Name: O-링 대동맥 밴딩 대 압력 과부하로 인한 심장 비대 모델링을 위한 기존의 횡대동맥 수축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 배우세요 생쥐에서 O-링 대동맥 밴딩을 이용한 압력 과부하 심장 비대 유도법을. 고정 직경 고무 링으로 일관된 혈류 속도 증가와 재현성 높은 결과를 얻어 심혈관 연구의 신뢰성을 향상시킵니다.

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이 작업은 Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF)의 지원을 받아 L.L., N.F. 및 O.J.M. (IVOLADMT-HF; FKZ 01KC2006A).

동물 실험은 지역 위원회(Ministerium für Energiewende, Landwirtschaft, Umwelt, Natur und Digitalisierung des Landes Schleswig-Holstein, 허가 번호: V242-21249/2020 [38-4/20])의 원칙에 따라 수행되었습니다. 본 연구에 사용된 마우스는 상업적 공급원으로부터 수득하였다( 재료 표 참조). 동물들은 12 시간 빛, 12 시간 야간 사이클을 갖는 표준 조건 하에서 유지되었다; 물과 음식은 자유롭게 제공되었습니다.
1. 동물 관리
<ol><li>침구, 둥지 재료, 은신처, 식수 및 음식에 대한 적절한 접근이있는 특수 케이지에 생쥐를 수용하십시오.</li>
	<li>동물을 지속적으로 전문화 된 수의사 통제 및 치료하에 두십시오. 알림: 외부 공급 업체가 주문한 마우스의 경우 절차를 시작하기 전에 7 일의 순응을 보장하십시오.</li>
</ol>2. O-링의 준비
알림: 0.4 주 후에 심장 비대를 유도하기 위해 고정 직경 2mm의 O- 링을 권장합니다. 유도된 심장 표현형의 범위 및 중증도는 O-링 직경의 크기에 의존한다.
<ol><li>먼저 대동맥 주위에 배치할 수 있도록 가위나 메스를 사용하여 현미경으로 O-링( 재료 표 참조)을 한 번 절단합니다(그림 1A, B).</li>
	<li>8-0으로 연결된 바늘로 컷에 가까운 각 링 측면을 뚫습니다. 비 흡수성 봉합사와 실을 당깁니다. 마지막 단계에서 대동맥 주위에 O- 링을 고정하기 위해 한쪽에 2-3cm, 다른쪽에 2cm를 자르고 남겨 둡니다 (그림 1C, D).</li>
	<li>수술 전에 결찰 보조제 (종 도구, 재료 표 참조)를 사용하여 수축 구멍을 통해 한쪽 링면의 실 끝 (더 오래 유지됨)을 당깁니다 (그림 1E, F). 다음 단계(6단계)에서 배치하기 위해 부착된 O-링이 있는 결찰 보조 장치를 따로 두십시오.</li>
	<li>링과 실을 소독하려면 링을 알코올 용액에 30 분 동안 두십시오. 그런 다음 셀룰로오스에 놓아 건조시킵니다. 사용할 때까지 말린 링을 밀폐된 욕조나 케이스에 보관하십시오. 수술 중 결찰 보조 장치를 통해 실을 당긴 후 사용할 때까지 깨끗한 표면에 링을 놓습니다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64455/64455fig01.jpg"> 그림 1: 결찰을 위한 O-링 준비 수행 . (A) 직경이 고정 된 O- 링을 한쪽면에 가위 또는 메스로 자릅니다. (B) O-링의 이미지. (C) 각 O-링 측면은 8-0으로 피어싱됩니다. 프롤렌 스레드. (D) 두 개의 나사산으로 뚫린 O-링. (E) O- 링의 한 링 측면의 나사산이 결찰 보조기구의 구멍을 통해 당겨집니다. (F) 배치 전 최종 위치 : 한쪽의 나사산은 결찰 보조 장치의 구멍을 통해 배치되고 다른 쪽의 나사산은 느슨하게 유지됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64455/64455fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
3. 마우스의 사전 투약 및 수술 분야의 준비
<ol><li>수술 중 충분한 진통제를 받으려면 수술을 진행하기 20 분 전에 진통제 부 프레 노르 핀 (0.1mg / kg, 재료 표 참조)을 복강 주사하십시오. 참고 : 본 연구에서는 진통제가 Gesellschaft für Versuchstierkunde / Society of Laboratory Animal Science (GV-SOLAS)의 권고에 따라 사용되었습니다.</li>
	<li>사전 투약 후, 마우스를 유도 챔버에서 100 % O 2의 0.5-1.0 L / min과 혼합 된2 % -4 % 이소 플루 란으로 마취시킨다.</li>
	<li>진정 된 마우스의 왼쪽 흉부에있는 털을 면도하십시오. 면도 후 마우스를 이소 플루 란으로 채워진 챔버에 다시 넣고 동물에게 삽관하기 전에 충분한 진정 작용을 기다립니다. 알림: 진정제의 적절한 시점은 느린 호흡을 나타내지 만 스냅 호흡을 피합니다. 이소플루란 가스 설정에 따라 적절한 수준의 진정 작용을 달성하는 데 2-3분이 걸립니다.</li>
