Name: 디지털 액적 PCR을 사용한 원형 RNA의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 배우세요 디지털 액적 PCR을 사용하여 circRNA를 정량화하는 방법을. C2C12 근육 세포에서 divergent primer를 활용한 이 기술은 낮은 발현량의 원형 RNA를 정밀하게 측정하여 분자 진단 및 RNA 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 연구는 생명 과학 연구소의 교내 자금, DBT 연구 보조금 (BT / PR27622 / MED / 30 / 1961 / 2018) 및 Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18 / 2 / 504017]이 Amaresh C. Panda에게 수여되었습니다. 기사를 교정해 주신 다른 실험실 구성원에게 감사드립니다.

RNA는 RNase에 민감합니다. 따라서 모든 시약, 기기 및 작업 공간은 RNase가 없어야 하며 주의해서 취급해야 합니다.
1. circRNA에 대한 발산 프라이머 설계(그림 1 참조)
<ol><li>BEDTools를 사용하여 circRNA 주석 데이터에서 또는 UCSC 게놈 브라우저에서 백스플라이스 접합 좌표18,19 사이에 존재하는 엑손/인트론 서열을 결합하여 성숙 서열을 검색합니다.</li>
	<li>전체 circRNA 서열 길이의 마지막 100개 뉴클레오티드를 circRNA 서열 10의 처음 100개 뉴클레오티드에 결합시켜200개 뉴클레오티드 길이의 PCR 주형 서열을 제조한다. 참고 : circRNA 길이가 200 뉴클레오티드 미만이면 두 개의 동일한 반으로 나누고 후반부부터 전반부 초까지 뉴클레오티드를 결합합니다.</li>
	<li>Primer3 웹 도구를 사용하고 길이20에서 120-180 뉴클레오티드 범위의 PCR 산물 길이를 설정하여 프라이머 설계에 위의 템플릿 서열을 사용합니다.</li>
	<li>Primer3의 기본 설정을 Tm 및 프라이머 길이와 같은 다른 매개변수에 사용합니다. circBnc2에 대한 프라이머 서열은 표 1에 열거되어 있다.</li>
	<li>합성을 위한 발산 프라이머 서열을 모든 올리고 합성 회사로부터 주문하십시오.</li>
</ol>2. RNA 분리
참고: 시판되는 키트 또는 사내 RNA 분리 방법을 사용하여 마우스 C2C12 세포에서 총 RNA를 분리합니다. 여기에 사용된 사내 RNA 분리 방법은 앞서 설명하였다21. 자성 실리카 비드는 이전에 공개된 프로토콜(22)을 사용하여 실험실에서 제조된다. 이러한 마그네틱 비드는 다양한 공급업체에서도 조달할 수 있습니다.
<ol><li>RNA 분리를 위해 약 5 x 106 개의 증식하는 C2C12 근원세포 세포와 4일 분화된 C2C12 myotube 1개가 들어 있는 10cm 접시 1개를 가져갑니다.</li>
	<li>세포를 10mL의 1x PBS로 3회 세척하고 피펫을 사용하여 PBS를 버립니다.</li>
	<li>세포 스크레이퍼를 사용하여 1mL의 1x PBS에서 세포를 긁어내고 4°C에서 750 x g에서 5분 동안 원심분리하고 피펫을 사용하여 PBS를 버립니다.</li>
	<li>RNA 분리 시약(RIR) 1mL를 추가하고 격렬한 피펫팅으로 세포를 용해시킵니다21.</li>
	<li>200 μL (RIR 부피의 1/5)의 클로로포름과 15 초 동안 와류를 추가합니다. 튜브를 4°C에서 12,000 x g에서 10분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상부 수층 400μL를 취하여 실리카 컬럼에 담고 실온에서 12,000 x g 에서 1분간 원심분리한다. 플로우 스루를 새 튜브로 가져와 600 μL의 100 % 에탄올을 첨가하십시오.</li>
	<li>20μL의 자성 실리카 비드를 추가하고 튜브를 25°C 및 1,200rpm으로 설정된 열혼합기에 5분 동안 놓습니다. 참고: 비드 부피는 용해를 위해 취해진 초기 세포 수에 따라 증가하거나 감소될 수 있습니다. 마그네틱 실리카 비드는 상업 공급 업체에서 조달 할 수 있습니다.</li>
	<li>튜브를 마그네틱 스탠드에 30초 동안 또는 용액이 투명해질 때까지 놓습니다. 피펫을 사용하여 상청액을 조심스럽게 폐기하십시오.</li>
	<li>자성 실리카 비드를 90% 에탄올을 함유하는 500μL의 세척 완충액에 재현탁시킨다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 30초 동안 놓습니다. 마그네틱 스탠드에서 튜브를 두 번 돌려 구슬을 씻습니다. 비드가 자석 쪽으로 가라앉도록 하고 피펫을 사용하여 버퍼를 버립니다.</li>
	<li>2.9단계를 두 번 반복합니다. 세척 후 튜브를 짧게 돌리고 마그네틱 스탠드에 30초 동안 다시 놓습니다. 남은 세척액을 폐기하십시오. 튜브를 50°C에서 3분 동안 열믹서에서 자연 건조하여 뚜껑을 열어 둡니다.</li>
	<li>뉴클레아제가 없는 물 20μL를 추가하고 비드를 재현탁합니다. 참고: RNA 용리 부피를 10μL까지 줄여 RNA 농도를 확장할 수 있습니다.</li>
