정값에서 평균값을 계산합니다.</li>
		<li>방사형 압축 시험에서는 플레이트가 시편과 접촉하는 지점을 감지하여 전후 직경을 계산합니다.</li>
		<li>실온에서 모든 테스트를 수행하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>인장 시험<ol><li>100N 하중(0.1N 하중 분해능, 0.001mm 위치 및 0.1초)이 장착된 견인 데스크탑 만능재료시험기(UTM) 변위 제어장치에서 인장 시험을 수행합니다. 시험기에는 힘 및 위치 센서가 장착되어 있으며, 제조업체(23)에 의해 특별히 설계된 소프트웨어가 있는 컴퓨터에 연결된다.</li>
		<li>0.4초마다 데이터를 기록하고 스프레드시트로 내보냅니다.</li>
		<li>외부 직경이 1cm이고 벽 두께가 1.5mm인 순수한 단층, 무독성 결정 폴리염화비닐(PVC) 중공 튜브로 토끼 기관의 평균 구경에 맞게 조정된 인장 죠를 구성합니다.</li>
		<li>전도체를 3cm 길이의 세그먼트로 나눕니다.</li>
		<li>봉합사로 인한 편향을 방지하기 위해 턱 가장자리에서 2mm, 2.5mm 간격으로 말단 봉합사를 위한 12개의 미리 형성된 구멍을 뚫습니다.</li>
		<li>PVC 유리관을 기관 가장자리에서 2mm 떨어진 곳에 6-0 나일론 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 미리 형성된 대체 구멍(5mm마다)을 통해 연속 봉합사를 사용하여 말단 문합으로 토끼 기관에 부착합니다.</li>
		<li>5.0mm/min의 변위 속도로 모든 조각을 늘립니다.</li>
		<li>변수 최대 응력(최대 σ, N/mm2) 및 변형률(최대 ε, 단위 없음)을 기관 부피 단위당 저장된 에너지(W/Vol, mJ/mm) 및 영률(E, MPa)과 함께 기록합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>방사형 압축 시험<ol><li>15N 로드셀(힘 분해능 0.001N, 위치 0.001mm, 시간 0.1초)이 장착된 압축 데스크탑 UTM에서 방사형 압축 테스트를 수행하여 힘 데이터(N), 위치(mm) 및 시간(초)을 얻습니다. 데이터를 기록하고 0.5초 간격으로 스프레드시트로 내보냅니다.</li>
		<li>멤브레인 부위가 하부 판에 놓이도록 기관을 놓습니다. 플레이트는 5mm/min의 일정한 속도로 상판을 향해 점차 상승합니다.</li>
		<li>기관을 완전히 폐색하는 데 필요한 시료 길이의 단위당 모든 단위(f , N/mm), 강성(R , Mpa·mm) 및 단위당 표면적당 에너지(W / S , mJ/mm2)를 계산합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 수술 기법
참고: 수술 기법은 다른 곳에서도 널리 보고되었다20.
<ol><li>멸균 관내 PVC 스텐트, 크기 14 Fr (벽을 압축하지 않고 자유롭게 미끄러질 수 있음)을 양쪽 끝에 3-4mm의 여백으로 놓습니다.</li>
	<li>첫 번째 연골의 연골간 공간을 통해 단일 6-0 나일론 모노필라멘트 스티치로 스텐트를 고정합니다.</li>
