Name: 자극 라만 산란 현미경을 사용한 타임랩스 라이브 셀 이미징을 위한 유연한 챔버 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 배우세요 자극 라만 산란 현미경을 위한 유연한 환경 챔버를 사용하여 SKOV3 세포의 지방 방울 역학을 24시간 동안 타임랩스 라이브 셀 이미징하는 방법을. 이 기술은 세포 대사 연구에 활용됩니다.

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현미경 인클로저 상자의 설계, 제작 및 테스트에 대해 Binghamton University의 2019년 학부 수석 디자인 팀(윤석철, Ian Foxton, Louis Mazza 및 James Walsh)에게 감사드립니다. 도움이 되는 토론을 해주신 Binghamton University의 Scott Hancock, Olga Petrova, Fabiola Moreno Olivas에게 감사드립니다. 이 연구는 수상 번호 R15GM140444에 따라 국립 보건원(National Institutes of Health)의 지원을 받았습니다.

1. 현미경 환경 인클로저 구축
참고: 이 대형 현미경 환경 인클로저는 현미경 본체의 온도와 이미징 환경을 37°C에서 안정화하는 데 사용됩니다(그림 1A).
<ol><li>광학 테이블의 마커 펜을 사용하여 SRS 현미경 프레임과 전동 스테이지의 발 위치를 표시합니다. 현미경의 검류계 스캐너 앞에 두 개의 홍채 다이어프램을 장착하고 펌프와 Stokes 레이저 빔이 조리개 다이어프램의 중앙을 통과하도록 조정합니다.</li>
	<li>현미경 프레임과 s를 제거합니다.tage 광학 테이블에서.</li>
	<li>실리콘 고무 시트(크기: 31 x 29인치, 두께: 1/8인치)를 광학 테이블(그림 1B)에 놓습니다.</li>
	<li>칼을 사용하여 표시를 따라 실리콘 고무를 자르고 작은 고무 조각을 제거한 다음 정사각형 MICA 세라믹 시트(크기: 6 x 6인치, 두께: 1/4인치)를 같은 위치에 놓습니다. 참고: MICA 세라믹은 가공하기 쉬운 소재입니다15. 알루미늄만큼 단단하지만 우수한 단열재입니다. MICA 세라믹 시트는 금속 현미경 프레임과 스테이지에서 스테인리스 스틸 광학 테이블로의 열 전달을 막는 데 사용되었습니다. 프레임과 스테이지의 발을 장착하기 위해 1/4-20 나사를 사용할 수 있도록 MICA 시트에 몇 개의 관통 구멍을 뚫어야 합니다.</li>
	<li>현미경 프레임과 스테이지를 광학 테이블로 다시 이동하고 마커 라인을 따라 MICA 세라믹 시트에 발을 조심스럽게 맞춥니다. 1/4-20 나사를 사용하여 프레임과 s를 장착합니다.tage 테이블 위에.</li>
	<li>SRS 광 경로를 다시 정렬합니다. 미러 1과 미러 2의 미러 마운트를 조정하여 레이저 빔이 미리 장착된 두 개의 조리개 다이어프램의 중앙을 통과하도록 합니다(그림 2). 참고: 현재 라이브 셀 이미징 작업에 사용되는 실험실에서 제작한 SRS 현미경의 기술적 세부 사항은 이전에16에 설명되어 있습니다. 펌프와 스톡스 빔의 펄스 폭은 유리 막대 분산으로 ~ 3-4ps입니다. 시스템은 ScanImage17 소프트웨어를 사용하여 제어됩니다.</li>
	<li>이 단열 기초 위에 5개의 대형 폴리카보네이트 시트(크기: 31 x 29 x 28인치, 두께: 0.25인치)를 사용하여 전체 현미경 프레임을 덮도록 환경 인클로저를 조립합니다. 참고: 인클로저 상자의 크기는 현미경 프레임과 스테이지의 크기에 따라 결정됩니다. 현미경 인클로저 상자의 전면 패널은 플렉시블 챔버를 설치하고 세포 배양 접시를 로드하기 위해 일시적으로 제거해야 합니다.<ol><li>인클로저를 조립하려면, 절단을 포함한 간단한 가공 작업 수행, 드릴링, 폴리카보네이트 시트의 각 가장자리에 나사 구멍 두드리기. 입구 및 출구 튜브에 맞도록 인클로저의 오른쪽과 왼쪽 시트에 직경 2.6인치의 큰 구멍 두 개를 자릅니다. 레이저 빔이 인클로저로 들어갈 수 있도록 후면 시트에 직경 5mm의 작은 구멍을 자릅니다.</li>
	</ol></li>
	<li>알루미늄 호일 테이프를 사용하여 상자의 가장자리와 인터페이스를 밀봉합니다.</li>
	<li>플렉시블 덕트 호스를 인클로저 상자의 입구 및 출구 포트에 연결하여 순환된 따뜻한 공기 흐름이 히터 모듈에 의해 펌핑되고 제어되도록 합니다. 히터 모듈의 열 센서를 세포가 배양되고 이미지화되는 유연한 챔버에 놓습니다. 목표 온도를 37°C로 설정합니다. 알림: 디퓨저는 환경 인클로저에서 보다 균일한 공기 흐름 분포를 얻기 위해 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 플렉시블 챔버 조립
<ol><li>가공된 속이 빈 원통형 알루미늄 조각 1(재질: 알루미늄 6061)을 3개의 고정 나사를 사용하여 대물렌즈의 노즈피스에 장착합니다(그림 2).</li>
	<li>4개의 1/4-20 나사를 사용하여 가공된 중공 원통형 알루미늄 조각 2를 샘플 홀더에 장착합니다(그림 2). 알림: 샘플 홀더는 50mm 커버 유리 바닥 세포 배양 접시를 고정하도록 수정해야 합니다. 1-7/8인치 구멍 톱을 사용하여 샘플 홀더 중앙에 관통 구멍을 뚫습니다. 50mm 구멍 톱을 사용하여 구멍을 카운터보어하고 관통 구멍의 깊이를 ~1mm로 유지합니다.</li>
	<li>s를 맞춥니다.amp알루미늄 조각 2가 있는 홀더를 전동 스테이지에 장착하고 나사를 사용하여 장착합니다.</li>