	<li>동물의 체온 (37 ° C)을 유지하기 위해 수술 전에 가열 패드를 켜십시오. 가열 패드를 직장 프로브( 재료 표 참조)에 연결하여 마우스의 체온을 자동으로 유지합니다.</li>
</ol>4. 생쥐의 삽관
<ol><li>필요한 기기를 준비합니다(그림 2A). 수술 전에 후두경을 약 1-3 분 동안 알코올에 넣은 다음 밤새 건조시켜 소독하십시오.</li>
	<li>가열 패드 주위에 고무 밴드를 펴서 마우스를 플레이트의 앞니에 고정합니다. 진정 된 마우스를 앙와위 자세로 가열 패드에 놓습니다.</li>
	<li>동물의 앞니 위에 고무 밴드를 놓아 접시의 목을 확장합니다.</li>
	<li>기관 내 삽관을위한 기관 개구부를 잘 볼 수 있도록 광원을 목구멍에 집중시킵니다 (그림 2B).</li>
	<li>한 손으로 삽관 보조제(수제 후두경, 재료 표 참조)를 놓고 입을 부드럽게 벌립니다(그림 2A[3]).</li>
	<li>다른 손과 작은 집게로 혀를 부드럽게 움직여 기관의 개구부를 청소하십시오.</li>
	<li>이 손을 사용하여 기관 내 튜브를 기관에 도입하십시오. 반면에 삽관 보조기구를 여전히 잡고 있습니다. 삽관의 경우 22G 캐뉼러를 사용하십시오( 재료 표 참조)(그림 2A[1]).</li>
	<li>3방향 스톱콕을 통해 기관내 튜브 위치를 생쥐용 인공호흡기( 재료 표 참조)에 연결하여 올바른 기관내 튜브 위치(기관내)를 확인합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침(일회 호흡량 200μL 및 호흡수 100-150회/분)에 따라 올바른 환기를 모니터링합니다(그림 2C).</li>
	<li>발가락 꼬집음 반사 검사(반사 반응 없음)로 충분한 마취 깊이를 확인합니다.</li>
	<li>마취 설정을 0.5-1.0 L / min 100 % O 2와 혼합 된2 % 이소 플루 란으로 돌립니다.</li>
	<li>수술 중 건조를 피하기 위해 눈에 안과 연고를 바르십시오.</li>
	<li>면봉을 사용하여 시중에서 판매하는 소독액으로 수술 부위를 3 번 소독하십시오 ( 재료 표 참조).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64455/64455fig02.jpg"> 그림 2: 마우스 삽관. (A) 삽관기구 : (1) 22G IV 캐뉼러는 기관 내 튜브 (만다린 제외)로 사용됩니다. (2) 집게; (3) 수제 후두경 (나무 막대기와 테이프로 접착 된 변형 / 평평한 캐뉼러). (B) 위치 가열 패드에 삽관을 수행합니다. (C) 인공 호흡기에 연결된 삽관 된 마우스. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64455/64455fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
5. 수술 및 링 위치 결정 준비
알림: 감염을 피하기 위해 멸균 물질과기구를 사용하십시오.
<ol><li>가위를 사용하여 xyphoid 과정과 왼쪽 겨드랑이 사이의 선 중간에 0.5-1cm 길이의 피부 절개를하십시오. 집게를 사용하여 밑에있는 갈비뼈에서 근육층을 분리하고 두 개의 견인기 (길이 5mm, 재료 표 참조)를 절개 부위에 삽입하여 흉곽을 노출시킵니다.</li>
	<li>왼쪽 개흉술을 시작하려면 마이크로 스프링 가위를 사용하여 두 번째와 세 번째 갈비뼈 사이의 늑간근에 작은 절개 (~ 1-2mm)를 수행하십시오. 흉강을 열고 45° 각도의 집게로 절개 부위를 펼칩니다.</li>
	<li>3 개의 흉부 견인기 (길이 1.0-2.5mm)를 절개 부위에 삽입하여 흉강을 열어 시각화를 개선합니다.</li>
	<li>대동맥궁을 노출시키려면 45° 각도의 가는 팁 겸자로 흉선과 지방 조직을 들어 올려 아치에서 부드럽게 분리하십시오.</li>
</ol>6. O- 링과 횡단 대동맥의 연결
<ol><li>한 손에 45° 각도의 집게로 대동맥궁을 노출시킵니다. 다른 한편으로는 한쪽의 나사산을 통해 결찰 보조제와 연결된 O-링을 위치시킵니다(단계 2).</li>
	<li>대동맥 궁 아래의 결찰 보조 장치를 사용하여 꼬리 쪽에서 상완 두부 동맥과 왼쪽 총 경동맥 사이의 횡 대동맥의 두개골 쪽으로 실을 통과시킵니다 (그림 3A).</li>
	<li>집게로 결찰 보조기구와 대동맥궁 사이의 두 실을 조심스럽게 잡습니다. 결찰 보조장치를 수축 및 제거하고 양쪽의 나사산을 당겨 아치 주위에 O-링을 부드럽게 배치합니다(그림 3B).</li>