	<li>토끼를 마취하십시오.<ol><li>피험자(3.65-4.05kg 수컷 뉴질랜드 백색 토끼)에게 진정제, 근육 이완제 및 진통제(2.5mg/kg 자일라진)와 함께 근육내 진통제(35mg/kg 케타민)를 사전 투여합니다.</li>
		<li>수술 부위에서 절개 부위를 면도하고 수술 부위를 청소하여 머리카락을 제거합니다.</li>
		<li>진통제와 항생제 예방: 0.05mg/kg 근육주사 부프레노르핀 및 10mg/kg 엔로플록사신.</li>
		<li>각 토끼의 가장자리 귀 정맥에 정맥 카테터를 넣으십시오.</li>
		<li>프로포폴 10mg/kg 볼루스를 정맥 주사하여 마취를 유도합니다.</li>
		<li>3리드 심전도, 맥박 산소 측정 및 비침습적 압력 측정을 사용하여 동물의 활력 징후를 모니터링합니다. 30분마다 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 눈에 생리학적 세럼을 바릅니다.</li>
		<li>발가락 핀치 방법을 사용하여 마취면을 확인합니다.</li>
		<li>흡입 된 이소 플루 란으로 마취를 자연 환기를 잃지 않고 최소 폐포 농도의 1.5 % -2 %로 유지하고 가열 패드로 토끼에게 열 지원을 제공하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>절개 부위를 요오드 기반 스크럽으로 원을 그리며 여러 번 소독하십시오. 항상 무균 상태에서 멸균 물질을 사용하여 세로 3cm 중앙 흉부 절개를 하고 가슴 근막과 근육 구성 요소로 구성된 양측 척추경 플랩을 수확합니다.</li>
	<li>각 반흉부에 하나씩 4 마리의 토끼에 플랩으로 기관을 감싼다.</li>
	<li>수술이 완료되면 이소플루란 투여를 중단하여 마취를 역전시킵니다.</li>
	<li>수술 후 기간<ol><li>마취에서 완전히 회복 될 때까지 동물을 수술실에 보관하십시오. 그들이 완전히 회복되면 다른 토끼와 함께 환경으로 되돌려 보내십시오.</li>
		<li>토끼를 항생제(0.5mL/kg 2.5% 엔로플록사신)와 진통제(5mg/mL 멜록시캄, 0.05mL/kg 메타캠)로 5일 동안 24시간마다 치료합니다.</li>
		<li>원하는 시간 동안 임플란트를 제자리에 두십시오.</li>
		<li>안락사 전에 근육 내 진통제(35mg/kg 케타민)와 진정제, 근육 이완제 및 진통제(2.5mg/kg 자일라진)로 토끼를 미리 치료합니다. 그런 다음 가장자리 귀 정맥을 통해 200mg/mL 주사를 사용하여 133mg/kg 펜토바르비탈 나트륨으로 토끼를 안락사시키고 기관을 적출합니다.</li>
		<li>기관에 대한 생체 역학 및 조직 학적 검사를 수행하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>6. 통계 분석
<ol><li>R 소프트웨어, 버전 3.5.3 R Core에서 베이지안 방법으로 모든 모델을 조정합니다(R Foundation for Statistical Computing. 2019).</li>
	<li>다중 선형 회귀 모형을 사용하여 f 및 R을 제외한 연구 변수를 분석합니다.</li>
	<li>f 변수와 R 변수의 경우 혼합 선형 회귀 모델을 적용합니다. 이 모델에서는 각 기관의 치료 및 상태와 관련된 관심 변수 외에도 폐색 비율을 단조 효과로 도입하고 기관당 독립 항을 무작위 요인으로 도입합니다.</li>
</ol>