	<li>가공된 두 개의 알루미늄 조각 사이에 천연 고무 필름 슬리브(두께: 0.01인치, 시아노아크릴레이트 접착제로 접착)를 놓고 양쪽 끝에 고무 밴드를 사용하여 장착합니다.</li>
	<li>적절한 튜브와 커넥터를 사용하여 압축된CO2 실린더를 가스 혼합기 모듈에 연결합니다. CO2 입력 압력을 20-25psi로 설정합니다. 내장된 CO2 센서와 컨트롤러를 사용하여 공기 혼합기 모듈이 5%CO2를 공기 흐름으로 조절하고 혼합할 수 있는지 확인합니다. 인라인 필터를 사용하여 공기 흐름을 청소하십시오.</li>
	<li>적절한 튜브와 커넥터를 사용하여 혼합 공기(5%CO2 포함)를 핫 플레이트에 놓인 사전 멸균된 물병으로 안내한 다음 가습된 공기를 유연한 챔버로 안내합니다. 핫 플레이트를 37 °C로 설정합니다. 따뜻한 물에 공기 흐름을 거품을 일으켜 공기 흐름의 습도를 높입니다.</li>
</ol>3. 타임랩스 생세포 SRS 이미징 실험을 위한 준비
<ol><li>노즈피스, 침지 대물렌즈 및 샘플 홀더를 포함하여 70% 에탄올로 유연한 챔버의 모든 부분을 닦습니다.</li>
	<li>UV 램프를 사용하여 전체 인클로저 시스템의 오염을 제거합니다.amp 20-30분 동안 인클로저에 배치합니다. 알림: 안전을 위해 UV 소독 과정에서 실험실에 머물지 마십시오.</li>
	<li>SKOV3 세포를 일반 인큐베이터에서 정상적인 생리학적 조건 하에서 12시간 동안 50mm 유리 바닥 페트리 접시에 배양합니다. 참고: 표준 생물 안전 캐비닛에서 SKOV3 세포 배양18 을 시작합니다.</li>
	<li>가공된 알루미늄 조각 2를 s에서 분리합니다.amp나사를 제거하여 홀더. 참고: 이것은 세포 배양 접시를 넣기 위해 유연한 챔버를 여는 방법입니다.</li>
	<li>세포 배양 접시를 넣습니다. 세포 배양 접시를 놓기 전에 콘덴서 상단에 침지 오일을 추가하는 것을 잊지 마십시오. 접시의 덮개를 제거하고 클램프를 사용하여 접시를 고정합니다. 알림: 오염을 방지하려면 모든 작업을 장갑을 끼고 수행해야 합니다.</li>
	<li>대략적으로 초점을 맞추기 위해 대물렌즈를 세포 배양 배지로 내립니다. 알루미늄 조각 2를 내려 유연한 챔버를 둘러싸고 나사를 사용하여 샘플 홀더에 장착합니다. 알림: 알루미늄 조각 2의 바닥에 2mm 실리콘 고무 쿠션 패드가 부착되어 틈을 단단히 밀봉합니다.</li>
	<li>200cc/min의 공기 유량으로 일반 세포 배양을 위해 5%CO2 및 19% O2 로 공기 공급을 설정합니다. 알림: 더 낮은 공기 흐름 속도를 사용할 수 있습니다. 유연한 챔버가 얼마나 잘 밀봉되어 있는지에 달려 있습니다.</li>
</ol>4. 타임랩스 라이브 셀 SRS 이미징 실험 수행
<ol><li>레이저 파장을 805nm로 조정하여 CH2 화학 결합의 진동에 기인하는 2854cm-1 라만 편이를 목표로 합니다. 낮은 레이저 출력을 사용하여 세포의 광손상을 줄입니다. 이 프로토콜을 따르려면 장기 라이브 셀 이미징을 위해 펌프 레이저의 평균 출력이 ~15mW이고 Stokes 레이저의 ~7.5mW(1,045nm로 고정됨)를 사용합니다. 알림: 레이저 출력이 높을수록 SRS 이미징 품질이 향상됩니다. 그러나 레이저 출력이 너무 높으면 살아있는 세포에 광손상을 유발할 수 있습니다. 이미지 품질과 사진 손상 사이에는 상충 관계가 있습니다.</li>
	<li>소프트웨어의 MAIN CONTROLS 패널에 있는 FOCUS 버튼을 사용하여 세포의 우수한 SRS 이미징을 얻을 수 있도록 대물렌즈를 조정하고 초점을 맞춥니다. 빠른 초점을 맞추려면 구성 패널에서 픽셀 수를 512 × 512픽셀로 설정하고 픽셀 유지 시간을 4.8μs로 설정합니다.</li>
	<li>락인앰플리파이어 입력 범위(통상 5mV)를 최대 신호 전압의 두 배로 설정합니다. 저역 통과 필터를 픽셀 유지 시간(4.8μs)과 동일하게 설정합니다. 참고: 실험실에서 구축한 SRS 시스템마다 다른 데이터 수집 설정을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>초점을 잘 맞춘 후 고품질 이미지 획득을 위해 이미징 해상도를 2,048μm 2 시야각에 대해 175× 2 픽셀로 설정합니다. MAIN CONTROLS 패널에서 SAVE 기능을 확인하고 CHANNELS 패널에서 SRS 채널을 확인합니다. MAIN CONTROLS 채널에서 두 프레임 사이의 간격 시간을 180초(3분)로 설정합니다. 24시간 이상의 타임랩스 이미징을 위해 획득 번호를 480으로 설정합니다. 참고: 실험 목적에 따라 더 낮은 이미징 해상도를 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>MAIN CONTROLS 패널의 LOOP 기능을 사용하여 자동 이미징 수집을 시작합니다. 알림: 이미징 첫 1시간 동안 온도 불안정으로 인한 초점 드리프트가 있는지 확인하십시오. 첫 번째 시간 이미징이 안정적이지 않을 수 있습니다. 타임랩스 이미징 세션 동안 2-3시간마다 초점을 확인하십시오.</li>
	<li>ImageJ19를 사용하여 수집된 이미지를 처리합니다. LD 정량화를 위해 다음 두 가지 방법을 사용하십시오: (i) LD/세포체 면적 비율 및 (ii) 총 LD의 평균 SRS 강도. 2,854cm-1에서 SRS 이미지의 비세포 픽셀을 임계값 및 영점 조정하여 세포체 면적을 측정합니다. SRS 이미지에서 비 LD 픽셀을 임계값화하고 영점 조정하여 LD 영역과 강도를 측정합니다. 참고: SRS 이미지 처리에 대한 자세한 내용은 이전에보고되었습니다 16.</li>
</ol>

