Name: Ube3a 변이체의 기능 평가를 위한 확장 가능한 세포 기반 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 학습하세요 Ube3a 미센스 변이체의 기능적 영향을 평가하는 확장 가능한 세포 기반 방법을. HEK293T 세포와 루시퍼레이스 리포터를 활용하여 앤젤만 증후군 및 자폐 스펙트럼 장애 관련 효소 활성을 정량화합니다.

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이 작품은 시몬스 재단 브리지 투 인디펜던스 어워드(SFARI Award #387972; J.J.Y.), 뇌 및 행동 연구 재단(J.J.Y.)의 NARSAD Young Investigator Award, 알프레드 P. 슬론 재단(JJY)의 연구 펠로우십, 엔젤만 증후군 재단(J.J.Y.), 화이트홀 재단(J.J.Y.), NIMH(R01MH122786; J.J.Y.).

1. Ube3a 변이체를 생성하기 위한 돌연변이 유발 클로닝
<ol><li>모든 Ube3a 변이체를 pCIG2 플라스미드 (그림 1A), EGFP 발현19에 대한 닭-β-액틴 프로모터 및 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 포함하는 비시스트로닉 벡터 내로 복제합니다. 전장 Ube3a 구축물은 N-말단 Myc-태그 서열을 함유하고, 5' SacI 부위 및 3' XmaI 부위를 사용하여 pCIG2로 클로닝된다. 또한, Ube3a 코딩 서열 내의 자연 발생 EcoRI, EcoRV 및 PstI 부위도 서브클론 단편에 사용된다. 참고: Ube3a 에 대한 식별되지 않은 변이체는 문헌 및 ClinVar 데이터베이스와 같은 공개적으로 액세스할 수 있는 리포지토리를 통해 얻을 수 있습니다.1. 보고되지 않은 추가 변종은 의료 센터와의 개인적인 의사 소통을 통해 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>적응된 2단계 메가프라이머 돌연변이유발법20 을 사용하여 Ube3a 판독 프레임에 돌연변이를 도입합니다. 첫 번째 단계에서, 돌연변이에 대한 상동성 5' 및 3'의 최소 30개의 염기쌍(bp)에 의해 측면에 원하는 돌연변이(이 프로토콜에 표시된 예는 UBE3A Q588E 변이체를 생성하는 것임)를 포함하는 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드를 설계합니다(그림 1B 및 표 1).</li>
	<li>돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드를 제1라운드 PCR에 상보적 올리고뉴클레오티드와 함께 사용하여 돌연변이를 포함하는 200-400 bp 메가프라이머를 생성한다(도 1C; 표 2 및 표 3). 1% 겔을 사용하고 후속 겔 정제를 사용하여 아가로스 겔 전기영동을 위해 PCR 반응 부피의 전체 50 μL를 사용한다(재료 표). 아래의 제2 라운드 PCR 단계에서 사용하기 위해 30 μL의 탈이온화된 H2O(diH2O)의 PCR 산물을 용리시킨다.</li>
	<li>표시된 대로 제2 라운드 PCR을 설정합니다(그림 1C; 표 2 및 표 3). 이 단계는 서브 클로닝에 적합한 돌연변이 및 말단 제한 부위를 포함하는 더 큰 DNA 단편 (일반적으로 ~ 1-1.5kb 길이)을 생성합니다 (그림 1C).</li>
	<li>PCR 반응 완료 후, PCR 정제 키트(재료 표)를 이용하여 생성된 생성물을 정제한다. 30 μL에서 용리시키고, 모든 정제된 생성물 및 pCIG2 및 Ube3a WT 구축물을 적절한 제한 효소로 소화시킨다 (실시예는 EcoRI 및 XmaI를 사용한 소화를 나타낸다).</li>
	<li>37°C에서 2시간 분해한 후, 아가로스 겔 전기영동(1% 겔)을 통해 분해 생성물을 분해하고, 적절한 생성물을 겔-정제한다. 제조업체의 프로토콜(재료 표)에 따라 결찰을 설정하고 결찰 제품을 DH10B 박테리아 균주(재료 표)로 변환한 다음 선택한 암피실린(100μg/mL)으로 플레이트합니다.</li>
	<li>다음 날, 2-4개의 콜로니를 선택하여 Luria 브로스(LB)와 100μg/mL 암피실린이 포함된 3mL 배양균을 접종합니다. 배양물을 진탕(225 rpm)을 갖는 궤도 배양기에서 37°C에서 밤새 성장시켰다.</li>
	<li>다음 날, 1-1.5mL의 박테리아 배양을 사용하여 플라스미드 DNA(재료 표)를 미니프렙합니다. 남은 배양액을 4°C에 두어 저장합니다. 원하는 돌연변이로부터 ~200bp에 결합하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 Sanger 시퀀싱으로 미니프렙된 플라스미드를 스크리닝합니다.</li>
	<li>4°C에서 저장된 박테리아 배양물을 사용하여 50 mL 배양물을 다시 접종하여 올바른 플라스미드를 midiprep으로 접종합니다(재료 표). Ube3a 코딩 서열을 완전히 시퀀싱하여 DNA의 올바른 서열을 검증합니다.</li>
	<li>후속 형질감염 단계를 위해 멸균 H2O를 사용하여 100ng/μL 농도로 Ube3a 변이체 플라스미드 및 β-카테닌 활성화 리포터(BAR)21, TK-레닐라 루시페라제, 리가아제 사멸 Ube3a(UBE3A C820A돌연변이) 및 pCIG2 빈 벡터의 작업 스톡을 생성합니다.</li>
</ol>2. 인간 배아 신장 293T(HEK293T) 세포의 제조 및 형질감염
<ol><li>앞서 설명한 대로 글루타민, 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 항생제-항진균제가 미리 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)에서 성장한 HEK293T 세포에서 분석을 수행합니다17. 세포를 37°C의 멸균 가습 인큐베이터에서 5%CO2로 성장시킨다.</li>
	<li>생물안전 캐비닛을 사용하여 먼저 부유된 HEK293T 세포를 100μL의 배양 배지에서 웰당 2.2 × 10개의4 개의 세포로 조직 배양 처리된 96웰 평평한 바닥 플레이트에 플레이트하고 밤새 성장하도록 합니다.</li>
	<li>둘째 날에, 세포를 생물안전 캐비닛에서 반딧불이 및 레닐 라 루시퍼라아제 리포터 플라스미드 (표 4) 및 Ube3a 플라스미드를 삼중으로 형질감염시켰다. 앞서 기술한 바와 같이 10:1:8 비율의 플라스미드(각각 웰당 50ng의 BAR, 5ng의 TK-Renilla 및 40ng의 Ube3a 플라스미드)를 사용하여 웰당 총 부피 10μL의 형질감염을 수행하고,18, 및 0.4μL의 형질주입 시약을 수행한다(표 4). 참고: 각 실험에 대해 빈 벡터(GFP만 해당) 및 리가아제 사멸 Ube3a 를 코딩하는 플라스미드도 형질감염되어 음성 대조군으로 사용됩니다.</li>
	<li>1.5mL 마이크로원심분리 튜브(표 4)에서 각 변이체에 대한 형질주입을 위한 마스터 믹스를 만들고 실온(RT)에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후, 튜브를 두드려 형질주입 혼합물을 부드럽게 교반한 다음, 형질주입 혼합물 10μL를 웰의 기존 성장 배지에 직접 첨가한다.</li>
	<li>그런 다음 세포를 인큐베이터로 되돌리고 플라스미드가 48시간 동안 발현되도록 합니다. 성장 배지의 교체는 필요하지 않습니다.</li>
	<li>형광 현미경을 사용하여 GFP 형광에 의한 형질감염 효율을 모니터링한다. HEK293T 세포는 이 방법으로 효율적으로 형질감염되며 세포의 >80%가 48시간 후에 GFP를 발현해야 합니다.</li>
</ol>3. 루시퍼라아제 활성 측정