	<li>튜브를 실온에서 2-3분 동안 두십시오. 튜브를 마그네틱 스탠드에 다시 놓고 30초 동안 그대로 두십시오. 분광 광도계를 사용하여 양 및 품질 평가를 위해 용해 된 RNA를 새 튜브에 수집합니다. 참고: RNA는 장기 보관을 위해 -20 °C 또는 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. 최적의 결과를 얻으려면 다음날 cDNA 합성 단계를 진행하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>3. cDNA 합성
<ol><li>분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정하고 cDNA 합성을 위해 RNA 1μg을 취합니다.</li>
	<li>1μg의 총 RNA와 1μL의 dNTP 믹스(dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP의 각 10mM), 4μL의 5x 역전사효소(RT) 버퍼, 2μL의 10x RT 랜덤 프라이머, 0.25μL의 역전사효소효소(200U/μL) 및 0.5μL의 RNase 억제제(40U/μL)를 혼합하고 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 최대 20μL의 부피를 구성합니다. 참고: 역전사효소 부피는 cDNA 합성을 위해 취한 초기 RNA 농도에 따라 변경될 수 있습니다.</li>
	<li>튜브를 탭하여 반응을 혼합하고 짧게 회전합니다. 튜브를 25 ° C에서 10 분 동안 놓은 다음 50 ° C에서 1 시간 동안 놓습니다.</li>
	<li>효소를 비활성화하려면 튜브를 85°C에 5분 동안 두십시오.</li>
	<li>튜브를 2분 동안 얼음으로 식히고 튜브에 뉴클레아제가 없는 물 480μL를 추가하여 cDNA 농도를 2ng/μL로 만듭니다. 참고: cDNA는 -20°C에서 보관하거나 dd-PCR 분석에 즉시 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 디지털 액적 PCR (dd-PCR) 워크 플로우
참고: dd-PCR의 워크플로우에는 샘플 준비부터 시작하여 액적 생성, PCR 증폭, 액적 계수 및 데이터 분석이 이어지는 여러 단계가 포함됩니다. dd-PCR은 제품의 절대 정량화를 포함하고 표준 곡선이 필요하지 않으므로 각 단계는 정확한 데이터 생성에 중요합니다. 따라서, dd-PCR의 각각의 상이한 단계가 이하에 설명되었다.
<ol><li>상기 dd-PCR 반응물의 제조.<ol><li>음성 제어 튜브 및 NTC(비템플릿 제어) 튜브와 함께 0.2mL PCR 튜브 또는 스트립에 22μL의 PCR 반응을 설정합니다. 참고: 서로 다른 circRNA의 검출을 위한 각각의 서로 다른 발산 프라이머 쌍은 테스트 샘플과 함께 NTC 반응을 가져야 합니다.</li>
		<li>11μL의 dd-PCR 마스터 믹스(예: 에바그린 슈퍼믹스)와 11μL의 뉴클레아제가 없는 물을 추가하여 음성 대조군 반응 튜브를 설정합니다. 알림: dd-PCR 마스터 믹스를 실온에서 해동한 다음 짧은 와동을 일으켜 균일한 혼합물을 만듭니다. 동일한 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 cDNA 희석에 사용된 음성 대조군 반응 튜브와 NTC 튜브를 설정합니다.</li>
		<li>11μL의 dd-PCR 마스터 믹스, 5.5μL 1μM 농도의 circRNA 특이적 정방향 및 역방향 프라이머 믹스, 5.5μL의 뉴클레아제가 없는 물을 추가하여 NTC 반응 튜브를 설정합니다. 참고: 100 μM 스톡의 정방향 및 역방향 원형 RNA 특이적 발산 프라이머를 희석하고 혼합하여 1 μM 작동 농도의 정방향 및 역방향 circRNA 프라이머 믹스를 제조하고; 따라서, 최종 프라이머 농도는 22 μL 반응에서 250 nM이다.</li>
		<li>11μL의 dd-PCR 마스터 믹스, 5.5μL의 circRNA 특이적 1μM 농도의 정방향 및 역방향 프라이머 믹스, 5.5μL의 cDNA(2ng/μL)를 추가하여 테스트 반응 튜브를 설정합니다.</li>
		<li>와류는 완전히 이어 모든 반응 튜브를 간단히 원심분리하여 튜브 바닥에서 균일한 반응 혼합물을 얻습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>액적 생성.<ol><li>20 μL의 PCR 혼합물을 0.2 mL PCR 튜브에서 액적 발생기 카트리지의 샘플 웰로 옮깁니다.</li>
		<li>다중 채널 피펫을 사용하여 액적 발생기 카트리지의 유정에 70μL의 액적 생성 오일을 조심스럽게 추가합니다. 알림: 사용하기 전에 액적 생성 오일을 실온에서 15분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>물방울 발생기 카트리지를 고무 개스킷으로 덮고 액적 발생기 기계에 넣어 카트리지의 액적 우물에서 생성된 샘플-오일 액적 혼합물을 얻습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>PCR 증폭.<ol><li>다중 채널 피펫을 사용하여 40μL의 샘플-오일 액적 혼합물을 액적 발생기 카트리지의 액적 웰에서 96웰 PCR 플레이트로 옮깁니다. 알림: dd-PCR 96-웰 플레이트로 옮기는 동안 액적이 깨지지 않도록 다중 채널 피펫의 팁을 통해 웰과 각도를 이루면서 샘플-오일 액적 혼합물을 조심스럽게 옮깁니다.</li>
