Name: 마우스 자궁에서 3D 자궁 내막 오가노이드 확립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: 배우세요 마우스 자궁에서 자궁 내막 상피를 효율적으로 분리하여 3D 오가노이드를 배양하는 방법을. 효소적 및 기계적 분리 기술을 활용하여 자궁 내막 신호와 재생 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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스테파니 팡가스 박사와 마틴 M. 마추크 박사(M.M.M.)에게 우리 원고를 비판적으로 읽고 편집해 주신 데 대해 감사드립니다. 연구는 유니스 케네디 슈라이버 국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소 보조금 R00-HD096057 (DM), R01-HD105800 (DM), R01-HD032067 (M.M.M.) 및 R01-HD110038 (M.M.M.) 및 NCI-P30 암 센터 지원 보조금 (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. Burroughs Wellcome Fund에서 차세대 임신 상을 수상했습니다.

마우스 취급 및 실험 연구는 Baylor College of Medicine의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에서 승인 한 프로토콜과 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 NIH 가이드에서 수립 한 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 효소 및 기계적 방법을 사용한 마우스에서 자궁 상피 분리
참고: 이 섹션에서는 겔 매트릭스 스캐폴드를 사용하여 마우스로부터 상피 자궁내막 오가노이드를 확립, 계대, 동결 및 해동하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 이전 연구에서는 발정기4상 동안 마우스에서 마우스 자궁내막 오가노이드의 최적 배양이 확립되는 것으로 확인되었으며, 이는 질 면봉(15)의 세포학적 검사에 의해 결정될 수 있습니다. 성체 암컷 WT 마우스 (6-8주령, 하이브리드 C57BL/6J 및 129S5/SvEvBrd)를 모든 실험에 사용하였다. 마우스는 이소플루란 진정 작용과 자궁 경부 관절 분리를 사용하여 IACUC 승인 지침에 따라 인도적으로 안락사되었습니다. 마우스가 안락사되면 다음 단계를 따라야합니다. 이 프로토콜에 사용되는 재료 및 솔루션과 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
<ol><li>사용하기 전에 젤 매트릭스가 얼음에서 약 1-2시간 동안 해동되도록 두십시오.</li>
	<li>마우스를 해부하려면 가위를 사용하여 복부에 중간 선 절개를하고 피부를 부드럽게 벗겨 기본 복막층을 노출시킵니다. 집게를 사용하여 복막층을 지탱하고 가위로 옆으로 절개하여 복부 내용물을 노출시킵니다.<ol><li>복부 지방 패드를 부드럽게 옆으로 움직여 자궁 뿔을 찾습니다. 먼저 자궁 경부 접합부에 잡고 가위를 사용하여 장간막 지방을 따라 잘라서 해부하십시오. 마우스 자궁을 해부 한 후 작은 가위로 자궁 뿔에서 지방 조직을 철저히 제거하십시오. 참고: 사용하기 전에 모든 수술 도구를 멸균하여 세포 분리 중에 멸균을 유지하고 마우스 복부에 70% 에탄올을 뿌리고 멸균 조직 배양 후드 아래에서 해부 후 모든 단계를 수행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>각 자궁 뿔을 각각 약 4-5mm 크기의 작은 조각으로 자릅니다.</li>
	<li>한 자궁의 모든 자궁 조각을 1 % 트립신 0.5mL가 들어있는 24 웰 플레이트의 한 웰에 넣습니다. 효소 용액이 자궁 내강으로 들어가도록 하여 자궁내막 상피를 밑에 있는 간질에서 효소적으로 분리합니다.</li>
	<li>24웰 플레이트를 37°C 가습 조직 배양 인큐베이터에서 약 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>1시간 배양 후 자궁 단편을 Dulbecco의 인산염 완충 용액(DPBS) 1mL가 포함된 35mm 조직 배양 플레이트로 옮깁니다.</li>
	<li>해부 현미경에서 미세한 집게와 1mL 피펫을 사용하여 자궁관에서 자궁 상피를 기계적으로 분리합니다. 집게로 자궁 조각의 한쪽 끝을 누른 상태에서 피펫 팁을 조각을 가로질러 세로로 부드럽게 움직여 자궁관의 다른 쪽 끝에서 상피를 짜냅니다. 해부 현미경으로 자궁 단편으로부터 분리 된 상피 시트를 관찰하십시오.</li>
	<li>1mL 피펫을 사용하여 상피 시트를 수집하고 1.5mL 튜브에 부드럽게 옮깁니다.</li>
	<li>나머지 자궁 조각에 대해이 과정을 반복하여 모든 상피 시트를 동일한 수집 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>해리된 상피 시트를 375 × g에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화한다.</li>
	<li>세포 펠릿을 방해하지 않도록 상청액을 조심스럽게 제거하십시오.</li>
	<li>세포 펠릿을 0.5mL의 2.5mg/mL 콜라게나제 + 2mg/mL DNase 용액에 재현탁합니다. 약 10배 위아래로 또는 단일 세포 현탁액이 달성될 때까지 피펫팅합니다.</li>