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<li>Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+autofocus+methods+for+automated+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Comparison of autofocus methods for automated microscopy.</a> Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).</li>
<li>Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanoreciprocity+in+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanoreciprocity in cell migration.</a> Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).</li>
<li>Zong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmon-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+single-molecule+detection+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).</li>
<li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-multiplex+vibrational+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Super-multiplex vibrational imaging.</a> Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

타임랩스 라이브 셀 SRS 현미경은 라벨 없는 방식으로 분자 추적을 위한 대체 이미징 기술입니다. 형광 표지와 비교하여 SRS 이미징은 광표백이 없어 분자를 장기간 모니터링할 수 있습니다. 그러나, 현재까지, 직립 SRS 현미경 상의 라이브 세포 이미징 시스템은 상업적으로 이용가능하지 않다. 이 작업에서는 안정적인 단열 현미경 인클로저 상자와 유연한 내부 소프트 챔버가 있는 라이브 셀 이미징 시스템을 개발하여 전송된 SRS 타임랩스 이미징을 가능하게 했습니다. 이 설정에서 대형 인클로저 박스는 37°C에서 온도 안정성을 유지하는 반면, 내부 소프트 챔버는 가습된 공기를 공급하여 최적의 세포 배양 환경을 구축합니다. 이 연구에서 입증된 유연한 개방 챔버는 살아있는 세포의 장기 SRS 이미징을 위한 간단한 워크플로우를 가능하게 합니다. 유리 바닥 접시에 파종된 세포는 이미징을 위해 유연한 온스테이지 챔버로 옮기기 전에 먼저 일반 인큐베이터에서 준비 및 배양할 수 있습니다. 라이브 세포 SRS 이미징을 수행하기 위한 대안적인 해결책은...