		<li>알루미늄 호일 실러로 96웰 PCR 플레이트를 밀봉하고 80°C로 예열된 플레이트 실러 기계 블록에 넣고 PCR 플레이트를 밀봉하기 위한 씰을 클릭합니다.</li>
		<li>이제 플레이트를 dd-PCR 열 순환기에 놓고 뚜껑 온도를 105°C로 설정하고 램프 속도를 2°C/s로 설정하여 표 2 에 언급된 대로 프로그램을 설정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>물방울 계산.<ol><li>PCR이 끝나면 플레이트 홀더가 액적을 계수하기 위한 올바른 위치에 있는 상태에서 플레이트를 dd-PCR 액적 카운터 기계에 놓습니다.</li>
		<li>액적 분석 소프트웨어를 열고 샘플 정보에 대한 입력을 제공하여 실행을 설정합니다.</li>
		<li>설정 옵션을 클릭하십시오. 그런 다음 템플릿 옵션을 클릭하여 새 템플릿을 엽니다.</li>
		<li>시료명(cDNA 사용 또는 음성대조군 또는 NTC), 표적명(circRNA 프라이머명) 및 유형(불명), 실험유형(ABS(절대정량) 및 슈퍼믹스(dd-PCR 에바그린 슈퍼믹스) 등 실험의 세부 사항을 넣어 각 웰을 정의합니다.</li>
		<li>마지막으로 템플릿을 저장하고 실행 옵션을 클릭하여 실행을 시작하고 행 또는 열별로 계산을 선택합니다. 기계가 액적 계수를 완료하도록 허용하며, 이는 약 1분/웰이 소요됩니다.</li>
		<li>분석 버튼을 클릭하여 액적 판독 완료 후 데이터를 분석 합니다.</li>
		<li>1D 진폭 버튼을 클릭하여 양수 및 음수 방울을 확인합니다.</li>
		<li>음의 물방울에서 양성 방울을 분리하려면 동일한 표적을 가진 모든 샘플에 대해 공통 임계 선을 설정하십시오. 참고: 각 샘플의 총 방울은 절대 정량화를 위해 10,000 이상이어야 합니다. NTC는 양의 액적 수를 나타내지 않아야 합니다. NTC에서 양성 액적의 존재는 시약의 오염 또는 프라이머 이량 체의 증폭을 나타냅니다. 양성 방울이 NTC에 프라이머 이량 체 또는 비특이적 생성물을 가지고 있는지 여부를 알아내는 것은 어렵습니다. 프라이머를 확인하고 dd-PCR을 포함한 모든 PCR에 대한 일반적인 관행으로 시약의 오염을 피하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>내보내기 버튼을 클릭하여 circRNA 카운트 데이터를 .csv 파일로 내보냅니다. 내보낸 데이터는 각 샘플에 존재하는 circRNA의 수를 보여줍니다.</li>
		<li>각 반응에 사용된 cDNA의 총량을 고려하여 RNA 나노그램당 각 샘플의 circRNA 수를 수동으로 계산합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PLoS One. 7 (2), 30733(2012).</li>
<li>Chen, L. L., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+circRNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of circRNA biogenesis.</a> RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).</li>
<li>Kristensen, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogenesis%2C+biology+and+characterization+of+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).</li>
<li>Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+in+disease%3A+Basic+properties+and+biomedical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).</li>
<li>Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+translation%2C+a+path+to+hidden+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNA translation, a path to hidden proteome.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685(2022).</li>
<li>Panda, A. C. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPanda%2C+AC+%22Circular+RNAs%3A+Biogenesis+and+Functions%22">Circular RNAs: Biogenesis and Functions</a>. Xiao, J. , Springer. Singapore. 67-79 (2018).</li>
<li>Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+circular+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Non-Coding+RNA%22%5BJournal%5D)">Emerging role of circular RNA-protein interactions.</a> Non-Coding RNA. 7 (3), 48(2021).</li>