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<li>Ross, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+stem+cells+seeded+into+decellularized+rat+kidney+scaffolds+endothelialize+and+remodel+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes.</a> Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).</li>
</ol>

저자 중 누구도 이해 상충이 없습니다.

존재하는 몇 가지 살균 전략이 있습니다. 초임계 CO2는 조직을 완전히 관통하여 배지를 산성화하고 임플란트 8,14,25의 감압에 의한 간단한 제거로 세포 인지질 이중층을 분해합니다. 자외선도 사용되어 왔으며 설치류 기관에서의 효과가 발표되었지만 문헌10에는 몇 가지 보고서 만 있습니다. 사용된 다른 방법으로는 과초산, 에탄올, 과산화산소 또는 전해수와 같은 물질의 적용이 포함되는데, 이는 불규칙한 결과를 제공하고 조직에 큰 영향을 미치는 것으로 나타났습니다11,12. 앞서 언급 한 전략과는 달리, 감마선 조사는 살균 측면에서 완전히 효과적 일뿐만 아니라 복용량과 살균 효과에 관해서도 철저하고 풍부...

임플란트의 살균은 생존력을위한 기본 요건입니다. 실제로 성공한 것으로 입증 된 보철물은 멸균 부위 (혈관, 심장, 뼈 등)에 이식 된 보철물입니다. 1. 기관은 두 개의 표면을 가지고 있습니다 : 외부 환경과 접촉하는 표면은 멸균되지 않으며, 다른 표면은 멸균 된 종격동을 향한 표면입니다. 따라서 기관이 추출되는 순간부터 멸균 기관이 아닙니다. 후속 탈세포화 공정이 최대 멸균 조건에서 수행됨에도 불구하고, 이는 멸균 단계2가 아니다. 이물질의 주입 자체는 그것이 생산하는 프로박테리아 미세환경으로 인한 감염의 위험을 수반한다3그리고 물질이 멸균된 경우에도 기증자로부터 수혜자에게 질병이 전파될 위험이 최대 0.014%에 달한다4. 기관의 올바른 혈관 형성을 보장하기 위해 거의 모든 실험적 이식 프로토콜에서 먼저 무균 부위(근육, 근막, 망막, 피하 등)에 이종 성 임플란트 5,6,7을 거칩니다. 이 배지에 비멸균 요소를 주입하면 영역3의 감염으로 이어질 수 있기 때문입니다.
멸균 임플란트를 얻기 위한 다양한 가능한 전략이 있습니다. 초임계CO2를 사용하여 말단 멸균 8,9를 달성하였다. 자외선 또는 과초산, 에탄올, 과산화산소 및 전해수와 같은 물질로 처리하는 것과 같은 다른 방법은 거의 항상 복용량에 따라 멸균 성공률이 다르지만 임플란트의 생체역학적 특성에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 실제로, 에틸렌 옥사이드와 같은 일부 물질은 주입된 매트릭스의 구조를 실질적으로 변화시킬 수 있고, 심지어 바람직하지 않은 면역원성 효과를 야기할 수 있다. 이러한 이유로, 이들 전략들 중 다수는 생물학적 모델(2,10,11,12,13)에 적용될 수 없다.
가장 널리 연구되고 인정되는 멸균 전략은 감마선 선량이 25kGy인 인간에게 이식된 의료 기기의 멸균에 대한 ISO 11737-1:2006 표준에 의해 수립된 전략입니다. 그러나이 규정은 불활성, 비 생물학적 요소14,15의 살균에만 초점을 맞추고 있습니다. 또한, 근치적 암종 치료에서 방사선 요법 선량은 의료기기 멸균에 사용되는 선량보다 3배 더 낮다1. 이를 염두에두고, 우리는 상기 용량이 미생물을 죽일뿐만 아니라 임플란트의 생물학적 구조를 파괴하고 근본적으로 변화시킬 것이라고 결론 지을 수 있습니다. 또한 분해시 잔류 지질을 생성할 가능성이 있으며, 이는 잠재적으로 세포독성을 가질 수 있고 스캐폴드(13,14,15,16,17)의 효소적 분해를 가속화할 수 있으며, 이는 1.9 kGy만큼 낮은 선량을 사용하고 방사선량에 정비례하는 손상을 입는 경우에도 마찬가지이다 17.
따라서, 본 논문의 목적은 방사선 조사에 의해 야기되는 최소한의 유해한 영향으로 멸균 임플란트가 얻어질 수 있도록 하는 방사선량을 확인하려고 시도하는 것이다 2,18,19. 우리가 따랐던 전략은 부정적인 배양을 달성할 때까지 킬로그레이 범위(0.5, 1, 2, 3kGy 등) 내에서 다양한 증량량으로 탈세포화 및 조사된 기관을 조사하는 것이었습니다. 살균을 확인하기 위해 음성 배양을 달성 한 용량에 대해 추가 테스트가 수행되었습니다. 멸균을 얻기위한 최소 선량을 결정한 후, 기관에 대한 조사의 구조적 및 생체 역학적 영향을 점검 하였다. 모든 메트릭을 대조군 토착 토끼 기관과 비교했습니다. 이어서, 구조물의 살균을 뉴질랜드 백색 토끼에 기관을 이식함으로써 생체 내에서 시험하였다.