광학 현미경은 샘플의 미세 구조를 관찰하는 데 사용됩니다. 광학 이미징은 다른 기술보다 빠르고, 덜 침습적이며, 덜 파괴적입니다1. 광학 현미경을 이용한 생세포 이미징은 장기간에 걸쳐 배양된 생세포의 역학을 포착하기 위해 개발되었다2. 다양한 유형의 광학 대비는 생물학적 샘플에 대한 뚜렷한 정보를 제공합니다. 예를 들어, 광학 위상 현미경은 샘플3에 걸친 굴절률의 미묘한 차이를 보여줍니다. 형광 현미경은 특정 생체 분자 또는 세포 소기관을 이미지화하는 데 널리 사용됩니다. 그러나, 형광의 광대역 여기 및 방출 스펙트럼은 일반적으로 다색 이미징이 수행될 때 스펙트럼 중첩을 초래한다4. 형광 분자는 빛에 민감하며 장기적이고 주기적으로 빛에 노출되면 표백될 수 있습니다. 또한, 형광 표지는 세포 내 분자의 생체 분포를 변화시킬 수 있다5. SRS 현미경은 무표지 화학 이미징 기술입니다6. SRS의 대비는 특정 화학 결합의 진동 전이에 의존합니다. 화학 결합의 진동 주파수는 종종 좁은 스펙트럼 대역폭을 나타내므로 동일한 샘플에서 여러 라만 대역을 이미지화하는 것이 가능합니다7. SRS 현미경은 살아있는 세포 이미징을 위한 고유한 도구로, 라벨 없는 방식으로 여러 화학적 대조를 제공합니다8.
염색되지 않은 세포의 SRS 이미징은 많은 연구에 사용되었지만 살아있는 세포의 장기 타임랩스 SRS 이미징은 널리 채택되지 않았습니다. 한 가지 이유는 상업용 개방형 챔버가 두께9,10,11,12의 크기 때문에 SRS 이미징에 직접 사용할 수 없기 때문입니다. 유리 뚜껑이 있는 이 챔버는 대부분 역방향 검출 체계와 함께 단일 높은 NA 대물렌즈를 사용하는 명시야 또는 형광 이미징을 위해 설계되었습니다. 그러나, SRS 이미징은 높은 NA 대물렌즈와 높은 NA 콘덴서를 모두 사용하는 송신 검출을 선호하며, 이는 대물렌즈와 콘덴서 사이에 매우 짧은 갭(전형적으로 수 밀리미터)만을 남긴다. 이 문제를 극복하기 위해 우리는 직립 현미경 프레임을 사용하여 살아있는 세포의 타임랩스 SRS 이미징을 가능하게 하는 부드러운 재료를 사용하여 유연한 챔버를 설계했습니다. 이 설계에서 침수 대물렌즈는 소프트 챔버에 둘러싸여 있으며 초점 및 이미징 목적을 위해 3차원으로 자유롭게 이동할 수 있습니다.
대부분의 포유류 세포를 배양하기 위한 최적의 온도는 37°C인 반면 실온은 항상 이보다 10° 낮습니다. 37°C보다 높거나 낮은 온도는 세포 성장률에 극적인 영향을 미친다13. 따라서 생세포 이미징 시스템에서는 세포 배양 환경의 온도 제어가 필요합니다. 온도 불안정은 장시간 이미징 중에 초점 흐림으로 이어지는 것으로 알려져 있다14. 안정적인 37°C 환경을 달성하기 위해 현미경 아래의 단열층을 포함하여 전체 현미경 프레임을 덮을 수 있는 대형 인클로저 챔버를 구축했습니다(그림 1). 크기가 큰 온도 제어 챔버 내에서 작고 유연한 챔버는 5%CO2로 보충된 조절된 공기 흐름을 통해 생리학적 습도와 pH를 정확하게 유지하는 데 도움이 됩니다(그림 2). 챔버의 온도 및 습도를 측정하여 이중 챔버 설계가 장기적이고 주기적인 SRS 이미징 하에서 세포 성장을 위한 최적의 세포 배양 조건을 제공하는지 확인했습니다(그림 3). 그런 다음 SKOV3 암세포에서 시간 경과 이미징 및 지질 방울(LD) 추적을 위한 시스템의 적용을 시연했습니다(그림 4, 그림 5 및 그림 6).