	<li>성공적으로 위치를 잡은 후 나사산과 수술 매듭으로 O- 링을 고정하십시오. 양쪽의 매듭이 열리지 않도록 추가로 매듭을 만드십시오(그림 3C).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64455/64455fig03.jpg"> 그림 3: O-링 이식 수행. (A) 대동맥궁은 1.0-2.5mm의 3개의 견인기에 의해 노출됩니다. 한쪽 고리면의 긴 실이 모두 대동맥 아래를 통과합니다. (B) O- 링은 링을 부드럽게 밀고 나사산을 당겨 배치됩니다. (C) is O-링이 올바른 위치에 있고 하나의 두개골이 양쪽에 꼬리 실로 매듭이 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64455/64455fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
7. 봉합 및 수술 후 회복
<ol><li>절개 부위에서 3 개의 가슴 견인기 (길이 2.5mm)를 제거하십시오.</li>
	<li>필요한 경우 따뜻한 0.9 % 등장 성 염 용액으로 채워 흉부에서 잔류 공기를 제거하십시오.</li>
	<li>봉합을 위해 흉부 절개를 노출하려면 두 개의 견인기 (길이 5mm)를 다시 가져 와서 피부를 옆으로 잡으십시오.</li>
	<li>2 개 또는 3 개의 6-0 비 흡수성 봉합사 ( 재료 표 참조)로 흉부를 닫고 인공 호흡기의 유출을 2 초 동안 꼬집어 폐를 다시 팽창시킵니다.</li>
	<li>2개의 견인기를 제거하고 3-5개의 4-0-흡수성 봉합사로 피부를 닫습니다.</li>
	<li>이소플루란을 끄고 모니터합니다. 동물이자가 호흡을 시작하면 수염이 움직이고 발가락 핀치 반사가 유발되어 마우스를 발관 할 수 있습니다. 관리 장치의 열 램프 아래 마우스를 왼쪽에 놓고 완전히 깨어날 때까지 관찰하십시오.</li>
	<li>충분한 의식을 회복 할 때까지 동물을 방치하지 마십시오. 알림: 수술을받은 동물은 더 나은 회복을 위해 자체 치료 장치 (케이지)를 받아야합니다.</li>
	<li>필요한 경우 7일 동안 식수에서 트라마돌(1mg/mL)으로, 수술 후 3일 동안 복강 주사로 부프레노르핀(0.1mg/kg, 하루 3회)으로 통증 관리를 수행합니다. 참고: 수술 후 진통제에 대한 지역 동물 윤리 위원회의 권장 사항을 따르십시오.</li>
	<li>매일 물병의 무게를 측정하여 약물을 확인하고 동물의 행동을 관찰하십시오.</li>
</ol>8. 링의 성공적인 수축 및 올바른 위치 확인
<ol><li>수술 후 하루, 협착에 대한 최대 유속을 측정하여 초음파를 사용하여 협착을 확인합니다.</li>
	<li>측정을 위해 초음파 시스템과 30MHz 주파수의 변환기 프로브가있는 심 초음파를 사용하십시오 ( 재료 표 참조).</li>
	<li>전술 한 바와 같이, 100 % O 2의 0.5-1.0 L / min으로 1.5 % -2 % 이소 플루 란에서 마스크를 사용하여 마취를 유지하십시오.</li>
	<li>마취 된 동물을 앙와위 자세로 가열 패드에 놓습니다. 가열 패드를 직장 프로브와 연결하여 체온을 37 ° C± 1 ° C로 유지하고 4 개의 마우스 발 센서를 사용하여 ECG로 심박수를 모니터링합니다 ( 재료 표 참조).</li>
	<li>더 나은 시각화를 위해 탈모 크림을 사용하십시오.</li>
	<li>성공적으로 수행된 ORAB는 초음파(~2,400mm/s)로 측정한 협착에 비해 유속이 증가합니다(그림 4C). 이 측정을 위해 변환기 헤드를 오른쪽 흉부에 파라스터미로 배치하여 2차원(2D) 이미징("B-모드")으로 대동맥궁의 위치를 파악합니다.<ol><li>컬러 도플러를 사용하여 대동맥의 혈류를 시각화하고 협착증에 대한 펄스파 도플러 혈류 속도로 측정합니다. 알림: 가짜 수술 마우스(수축 없는 대조 수술)는 ~600-900mm/s의 혈류 속도를 보여줍니다. 또한 성공적인 ORAB는 마우스의 오른쪽 경동맥 (~ 150mm / s) (RC, 그림 4A)과 왼쪽 경동맥 (~ 300mm / s) LC, 그림 4B) 사이의 속도 흐름 비율을 증가시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>2차원(2D) 이미징(B-모드)으로 오른쪽 및 왼쪽 동맥 경동맥을 시각화합니다. 트랜스듀서 헤드를 목의 왼쪽과 오른쪽에 45° 각도로 수평으로 놓고 펄스파 도플러를 사용하여 혈류 속도를 결정합니다. 참고: 가짜 수술 마우스에서 두 동맥의 속도 흐름은 비슷합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64455/64455fig04.jpg"> 그림 4: 경동맥의 맥파 도플러 속도 측정을 사용한 횡대동맥 결찰 확인. (A) 우측 경동맥의 대표적인 맥파 도플러 속도 신호. (B) 협착은 왼쪽보다 오른쪽 경동맥에서 더 높은 유속을 초래합니다. (C) 수축에 의해 유도 된 협착은 하행 대동맥의 유속이 2,400mm / s 이상을 초래합니다. 가짜 마우스는 600-900 mm / s의 유속을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64455/64455fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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</ol>