<li>Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CircRNAs%3A+Role+in+human+diseases+and+potential+use+as+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers.</a> Cell Death & Disease. 12 (5), 468(2021).</li>
<li>Pandey, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+analysis+of+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Methods for analysis of circular RNAs.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566(2020).</li>
<li>Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDas%2C+A+%22PCR+Primer+Design.+Methods+in+Molecular+Biology%22">PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology</a>. 2392, Humana. New York, NY. 103-114 (2022).</li>
<li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+abundant%2C+conserved%2C+and+associated+with+ALU+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li>
<li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li>
<li>Hayden, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+droplet+digital+PCR+to+real-time+PCR+for+quantitative+detection+of+cytomegalovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+From+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409(2017).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic%2C+prognostic%2C+and+therapeutic+value+of+droplet+digital+PCR+%28ddPCR%29+in+COVID-19+patients%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712(2021).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li>
<li>Lee, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UCSC+genome+browser+database%3A+2022+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The UCSC genome browser database: 2022 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), 115(2012).</li>
<li>Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick+and+cost-effective+method+for+DNA-free+total+RNA+isolation+using+magnetic+silica+beads%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Synthesis+of+Functionalized+Paramagnetic+Beads+for+Nucleic+Acid+Purification+and+Manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation.</a> Bio-protocol. 9 (20), 3394(2019).</li>
<li>Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+droplet+digital+PCR+shows+high+resilience+to+PCR+inhibitors+from+plant%2C+soil+and+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples.</a> Plant Methods. 10 (1), 42(2014).</li>
<li>Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+droplet+digital+PCR+from+RNA+and+DNA+extracts+with+direct+comparison+to+RT-qPCR%3A+Clinical+implications+for+quantification+of+Oseltamivir-resistant+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations.</a> Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