<table><tbody><tr><td>실험실에서 제작한 SRS 현미경</td><td></td><td></td><td>https://rdcu.be/cP6ve</td></tr><tr><td>HF2LI 50MHz 락인 앰플리버</td><td>취리히 악기</td><td>HF2LI</td><td></td></tr><tr><td>조리개 다이어프램</td><td>Thorlabs Inc</td><td>SM1D12</td><td></td></tr><tr><td>Kinematic Mirror Mount</td><td>Thorlabs Inc</td><td>KM100</td><td></td></tr><tr><td>현미경 프레임</td><td>Nikon Inc</td><td>FN-1</td><td></td></tr><tr><td>전동 현미경 검사 단계</td><td>: Prior Scientific</td><td>Z-Deck</td><td></td></tr><tr><td>오일 이멀젼 콘덴서(C-AA, Achromat/Aplanat, NA 1.4)</td><td>Nikon Inc</td><td>MBL71405</td><td></td></tr><tr><td>침수 대물렌즈(CFI75 Apo 25XC W 1300)</td><td>Nikon</td><td>Inc MRD77225</td><td></td></tr><tr><td>현미경 인클로저용 재료 및 부품(31'' x 29'' x 28'' L x W x H)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Airtherm 히터 모듈</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>AIRTHERM-SAT-1W</td><td></td></tr><tr><td>Airtherm 히터 컨트롤러, CO2 및 습도 모니터</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>AIRTHERM-SMT-1W</td><td></td></tr><tr><td>Air/CO2 믹서 모듈</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>ECU-HOC-W</td><td></td></tr><tr><td>플렉시블 덕트 호스 (2-1 / 2 "ID, 2-3 / 4"OD)</td> <td>McMaster-Carr</td><td>56675K71</td><td></td></tr><tr><td>고온 유리 - 운모 세라믹, 기계 가공이 쉬운 (6 "x 6", 1/4 "두께)</td> <td>McMaster-Carr</td><td>8489K62</td><td></td></tr><tr><td>폴리 카보네이트 시트 (두께 0.25 "")</td><td>McMaster-Carr</td><td>8574K286</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 고무 시트 (36 "x 36", 두께 1/8 ")</td><td>McMaster-Carr</td><td>5827T43</td><td></td></tr><tr><td> Flexible chamber</td><td></td><td></td><td></td>Hot plate 용 재료 및 부품</tr> <tr><td></td><td>McMaster-Carr</td><td>31745K11</td><td></td></tr><tr><td>고순도 인라인 필터, 1/4 NPT</td><td>McMaster-Carr</td><td>6645T18</td><td></td></tr><tr><td>구멍 톱 (절단 직경 1-7 / 8 inch)</td><td>McMaster-Carr</td><td>4066A34</td><td></td></tr><tr><td>홀 쏘 (절단 직경 50 mm)</td><td>McMaster-Carr</td><td>4556A19</td><td></td></tr><tr><td>고온 실리콘 고무 튜브, 연질, 2 mm ID, 5 mm OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>5054K313</td><td></td></tr><tr><td>인라인 필터 (1/4 NPT, 40 미크론)</td><td>McMaster-Carr</td><td>98385K843</td><td></td></tr><tr><td>다목적 6061 알루미늄 원형 튜브 (1/8 ''벽 두께, 4' ' OD)</td><td>McMaster-Carr</td><td>9056K42</td><td></td></tr><tr><td>다목적 6061 알루미늄 원형 튜브 (3/4'' 벽 두께, 3-3/4'' OD)</td><td>McMaster-Carr</td><td>9056K47</td><td></td></tr><tr><td>다목적 6061 알루미늄 바 (12'' x 12'', 두께 1/4'')</td><td>McMaster-Carr</td><td>8975K142</td><td></td></tr><tr><td>다목적 6061 알루미늄 바(8'' x 8'', 두께 3/8' ')</td><td>McMaster-Carr</td><td>9246K21</td><td></td></tr><tr><td>대물렌즈 노즈피스(단일)</td><td>Nikon Inc</td><td>FN-MN-H</td><td></td></tr><tr><td>샘플 홀더(수정)</td><td>Prior Scientific</td><td>HZ202</td><td></td></tr><tr><td>초박형 천연 고무 필름(두께 0.01'')</td><td>McMaster-Carr</td><td>8611K13</td><td></td></tr><tr><td>진공 밀봉 유리 항아리</td><td>McMaster-Carr</td><td>3231T44</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (피지)</td><td></td><td>imagej.net</td><td></td></tr><tr><td>ScanImage</td><td>Vidrio Technologies, LLC</td><td></td><td>SRS 이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>Materials for live-cell imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cover glass bottom sterile culture dish (Dia.x H, 50 x 7 mm)</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>70674-02</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 세포 배양 배지</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>LysoSensor 형광 염료 DND-189</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L7535 (Invitrogen)</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid</td><td>MilliporeSigma</td><td>364525</td><td></td></tr><tr><td>SKOV3 세포주</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td></td></tr></tbody></table>

자극 라만 산란 현미경을 사용한 타임랩스 라이브 셀 이미징을 위한 유연한 챔버

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

자극 라만 산란(SRS) 현미경은 라벨이 필요 없는 화학 이미징 기술입니다. SRS를 사용한 생세포 이미징은 많은 생물학적 및 생물 의학 응용 분야에서 입증되었습니다. 그러나, 살아있는 세포의 장기 타임랩스 SRS 이미징은 널리 채택되지 않았다. SRS 현미경은 고해상도 이미징을 달성하기 위해 높은 개구수(NA) 침수 대물렌즈와 높은 NA 오일 이멀젼 콘덴서를 사용하는 경우가 많습니다. 이 경우 대물렌즈와 콘덴서 사이의 간격은 몇 밀리미터에 불과합니다. 그러므로, 대부분의 상업적인 단계 정상 환경 약실은 단단한 유리제 덮개를 가진 그들의 큰 간격 때문에 SRS 화상 진찰을 위해 이용될 수 없습니다. 이 백서는 정립 현미경 프레임에서 전송된 SRS 신호 감지를 통해 타임랩스 라이브 셀 이미징에 사용할 수 있는 유연한 챔버의 설계 및 제작에 대해 설명합니다. 챔버의 유연성은 얇은 천연 고무 필름 인 부드러운 소재를 사용하여 달성됩니다. 새로운 인클로저 및 챔버 설계는 기존 SRS 이미징 설정에 쉽게 추가할 수 있습니다. 테스트 및 예비 결과는 플렉서블 챔버 시스템이 향후 다양한 바이오이미징 애플리케이션에 사용될 수 있는 살아있는 세포의 안정적이고 장기적인 타임랩스 SRS 이미징을 가능하게 한다는 것을 보여줍니다.