참고: 루시페라아제 활성은 제조업체의 프로토콜에 따라 반딧불이 및 레닐 라 루시퍼라아제(재료 표)를 모두 분석하는 상업적으로 이용 가능한 시스템을 사용하여 평가됩니다.
<ol><li>형질감염된 HEK293T 세포에서 배양 배지를 조심스럽게 흡인한 다음 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척합니다. PBS를 흡인하고 25μL의 비변성 용해 완충액을 추가하여 세포를 용해하고 얼음 위에서 부드럽게 흔들면서 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>그런 다음 생성된 용해물 20μL(원심분리 필요 없음)를 Firefly 루시퍼라제 기질 시약 100μL가 포함된 새로운 96웰 분석 플레이트에 추가합니다. 두드려 접시를 부드럽게 섞습니다.</li>
	<li>플레이트를 플레이트 리더에 로드하고 판독 높이가 1mm이고 적분 시간이 1초인 상단 검출기를 사용하여 발광을 측정합니다. 알림: 감지기의 게인은 신호 강도에 따라 조정해야 할 수 있습니다.</li>
	<li>반딧불이 루시퍼라아제 발광을 읽은 직후, 100 μL의 레닐라 루시퍼라아제 기질을 웰에 첨가한다. 이 단계는 반딧불이 루시퍼라아제 활성을 동시에 소멸시키면서 레닐라 루시퍼라아제 활성을 평가한다. 플레이트의 부드러운 교반에 의해 샘플을 혼합하고 다시 발광을 측정하여 레닐 라 루시퍼라아제 활성을 평가하였다. 알림: 이 분석에는 다른 플레이트를 사용할 수 있지만 검은색 프레임과 흰색 웰이 있는 플레이트를 사용하면 노이즈를 최소화하면서 루시퍼라아제 신호를 증폭하므로 가장 민감한 결과를 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>리포터 반응을 반딧불이 루시퍼라아제 대 레 닐 라 루시퍼라아제 비율(반딧불이/레닐라)로 정량화하고, 삼중 측정의 값을 평균화한다. 그 후, 각 변이체에 대한 Firefly/Renilla 값을 야생형(WT) Ube3a 발현 세포의 값에 대해 정규화하여 변이체 단백질의 상대적 활성을 비교합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClinVar%3A+Public+archive+of+relationships+among+sequence+variation+and+human+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype.</a> Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).</li>
<li>Lek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein-coding+genetic+variation+in+60%2C706+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans.</a> Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).</li>
<li>Starita, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+interpretation%3A+Functional+assays+to+the+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Variant interpretation: Functional assays to the rescue.</a> American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).</li>
<li>Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HPV-16+E6+and+E6-AP+complex+functions+as+a+ubiquitin-protein+ligase+in+the+ubiquitination+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53.</a> Cell. 75 (3), 495-505 (1993).</li>
<li>Albrecht, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinted+expression+of+the+murine+Angelman+syndrome+gene%2C+Ube3a%2C+in+hippocampal+and+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons.</a> Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).</li>
<li>Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Angelman+syndrome+candidate+gene%2C+UBE3A%2FE6-AP%2C+is+imprinted+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain.</a> Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).</li>
<li>Vu, T. H., Hoffman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinting+of+the+Angelman+syndrome+gene%2C+UBE3A%2C+is+restricted+to+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain.</a> Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).</li>
<li>Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UBE3A%2FE6-AP+mutations+cause+Angelman+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome.</a> Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).</li>
<li>Jiang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+Angelman+ubiquitin+ligase+in+mice+causes+increased+cytoplasmic+p53+and+deficits+of+contextual+learning+and+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation.</a> Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).</li>
<li>Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angelman+syndrome%3A+Insights+into+genomic+imprinting+and+neurodevelopmental+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes.</a> Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).</li>
<li>Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comorbidity+of+autism+with+the+genomic+disorders+of+chromosome+15q11.2-q13%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13.</a> Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).</li>