CircRNA 연구는 지난 10년 동안 고처리량 시퀀싱 기술의 발견으로 성장했습니다. 결과적으로, 그것은 미래의 RNA 치료제를위한 잠재적 인 분자로 간주되었습니다. 또한, 암 및 심혈관 질환 4,8을 비롯한 여러 질환에서 바이오마커로 작용하는 것으로 알려져 있다. 그러나 circRNA의 식별은 존재도가 낮고 모 mRNA9와 구별되는 특정 백스플라이스 접합 서열이 하나만 있기 때문에 까다롭습니다. 발산 프라이머를 사용하는 RT-PCR은 발견 9,10 이후 circRNA를 검증하는 황금 표준 기술이었습니다. circRNA 정량화를 위해 여러 분자 방법이 개발되었지만 존재도가 낮기 때문에 circRNA 발현을 정확하게 측정하는 것은 어렵습니다. dd-PCR은 주어진 샘플(<sup c...

RNA 시퀀싱 기술과 새로운 계산 알고리즘의 최근 발전은 원형 RNA(circRNA)1라고 하는 성장하는 비코딩 RNA 계열의 새로운 구성원을 발견했습니다. 이름에서 알 수 있듯이 circRNA는 자유 끝이 없는 단일 가닥 RNA 분자 계열입니다. 이들은 백스플라이싱이라고 하는 비표준 헤드-투-테일 스플라이싱에 의해 형성되며, 여기서 상류 스플라이스 수용체 부위는 다운스트림 스플라이스 공여체 부위와 공유적으로 결합하여 안정적인 RNA 원 1,2를 형성합니다. 이 과정은 순환된 엑손의 상류 및 하류에 존재하는 거꾸로 된 Alu 반복 요소를 포함한 여러 요인에 의해 매개되거나 일부 스플라이싱 인자 또는 RNA 결합 단백질(RBP)2,3에 의해 매개될 수 있습니다. 엑소닉 또는 인트론 서열에서만 생성된 원형 RNA는 엑소닉 circRNA 및 원형 인트론 RNA 또는 ci-RNA로 분류되는 반면, 일부 엑소닉 circRNA는 인트론을 유지하며 엑손-인트론 circRNA(EIcircRNA)라고 합니다.3,4. circRNA의 기능은 스폰지 miRNA 및/또는 RBP, 전사 조절 및 펩티드 3,5,6,7로 번역하여 세포 기능을 조절하는 것을 포함하여 다면적입니다. 여러 보고서에서 다양한 질병 및 생리적 과정에서 circRNA의 중요성을 강조했습니다8. 또한, 조직 특이적 발현 패턴 및 엑소뉴클레아제 소화에 대한 내성은 질병 진단을 위한 기능적 바이오마커가 되며 적절한치료 표적으로도 사용될 수 있다8. 건강과 질병을 조절하는 데있어 그 중요성을 고려할 때, circRNA 발현의 정확한 정량화는 시간의 필요성입니다.
생물학적샘플에서 circRNA를 정량화하기 위해 여러 생화학적 방법이 개발되었습니다9. circRNA 정량화에 가장 편리하고 널리 사용되는 방법 중 하나는 역전사 후 발산 프라이머 쌍10을 사용하는 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)입니다. 그러나 대부분의 circRNA는 선형 mRNA에 비해 존재량이 적기 때문에 정량화하기가 어렵습니다11. 이 문제를 극복하기 위해 우리는 디지털 액적 PCR (dd-PCR)을 사용하여 주어진 샘플에서 circRNA의 수를 정확하게 정량화하고자했습니다. dd-PCR은 미세 유체 원리를 따르는 고급 PCR 기술입니다. 오일에 여러 개의 수성 방울을 생성하고 PCR은 개별 반응(12)으로서 각 액적에서 발생합니다. 반응은 개별 액적에서 발생하고 액적 판독기를 사용하여 분석되며, 이는 관심 유전자12에 대한 양성 또는 음성 액적의 수를 제공합니다. 주어진 샘플에 단 하나의 사본만 있는 경우에도 관심 유전자를 정확하게 정량화하는 가장 민감한 기술입니다. 억제제에 대한 민감도 감소, 정밀도 향상 및 정량화를 위한 참조 유전자 생략은 기존 qPCR13,14,15보다 유리합니다. 관심 유전자의 절대 정량화를위한 연구 및 진단 도구로 널리 사용되었습니다16,17. 여기에서는 발산 프라이머를 사용하여 마우스 C2C12 근관을 분화하고 마우스 C2C12 근아세포를 증식시키는 데 있어 circRNA 정량화를 위한 상세한 dd-PCR 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Tarson</td><td>500010</td><td></td></tr><tr><td>0.2ml 튜브 스트립(캡 포함)</td><td>Tarson</td><td>610020, 510073</td><td></td></tr><tr><td>필터 팁</td><td>Tarson</td><td>528104</td><td></td></tr><tr><td>DNase/RNase-Free 증류수</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>셀 스크래퍼</td><td>HiMedia</td><td>TCP223</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>SRL</td><td>96764</td><td></td></tr><tr><td>DNA 희석제</td><td>HiMedia</td><td>MB228</td><td></td></tr><tr><td>랜덤 프라이머</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 세트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>쥐 RNase 억제제</td><td>NEB</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>Maxima reverse 전사 효소</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EP0743</td><td></td></tr><tr><td>QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864033</td> Evagreen Bio-Rad 1864006 <td></td></tr><tr><td></td><td></td>PCR 플레이트<td>용 액적 생성 오일</td><td></td></tr><tr><td>열 밀봉, 호일, 피어싱 가능한</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>DG8 카트리지 및 개스킷</td><td>Bio-Rad</td><td>1864007</td><td></td></tr><tr><td>DG8 카트리지 홀더</td><td>Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>QX200 물방울 생성기</td><td>Bio-Rad</td><td>1864002</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96-웰 플레이트</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR 플레이트 씰러</td><td>Bio-Rad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>C1000 터치 열 순환기 96&ndash; 딥 웰 반응 모듈</td><td>Bio-Rad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>QX200 액적 리더</td><td>Bio-Rad</td><td>1864003</td><td></td></tr><tr><td>Quantasoft 소프트웨어</td><td>Bio-Rad</td><td>1864011</td><td></td></tr><tr><td>실리카 컬럼</td><td>우산 생명 과학</td><td>38220090</td><td></td></tr><tr><td>UCSC Genome Browser</td><td></td><td>https://genome.ucsc.edu/</td><td></td></tr> <tr><td>Primer 3</td><td></td><td></td><td></td>https://primer3.ut.ee/</tr></tbody></table>