	<li>0.5mL의 DMEM/F12 + 10% 소 태아 혈청(FBS) + 항생제를 추가하고 375×g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 참고: 세포 배양에 사용되는 광범위한 항생제에 대한 추가 정보는 재료 표를 참조하십시오.</li>
	<li>상청액을 조심스럽게 제거하고 1mL의 DMEM/F12 + 10% FBS + 항생제에 세포를 재현탁시킵니다. 세포를 375 × g에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
</ol>2. 기질 구획의 가공
참고: 이 섹션에서는 마우스 자궁내막의 기질 구획을 분리하는 데 필요한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 상피/기질 공동 배양 실험에 대한 관심이 증가함에 따라 오가노이드를 생성할 상피 세포 외에 기질 세포 집단을 처리할 수 있는 것이 중요합니다.
<ol><li>모든 상피가 자궁 조각에서 효소 적으로 기계적으로 분리되면 나머지 튜브와 같은 구조는 "기질 / 자궁 내막"구획입니다. HBSS 용액에서 2.5 mg/mL 콜라게나제 + 2 mg/mL DNase에 이 조직을 수집합니다.</li>
	<li>기질/자궁내막 샘플을 37°C 쉐이커에서 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>배양 후 마우스당 500μL의 DMEM/F12 + 10% FBS + 항생제를 추가하고 40μm 세포 필터를 통해 해리되지 않은 단편을 필터링합니다.</li>
	<li>세포를 375 × g에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화한다.</li>
	<li>상청액을 조심스럽게 제거하고 1mL의 DMEM/F12 + 10% FBS + 항생제에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 혼합물을 10cm 세포 배양 플레이트에 DMEM/F12 + 10% FBS + 항생제 10mL에 적가합니다. 플레이트를 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다.</li>
	<li>마우스 자궁내막 상피 및 기질 세포의 공동-배양을 생성하려면, 스캐폴드-프리 또는 콜라겐 매트릭스 시스템 6,8을 사용하여 인간 자궁내막 오가노이드에 대해 기재된 방법을 따른다. 참고: 이러한 기술은 아직 마우스에 대해 발표되지 않았지만 인간 자궁내막과 함께 게시된 프로토콜을 기반으로 조정할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 자궁 상피를 겔 매트릭스로 캡슐화하여 오가노이드 설정
알림: 사용할 준비가 될 때까지 젤 매트릭스를 얼음 위에 보관하십시오.
<ol><li>상청액을 제거하고 세포 펠릿의 20배인 부피의 겔 매트릭스로 세포 펠릿을 재현탁시킨다(즉, 세포 펠릿이 20μL인 경우, 세포를 400μL의 겔 매트릭스로 재현탁시킨다). 기포가 발생하지 않도록 펠릿을 조심스럽게 다시 매달아 놓으십시오.</li>
	<li>겔 매트릭스/세포 현탁액이 실온에서 ~10분 동안 침전되도록 합니다.</li>
	<li>겔 매트릭스/세포 현탁액이 반고체 겔이 되면 넓은 구멍의 200μL 팁이 있는 P200 마이크로피펫을 사용하여 25μL의 겔 매트릭스/세포 현탁액을 부드럽게 흡입합니다. 12웰 플레이트의 웰당 3개의 개별 25μL 돔을 분주하고 겔 매트릭스가 37°C 가습 조직 배양 인큐베이터에서 15분 동안 경화되도록 합니다.</li>
	<li>겔 매트릭스가 경화된 후 겔 매트릭스 돔을 포함하는 각 웰에 750μL의 오가노이드 배지를 추가합니다. 가습된 조직 배양 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다. 알림: 오가노이드 배지 제형은 재료 표에 나와 있습니다. 오가노이드는 일반적으로 초기 배양 후 4일 이내에 형성됩니다.</li>
</ol>4. 에스트라디올 처리 후 자궁내막 오가노이드의 유전자 발현 분석
참고: 이 섹션에서는 에스트라디올로 치료한 후 실시간 qPCR을 사용하여 자궁내막 상피 오가노이드의 유전자 발현을 프로파일링하는 데 사용되는 방법을 설명합니다(E2; 표 1 참조). 자궁 내막은 난소 호르몬 E2의 주기적 제어하에 있기 때문에 E2에 대한 유기체의 반응성을 테스트하는 것은 생리 기능의 중요한 척도입니다. 우리는 고품질 RNA를 얻었고 자궁내막 상피 오가노이드에서 qPCR 및/또는 RNA 시퀀싱을 사용하여 유전자 발현을 프로파일링하기에 충분한 mRNA를 생성했습니다. 이 섹션에서는 유전자 발현의 다운스트림 분석을 위해 오가노이드를 수집하고 처리하는 방법을 설명합니다. 선택된 치료 배지는 배양된 자궁내막 세포를 치료하기 위해 사용된 배지를 반영한다. 그러나, 이러한 치료 배지는 호르몬 8,16,17로 인간 자궁내막 3D 배양물의 치료에 대해 행해진 바와 같이, 그에 따라 최적화될 수 있다는 것에 유의해야 한다.
<ol><li>상기 기재된 바와 같이 자궁내막 오가노이드를 배양한다.</li>
	<li>오가노이드 배지를 제거하고 파종 4일 후 750μL의 기아 배지로 교체합니다. 밤새 배양하십시오.</li>
	<li>다음날 아침, 기아 배지를 제거하십시오. 비히클 또는 10 nM E2를 포함하는 750 μL의 처리 배지를 추가합니다. 48 시간 동안 배양하십시오.</li>
	<li>키트 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA 분리를 진행합니다.</li>
</ol>5. 자궁내막 오가노이드의 조직학적 분석