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스레드 / 봉합사 기반 대동맥 밴딩은 마우스에서 압력 과부하 심장 비대를 유도하기 위해 수년 동안 사용되어 왔습니다. 생체 내에서 심장 리모델링 및 질병 진행의 병리 메커니즘을 조사하는 확립 된 방법입니다. 한계는 협착 정도의 상대적으로 높은 차이와 결과적으로 리모델링입니다. Melleby et al.10 에 의해 처음 기술된 최근 도입된 ORAB 기술은 고무 O-링을 사용하여 기존 방법을 최적화합니다.
이 기술의 가장 중요한 이점은 O- 링의 고정 직경으로, 협착 정도의 변동성이 적고 결과적으로 수술 후 심장 비대의 표현형이 더 재현 가능합니다. 또 다른 장점은이 방법에서 더 빠른 학습과 더 쉬운 배치입니다. 실/봉합 기반 과정을 통해 대동맥 주변에서 적절한 정도의 결찰을 찾는 데는 일반적으로 시간과 경험이 필요합니다. 대조적으로, 이것은 고정 직경 또는 O-링 때문에 O-링 접근 방식과 동일한 정도로 필요하지 않습니...

생리적 심장 비대는 발달, 운동 및 임신 중에 관찰 될 수 있지만 병리학 적 심장 비대는 동맥 고혈압, 판막 심장 질환 또는 유전자 돌연변이와 같은 혈역학 적 스트레스 상태에 반응합니다. 처음에 심장은 심장 기능을 유지하기 위해 심근 세포 크기가 증가하고 심실 벽이 두꺼워지는 것을 특징으로하는 리모델링을 거칩니다 1,2. 반면에 병리학 적 심장 리모델링은 부정맥, 갑작스런 사망 및 높은 사망률의 위험 증가와 관련이 있습니다. 마지막으로, 시간이 지남에 따라 심실 확장, 수축 기능의 강력한 감소, 그리고 결국 높은 이환율, 사망률 및사회적 비용과 관련된 심부전(HF)으로의 진행을 초래합니다3. 따라서 새로운 치료 전략을 개발하기 위해서는 분자 배경을 이해하는 것이 시급합니다4.
대동맥 밴딩은 마우스5에서 압력 과부하 유발 좌심실 (LV) 비대 및 심부전을 모방하는 모델입니다. 이 방법을 사용하면 생체 내에서 압력 과부하 유발 심장 리모델링의 병리 메커니즘을 검사 할 수 있습니다. 마우스의 첫 번째 대동맥 밴딩 절차는 Rockman et al.6에 의해보고되었습니다. 압력 과부하는 대동맥 주위의 실 봉합 기반 결찰에 의해 유도됩니다 (상완 두개와 왼쪽 총 경동맥 사이). 0.4mm 직경의 협착을 만들기 위해 봉합사를 27G 바늘과 대동맥 주위에 놓습니다. 결찰 후 바늘을 제거합니다 6,7.
바늘 직경이 고정되어 있더라도 실의 조임은 외과 의사에 크게 의존하므로 심장 비대의 유도 표현형에 영향을 미칩니다. 또한 실/봉합사 기반 방법에서는 수술 후 협착 직경의 정도가 다양하여사망률의 높은 변동과 관련이 있습니다8,9. 또한이 방법을 훈련하는 것은 특히 나사를 조이는 데 올바른 수준과 일관성을 찾는 것과 관련하여 어렵습니다. 마지막으로, 훈련 시작시 대동맥의 파괴 또는 기타 조직 손상으로 인한 수술 중 및 수술 후 사망률이 높고 생존 동물의 협착 정도가 크게 변합니다.
최근에, 대동맥 밴딩의 최적화 된 절차가 Melleby et al.10에 의해 기술되었다. 그들은 내경이 0.71mm, 0.66mm 및 0.61mm인 고정 미끄럼 방지 고무 O-링을 사용하여 협착의 변동이 적고 압력 과부하의 재현성이 높은 ORAB(O-링 대동맥 밴딩) 방법을 제시했습니다. 요컨대, O- 링을 잘라내어 오름차순 아치 주위에 놓고 나사산으로 다시 닫습니다. 이러한 O-링을 사용하는 다른 과학자들은 유도된 심장 비대에서 더 적은 변동성을 보고했습니다9. 그들은 또한 수술 중 및 수술 후 사망률뿐만 아니라 유도 된 비대 표현형 9,11의 재현성이 향상되고 변동이 적다는 것을 관찰했습니다. 이 기사에서는 단계별 프로토콜에서이 고유 한 전략의 절차를 설명합니다. 이 보고서에서 공유 된 전문 지식은 다른 과학자들이이 분야에서 기술을 향상시키는 데 도움이 될 것입니다.
6주 후 심부전을 유발하는 심장 비대를 유도하려면 12주 된 C57BL/6N 수컷 마우스를 수술에 권장합니다. 마우스 하위 균주 C57BL/6N과 C57BL/6J 사이의 대동맥 밴딩 2주 후 비교는 C57BL/6N 마우스에서 심각한 심장 기능 장애 및 관련 사망률 증가를 보여주었습니다. 따라서 이들은 심부전 모델에 더 적합합니다12. 12 주 된 수컷과 암컷 마우스는 대동맥의 노출과 특수기구로 O- 링을 배치하기에 최적의 크기를 가지고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1 x 긴 고정 장치, 6cm</td><td></td><td>&nbsp; 18200-01</td><td></td></tr><tr><td>2 x 블런트 리트랙터, 5mm 너비&nbsp;</td><td></td><td>18200-11</td><td></td></tr><tr><td>2 x 짧은 고정기, 3cm</td><td></td><td>&nbsp; 18200-02</td><td></td></tr><tr><td>2 x 세밀한 팁 45도; 각도 있는 집게&nbsp;</td><td>FST (fine sience tools)</td><td>11160-10</td><td></td></tr><tr><td>3 x 블런트 리트랙터, 2.5 mm 넓이&nbsp;</td><td></td><td>18200-10</td><td></td></tr><tr><td>3 x 리트랙터 와이어&nbsp;</td><td></td><td>18200-05</td><td></td></tr><tr><td>4-0 흡수성 봉합사 (Vicryl)</td><td>ETHICON</td><td>SABBKLT0</td><td>피부 봉</td></tr>합 <tr><td>6-0 봉합사 (Prolene), 바늘 크기:13 mm</td><td>ETHICON</td><td>JDP879</td><td>가슴 근육 봉</td></tr><tr><td>합 8-0 봉합사 (Prolene), 바늘 크기: 6.5 mm</td><td>ETHICON</td><td>RHBECH</td><td>반지를 빠르게 하는 데 사용&nbsp;</td></tr><tr><td>마취 상자, 