디지털 액적 pcr을 사용한 원형 rna의 정량화

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

디지털 액적 중합효소 연쇄 반응(dd-PCR)은 가장 민감한 정량화 방법 중 하나입니다. 반응을 거의 20,000개의 유중수 방울로 분획하고 개별 액적에서 PCR이 발생합니다. dd-PCR은 기존의 실시간 qPCR에 비해 낮은 존재비 표적 검출의 정확도 향상, 정량화를 위한 참조 유전자 생략, 샘플에 대한 기술 복제 제거, 샘플의 억제제에 대한 높은 복원력 표시 등 몇 가지 장점이 있습니다. 최근 dd-PCR은 유전자 발현 분석 및 진단을 위해 표적 DNA 또는 RNA를 정확하게 정량화하는 가장 보편적 인 방법 중 하나가되었습니다. 원형 RNA(circRNA)는 5' 및 3' 말단이 없는 최근에 발견된 공유 결합 폐쇄 RNA 분자의 대가족입니다. 그들은 RNA 결합 단백질과 마이크로 RNA의 스폰지 역할을하여 유전자 발현을 조절하는 것으로 나타났습니다. 또한 circRNA는 체액으로 분비되며 엑소뉴클레아제에 대한 내성으로 인해 질병 진단을 위한 바이오마커 역할을 합니다. 이 기사는 발산 프라이머 설계, RNA 추출, cDNA 합성 및 dd-PCR 분석을 수행하여 세포의 특정 원형 RNA(circRNA) 수준을 정확하게 정량화하는 방법을 보여주는 것을 목표로 합니다. 결론적으로, 우리는 dd-PCR을 사용하여 circRNA의 정확한 정량화를 입증합니다.