참고: 자궁내막 오가노이드의 형태학적 특징을 영상화하는 것은 성장 인자, 유전자 조작 또는 소분자 억제제의 세포 효과를 평가하는 데 중요합니다. 이 섹션에서는 조직학적 염색 및 항체 면역형광 염색을 사용하여 자궁내막 상피 오가노이드를 고정, 처리 및 이미지화하는 데 사용되는 기술을 설명합니다.
<ol><li>1x PBS에 1mL의 4% 파라포름알데히드가 포함된 1.5mL 미세 원심분리 튜브를 준비합니다. 얼음 위에 놓으십시오.</li>
	<li>오가노이드를 함유하는 12-웰 플레이트의 웰로부터 배지를 흡인한다.</li>
	<li>절단 팁이 있는 1mL 피펫 팁을 사용하여 500μL의 4% 파라포름알데히드를 각 웰로 옮기고 플레이트 바닥에서 겔 매트릭스 돔을 부드럽게 분리합니다.</li>
	<li>전체 겔 매트릭스 돔을 피펫 팁으로 부드럽게 흡입하고 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>오가노이드를 4°C의 회전 장치에 밤새 놓아 고정합니다.</li>
	<li>다음날 아침, 튜브를 600×g에서 5 분 동안 원 심분리하여 오가노이드를 펠릿화합니다. 피펫으로 4% 파라포름알데히드 용액을 부드럽게 제거하고 버립니다. 유기체를 70 % 에탄올로 2 배 세척하십시오.</li>
	<li>마지막 세척 후 튜브에서 50-100 μL의 에탄올을 제외한 모든 것을 제거합니다. 튜브를 따로 보관하십시오.</li>
	<li>표본 처리 젤 튜브를 수조에 넣고 전자레인지에 ~30초 동안 가열하여 젤을 녹입니다. 겔의 일관성을 모니터링하여 시편 처리 젤이 끓지 않는지 확인하십시오. 알림: 시편 처리 젤이 녹았지만 뜨겁게 끓지 않으면 신속하게 작업하여 오가노이드를 캡슐화합니다.</li>
	<li>금형의 전체 표면을 덮을 만큼 충분한 시편 처리 젤을 옮깁니다(약 250μL).</li>
	<li>시편 처리 겔이 여전히 용융된 동안, 오가노이드를 함유한 50 μL의 70% 에탄올 용액을 신속하게 옮깁니다. 오가노이드가 가라앉거나 금형의 바닥 부분으로 밀려 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>조직학 몰드를 얼음 양동이에 놓고 시편 처리 젤이 냉각되고 응고되도록합니다.</li>
	<li>시편 처리 젤이 완전히 건조되면 표본 처리 젤을 표본 백에 조심스럽게 옮기고 오가노이드가 있는 평면을 추적합니다.</li>
	<li>백을 조직학 카세트에 넣고 포르말린 고정 및 조직의 파라핀 매립에 사용되는 표준 방법을 사용하여 처리한다(18).</li>
	<li>파라핀에 고정하고 매립한 후, 마이크로톰19를 사용하여 5 μm 섹션으로 절편화하였다. 아래에 설명된 대로 표준 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색 또는 면역염색 절차를 진행합니다.</li>
</ol>6. 헤마톡실린 & 에오신 염색
<ol><li>다음과 같이 섹션을 탈파라핀화합니다: 크실렌, 2 x 10분; 100 % 에탄올, 2 x 3 분; 80 % 에탄올, 3 분; 60 % 에탄올, 3 분; dH2O, 2 x 3분; 헤마톡실린에서 1분; 수돗물 (3 x 5 초); 에오신에서 1분.</li>
	<li>다음과 같이 섹션을 탈수하십시오 : 60 % 에탄올, 3 분; 80 % 에탄올, 3 분; 95 % 에탄올, 3 분; 100 % 에탄올, 2 x 3 분; 자일렌, 2 x 15분</li>
	<li>장착 매체를 사용하여 장착하십시오.</li>
</ol>7. 면역형광염색
<ol><li>6.1단계에 설명된 대로 섹션을 분리합니다.</li>
	<li>항원 검색 수행<ol><li>슬라이드를 항원 검색 용액에 전자 레인지 용 용기에 담그십시오.</li>
		<li>용액이 끓지 않도록 20분 간격으로 5분 동안 전자레인지에 돌립니다.</li>
	</ol></li>
	<li>20분 항원 회수 단계가 완료된 후, 슬라이드를 항원 회수 완충액에 잠긴 상태에서 40분 동안 얼음 위에서 식히도록 합니다.</li>
	<li>1x TBST로 슬라이드를 3분 동안 세척합니다.</li>
	<li>실온에서 1시간 동안 TBST 중 3% BSA에서 인큐베이션하여 슬라이드를 차단합니다.</li>
	<li>1차 항체 배양<ol><li>항체를 TBST에서 3% BSA로 희석합니다(Ab에 따라 1:50-1:1,000).</li>
		<li>가습 챔버에서 4°C에서 밤새 배양합니다.</li>
		<li>TBST로 3 회 5 분 동안 씻으십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>2차 항체 배양<ol><li>항체를 3% BSA(TBST) (1:250) 또는 5% 정상 당나귀 혈청으로 희석합니다.</li>
		<li>항체가 형광단에 접합되기 때문에 어둠 속에서 실온(RT)에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>핵 염색<ol><li>TBST에서 4',6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌 (DAPI) 1 : 1,000을 희석하십시오.</li>
		<li>RT에서 5 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>TBST로 2 회 5 분 동안 씻으십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>장착<ol><li>장착 매체 한 방울을 사용하여 커버슬립을 장착합니다.</li>
		<li>다음날 매니큐어를 사용하여 커버 슬립을 밀봉하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