<li>Urraca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interstitial+duplication+15q11.2-q13+syndrome+includes+autism%2C+mild+facial+anomalies+and+a+characteristic+EEG+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Autism+Research%22%5BJournal%5D)">The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature.</a> Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).</li>
<li>de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+the+understanding+of+autism+disease+mechanisms+through+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics.</a> Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).</li>
<li>Scheffner, M., Staub, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HECT+E3s+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">HECT E3s and human disease.</a> BMC Biochemistry. 8, Suppl 1 (2007).</li>
<li>Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+Angelman+syndrome-associated+mutations+in+the+E3+ubiquitin+ligase+E6-associated+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).</li>
<li>Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+specifies+axons+during+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling specifies axons during brain development.</a> Cell. 142 (1), 144-157 (2010).</li>
<li>Yi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autism-linked+UBE3A+T485A+mutant+E3+ubiquitin+ligase+activates+the+Wnt%2Fbeta-catenin+pathway+by+inhibiting+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).</li>
<li>Weston, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+disease-linked+hyperactivating+mutations+in+UBE3A+through+large-scale+functional+variant+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6809(2021).</li>
<li>Hand, R., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin2+regulates+the+initial+axon+guidance+of+cortical+pyramidal+neurons+projecting+medially+to+the+corpus+callosum%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum.</a> Neural Development. 6, 30(2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+allosteric+activation+of+kinases+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineered allosteric activation of kinases in living cells.</a> Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).</li>
<li>Biechele, T. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+beta-catenin%2FTCF+transcription+with+beta-catenin%2FTCF+transcription-based+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs.</a> Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).</li>
<li>Yi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Autism-linked+mutation+disables+phosphorylation+control+of+UBE3A%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A.</a> Cell. 162 (4), 795-807 (2015).</li>
<li>Kuhnle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angelman+syndrome-associated+point+mutations+in+the+Zn%282%2B%29-binding+N-terminal+%28AZUL%29+domain+of+UBE3A+ubiquitin+ligase+inhibit+binding+to+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).</li>
<li>Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+E6-AP+gene+%28UBE3A%29+encodes+three+potential+protein+isoforms+generated+by+differential+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing.</a> Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).</li>
<li>Avagliano Trezza, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+nuclear+UBE3A+causes+electrophysiological+and+behavioral+deficits+in+mice+and+is+associated+with+Angelman+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).</li>
<li>Bossuyt, S. N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+nuclear+UBE3A+activity+is+the+predominant+cause+of+Angelman+syndrome+in+individuals+carrying+UBE3A+missense+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations.</a> Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).</li>
</ol>