작은</td><td>Havard 장치&nbsp;</td><td>50-0108</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6N 마우스</td><td>찰스 리버</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플루오소버 활성탄 필터 캐니스터</td><td>Havard 장치&nbsp;</td><td>34-0415</td><td>마취를 유도하고 유지하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>수제 후두경&nbsp;</td><td></td><td></td><td>삽관은</td></tr><tr><td>하버드 장치 마취 기화기</td><td>Havard 장치&nbsp;</td><td></td><td>마취를 유도하고 유지하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>. 가열 패드 + 직장 프로브 (LSI Letica Scientific Instruments:Temperature control unit HB 101/2 )</td><td>Panlab/ Havard 장치&nbsp;</td><td></td><td>체온을 조절하고 유지하는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>i.v. 캐뉼라 블루 22게이지 (Vasofix Braun&uuml; le 0.9 x 25 mm)</td><td>B/Braunsharing 전문 지식&nbsp;</td><td>4268091B</td><td>삽관&nbsp;</td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>박스터</td><td></td><td>마취</td></tr><tr><td>코단(베타딘 용액)</td><td>Sch&uuml; LKE</td><td>20003960-A</td><td>소독&nbsp;</td></tr><tr><td>결찰 보조제</td><td>FST (fine sience tools)</td><td>18062-12</td><td>O-ring과 liagtion을 수행하는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>현미경 조명: Schott VisiLED 세트 MC1500/S80-55 (+ 컨트롤러)</td><td>SCHOTT</td><td></td><td>Ligth</td></tr><tr><td>현미경&nbsp; 카메라&nbsp; (라이카 IC80 HD)</td><td>라이카</td><td></td><td>시각화 운영 분야에 사용&nbsp;</td></tr><tr><td>MiniVac 완전한 마취 시스템&nbsp; 작은 설치류를 위해</td><td>Havard 장치&nbsp;</td><td>75-0233</td><td>마취를 유도하고 유지하는 데 사용됩니다</td></tr>. 마우스 <tr><td>인공호흡기 MiniVent Type 845</td><td>Havard 장치&nbsp;</td><td>73-0044</td><td>수술 중 인공호흡에 사용&nbsp;</td></tr><tr><td>바늘 홀더&nbsp;</td><td>FST (미세 사이언스 도구)</td><td>&nbsp; TE-10804</td><td></td></tr><tr><td>O-링, 미끄럼 방지 고무 (0.0018 mm x 0.020 mm)</td><td>애플 고무 제품&nbsp;</td><td></td><td>대동맥궁 해</td></tr><tr><td>동 가위</td><td>FST (fine sience tools)</td><td>14040-09</td><td>피부와 실을 자르는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>소형 동물 회수 시스템 (최대 200 g까지의 동물용 키트)</td><td>FST (세밀한 사이언스 도구)</td><td>18200-20</td><td></td></tr><tr><td>소형 베이스 플레이트, 20 x 30 cm&nbsp;</td><td></td><td>&nbsp; 18200-03</td><td></td></tr><tr><td>테이블은 발열 패드 + 직장 프로브 + ECG 및 &nbsp; 트랜스듀서 삼각대</td><td>FujiFilm Visual Sonics 이미징 시스템</td><td></td><td>초음파 심전도로</td> 통합되어 있습니다.</tr><tr><td>Temgesic (Buprenorphin)</td><td>Indivior UK Limited</td><td>997.00.00</td><td>통증 사전 약물 치료&nbsp;</td></tr><tr><td>쓰리 웨이 스톱 콕 (파란색)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>트라말 (타마돌)</td><td>Gr&uuml; 약물</td> 복용 후 넨탈 <td></td><td>통증&nbsp;</td></tr><tr><td>트랜스듀서 프로브 MS400 (Visual Sonics)&nbsp;</td><td>FujiFilm Visual Sonics 이미징 시스템</td><td></td><td>심초음파&nbsp;</td></tr><tr><td>심장 강화 패키지가 있는 초음파 시스템&nbsp;</td><td>FujiFilm Visual Sonics 이미징 시스템</td><td></td><td>심초음파&nbsp;</td></tr><tr><td>Vannas 스프링 가위 - 2.5 mm 커팅 엣지</td><td>FST (세밀한 sience 도구)</td><td>15000-08</td><td>늑간 가슴 근육을 자르는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>수의사 연고&nbsp;</td><td>Bepanten</td><td></td><td>눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 사용</td></tr></tbody></table>