타임랩스 SRS 이미징을 위한 플렉시블 챔버 시스템을 제작 및 조립한 다음(그림 1 및 그림 2) 시스템의 성능을 평가했습니다. 현미경 환경 인클로저 내부의 온도는 1시간 이내에 예상 37°C에 도달했으며, 이는 실내 온도에 큰 영향을 미치지 않았습니다(그림 3A). 가요성 챔버 내의 온도는 1.5 시간 내에 37 °C에 도달하였고, 적어도 24 시간 동안 37 °C에서 안정적으로 유지되었다 (도 3B). 플렉시블 챔버의 상대 습도는 1시간 내에 85%에 도달할 수 있으며 최소 24시간 동안 유지될 수 있습니다(그림 3C). 측정된 온도 및 습도 데이터는 이 시스템이 장기적인 세포 성장을 위한 최적의 환경을 제공할 수 있음을 확인합니다.
<p class="j...

우리는 전송된 신호 감지 기능이 있는 직립 자극 라만 산란 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 타임랩스 이미징을 위한 무대 상단의 유연한 환경 챔버를 보고합니다. 지질 방울은 3분 시간 간격으로 최대 24시간 동안 올레산으로 처리된 SKOV3 세포에서 이미지화되었습니다.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...

유연한 환경 챔버 기술은 작동 현미경 프레임에서 전송된 신호 감지를 통해 SRS 이미징으로 타임랩스를 가능하게 합니다. SRS 현미경은 높은 개구수 대물렌즈와 고급 콘덴서를 사용하여 기존 챔버가 들어갈 수 없는 몇 밀리미터의 간격만 남겼습니다. 유연한 챔버는 이 문제를 해결합니다.SRS 현미경을 사용하는 연구원은 이 기술을 쉽게 채택할 수 있습니다. 유연한 챔버는 또한 최적의 생리학적 조건에서 표본을 유지하기 위해 해부 또는 멸균 현미경에 사용할 수 있습니다. 시작하려면 광학 테이블의 마커 펜을 사용하여 SRS 현미경 프레임과 전동 스테이지의 발 위치를 표시하십시오.현미경 프레임과 s를 제거한 후tage 광학 테이블에서 실리콘 고무 시트를 테이블 위에 놓습니다. 칼을 사용하여 표시를 따라 실리콘 고무를 자릅니다. 작은 고무 조각을 제거하고 정사각형 운모 세라믹 시트를 같은 위치에 놓습니다.그런 다음 현미경 프레임과 스테이지를 광학 테이블로 다시 이동하고 마커 라인을 따라 발을 운모 세라믹 시트에 조심스럽게 맞춥니다. SRS 광학 경로를 재정렬한 후 5개의 대형 폴리카보네이트 시트를 사용하여 전체 현미경 프레임을 덮도록 단열 기초 위에 환경 인클로저를 조립합니다. 알루미늄 호일 테이프를 사용하여 상자의 가장자리와 인터페이스를 밀봉합니다.플렉시블 덕트 호스를 인클로저 상자의 입구 및 출구 포트에 연결하여 순환되고 따뜻한 공기 흐름이 히터 모듈에 의해 펌핑되고 제어되도록 합니다. 3개의 고정 나사를 사용하여 가공된 중공 원통형 알루미늄 조각 1을 대물렌즈의 노즈 피스에 장착합니다. 다음으로, 4개의 나사를 사용하여 가공된 중공 원통형 알루미늄 조각 2를 샘플 홀더에 장착합니다.알루미늄 조각 2가 있는 샘플 홀더를 전동 스테이지에 장착하고 나사를 사용하여 장착합니다. 가공된 두 개의 알루미늄 조각 사이에 천연 고무 필름 슬리브를 놓고 양쪽 끝에 고무 밴드를 사용하여 장착합니다. 적절한 튜브와 커넥터를 사용하여 압축된 CO2 실린더를 가스 혼합기 모듈에 연결합니다.CO2 입력 압력을 20-25psi로 설정합니다. 내장된 CO2 센서와 컨트롤러를 사용하여 에어 믹서 모듈이 5%CO2를 조절하고 공기 흐름에 혼합할 수 있는지 확인합니다. 인라인 필터를 사용하여 공기 흐름을 청소하십시오.적절한 튜브와 커넥터를 사용하여 혼합 공기를 핫플레이트에 놓인 사전 멸균된 물병으로 안내한 다음 가습된 공기를 유연한 챔버로 안내합니다. 핫플레이트를 섭씨 37도로 설정합니다. 따뜻한 물에 공기 흐름을 거품을 일으켜 공기 흐름의 습도를 높입니다.s에서 기계 알루미늄 조각 2를 분리합니다.amp나사를 제거하여 홀더. 