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여기에 설명된 프로토콜은 Ube3a 변이체의 효소 활성을 평가하기 위한 효율적이고 확장 가능한 방법을 제공합니다. 이 분석을 사용할 때 신중하게 고려해야 할 몇 가지 기술적 세부 사항이 있습니다. 한 가지 고려사항은 본 분석에 사용된 Wnt 리포터 플라스미드의 선택이다. 여기에 설명된 프로토콜은 TCF 결합 부위의 재조합 및 손실을 최소화하기 위해 특별히 설계된 링커 서열로 분리된 12개의 T 세포 인자(TCF) 반응 요소의 연결기를 포함하는 리포터인 β-카테닌 활성화 리포터(BAR)21을 구체적으로 사용합니다. 문헌23에 기재된 추가의 루시페라아제계 Wnt 리포터 플라스미드가 있으며, 이전의 연구에서 일부가 UBE3A 활성을 평가하는데 사용될 수 있음을 나타내지만, BAR 플라스미드는 이러한 목적을 위해 가장 철저하게 특성화되었다17,18<sup class="xre...

최근의 기술 발전으로 엑솜과 게놈의 시퀀싱이 임상 환경 1,2에서 일상화되었습니다. 이로 인해 일반적으로 단백질에서 하나의 아미노산을 변경하는 수백만 개의 잘못된 변이를 포함하여 많은 유전 적 변이가 발견되었습니다. 이러한 변이의 기능적 중요성을 이해하는 것은 여전히 어려운 과제이며, 알려진 missense 변이체 중 소수(~2%)만이 임상적 해석을 가지고 있습니다1,3.
이 문제의 두드러진 예는 분해를 위해 기질 단백질을 표적으로 하는 E3 유비퀴틴 리가아제를 암호화하는 유전자인 Ube3a입니다4. Ube3a는 염색체 15q11-13 내에 있으며 모계 유전 대립 유전자 5,6,7에서만 독점적으로 발현됩니다. 질병 유전학의 관찰은 UBE3A 효소의 불충분하거나 과도한 활성이 뚜렷한 신경 발달 장애를 유발한다는 것을 강력하게 시사합니다. 모체 염색체 15q11-13의 결실은 심각한 지적 장애, 운동 장애, 발작, 잦은 미소를 가진 행복한 태도 및 이형 얼굴 특징 8,9,10을 특징으로하는 장애 인 Angelman 증후군 (AS)8을 유발합니다. 대조적으로, 모체 염색체 15q11-13의 복제 또는 삼중은 자폐증의 가장 널리 퍼진 증후군 형태 중 하나로 인식되는 이질적인 상태 인 Dup15q 증후군을 유발합니다11,12,13. 또한 Ube3a에서 확인된 수백 개의 잘못된 변이체가 있으며, 그 중 대부분은 기능적 및 임상적 중요성이 알려지지 않았기 때문에 불확실한 중요성(VUS)의 변이체로 간주됩니다. 따라서, Ube3a 변이체가 신경발달 질환에 기여하는지 여부를 결정하기 위해 경험적으로 평가할 수 있는 방법을 개발하는 데 상당한 관심이 있다.
UBE3A 효소는 E3 유비퀴틴 리가아제의 HECT (E6-AP C- 말단과 상동) 도메인 패밀리에 속하며, 모두 E2 효소로부터 활성화 된 유비퀴틴을 받아들이고 기질 단백질14로 전달하는 데 필요한 생화학 적 기계를 포함하는 시조 HECT 도메인을 소유한다. 역사적으로 E3 효소의 특성 분석은 정제 된 단백질 4,15,16의 앙상블을 필요로하는 재구성 된 시험관 내 시스템에 의존했습니다. 이러한 방법은 느리고 노동 집약적이며 많은 변종의 활동을 평가할 수 없습니다. 이전 연구에서 UBE3A는 프로테아좀의 기능을 조절하여 β-카테닌17의 분해를 늦춤으로써 HEK293T 세포에서 Wnt 경로를 활성화하는 것으로 확인되었습니다. 이러한 통찰력은 Ube3a18의 기능 손실 및 획득 변이체를 식별하는 효율적이고 신속한 방법으로 Wnt 경로 리포터를 사용할 수 있게 한다. 아래 프로토콜은 Ube3a 변이체의 활성 변화를 평가하기 위한 루시페라아제 기반 리포터뿐만 아니라 Ube3a 변이체를 생성하는 방법을 자세히 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>0.05% 트립신-EDTA (1x), 페놀 레드</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb DNA 사다리</td><td>Lambda Biotech</td><td>M108-S</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA 사다리</td><td>Lambda Biotech</td><td>M107</td><td></td></tr><tr><td>10x 버퍼 for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202A</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion HF 반응 버퍼</td><td>New England BioLabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균 용액</td><td>Corning</td><td>30004CI</td><td></td></tr><tr><td>Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate</td><td>PerkinElmer</td><td>6005030</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin Disodium Salt</td><td>Midwest Scientific</td><td>KCC46000-5</td><td></td></tr><tr><td>Countess cell counting chamber&nbsp; 슬라이드</td> Thermo Fisher Scientific <td>C10283</td><td></td>Countess II<td>의 Invitrogen</td></tr><tr><td> 자동 세포 계수기&nbsp;</td><td>life technologies</td><td></td><td>세포 계수기</td></tr><tr><td>맞춤형 DNA 올리고</td><td>통합 DNA 기술(IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>데옥시뉴클레오티드(dNTP) 용액 혼합물</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, GlutaMAX 보충제, 피루브산</td><td>Gibco</td><td>10569044</td> HEK293T 세포주 DPBS (1x)Gibco <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>성장을 지원하기 위한 기저 배지14190-136</td><td></td></tr><tr><td>듀얼-루시페라제 리포터 분석 시스템</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, 적격, 열 불활성화</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>Fetal bovine serum</td></tr><tr><td>Fisherbrand 표면 처리 조직 배양 접시</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6 Transfection Reagent</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Dye Purple (6x)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024A</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>고효율 ig 10B 화학적 수용 세포</td><td>온전한 유전체학</td><td>1011-12</td><td>대장균 DH10B 세포</td></tr><tr><td>고속 플라스미드 미디 키트</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td>미디 준비</td></tr><tr><td>pCIG2 플라스미드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pGL3 BAR 플라스미드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion HF DNA 중합효소</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530L</td><td>DNA polymerase</td></tr><tr><td>ProFlex 3 x 32 well PCR System</td><td>Applied biosystems by life technologies</td><td></td><td>Thermocycler</td></tr><tr><td>pTK Renilla plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Mini prep</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>Gel purification</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트 (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>PCR 정제</td></tr><tr><td>rCutSmart 버퍼</td><td>New England BioLabs</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>SacI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3156S</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>Synergy HTX 멀티-모드 리더</td><td>BioTek</td><td></td><td>&nbsp; 플레이트 리더는 Gen5 소프트웨어 v3.08 (BioTek)T4</td></tr> <tr><td>DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202L</td><td>Ligase</td></tr><tr><td>TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP13324</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트 96웰, Flat Bottom</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012931</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Ethidium Bromide Solution</td><td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td><td>을 실행합니다.</td><td></td></tr><tr><td>15585011 XmaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0180S</td><td>제한 효소</td></tr></tbody></table>