여기에서는 마우스 자궁내막에서 자궁내막 상피 오가노이드를 생성하는 방법과 다운스트림 분석에 일상적으로 사용되는 프로토콜에 대해 설명합니다. 자궁내막 오가노이드는 자궁내막증, 자궁내막암 및 착상 실패와 같은 자궁내막 관련 질병을 제어하는 메커니즘을 연구하는 강력한 도구입니다. 2017년에 발표된 획기적인 연구에서는 마우스와 인간 상피 4,5에서 자궁내막 오가노이드의 장기 및 재생 가능한 배양 조건을 보고했습니다. 오가노이드가 다른 시스템에서 생물학적 경로를 연구하기 위해 널리 사용되었지만, 시험관 내 자궁내막 조직의 연구는 배양물에서 형질전환되지 않은 1차 상피를 연구하기에 적합한 모델의 부재로 인해 제한되었습니다26. 인간 및 마우스 자궁내막에서 유래한 자궁내막 오가노이드는 장, 신장 및 폐와 같은 다른 장기 조직의 오가노이드를 배양하는 데 일반적으로 사용되는 조건을...

자궁강의 내부 안감 점막 조직인 자궁내막은 여성의 생식 건강에 중요한 역할을 하는 독특하고 매우 역동적인 조직입니다. 생식 수명 동안 자궁 내막은 난소 호르몬 인 에스트로겐과 프로게스테론의 공동 작용에 의해 조정 된 수백 번의 증식, 분화 및 분해주기를 겪을 가능성이 있습니다. 유전자 조작 마우스에 대한 연구는 호르몬에 대한 자궁 내막 반응과 배아 이식, 기질 세포 탈락 및 임신 조절을 뒷받침하는 기본적인 생물학적 메커니즘을 밝혀 냈습니다1. 그러나 시험관 내 연구는 전통적인 2D 세포 배양 2,3에서 형질전환되지 않은 일차 마우스 자궁내막 조직을 유지하는 데 어려움이 있기 때문에 제한적이었습니다. 최근 3D 장기 시스템 또는 오가노이드와 같은 자궁내막 조직 배양의 발전은 자궁내막 세포 재생 및 분화를 제어하는 생물학적 경로를 조사할 수 있는 새로운 기회를 제공합니다. 마우스 및 인간 자궁내막 오가노이드 시스템은 다양한 매트릭스4,5에 캡슐화된 순수한 자궁내막 상피로부터 개발되었으며, 인간 자궁내막은 스캐폴드가 없는 상피/기질 공동 배양6,7로, 보다 최근에는 콜라겐 캡슐화된 상피/기질 집합체8로 배양되었습니다. . 상피 오가노이드 배양의 성장 및 재생 잠재력은 오가노이드 4,5,9의 성장 및 재생을 최대화하기 위해 경험적으로 결정된 성장 인자 및 소분자 억제제의 정의된 칵테일에 의해 뒷받침됩니다. 또한, 자궁내막 오가노이드를 동결 및 해동하는 능력은 향후 연구를 위해 생쥐와 인간의 자궁내막 오가노이드의 장기 뱅킹을 허용합니다.
유전자 조작 마우스는 임신 초기와 탈락을 제어하는 복잡한 신호 전달 경로를 밝혀 냈으며 임신 손실, 자궁 내막 암 및 자궁 내막증의 모델로 사용되었습니다. 이러한 유전 연구는 여성 생식 조직에서 특이적으로 활성인 cre 재조합 효소를 사용하여 loxP 측면 대립 유전자 ( "플록스")의 세포 특이 적 결실로 크게 달성되었습니다. 이러한 마우스 모델에는 자궁 내막 상피 및 기질 조직에서 강력한 재조합 효소 활성을 갖는 널리 사용되는 프로게스테론 수용체 -cre10, 성인 마우스에서 자궁 내막 상피 재조합을 유도하는 락토페린 i-cre11 또는 뮐러 유래 조직에서 상피 특이 적 결실을 유발하는 Wnt7a-cre 12가 포함됩니다. . 유전자 조작 마우스 모델에서 자궁내막 조직을 3D 오가노이드로 배양하는 것은 자궁내막 생물학을 조사하고 자궁내막 세포 재생 및 분화를 제어하는 성장 인자 및 신호 전달 경로의 식별을 용이하게 할 수 있는 훌륭한 기회를 제공했습니다13,14. 마우스 자궁 내막 조직의 분리 및 배양 방법은 문헌에 기재되어 있으며 자궁 내막 상피 유기체의 후속 배양을위한 자궁 상피의 분리를위한 다양한 효소 전략의 사용을보고한다4. 이전 문헌이 자궁내막 상 피 오가노이드 배양 프로토콜 4,5,6에 대한 중요한 프레임워크를 제공했지만, 이 백서는 이러한 오가노이드를 생성, 유지, 처리 및 분석하기 위한 명확하고 포괄적인 방법을 제공합니다. 이러한 기술의 표준화는 여성 생식 생물학 분야의 발전을 가속화하는 데 중요합니다. 여기에서, 우리는 겔 매트릭스 스캐폴드에서 자궁내막 오가노이드의 후속 배양을 위한 마우스 자궁내막 상피 조직의 효소적 및 기계적 정제를 위한 상세한 방법론을 보고한다. 또한 겔 매트릭스 캡슐화 마우스 자궁내막 상피 오가노이드의 다운스트림 조직학적 및 분자 분석을 위한 방법론을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Organoid Media Formulation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>최종 농도</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>100%</td></tr><tr><td>소 췌장에서 추출한 트립신</td><td>시그마 알드리치</td><td>T1426-1G</td><td>1%</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634010</td><td>1X</td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>1X</td></tr><tr><td>B-27&trade; 보충제 (50X), 비타민 A 뺀</td><td>성분 Life Technologies</td><td>12587010</td><td>1X</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>100 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>N-아세틸-L-시스테인</td><td>시그마 알드리치</td><td>A9165-5G</td><td>1.25mM</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Life Technologies</td><td>25030024</td><td>2mM</td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>시그마 알드리치</td><td>N0636-100G</td><td>10nM</td></tr><tr><td>ALK-4, -5, -7 억제제, A83-01</td><td>토크리스</td><td>2939</td><td>500nM</td></tr><tr><td>재조합 인간 EGF</td><td>페프로텍</td><td>AF-100-15</td><td>50ng/mL</td></tr><tr><td>재조합 인간 Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>재조합 인간 Rspondin-1</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td>500 ng/mL</td></tr><tr><td>재조합 인간 FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>재조합 인간 HGF</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>WNT3a</td><td>R& D systems</td><td>5036-WN</td><td>200 ng/mL</td></tr><tr><td>기타 소모품 및 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>최종 농도</td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130-1G</td><td>5 mg/ </td></tr><tr><td>소 췌장에서 나온 mL Deoxyribonuclease I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25-100MG</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td>1X</td></tr><tr><td>HBSS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>ThermoFisher</td><td>14170112</td><td>1X</td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; 폴리스티렌 마이크로플레이트 (24-웰)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#08-772-51</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; 폴리스티렌 마이크로플레이트(12-Well)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#0877229</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers, 40 &micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>#08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA MiniPrep (50 &micro; g)</td> <td>Genesee Scientific</td><td>11-331</td><td></td></tr><tr><td>Trizol 시약</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F-12, HEPES, 페놀 레드</td><td>없음 ThermoFisher</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 숯 벗겨짐</td><td>시그마 Aldrich</td><td>F6765-500ML</td><td>2 %</td></tr> <tr><td>Estratiol (E2)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>E1024-1G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>포름 알데히드 16 % 수성 솔루션, EM 등급</td><td>VWR</td><td>15710</td><td>4%</td></tr><tr><td>Epredia 카세트 1 슬롯 티슈 카세트</td><td>Fisher Scientific</td><td>1000961</td><td></td></tr><tr><td>Epredia 스테인리스 스틸 임베딩 베이스 몰드</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-010-15&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 200 proof (100%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-601&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90147</td><td></td></tr><tr><td>Permount 마운팅 미디엄</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-277-97</td><td></td></tr><tr><td>Epredia 나일론 생검 백</td><td>Fisher Scientific</td><td>6774010</td><td></td></tr><tr><td>HistoGel 표본 처리 젤</td><td>VWR</td><td>83009-992</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin 용액 Premium</td><td>VWR</td><td>95057-844</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y (노란빛) 용액 프리미엄</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>TBS 버퍼, 20X, pH 7.4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8054</td><td>1X</td></tr><tr><td>TBST (10X), pH 7.4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8056</td><td>1X</td></tr><tr><td>시트르산&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0759-1KG</td><td></td></tr><tr><td>시트르산 나트륨 삼염기성 이수화물</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4641-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-100G</td><td>3%</td></tr><tr><td>DAPI 용액(1mg/mL)</td><td>ThermoFisher</td><td>62248</td><td>1:1000 희석</td></tr><tr><td>VECTASHIELD 안티페이드 마운팅 미디엄</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>투명 매니큐어</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1849418</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드</td><td>Fisher 과학적인</td><td>22037246</td><td></td></tr><tr><td>VWR 마이크로 커버 안경</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript VILO 마스터 믹스</td><td>ThermoFisher</td><td>11755050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR 마스터 믹스</td><td>ThermoFisher</td><td>4364346</td><td></td></tr><tr><td>Krt8 항체 (TROMA-I)&nbsp;</td><td>DSHB</td><td>트로마-I&nbsp;</td><td>1:50 희석</td></tr><tr><td>Vimentin Antobody</td><td>Cell Signaling</td><td>5741S</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>당나귀 anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsosorbed Secondary 항체, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21209</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsosbed Secondary 항체, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21206</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>ZEISS Stemi 508 Stereo 현미경</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1 디지털 카메라가 있는 도립 일상 현미경</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Primer Sequence</td><td>Forward (5'-3')</td><td>Reverse (5'-3')</td><td>_</td></tr><tr><td>Lipocalin 2 (Lcn2)</td><td>GCAGGTGGTACGTTGGG</td><td>CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC</td><td></td></tr><tr><td>락토페린(Ltf)</td><td>TGAGGCCCTTGGACTCTGT</td>, <td>ACCCACTTTTCTCTCTCGTTC</td><td></td></tr>, <tr><td>프로게스테론(Pgr)</td><td>CCCACAGGAGTTTGTGTCAAGCTC,</td><td>TAACTTCAGACATCATTTCCGG</td><td></td></tr>, <tr><td>글리세르알데히드 3, 인산염 탈수소효소(Gapdh)</td><td>CAATGTGTCCGTCGTGGATCT,</td><td>GCCTGCTTCACCACCTTCTT</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 자궁에서 3d 자궁 내막 오가노이드 확립