o-링 대동맥 밴딩 대 압력 과부하로 인한 심장 비대 모델링을 위한 기존의 횡대동맥 수축

O-Ring Aortic Banding Versus Traditional Transverse Aortic Constriction for Modeling Pressure Overload-Induced Cardiac Hypertrophy

마우스의 대동맥 밴딩은 심장 압력 과부하로 인한 심장 비대 및 심부전 유도에 가장 일반적으로 사용되는 실험 모델 중 하나입니다. 이전에 사용 된 기술은 협착을 만들기 위해 무딘 27G 바늘 위에 묶인 대동맥 궁 주위의 나사산 봉합사를 기반으로합니다. 이 방법은 외과 의사가 수동으로 실을 조이는 것에 달려 있으므로 직경 크기의 차이가 커집니다. Melleby et al.이 설명한 새롭게 정제 된 방법은 수술 후 변동성이 적고 재현성이 높아집니다. 새로운 기술인 O-링 대동맥 밴딩(ORAB)은 실이 있는 봉합사 대신 미끄럼 방지 고무 링을 사용하여 압력 과부하의 변화를 줄이고 심장 비대의 재현 가능한 표현형을 제공합니다. 수술 중 O- 링은 상완 동맥과 왼쪽 경동맥 사이에 위치합니다. 성공적인 수축은 심 초음파로 확인됩니다. 1일 후, 링을 올바르게 배치하면 O-링으로 인한 협착에 대한 횡대동맥의 유속이 증가합니다. 2 주 후, 손상된 심장 기능은 박출률 감소 및 벽 두께 증가로 입증됩니다. 중요하게도, 직경 크기의 변동이 적을 뿐만 아니라, ORAB는 횡대동맥 수축(TAC)에 비해 수술 중 및 수술 후 사망률이 낮다는 것과 관련이 있습니다. 따라서 ORAB는 일반적으로 사용되는 TAC 수술보다 우수한 방법을 나타내며 결과적으로 재현 가능한 결과와 필요한 동물 수를 줄일 수 있습니다.

일반적으로 대동맥 밴딩은 인간 대동맥 협착증을 모방하고 마우스에서 심장 비대를 유도합니다. 성공적인 절차는 심장 비대 및 심장 기능 감소 5,6에 의해 반영된 심장 조직 리모델링을 특징으로합니다.
수술 후 1 일 직후, 횡 대동맥의 O- 링 수축의 효과는 심 초음파13에 의해 생체 내에서 결정될 수 있습니다. 대동맥 협착증의 성공적인 유도는 펄스 파 도플러 초음파로 측정 된 대동맥의 협착에 대한 혈류 속도 증가로 나타납니다 (그림 4C). 또한 위에서 설명한 대로 ORAB의 기능적 마커로서 좌우 경동맥 사이의 혈류 속도 비율을 결정합니다(그림 4A,B).
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본 프로토콜은 심장 비대에 압력 과부하를 유도하기 위해 마우스에서 대동맥 밴딩의 새로운 기술을 기술한다. 밴딩에는 내경이 고정 된 고무 링이 사용됩니다. 이 새로운 기술은 향후 실험을 위해 변동을 줄이고 재현 가능한 데이터를 약속합니다.

O-링 대동맥 밴딩 대 압력 과부하로 인한 심장 비대 모델링을 위한 기존의 횡대동맥 수축

Aortic banding in mice is one of the most commonly used experimental models for cardiac pressure overload-induced cardiac hypertrophy and the induction of ...