<table><tbody><tr><td>6-0 나일론 모노필라멘트 봉합사&nbsp;</td><td>모노소프트. 코비디엔; 미국 매사추세츠주 맨스필드</td><td>SN-5698G</td><td></td></tr><tr><td>암포테리신 B 5%</td><td>Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent, Santa Clara, CA, USA</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀</td><td>부프렉스. 레킷벤키저 헬스케어; Hull, Reino Unido</td><td>N02AE01</td><td></td></tr><tr><td>압축 데스크탑 UTM</td><td>Microtest, 마드리드, 스페인</td><td>EM1/10/FR</td><td></td></tr><tr><td>Cryostate</td><td>Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania</td><td>CM3059</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>시그마-알드리치; 미국 MO</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽; Waltham, MA, USA</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>DNA 추출 키트</td><td>DNeasy 추출 키트 Quiagen, Hilden, Germany</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Enrofloxacin, 2.5%</td><td>Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany</td><td>0035-0002</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>GE Healthcare Hyclone; 스페인 마드리드</td><td>SH20898.03IR</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany)</td><td>DM2500??</td><td></td></tr><tr><td>냉동 용기&nbsp;</td><td>프로스티 씨. 써모 피셔; 스페인 마드리드</td><td>&nbsp; 5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>이소플루오란</td><td>이소플로; 프로이마 가나데라; 시우다드 레알, 스페인&nbsp;</td><td>8.43603E+12</td><td></td></tr><tr><td>케타민</td><td>이말겐. 메리알; 툴루즈, 프랑시아</td><td>BOE127823</td><td></td></tr><tr><td>리니어 액셀러레이터&nbsp;</td><td>"트루 빔". Varian, Palo Alto, California, USA</td><td>H191001</td><td></td></tr><tr><td>자기 교반기</td><td>궤도 셰이커 PSU-10i. 바이오산; 리가, Letonia</td><td>BS-010144-AAN</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam 5 mg/ml</td><td>Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany</td><td>6283-MV</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 5%</td><td>Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>펜토바르비탈 나트륨</td><td>돌레탈. 베토퀴놀; 마드리드, 에스파&ntilde; </td><td>a 3.60587E+12</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>시그마-알드리치; 미주리, 미국</td><td>P2272</td><td></td></tr><tr><td>프로포폴</td><td>프로포폴 Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania</td><td>G 151030</td><td></td></tr><tr><td>단백질 분해 효소 K</td><td>Gibco Thermo Fisher Scientific; 월섬, 매사추세츠, 미국</td><td>S3020</td><td></td></tr><tr><td>PVC 중공 튜브</td><td>Cristallo 추가; FITT, 산드리고, 이탈리아</td><td>hhdddyyZ</td><td></td></tr><tr><td>PVC 스텐트&nbsp;</td><td>아가일TM 메드트로닉; 터키 이스탄불</td><td>019 5305 1</td><td></td></tr><tr><td>R 소프트웨어, 버전 3.5.3 R Core</td><td>R Foundation for Statistical Computing</td><td>R 3.5.3</td><td></td></tr><tr><td>도데실황산나트륨(SDS)</td><td>시그마-알드리치; 미주리, 미국</td><td>8,17,034</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Nanodrop, Life Technologies; 이소겐 생명과학. 네덜란드 위트레흐</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>스프레드시트</td><td>Mac용 Microsoft Excel, 버전 16.23, 미국 워싱턴주 레드몬드</td><td>2864993241</td><td></td></tr><tr><td>견인 만능 시험기&nbsp;</td><td>테스트 기계, Veenendaal, 네덜란드</td><td>84-01</td><td></td></tr><tr><td>UTM Software</td><td>TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA&nbsp;</td><td>100-093-627 F</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD 마운팅 미디엄&nbsp;</td><td>벡터 랩스, 벌링게임; 캘리포니아; 미국</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>자일라신</td><td>자일라직. 더 칼리어; 바르셀로나, 에스파&ntilde; 재질</td><td>보기 20102-003</td><td></td></tr></tbody></table>

탈세포화된 기관 이식편을 위한 저선량 감마선 멸균

Low-Dose Gamma Radiation Sterilization for Decellularized Tracheal Grafts

이식이 올바르게 진행되도록하는 주요 측면 중 하나는 배지의 무균 성입니다. 탈세포화된 기관 이식은 원래 환경과 접촉하여 처음부터 무균이 되지 않은 장기를 이식하는 것을 포함합니다. 탈세포화 프로토콜(세제 노출[2% 도데실황산나트륨], 연속 교반 및 삼투압 충격을 통해)은 무균 조치에 따라 수행되지만 살균을 제공하지는 않습니다. 따라서 주요 과제 중 하나는 생체 내 이식 전에 무균성을 보장하는 것입니다. 무기 물질에 대한 감마선 멸균 프로토콜이 확립되어 있지만 유기 물질에 대한 그러한 조치는 없습니다. 또한, 확립된 방사선량(25kGy)이 임플란트를 완전히 파괴할 수 있기 때문에 무기 재료에 대한 프로토콜을 유기 재료에 적용할 수 없습니다. 이 논문은 탈세포화된 토끼 기관에서 증가된 방사선량의 영향을 연구합니다. 우리는 용량 범위(kGy)를 유지하고 멸균이 달성되는 최소 용량을 찾을 때까지 증량된 용량을 테스트했습니다. 복용량을 결정한 후, 우리는 조직 학적으로나 생체 역학적으로 장기에 미치는 영향을 연구했습니다. 우리는 0.5kGy가 무균을 달성하지 못했지만 1kGy와 2kGy의 용량은 모두 달성했으며 따라서 1kGy는 멸균을 달성하는 데 필요한 최소 용량이라고 결정했습니다. 현미경 연구는 멸균되지 않은 장기와 비교하여 관련 변화를 나타내지 않았습니다. 축 방향 생체 역학적 특성은 전혀 변경되지 않았으며 기관이 방사상으로 견딜 수있는 단위 길이당 힘의 약간만 감소했습니다. 따라서 우리는 1 kGy가 장기에 미치는 영향을 최소화하면서 탈세포 화 된 토끼 기관의 완전한 살균을 달성한다고 결론 지을 수 있습니다.