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

자궁 내막 조직은 자궁의 내강을 따라 늘어서 있으며 에스트로겐과 프로게스테론의 주기적 통제하에 있습니다. 그것은 내강 및 선 상피, 간질 구획, 혈관 네트워크 및 복잡한 면역 세포 집단으로 구성된 조직입니다. 마우스 모델은 자궁 내막을 연구하는 강력한 도구였으며 이식, 태반 및 암을 제어하는 중요한 메커니즘을 밝혀 냈습니다. 최근 3D 자궁내막 오가노이드 배양의 개발은 자궁내막 생물학의 기초가 되는 신호 전달 경로를 해부하는 최첨단 모델을 제시합니다. 유전자 조작 마우스 모델에서 자궁내막 오가노이드를 확립하고, 전사체를 분석하고, 단일 세포 분해능으로 형태를 시각화하는 것은 자궁내막 질환 연구에 중요한 도구입니다. 이 논문은 마우스에서 자궁 내막 상피의 3D 배양을 확립하는 방법을 설명하고 유전자 발현을 정량화하고 오가노이드의 조직학을 분석하는 기술을 설명합니다. 목표는 자궁내막 상피 오가노이드의 유전자 발현 및 형태학적 특성을 확립, 배양 및 연구하는 데 사용할 수 있는 리소스를 제공하는 것입니다.

마우스 자궁내막 오가노이드의 위상차 이미지 첨부된 프로토콜에 설명된 대로 WT 마우스 자궁내막 상피에서 오가노이드를 확립했습니다( 그림 1의 다이어그램 참조). 마우스 자궁 내막 상피의 효소 해리에 이어, 상피 시트를 자궁 기질 세포로부터 기계적으로 분리하고 콜라게나제로 더 해리시켜 단일 세포 현탁액을 생성시켰다. 올바르게 수행되면 이 상피 및 기질 세포 분리 방법은 반대 세포 유형의 10%-15% 이하의 오염을 가진 샘플을 생성해야 합니다( 그림 2의 면역형광 이미지 참조). 이어서, 상피 세포 펠렛을 겔 매트릭스에 재현탁시키고, 실온에서 겔화시키고, 조직 배양 플레이트 상의 25 μL 돔으로 플레이팅하였다. 겔 매트릭스 돔이 응고 된 후, 이들은 유기체 배지로 겹쳐서 성장시켰다. 우리는 일반적으로 자궁 내막 상피 세포가 그림 3과 같이 3-4</s...