각 샘플에서 circRNA의 절대 수는 내보낸 dd-PCR 데이터로부터 유도할 수 있다. 실시간 정량 PCR 분석은 분화된 C2C12 근관에서 circBnc2 의 차등 발현을 제안했습니다(데이터는 나타내지 않음). 여기에서, 우리는 증식하는 C2C12 근원 세포 및 근관에서 circBnc2 의 절대 복제 수를 확인하고 싶었습니다. circBnc2 의 발현은 두 가지 조건에서 비교되기 때문에 동일한 시약과 절차를 사용하여 RNA 분리, cDNA 합성 및 PCR을 위해 모든 샘플을 동시에 처리하는 것이 매우 중요합니다. dd-PCR 반응을 사용하여 circRNA의 절대 정량화를 수행하려면 총 RNA의 나노그램당 표적 RNA 분자의 정확한 수를 계산하기 위해 cDNA 합성에 동일한 양의 초기 총 RNA를 사용해야 합니다. 예를 들어, 총 RNA 1μg을 cDNA 합성에 사용하고 dd-PCR 분석을 수행하기 전에 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 500μL로 희석하여 최종 농도 2ng/μL...

이 프로토콜은 발산 프라이머를 사용하여 세포에서 원형 RNA(circRNA) 수준을 정밀하게 정량하기 위한 디지털 액적 PCR(dd-PCR)의 자세한 방법을 설명합니다.

디지털 액적 PCR을 사용한 원형 RNA의 정량화

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

dd-PCR은 표적 DNA 또는 RNA의 절대 정량화를 위한 매우 민감하고 정확한 방법입니다. 다른 기존 방법으로는 정확한 결과를 제공하지 못하는 질병 진단에 사용되었습니다. dd-PCR은 매우 낮은 풍부 핵산 분자를 검출하기 위한 가장 민감한 기술입니다.정량적 PCR과 달리 dd-PCR은 정량화를 위한 하우스키핑 유전자 제어가 필요하지 않습니다. 감도와 정확성으로 인해 dd-PCR은 마이크로 RNA 및 원형 RNA와 같은 낮은 풍부 RNA 분자와 관련된 분자 진단 및 연구를 위한 도구로 사용할 수 있습니다. dd-PCR을 사용하기 전에 RT-PCR 또는 RT-qPCR을 수행하여 프라이머가 비특이적 PCR 증폭 없이 표적 유전자를 증폭하고 있는지 확인해야 합니다.시작하려면, 전체 원형 RNA 서열 길이의 마지막 100개 뉴클레오티드를 원형 RNA 서열의 처음 100개 뉴클레오티드에 결합함으로써 길이가 200개 뉴클레오티드 인 PCR 주형 서열을 준비한다. Primer 3 웹 도구로 디자인된 프라이머용 템플릿 시퀀스를 사용합니다. RNA 분리를 위해 약 500만 개의 증식하는 C2C12 근원세포 세포와 4일 분화된 C2C12 근관이 들어 있는 10cm 접시 하나를 가져갑니다.세포를 10 밀리리터의 1X PBS로 3 회 세척하고 피펫을 사용하여 PBS를 버립니다. RNA 분리 시약 1밀리리터를 추가하고 격렬한 피펫팅으로 세포를 용해시킵니다. 그런 다음 200 마이크로 리터의 클로로포름을 넣고 15 초 동안 와동시킵니다.튜브를 섭씨 4도에서 12, 000 G에서 10 분간 원심 분리하고 상부 수층 400 마이크로 리터를 취하여 실리카 컬럼에 넣고 실온에서 12, 000G에서 1 분간 원심 분리합니다. 새 튜브로 흐름을 가져 와서 600 마이크로 리터의 100 % 에탄올을 첨가하십시오. 20 마이크로 리터의 자성 실리카 비드를 넣고 튜브를 섭씨 25도 및 1, 200RPM으로 5 분 동안 설정 한 열 혼합기에 놓습니다.그런 다음 튜브를 마그네틱 스탠드에 30초 동안 또는 용액이 투명해질 때까지 놓습니다. 자성 실리카 비드를 90% 에탄올을 함유하는 500마이크로리터의 세척 완충액에 재현탁시킨다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 30초 동안 놓은 후 비드가 자석 쪽으로 가라앉도록 하고 피펫을 사용하여 버퍼를 버립니다.튜브를 섭씨 50도에서 써모믹서에서 3분 동안 자연 건조하여 뚜껑을 열어 둡니다. 20마이크로리터의 뉴클레아제

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연구

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이 비디오에서는 디지털 중합효소연쇄반응(dPCR)으로 표적 핵산을 검출하기 위해 유화된 나노 액적을 생성하는 단계별 절차를 제시합니다.