탈세포화 DAPI 염색은 DNA의 부재를 보여주고, 전기영동에 의해 임의의 기관에서 50 ng 이상의 DNA 값이 검출되지 않았으며, 모든 단편은200 bp 20보다 작았다.
미생물 배양 0.5 kGy를 받은 8개 조각 중 2개는 1주일 이내에 색 변화를 보였다. 1 kGy 및 2 kGy에서 조사된 조각들 중 어느 것도 색 변화를 나타내지 않았다(그림 1).
조직학적 분석 분석된 시편에서 콜라겐 또는 탄성 섬유 분포 패턴의 변화는 감지되지 않았습니다(그림 2).
방사선량 결정 0.5 kGy에서...

기관 조직 이식에는 멸균이 필수적입니다. 여기에서 우리는 장기가 완전히 견딜 수 있는 저선량 감마선 조사를 사용하는 멸균 프로토콜을 제시합니다.

One of the main key aspects in ensuring that a transplant evolves correctly is the sterility of the medium. Decellularized tracheal transplantation ...

이 프로토콜은 특성에 영향을 미치지 않고 모든 비 멸균 기관에 대한 완전한 멸균 프로세스를 제공합니다. 이 기술의 주요 목적은 장기의 특성에 영향을 미치지 않고 장기를 멸균 할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 기관에 초점을 맞추었지만 감마선 선량이 적을수록 생물학적 물질을 효과적으로 살균 할 수 있음이 입증되었습니다.개인은 다른 유형의 장기에 대해 가장 낮은 유효 용량을 정의함으로써 문제에 직면 할 수 있습니다. 그런 다음 더 낮은 용량으로 시작하여 살균이 이루어질 때까지 복용량을 늘리는 것이 좋습니다. 안락사된 뉴질랜드 흰 토끼 또는 Oryctolagus cuniculus에서 해부한 기관을 2cm 조각으로 분할하는 것으로 시작하십시오.가위로 주변 결합 조직과 내부 점막층을 제거합니다. SDS, 5% 페니실린 스트렙토마이신 및 5% 암포테리신을 함유한 12밀리리터의 PBS 용액에 표본을 담그십시오. 기관을 실온에서 5주 동안 400RPM의 자기 교반기로 일정하게 교반합니다.매주, 배지를 교체하기 전에 기관을 증류수에 담그면 2시간 동안 삼투압 충격을 줍니다. 5주 후, 섭씨 영하 80도의 냉동 용기에서 80% FBS와 20% DMSO의 12밀리리터 혼합물을 사용하여 기관 표본을 극저온화합니다. 13 일에서 15 일 후에 섭씨 37 도의 수조에서 기관을 해동하십시오.그런 다음 PBS로 씻으십시오. 검체를 조사하기 위해, 기포 형성을 방지하면서, 20 밀리리터의 PBS에 25 밀리리터의 기관 조각을 넣는다. 10 메가 볼트의 공칭 에너지의 광자가있는 선형 가속기를 사용하여 조사가 수행되어 필터가없는 빔을 평평하게합니다.분당 2, 400 모니터 단위의 선량률을 적용하고 원고에 설명 된대로 다른 매개 변수를 설정하십시오. 완료되면 항생제나 항진균제 없이 10% 비활성화된 FBS가 보충된 30밀리리터의 DMEM에서 검체를 배양합니다. 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소의 표준 조직 인큐베이터에서 2주 동안 배양하고 24시간마다 배지 pH, 색상 및 탁도 변화와 같은 오염 매개변수를 검사합니다.힘 및 위치 센서와 특별히 설계된 소프트웨어가 장착된 트랙션 데스크탑 만능재료시험기(UTM 변위 제어장치)에서 인장 시험을 수행합니다. 0.4초마다 데이터를 기록하고 스프레드시트로 내보냅니다. 