이 프로토콜은 유전자 발현 및 조직학적 분석을 위한 마우스 자궁내막 상피 오가노이드를 확립하는 방법론을 설명합니다.

마우스 자궁에서 3D 자궁 내막 오가노이드 확립

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

이 프로토콜은 자궁 내막 오가노이드 배양을 위해 마우스 자궁에서 고순도 자궁 상피를 분리하는 단계별 방법론을 보여주기 때문에 중요합니다. 이 방법은 효소 및 기계적 해리를 효율적으로 활용하여 자궁 상피를 분리합니다. 이 기술은 분리된 상피에서 파생된 자궁내막 상피 오가노이드를 확립, 치료 및 분석하기 위해 간소화되었습니다.사용하기 전에 약 1-2 시간 동안 얼음에서 젤 매트릭스를 해동하여 시작하십시오. 그런 다음 안락사 된 마우스를 가위로 복부에 정중선 절개를하고 피부를 부드럽게 벗겨 밑에있는 복막층을 노출시켜 해부합니다. 복부 지방 패드를 부드럽게 옆으로 움직여 자궁 뿔을 찾고 자궁 경부 접합부에서 자궁 뿔을 잡고 장간막 지방을 따라 절단하십시오.마우스 자궁을 해부 한 후 작은 가위로 자궁 뿔에서 지방 조직을 철저히 제거하십시오. 완료되면 각 자궁 뿔을 각각 약 4-5mm 크기의 작은 조각으로 자릅니다. 한 자궁의 모든 자궁 조각을 0.5 밀리리터의 1 % 트립신이 들어있는 24 웰 플레이트의 한 우물에 넣습니다.그런 다음 24웰 플레이트를 섭씨 37도의 가습 조직 배양 인큐베이터에서 약 1시간 동안 배양하여 밑에 있는 기질에서 자궁내막 상피를 효소적으로 분리합니다. 배양 후, 자궁 단편을 Dulbecco의 인산염 완충 용액 또는 DPBS 1 밀리리터를 함유하는 35 밀리미터 조직 배양 플레이트로 옮깁니다. 다음으로, 자궁 단편의 한쪽 끝을 집게로 잡고 피펫 끝을 단편을 가로질러 세로로 부드럽게 움직여 자궁관의 다른 쪽 끝에서 상피를 짜내어 해부 현미경으로 자궁 상피를 분리합니다.그런 다음 해부 현미경으로 자궁 조각에서 분리 된 상피 시트를 관찰하십시오. 다음으로, 1 밀리리터 피펫을 사용하여 모든 상피 시트를 동일한 1.5 밀리리터 튜브로 부드럽게 옮깁니다. 해리된 상피 시트를 375 x g에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화한다.세포 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 제거하고 세포 펠릿을 밀리리터 콜라게나제 0.5밀리리터에 DNA 용액 밀리리터당 2밀리그램을 더한 2밀리리터에 재현탁시킵니다. 약 10회 위아래로 또는 단일 세포 현탁액이 달성될 때까지 피펫팅합니다. 다음으로 DMEM F/12 0.5ml와 소 태아 혈청 10% 또는 FBS와 항생제를 넣고 375 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.상청액을 제거하고 1 밀리리터 DMEM / F12와 10 % FBS와 항생제에 세포를 재현 탁시키고 세포를 원심 분리합니다. 준비가 될 때까지 젤 매트릭스를 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 원심분리기로부터 상층액을 세포로부터 제거하고, 기포를 도입하지 않고 겔 매트릭스의 20배 부피를 사용하여 세포 펠렛을 재현탁시킨다.겔 매트릭스 세포 현탁액을 실온에서 약 10분 동안 침전시킵니다. 겔 매트릭스 셀 현탁액이 반고체 겔이 되면 넓은 구멍의 200마이크로리터 팁이 있는 P200 마이크로피펫을 사용하고 25마이크로리터의 겔 매트릭스 세포 현탁액을 부드럽게 흡입합니다. 12웰 플레이트의 웰당 3개의 개별 25마이크로리터 돔을 분주하고 겔 매트릭스가 15분 동안 경화되도록 하고 섭씨 37도의 가습 조직 배양 인큐베이터를 사용합니다.겔 매트릭스가 경화된 후, 겔 매트릭스 돔을 포함하는 각 웰에 750마이크로리터의 오가노이드 배지를 첨가하고, 가습된 조직 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도의 인큐베이터를 첨가한다. 마우스 자궁내막 오가노이드의 위상차 이미지는 상피 및 기질 세포 분리가 반대 세포 유형의 10%에서 15% 이하의 오염을 가진 샘플을 산출한다는 것을 보여주었습니다. 자궁내막 상피 세포는 3 내지 4일 이내에 오가노이드로 조립되었다.절편된 포르말린 고정 파라핀 포매 자궁내막 오가노이드는 헤마톡실린 및 에오신 염색에 의해 시각화되었으며, 이는 오가노이드의 내강인 상피 및 중공 중심의 단일 층을 표시했습니다. 형광 현미경 이미징은 오가노이드의 모든 세포가 사이토케라틴 8 양성이고 DAPI를 함유하고 있음을 보여주었으며, 이는 자궁내막 오가노이드의 고정, 삽입 및 처리가 항체 기반 면역염색과 호환됨을 나타냅니다. 실시간 정량 PCR은 10 나노 몰 에스트라 디올로 자극하면 상피 오가노이드에서 리포칼린 2, 락토페린 및 프로게스테론 수용체의 발현이 증가한다는 것을 보여 주었으며, 이는 자궁 내막 상피 오가노이드가 에스트라 디올에 반응하는 유전자 발현 변화를 측정하는 데 성공적으로 사용될 수 있음을 나타냅니다.기계적 해리 단계에서 자궁내막 상피의 명확한 분리가 이루어지도록 하는 것이 중요합니다. 자궁관에서 나오는 상피를 관찰 할 수 있어야합니다. 다른 방법은 겔 매트릭스로 캡슐화함으로써 상피 오가노이드를 확립하는 것을 포함한다.원하는 경우, 기질 구획을 추가로 분해하여 3D 상피 기질 공동 배양을 생성할 수 있습니다. 이 방법은 자궁 내막의 재생을 제어하는 신호에 대한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 자궁 내막증, 임신 손실 및 암과 같은 여성의 질병을 치료하는 데 도움이 될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