노즈 피스를 포함하여 플렉시블 챔버의 모든 부분을 70% 에탄올로 닦습니다.ample 홀더 및 물 담그기 목표. UV 램프를 사용하여 전체 인클로저 시스템의 오염을 제거합니다.amp 인클로저에 20-30분 동안 배치합니다.그런 다음 세포 배양 접시를 넣습니다. 접시의 덮개를 제거하고 클램프를 사용하여 고정하십시오. 대략적으로 초점을 맞추기 위해 대물렌즈를 세포 배양 배지로 내립니다.알루미늄 조각 2를 내려 유연한 챔버를 둘러싸고 나사를 사용하여 샘플 홀더에 장착합니다. 그런 다음 센서를 삽입합니다. 일반 세포 배양을 위해 5% CO2 및 19% O2로 공기 공급을 분당 200입방센티미터의 공기 흐름 속도와 섭씨 37도로 설정합니다.레이저 파장을 805 나노 미터로 조정하여 CH2 화학 결합의 진동에 기인하는 2, 854 센티미터 역 라만 시프트를 목표로합니다. 낮은 레이저 출력을 사용하여 세포의 사진 손상을 줄입니다. 소프트웨어의 기본 컨트롤 패널에 있는 초점 버튼을 사용하여 세포의 우수한 SRS 이미징을 얻을 수 있도록 대물렌즈를 조정하고 초점을 맞춥니다.빠른 초점을 맞추려면 구성 패널에서 픽셀 번호를 512 x 512 픽셀로 설정하고 픽셀 유지 시간을 4.8마이크로초로 설정합니다. 초점을 잘 맞춘 후 고품질 이미지를 획득하기 위해 이미징 해상도를 2048마이크로미터 제곱 화각에 대해 2048 x 175 픽셀로 설정합니다. 메인 컨트롤 패널에서 저장 기능을 확인하고 채널 패널에서 SRS 채널을 확인합니다.메인 컨트롤 채널에서 두 프레임 사이의 간격 시간을 180초로 설정합니다. 24시간 이상의 타임랩스 이미징을 위해 획득 번호를 480으로 설정합니다. 메인 컨트롤 패널의 루프 기능을 사용하여 자동 이미징 획득을 시작합니다.타임랩스 SRS 이미징을 위한 플렉시블 챔버 시스템의 성능을 평가하였다. 현미경 환경 인클로저 내부의 온도는 예상 섭씨 37도에 도달했으며 실온에 큰 영향을 미치지 않았습니다. 플렉시블 챔버의 온도는 1.5 시간 만에 섭씨 37도에 도달했으며 최소 24 시간 동안 안정적으로 유지되었습니다.가동 가능한 약실에 있는 상대 습도는 1 시간 동안 85%를 도달하고 적어도 24 시간 동안 유지될 수 있었습니다. 살아있는 SKOV3 세포의 타임 랩스 SRS 이미징은 3 분의 시간 분해능으로 세포 내 지질 방울의 빠르고 활동적인 움직임을 보여주었습니다. 24시간 이미징 세션이 끝날 때까지 세포는 여전히 정상적인 형태와 밀도를 보였으며 이는 세포가 건강했음을 나타냅니다.다음으로, 올레산을 처리한 SKOV3 세포를 영상화하고, 10시간에 걸쳐 지질 액적 축적을 추적하였다. 지질 액적의 양은 지질 액적 대 세포체 면적 비율 및 지질 액적의 총 SRS 강도를 사용하여 정량화하였다. 결과는 지질 방울의 양이 10시간 동안 계속 증가했음을 나타냅니다.형광 염료 DND-189로 표지된 리소좀의 지질 방울의 동시 순방향 SRS 이미징 및 후방 2광자 형광 이미징도 입증되었습니다. 지질 방울과 리소좀의 매우 낮은 정도의 공동 국소화가 관찰되었습니다. 이 프로토콜을 시도할 때 초점 드리프트는 라이브 셀 이미징에서 일반적인 문제라는 점을 명심하십시오.약 2시간의 타임랩스 이미징 후에 초점을 다시 맞춰야 할 수 있습니다. 개발 후, 타임랩스 SRS 이미징은 살아있는 세포에서 라벨이 없는 분자 또는 라만 텍스트가 있는 라벨링된 분자를 추적하기 위한 다양한 연구에 사용되었습니다.

a-flexible-chamber-for-time-lapse-live-cell-imaging-with-stimulated

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

출처: Zhang, M. 외, 단일 박테리아 내 중수소 통합 자극 라만 산란 영상을 통한 신속 항균 감수성 검사. J. Vis. Exp. (2022)이 영상은 자극 라만 산란 현미경을 활용해 중수소 표지된 대사 활동을 추적하여 항생제에 대한 감수성을 평가하는 방법을 시연합니다. 탄소-중수소 신호를 모니터링함으로써 내성 및 감수성 박테리아 집단을 신속히 검출할 수 있게 합니다.