토끼 기관의 평균 구경에 맞는 인장 턱을 순수한 단층 무독성 크리스탈 폴리염화비닐 또는 PVC 중공 튜브로 구성합니다.전도체를 3cm 길이의 세그먼트로 나눕니다. 편향없이 말단 봉합을 수행하려면 턱 가장자리에서 2.5mm 떨어진 12 개의 미리 형성된 구멍을 뚫습니다. 다음으로, 기관 가장자리에서 2mm 떨어진 곳에 있는 교대로 수행되는 5mm 구멍을 통해 연속 6-0 나일론 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 종단 문합에 의해 PVC 유리관을 토끼 기관에 부착합니다.분당 5.0mm의 변위 속도로 모든 조각을 늘립니다. 그런 다음 최대 응력 및 변형률, 기관 부피 단위당 저장된 에너지, 영률과 같은 변수를 기록합니다. 15뉴턴 로드셀이 장착된 압축 데스크탑 UTM에서 방사형 압축 테스트를 수행하여 힘 데이터, 위치 및 시간을 얻습니다.데이터를 기록하고 0.5초 간격으로 스프레드시트로 내보냅니다. 분당 5mm의 일정한 속도로 플레이트가 상판을 향해 점진적으로 상승하기 전에 막 영역이 하부 플레이트에 놓인 기관을 놓습니다. 시료 길이의 단위당 모든 변수, 강성 및 기관을 완전히 폐색하는 데 필요한 표면적의 단위당 에너지를 계산합니다.크기 14의 멸균 관내 PVC 스텐트를 삽입하여 양쪽 끝에 3-4mm의 여유를 확보합니다. 첫 번째 연골의 연골간 공간을 통해 단일 6-0 나일론 모노필라멘트 스티치로 스텐트를 고정합니다. 무균 상태와 멸균 물질로 세로 3 센티미터의 중앙 흉부 절개를하고 가슴 근막과 근육 성분으로 구성된 양측 척추 경 플랩을 수확합니다.4 마리의 토끼, 각 혈흉에 하나의 기관을 플랩으로 기관을 감싼다. 수술이 완료되면 이소플루란 투여를 중단하여 마취를 역전시킵니다. 0.5 킬로 그레이의 방사선에 노출 된 8 개 조각 중 2 개 조각은 1 주일 이내에 미디어 색상의 변화를 나타 냈습니다.그러나 1 또는 2 킬로 그레이에서 조사 된 조각들 중 어느 것도 매체 색상의 변화를 나타내지 않았습니다. 대조군과 비교하여, 상이한 방사선량으로 조사된 분석된 시편에서 콜라겐 또는 탄성 섬유 분포 패턴 변화가 검출되지 않았다. 조사된 기관에 대한 인장 시험에서 얻은 데이터가 여기에 나와 있습니다.탈세포화 및 조사된 기관에 대한 응력 변형률 곡선은 멸균되지 않은 기관과 비교하여 변화가 없음을 나타냈습니다. 천연 기관 또는 대조군과 탈세포화, 냉동 보존 및 조사된 기관에 대해 수행된 압축 테스트가 표시됩니다. 해당 그래프는 방사선 조사가 천연 기관과 비교하여 폐색 비율을 변화시키지 않는다는 것을 보여주었습니다.감마선 조사는 임상적으로 최소한이지만 통계적으로 유의미한 방사선 생체역학적 특성과 단위 길이당 가변적인 힘을 감소시켰습니다. 조직 학적 검사는 천연 기관의 perichondrium 형태로 고도로 조직 된 결합 조직을 보여주었습니다. 연골은 손상되지 않았으며 괴사의 징후는 보이지 않았습니다.생체에 방사선 원소를 이식할 때 감염 및 조직 거부를 방지하기 위해서는 임플란트의 무균 상태와 멸균 과정이 가장 중요합니다. 조직 생성 후 이식해야 할 장기는 광범위하며 멸균 상태여야 합니다. 이 과정을 따르면 장기의 주요 특성에 영향을 미치지 않고 완전한 살균을 달성 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

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