ube3a 변이체의 기능 평가를 위한 확장 가능한 세포 기반 방법

A Scalable, Cell-Based Method for the Functional Assessment of Ube3a Variants

의학에서 시퀀싱의 사용이 증가함에 따라 인간 게놈에서 수백만 개의 코딩 변이가 확인되었습니다. 이러한 변이의 대부분은 신경 발달 장애와 관련된 유전자에서 발생하지만 대다수의 변이체의 기능적 중요성은 아직 알려지지 않았습니다. 본 프로토콜은 자폐증 및 Angelman 증후군 모두에 연결된 E3 유비퀴틴 리가 아제를 암호화하는 유전자 인 Ube3a에 대한 변이체 연구를 설명합니다. Ube3a 의 복제 또는 삼중 복제는 자폐증과 밀접한 관련이 있지만 결실은 Angelman 증후군을 유발합니다. 따라서 UBE3A 단백질 활성의 변화의 원자가를 이해하는 것은 임상 결과에 중요합니다. 여기서, Ube3a 변이체를 Wnt 경로 리포터와 페어링하는 신속한 세포 기반 방법이 설명된다. 이 간단한 분석은 확장 가능하며 모든 Ube3a 변이체에서 활성 변화의 원자가 및 크기를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 또한이 방법의 기능을 통해 UBE3A의 효소 메커니즘에 대한 깊은 통찰력을 얻는 데 사용할 수있는 풍부한 구조 기능 정보를 생성 할 수 있습니다.

Ube3a 미센스 변이체의 대규모 기능 스크리닝은 기능 손실 및 기능 획득 돌연변이의 광범위한 환경을 식별합니다. Ube3a 돌연변이체에 대한 이전 연구는 Wnt 반응이 세포 UBE3A 단백질 활성의 보고자로서 작용할 수 있음을 시사하였다. 이러한 관찰은 확장되었고, BAR 분석이 세포에서 UBE3A 활성의 범위를 보고하기에 적합한지 여부를 조사하기 위해 추가 검증 실험이 수행되었습니다. 먼저, HEK293T 세포를 인간 WT Ube3a를 코딩하는 다양한 양의 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 이 실험은 BAR 반응이 세포로 형질감염된 Ube3a의 양에 따라 선형적으로 변한다는 것을 입증했습니다(그림 2A). 둘째, BAR 분석은 문헌22에서 이전에 특성화된 질병-연관 변이체를 코딩하는 플라스미드 DNA를 사용하여 시험하였다. 이들 ...