장 장간막의 동맥 계단식으로 자궁 조직의 자동 이식에 의한 마우스 및 쥐에 endometriosis의 수술 유도의 설명입니다.

자궁의 자동 이식하여 수술 유발 Endometriosis의 마우스 모델

상피 및 기질 세포로 구성되는 인간 1 차 자궁내막 오르가노이드를 생성하고 네이티브 자궁내막 조직의 특성을 유지하는 프로토콜이 제시된다. 이 프로토콜은 자궁 조직 획득에서 자궁 내막 오르가노이드의 조직학적 처리에 이르는 방법을 설명합니다.

다세포 인간 1 차 자궁 내막 오르가노이드의 생성

자궁내막증의 많은 설치류 모델은 기술적 복잡성, 재현성 및/또는 면역 손상된 동물 또는 특수 리포터 마우스에 대한 필요성에 의해 제한됩니다. 우리는 독립적으로 검증 가능하고 객관적인 점수 매기기 시스템을 갖춘 실험용 마우스를 사용하여 병변 유도의 단순화 된 시스템을 제시하며, 난소 절제술 이나 생존 수술에 대한 요구 사항이 없습니다.

자연적으로 사이클링 마우스를 사용하는 자궁내막증의 신제닉 뮤린 모델

이 연구는 임상적으로 중요한 자궁내막증의 하위 유형인 자궁내막종을 시뮬레이션하도록 특별히 설계된 새로운 마우스 모델을 소개합니다. 이 모델은 C57BL/6J 마우스를 활용하여 자궁내막종 관련 불임의 기저에 있는 병태생리학적 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 하며, 현재 생식 의학의 지식 격차를 해소할 수 있는 정교한 도구를 제공합니다.

자궁내막종과 관련된 불임을 연구하기 위한 실험적 마우스 모델 수립

여기에서는 쥐 자궁내막 상피 줄기세포(reESC)를 분리 및 배양하여 쥐 자궁내막 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 자궁내막 질환의 체외 연구를 용이하게 하여 유전자 편집 및 기타 세포 조작을 가능하게 합니다.

쥐 자궁내막 상피 줄기세포에서 쥐 자궁 오가노이드의 생성 및 특성화

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얇은 자궁내막의 마우스 모델 구축

이 프로토콜은 시험관 내 및 생체 내에서 고급 장액성 난소 암종(HGSOC) 마우스 모델의 개발을 자세히 설명합니다. 쥐 나팔관 오가노이드의 파생, 인간 HGSOC 유전학을 요약하기 위한 유전자 변형, 종양의 생체 내 발달을 위한 동계 마우스의 난소 활액낭에 도입.

고급 장액성 난소 암종 모델링을 위한 나팔관 상피 세포의 마우스 유래 오가노이드 라인 개발

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유방 형태 형성을 재현하는 3차원 인간 유방 오가노이드를 생성하는 정의된 하이드로겔 기반 방법

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