이 새로운 대동맥 밴딩 기술은 분산이 적고 재현성이 높은 마우스에서 압력 과부하 심장 비대를 유도 할 수 있습니다. 대동맥 주위에 고정 된 직경의 고무 링을 배치하면 횡 대동맥에서 일관된 유속 증가를 유도하여 재현 가능한 심장 비대를 생성합니다. 이 절차는 설치류에서 이미 마취 및 미세 수술 기술을 경험했거나 안내 할 수있는 경험이있는 사람이 수행해야합니다.대동맥 주위에 배치할 수 있도록 가위 또는 메스를 사용하여 현미경으로 O-링을 한 번 절단하는 것으로 시작합니다. 8-0으로 연결된 바늘로 컷에 가까운 각 링 측면을 뚫습니다. 비 흡수성 봉합사, 실을 당깁니다. 자르고 한쪽에 2-3 센티미터, 다른쪽에 2 센티미터를 남겨 두어 마지막 단계에서 대동맥 주위에 O- 링을 고정시킵니다.수술 전에 결찰 보조기구를 가져 와서 결찰 보조기구의 구멍을 통해 한쪽 링면의 실 끝을 당깁니다. 부착된 O-링이 있는 결찰 보조 장치를 배치를 위해 옆에 두십시오. 마취 된 마우스의 왼쪽 흉부에있는 모피를 면도하십시오.그런 다음 삽관 전에 충분한 진정 작용을 위해 마우스를 이소플루란으로 채워진 챔버에 다시 넣습니다. 동물의 체온을 섭씨 37도로 유지하기 위해 수술 전에 가열 패드를 켜십시오. 가열 패드를 직장 프로브에 연결하여 마우스의 체온을 자동으로 유지합니다.가열 패드 주위에 고무 밴드를 펴서 마우스를 플레이트의 앞니에 고정합니다. 마취 된 마우스를 앙와위 자세의 가열 패드에 놓습니다. 동물의 앞니 위에 고무 밴드를 놓아 접시의 목을 확장합니다.기관 내 삽관을위한 기관의 개구부를 잘 볼 수 있도록 목구멍에 광원을 집중시킵니다. 한 손으로 입을 부드럽게 열고 다른 손과 작은 집게로 삽관 보조제를 놓습니다. 혀를 부드럽게 움직여 기관의 개구부를 청소하십시오.기관 내 튜브를 기관에 도입하고 다른 한편으로는 삽관 보조기구를 계속 잡으십시오. 3방향 스톱콕을 통해 기관 내 튜브 위치를 생쥐용 인공호흡기에 연결하여 올바른 기관 내 튜브 위치를 확인합니다. 제조업체의 지침에 따라 올바른 환기를 모니터링하십시오.발가락 꼬집음 반사 검사로 충분한 마취 깊이를 확인하십시오. 수술 중 건조를 피하기 위해 눈에 안과 연고를 바르십시오. 시중에서 판매하는 소독액을 사용하여 수술 부위를 소독하십시오.가위를 사용하여 xiphoid 돌기와 왼쪽 겨드랑이 사이의 선 중간에 0.5-1cm 길이의 피부 절개를하십시오. 집게를 사용하여 밑에있는 갈비뼈에서 근육층을 분리하고 두 개의 5mm 견인기를 절개 부위에 넣어 흉곽을 노출시킵니다. 왼쪽 개흉술을 시작하려면 마이크로 스프링 가위를 사용하여 두 번째와 세 번째 갈비뼈 사이의 늑간근에서 1-2mm 절개를 수행하십시오.흉강을 열고 45도 각도의 집게로 절개를 펼칩니다. 시각화를 개선하기 위해 흉강을 열기 위해 3 개의 흉부 견인기를 절개 부위에 배치하십시오. 대동맥 궁을 노출시키려면 45도 각도의 미세한 포셉으로 흉선과 지방 조직을 아치에서 들어 올려 부드럽게 분리하십시오.한 손에 45도 각도의 집게로 대동맥궁을 노출시킵니다. 반면에 이전에 부착된 한쪽의 나사산을 통해 결찰 보조 장치와 연결된 O-링을 배치합니다. 꼬리에서 상완 동맥과 왼쪽 총 경동맥 사이의 횡 대동맥의 두개골 쪽까지 대동맥 궁 아래의 결찰 보조 장치를 사용하여 실을 통과시킵니다.집게로 결찰 보조기구와 대동맥궁 사이의 두 실을 조심스럽게 잡습니다. 결찰 보조장치를 제거하고 양쪽의 나사산을 당겨 아치 주위에 O-링을 부드럽게 배치합니다. 성공적으로 위치를 잡은 후 나사산과 수술 매듭으로 O- 링을 고정하십시오.양쪽에서 열리지 않도록 추가 매듭을 만드십시오. O- 링을 결찰 한 후 절개 부위에서 3 개의 흉부 견인기를 제거합니다. 필요한 경우 따뜻한 0.9 % 등장 성 염 용액으로 채워 흉부의 잔류 공기를 제거하십시오.봉합을 위해 흉부 절개를 노출하려면 두 개의 5mm 견인기를 다시 가져 와서 피부를 옆으로 잡으십시오. 2 개 또는 3 개의 6-0 비 흡수성 봉합사로 흉부를 닫습니다. 2 개의 견인기를 제거하고 3-5 개의 4-0 흡수성 봉합사로 피부를 닫습니다.그런 다음 이소 플루 란을 끄고 모니터링하십시오. 폐를 다시 팽창시키기 위해 인공 호흡기의 유출을 2 초 동안 꼬집습니다. 수술 후 하루, 협착에 대한 최대 유속을 측정하여 초음파를 사용하여 협착을 확인합니다.측정을 위해 초음파 시스템과 30 메가 헤르츠 주파수의 변환기 프로브가있는 심 초음파를 사용하십시오. 마취 된 동물을 앙와위 자세로 가열 패드에 놓고 가열 패드를 직장 프로브와 연결하여 체온을 섭씨 37 도로 유지하고 4 개의 마우스 발 센서를 사용하여 ECG로 심박수를 모니터링합니다. 성공적으로 수행 된 O- 링 대동맥 밴딩은 초음파로 측정 한 협착증에 대한 유속을 증가시킵니다.이 측정을 위해 변환기 헤드를 오른쪽 흉부에 흉부 주위로 배치하여 2차원 이미징으로 대동맥궁의 위치를 지정합니다. 컬러 도플러를 사용하여 대동맥의 혈류를 시각화하고 협착에 대한 펄스 웨이브 도플러 혈류 속도로 측정하십시오. 2차원 영상으로 좌우 총경동맥을 시각화합니다.트랜스듀서 헤드를 목의 왼쪽과 오른쪽에 45도 각도로 수평으로 놓고 펄스 웨이브 도플러를 사용하여 혈류 속도를 결정합니다. 대동맥 협착증의 성공적인 유도는 펄스 파 도플러 초음파로 측정 된 대동맥의 협착에 대한 혈류 속도 증가로 나타났습니다. 또한, 오른쪽과 왼쪽 총 경동맥 사이의 혈류 속도 비율은 O- 링 대동맥 밴딩의 기능적 마커로 결정되었습니다.수술 2 주 후, 이완기에서 좌심실 후벽과 뇌실 내 중격 직경의 증가가 관찰되었다. 또한, 심장 기능의 점진적인 악화는 감소된 좌심실 박출률 측정을 통해 문서화되었습니다. 대동맥궁 주위에 O링을 고정하는 동안 최적의 결과를 얻으려면 매듭으로 양쪽의 링을 닫는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오에서는 압력 과부하로 인한 심부전을 조사하기 위해 마우스에서 최소 침습적 횡단 대동맥 수축에 대한 실험 프로토콜을 시연합니다.