액적 디지털 중합효소 연쇄 반응: 희귀 종양 돌연변이 검출을 위한 나노액적 PCR 반응을 생성하는 방법

우리는 단순화된 (아날로그) 판독으로 핵산을 정량화하기 위한 종말점 디지털 분석을 설명합니다. 당사는 특수 기기가 아닌 표준 qPCR 기계를 사용하여 액적 기반 디지털 분석의 벌크 형광을 측정하고 현미경 검사로 결과를 확인합니다.

디지털 핵산 정량 분석​​ 실험의 단순 대량 판독

염료 기반 화학 및 액적 디지털 PCR 기술을 사용한 cell-free microRNA 정량화를 위한 민감하고 정확한 방법에 대해 설명합니다.

마이크로 RNA 정량는 DNA 결합 염료 화학, 물방울 디지털 PCR을 사용하여 순환

순환 microRNAs는 심혈 관 질환 및 급성 심근 경색에 대 한 생체로 약속을 보여주었다. 이 연구에서 우리는 미르 추출, 반전 녹음 방송 및 심혈 관 질환 환자의 혈 청에서 miRNAs의 절대 정량화에 대 한 디지털 PCR 프로토콜을 설명합니다.

급성 심근 경색 및 심혈 관 질환 MicroRNAs 순환 측정을 위한 디지털 PCR

여기에서, 우리는 환자 생물학적 유체 (biofluids)에 존재하는 순환 DNA에 있는 종양 체세포 돌연변이를 검출하는 프로토콜을 제시합니다. 우리의 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 (dPCR) 기지를 둔 방법은 종양 돌연변이 allelic 주파수 (MAF)의 정량화를 가능하게 하고, 종양 반응의 진단 그리고 시간적 감시에 최소침습 적인 보충을 촉진하.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

원형 RNA (circRNAs)는 단백질 사이 전사 규칙 그리고 중재 상호 작용에 있는 역할을 할 수 있는 비 코딩 RNA입니다. circRNA 염기서열 분석 라이브러리의 구성을 위한 상이한 파라미터의 평가에 이어, RNase R 전처리와 함께 좌초된 총 RNA 라이브러리 제제를 활용한 프로토콜이 컴파일되고 여기에 제시된다.

RNA 시퀀싱을 사용하는 원형 RNA 식별

이 작업은 2색 ddPCR 시스템을 사용하여 SARS-CoV-2 검출을 위한 다양한 분석법을 개발하는 단계를 요약합니다. 단계는 정교하며 분석 및 실험 성능을 개선하는 방법에 대한 메모가 포함되어 있습니다. 이러한 분석은 여러 SARS-CoV-2 RT-ddPCR 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

SARS-CoV-2 검출 및 정량화를 위한 2단계 역전사 액적 디지털 PCR 프로토콜

여기에서는 단일 세포에서 절대 미토콘드리아(mt)DNA 복제 수와 mtDNA 결실 이형질 수준을 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

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아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터 게놈 복제의 정확한 정량화는 매우 중요하지만 표준화된 프로토콜은 아직 확립되지 않았습니다. 이 프로토콜은 바이러스 게놈 역가를 신뢰성 있게 정량화하기 위해 정제된 AAV 샘플을 준비하고 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응(dd_PCR)을 수행하기 위한 검증된 방법을 설명합니다.

Digital Droplet Polymerase Chain Reaction에 의한 정제된 벡터 샘플의 Adeno-Associated Viral Genomes 정량화

본 연구는 다공성 막 삽입물을 이용해 축삭 mRNA를 분리하는 견고한 방법을 제시하여, 전체 뉴런과 신경돌의 분리 및 RNA 정제를 가능하게 합니다. RTddPCR과 결합하여 저복제 전사체의 절대적 정량화를 가능하게 하여, 높은 민감도, 재현성, 광범위한 실험적 적용성을 가진 mRNA 수송 및 국소 번역 연구를 용이하게 합니다.

다공성 막 삽입물과 RTddPCR을 이용한 축삭 mRNA의 분리 및 정량

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디지털 액적 PCR을 사용한 원형 RNA의 정량화

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