기능 상실 및 획득이 Angelman 증후군 및 자폐 스펙트럼 장애와 관련된 유전자인 Ube3a에서 잘못된 센스 변이체의 기능적 중요성을 평가하기 위해 간단하고 확장 가능한 방법이 개발되었습니다.

Ube3a 변이체의 기능 평가를 위한 확장 가능한 세포 기반 방법

The increased use of sequencing in medicine has identified millions of coding variants in the human genome. Many of these variants occur in genes ...

우리의 방법은 Angelman 증후군을 유발하고 Dup15q 증후군으로 알려진 유전 적 형태의 자폐증과 밀접한 관련이있는 유비퀴틴 리가 아제 인 Ube3a의 변이체의 기능적 영향을 이해하는 빠른 방법을 제공합니다. 유비퀴틴 리가제 활성의 특성화는 전통적으로 노동 집약적이고 느리며, 이러한 방법은 Ube3a에 대해 확인된 수백 가지 변이체를 특성화하는 것이 어렵고 실제로 적합하지 않습니다. 엔젤만 증후군은 모계 Ube3a 유전자의 결실로 인해 발생하는 반면, Dup15q 증후군은 모계 Ube3a의 복제로 인해 발생하므로 잘못된 변이가 Ube3a 효소의 활성을 어떻게 변화시켰는지 추론하는 것이 중요하며, 이는 각 변이체를 경험적으로 테스트하지 않고는 하기 어려운 일입니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 기술자 인 Jalin Stelzer가 될 것입니다. 원고에 설명 된대로 가습 용기에 5 % 이산화탄소를 사용하여 섭씨 37 도의 Dulbecco의 변형 된 독수리 배지에서 성장한 HEK293T 세포에서 분석을 수행하여 시작하십시오. 생물안전 캐비닛에서 부유된 HEK293T 세포를 조직 배양 처리된 96웰 평평한 바닥 플레이트에 플레이트하고 세포를 37도에서 밤새 배양합니다.둘째 날에, 세포를 반딧불이 및 레닐라 루시퍼라아제 리포터 플라스미드, 및 Ube3a 플라스미드를 삼중으로 생물안전 캐비닛에서 형질감염시킨다. 웰 당 10 마이크로 리터의 총 부피로 형질 감염을 수행하십시오. 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에서 각 변이체에 대한 형질주입을 위한 마스터 믹스를 만들고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다.인큐베이션 후, 튜브를 두드려 형질주입 혼합물을 부드럽게 교반한 다음, 10 마이크로리터의 형질주입 혼합물을 웰 내의 기존 성장 배지에 직접 첨가한다. 그 후, 세포를 인큐베이터로 되돌리고 플라스미드가 48시간 동안 발현되도록 합니다. 형광 현미경을 사용하여, GFP 형광에 의한 형질감염 효율을 모니터링한다.80% 이상의 세포가 48시간 후에 GFP를 발현해야 합니다. 형질감염된 HEK293T 세포로부터 배양 배지를 조심스럽게 흡인하고, 차가운 PBS로 세포를 세척한다. PBS를 흡인합니다.세포 용해를 위해 25마이크로리터의 비변성 용해 완충액을 추가하고 부드러운 흔들림으로 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 이어서, 생성된 용해물 20 마이크로리터를 반딧불이 루시퍼라제 기질 시약 100 마이크로리터를 함유하는 새로운 96-웰 분석 플레이트에 첨가하고, 두드려서 플레이트를 부드럽게 혼합한다. 플레이트를 플레이트 리더에 로드하고 판독 높이가 1mm이고 적분 시간이 1초인 상단 검출기를 사용하여 발광을 측정합니다.반딧불이 루시퍼라아제 발광을 읽은 직후, 100마이크로리터의 레닐라 루시퍼라아제 기질을 웰에 첨가하여 레닐라 루시퍼라아제 활성을 평가하면서 반딧불이 루시퍼라아제 활성을 소멸시킨다. 샘플을 부드러운 플레이트 교반에 의해 혼합하고 발광을 다시 측정하여 레닐라 루시퍼라아제 활성을 평가하였다. 리포터 반응을 정량화하고 각 변이체에 대한 Firefly 및 Renilla 값을 야생형 Ube3a에 대해 정규화하여 변이체 단백질의 상대적 활성을 비교합니다.야생형 Ube3a를 코딩하는 플라스미드의 증가량으로 형질감염된 HEK293T 세포는 BAR 반응의 선형 증가를 나타낸다. BAR 분석은 플라스미드의 질병 관련 변이체를 식별하여 이 방법의 정확성과 일반성을 입증합니다. 152개의 Ube3a 변이체에 대한 BAR 분석법은 야생형 Ube3a에 비해 양성 기능 손실 및 기능 돌연변이 획득을 나타낸다.Ube3a의 위치 588에서 기능 글루타메이트 치환의 이득, 기능 프롤린 치환의 상실 및 기능 아르기닌 치환의 또 다른 손실은 크게 다른 효과를 생성함으로써 경험적 변이 평가의 중요성을 강조합니다. 히트 플롯은 Ube3a의 위치 588에서 포괄적인 돌연변이 분석을 위한 정규화된 BAR 결과를 보여줍니다. 흰색 음영은 야생형 Ube3a 활동 수준을 나타내고, 파란색 음영은 기능 손실을 나타내며, 빨간색 음영은 기능 돌연변이의 이득을 나타냅니다.우리 연구의 임상적 의미 외에도 Ube3a는 모두 보존된 HECT 촉매 도메인을 소유하는 유비퀴틴 리가아제의 HECT 도메인 계열의 구성원입니다. 그리고 우리 연구의 흥미로운 측면 중 하나는 Ube3a에 대한 풍부한 구조 함수 데이터를 제공하고 이것이 이 종류의 효소에 대한 더 깊은 기계론적 이해를 얻는 데 사용될 수 있다는 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기, 우리는 개발을위한 체계적인 접근 방법을 제시 생리 학적 관련성이 민감하고...