마우스 모델의 횡방향 대동맥궁 밴딩: 좌심실에서 고압 유도를 위한 마우스의 최소 침습 기술

우리는 작은 금속 클립을 사용하여 상행 대동맥의 수축에 의해 위 스타 쥐의 압력 과부하 및 좌심실 비대를 만들기위한 단계별 절차를 설명합니다. 이 모델은 광범위하게 심장 비대 동안 리모델링 변경을 공부하고 이러한 변화의 회귀를위한 전략을 파악하고 평가하기 위해 사용된다.

압력 과부하 심장 비대 모델의 창조를위한 쥐의 대동맥 수축 오름차순

심장 비대와 리모델링을 유도하는 복부 대동맥 수축의 쥐 모델을 설명합니다. 효율적이고 재현성이 높으며 최소 침습적 방법을 사용하여 심근 비대 및 기능 장애 연구를 위한 간단하면서도 유용한 플랫폼을 제공합니다.

쥐의 복부 대동맥의 수축을 통해 심장 리모델링의 모델

기관 삽관과 인공 호흡기의 사용을 제거하면서 최소 침습 가로 대동맥 수축 (MTAC)는 일반 가로 대동맥 수축 (TAC)의 본질을 절약합니다. 그것은 특히 병진 연구에서 좌심실 과부하에 높은 처리량 연구를위한 매우 바람직한 방법으로 증명한다.

마우스의 최소 침습 가로 대동맥 수축

이 프로토콜의 목표는 단계별로 설명 하는 최소 침 습 가로 대동맥 수축 (TAC) 생쥐에서의 기술. 삽 관 법 그리고 일반적으로 사용 되는 표준 절차 필수는 환기의 제거, 최소 침 습 전술 수술 절차를 간소화 하 고 동물에 긴장을 감소 시킨다.

왼쪽된 심 실 비 대의 유도 대 한 생쥐에서 최소 침 습 가로 대동맥 수축의 기술

여기, 선물이 측면 thoracotomy 통해 가로 대동맥 수축 (TAC)의 프로토콜. 이 기술은 압력 과부하 및 마우스 활용 표준 전술 실험실 설정에서에서 심장 마비를 시뮬레이션을 최소 침 습, 닫힌 가슴 수술입니다.

마우스에 가로 대동맥 수축 유도를 폐쇄 가슴 모델

우리는 바로 심 실 비 대와 쥐에 있는 실패를 유발 하는 수술 방법 제시.

압력 과부하의 모델 밴딩 폐 트렁크 유도 오른쪽 심 실 비 대 및 실패

여기서 우리는 대동맥 수축의 잘 확립 된 마우스 모델에서 탈밴드 수술 대동맥의 단계별 프로토콜을 설명합니다. 이 절차는 비대의 좌심실 역 리모델링 및 회귀의 근본적인 메커니즘을 연구할 뿐만 아니라 심근 회복을 가속화할 수 있는 새로운 치료 옵션을 테스트할 수 있습니다.

설치류에서 대동맥 탈밴드에 의해 왼쪽 심실 역 리모델링 공부

우리는 리모델링 과정의 개시에 관여하는 신호 변환 경로가 활성화되는 압력 과부하 유도 적당한 리모델링 및 초기 수축기 기능 장애의 쥐 모델의 생성을 설명합니다. 이 동물 모델은 심부전을 위한 초기 치료 반대로 리모델링 전략을 적용하기 위한 분자 표적을 확인하는 것을 도울 것입니다.

압력 과부하의 쥐 모델은 오버트 수축기 심부전과 반대로 적당한 리모델링 및 수축기 기능 장애를 유도했습니다.

이 프로토콜은 돼지의 상행 대동맥 밴딩에 대한 최소 침습 수술 절차를 설명합니다.

돼지 대동맥 협착증의 최소 침습 모델

우리는 폐동맥 밴딩에 의해 유발된 우심실 압력 과부하의 쥐 모델을 설명합니다. 삽관, 수술 및 심장 초음파에 의한 표현형에 대한 자세한 프로토콜이 논문에 포함되어 있습니다. 삽관 및 수술에는 맞춤형 기구가 사용되어 모델을 빠르고 저렴하게 복제할 수 있습니다.

압력 과부하로 인한 우심실 비대와 폐동맥 밴딩에 의한 실패의 Murine 모델

배우세요 생쥐에서 O-링 대동맥 밴딩을 이용한 압력 과부하 심장 비대 유도법을. 고정 직경 고무 링으로 일관된 혈류 속도 증가와 재현성 높은 결과를 얻어 심혈관 연구의 신뢰성을 향상시킵니다.

O-링 대동맥 밴딩 대 압력 과부하로 인한 심장 비대 모델링을 위한 기존의 횡대동맥 수축

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