자극 라만 산란 현미경을 이용한 박테리아 항생제 감수성 검출

출처: Espinoza, R., et al. 조직 진단을 위한 마우스 뇌의 실시간 2색 자극 라만 산란 영상. J. Vis. Exp. (2022).  이 비디오는 쥐의 뇌 조직 절편에 대한 2색 자극 라만 산란(SRS) 이미징을 보여줍니다. 두 개의 동기화된 레이저 빔이 조직 부분으로 향하여 분자 진동을 여기시켜 빔의 상대적인 강도 변화를 초래합니다. 조직의 지질과 단백질은 레이저 빔의 고유한 주파수 쌍을 사용하여 검출됩니다. 그런 다음 결과 신호에 별도의 색상이 할당되어 조직의 단백질과 지질을 식별하는 데 도움이 되는 2색 이미지를 생성합니다.

마우스 뇌 조직의 2색 자극 라만 산란 이미징

이 기사는 여러 색상의 광학 초해상도로 동적 생물학적 과정을 이미지화하기 위해 TIRF-SIM(Total Internal Reflection Fluorescence Illumination)으로 작동하는 구조화 조명 현미경의 조립 및 작동에 대한 심층 가이드를 제공합니다.

여러 색상과 고속에서 구조화 조명 TIRF 현미경에 가이드

신속 하 고 높은 해상도 허용 하는 고급 현미경, 고립 된 플라즈마 멤브레인와 주변 세포내 볼륨의 이미지를 제시 한다. 회전 디스크 및 총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 한 설정의 통합 3.5까지 높은 수집 속도에서 라이브 이미징 실험을 허용 이미지 스택 당 s.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

이 원고에서, 레이저 스캐닝 현미경과 SRS 실험 설정의 통합에 의해 얻어진 자극된 라만 산란(SRS) 현미경의 구현이 설명된다. SRS 현미경은 두 개의 펨토초(fs) 레이저 소스, Ti-Sapphire(Ti:Sa) 및 동기화된 광학 파라메트릭 발진기(OPO)를 기반으로 합니다.

자극된 라만 산란을 기반으로 한 비선형 현미경 구현

자극라만 산란 (SRS) 현미경 검사법은 특정 화학 적 moieties의 선택적, 라벨없는 이미징을 허용하고 효과적으로 생체 내에서 지질 분자를 이미지하기 위해 사용되었습니다. 여기에서, 우리는 SRS 현미경 검사법의 원리에 대한 간략한 소개를 제공하고 Caenorhabditis elegans에있는 지질 저장에 그것의 사용을 위한 방법을 기술합니다.

자극라만 산란 현미경 검사를 사용하여 Caenorhabditis elegans의 지질 저장 역학의 라벨 프리 이미징

자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 특정 화학 결합의 고유 진동을 기반으로 생체 분자의 라벨 없는 이미징을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서, 통합 SRS 및 이광자 형광 현미경의 도구 셋업은 살아있는 마우스의 척수에서 세포 구조를 시각화하기 위해 기술된다.

생체 내 결합 된 이광자 형광 및 자극 된 라만 산란 현미경을 사용한 생물학적 조직 이미징

자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 강력하고 비파괴적이며 라벨이 없는 이미징 기술입니다. 한 가지 새로운 응용 분야는 자극 라만 조직학이며, 여기서 단백질과 지질 라만 전이에서 두 가지 컬러 SRS 이미징이 의사 헤마톡실린 및 에오신 이미지를 생성하는 데 사용됩니다. 여기에서는 조직 진단을 위한 실시간 이색 SRS 이미징을 위한 프로토콜을 시연합니다.

조직 진단을 위한 마우스 뇌의 실시간 두 가지 색상 자극 라만 산란 영상

이 논문은 동일한 현미경 플랫폼에 통합 된 자극 된 라만 산란 (SRS)과 일관된 스토크스 라만 산란 (CARS)의 해상도, 감도 및 이미징 대비를 직접 비교합니다. 결과는 CARS가 더 나은 공간 분해능을 가지며, SRS는 더 나은 콘트라스트와 스펙트럼 분해능을 제공하며, 두 방법 모두 비슷한 감도를 가지고 있음을 보여줍니다.

화학 이미징을 위한 하이퍼스펙트럼 자극 라만 산란 및 일관된 안티스토크스 라만 산란 현미경의 직접 비교

우리는 광대역 자극 라만 산란 (SRS) 현미경으로 화학 이미지를 획득하기위한 프로토콜을 제시합니다. 차등 다중 채널 잠금 검출로 작동하는 SRS 현미경을 기반으로 하는 프로토콜은 시료 준비, SRS 장치의 조정 및 화학적으로 이질적인 샘플의 서로 다른 구성 요소를 분리하기 위한 화학측정법을 설명합니다.

광대역 자극 라만 산란 현미경을 기반으로 한 멀티플렉스 화학 이미징

배우세요 자극 라만 산란 현미경을 위한 유연한 환경 챔버를 사용하여 SKOV3 세포의 지방 방울 역학을 24시간 동안 타임랩스 라이브 셀 이미징하는 방법을. 이 기술은 세포 대사 연구에 활용됩니다.

자극 라만 산란 현미경을 사용한 타임랩스 라이브 셀 이미징을 위한 유연한 챔버

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