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세포주 및 조직 샘플에서 Deubiquitinating 효소의 활성을 측정 방법

뇌 결 heterotopia (PNH) 성인에서 대뇌 피 질의 개발 (MCD)의 기형의 가장 일반적인 형태는 그러나 그것의 유전으로 가장 산발적 인 경우 알 수 없는 남아 있다. 우리는 최근 MCDs에 대 한 비 발한 후보자 유전자를 식별 하 고 직접 그들의 원인이 역할 비보를 확인 하는 전략을 개발 했습니다.

배열 CGH, 전체 exome 시퀀싱과 설치류에 Utero에서 Electroporation 뇌 기형에 대 한 원인 유전자를 식별 하는 새로운 전략

우리는 전사 인자(TF) DNA 결합에 영향을 미치는 비암호화 유전적 변이를 식별하기 위한 전략적 계획과 프로토콜을 제시합니다. 유전자형 의존성 TF DNA 결합의 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA) 및 DNA 친화성 침전 분석(DAPA) 분석을 위한 자세한 실험 프로토콜이 제공됩니다.

전기 영동 이동성 분석 (EMSA) 및 Shift 키를 사용하여 기능 비 코딩 유전자 변형에 대한 심사 DNA 화성 강수 분석 (DAPA)

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여기에서, 저자들은 망막에서 전사체 및 크로마틴 접근성 프로파일을 특성화하는데 있어서 표현형 및 후속 쌍을 이룬 scRNA-seq 및 scATAC-seq 에 대한 MULTI-seq 의 유용성을 보여준다.

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Live FRET 현미경 검사 및 면역형광을 통해 초기 제브라피시 누난 증후군 모델에서 ERK 활동 조절을 평가하기 위한 효율적인 프로토콜

학습하세요 Ube3a 미센스 변이체의 기능적 영향을 평가하는 확장 가능한 세포 기반 방법을. HEK293T 세포와 루시퍼레이스 리포터를 활용하여 앤젤만 증후군 및 자폐 스펙트럼 장애 관련 효소 활성을 정량화합니다.

Ube3a 변이체의 기능 평가를 위한 확장 가능한 세포 기반 방법

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