Name: 시험관 내 허혈성 뇌졸중 연구를 위한 인간 혈액-뇌 장벽의 삼중 일차 세포 배양 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:05:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 학습하세요 혈액-뇌 장벽의 삼중 일차 세포 배양 모델을 이용한 허혈성 뇌졸중 연구 방법을. 이 기법은 뇌졸중 후 회복에 영향을 미치는 세포 메커니즘을 조사하고 신약 후보 물질을 선별하는 데 활용됩니다.

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참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 셀, 재료, 장비 및 솔루션과 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 삼중 세포 배양 BBB 모델 설정
<ol><li>심기 주위 세포<ol><li>합류할 때까지 37°C에서 5%CO2 인큐베이터 내에서 세포 접착을 위한 활성화된 표면을 가진 T75 배양 플라스크에서 HBVP를 배양합니다. 합류점에 도달하면 오래된 혈관주위세포 배지를 흡인하고 따뜻한 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 5mL로 세포를 세척합니다. DPBS를 흡인하고 4mL의 따뜻한 트립신-EDTA 용액과 1mL의 DPBS를 조합하여 플라스크에서 세포를 분리합니다. 참고: P7 이후의 구절은 사용하지 마십시오.</li>
		<li>플라스크를CO2 인큐베이터에서 37°C에서 5분 동안 인큐베이션한다. 현미경으로 보고 세포가 플라스크에서 분리되었는지 확인합니다. 5mL의 따뜻한 혈관주위세포 배지(2% 소 태아 혈청[FBS] 함유)를 플라스크에 추가하고 분리된 세포를 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>세포 현탁액을 200 × g에서 3분 동안 원심분리하여 세포가 튜브 바닥에 펠릿을 형성하도록 합니다. 튜브에서 배지를 흡입하여 세포 펠릿이 손상되지 않았는지 확인합니다.</li>
		<li>세포 펠렛을 혈관주위세포 배지에 재현탁시키고; 세포의 합류점과 필요한 웰 삽입물의 수에 따라 배지의 양을 계산하십시오. 재현탁 세포 10μL를 취하여 세포 계수 슬라이드에 넣고 세포 수를 계산합니다.</li>
		<li>세포 밀도를 결정하고 웰 삽입물의 내강 면에 1mL의 혈관주위세포 배지에 삽입물 300,000개/삽입물을 시드합니다(6웰 형식). 알림: 인서트 밑면에 HBVP를 파종할 때 먼저 잘 삽입된 플레이트를 거꾸로 뒤집는 것이 매우 중요합니다. 플레이트가 표면에 평평하게 놓인 상태에서 바닥 부분을 제거하여 웰 인서트의 면이 노출되도록 합니다. 측류면에 pericyte 세포 현탁액을 추가 한 후, 증발을 방지하기 위해 뒤집힌 판으로 웰 인서트를 덮으십시오. 모든 플레이트를 뒤집어 37°C의 5%CO2 인큐베이터에서 밤새 보관한다.</li>
	</ol></li>
	<li>성상 세포 파종<ol><li>합류점에 도달 할 때까지 37 ° C의 5 % CO2 인큐베이터 내에서 T75 플라스크에서 HA를 배양하십시오. 혈관주위세포 배지 대신 성상세포 배지(2% FBS 포함)를 사용하여 위의 1.1.1-1.1.4단계를 따르십시오. 참고: P9 이후의 구절은 사용하지 마십시오.</li>
		<li>세포 밀도를 결정하고 조직 배양 6웰 플레이트의 바닥에 300,000개의 세포/웰을 시드합니다. 증발을 방지하기 위해 플레이트를 덮고 모든 플레이트를 37°C에서 밤새 5%CO2 인큐베이터에 보관한다.</li>
	</ol></li>
	<li>내피 세포 파종<ol><li>합류할 때까지 37°C에서 5%CO2 인큐베이터 내에서 조직 배양 접시에서 HBMEC를 배양합니다. 혈관주위세포 배지 대신 완전한 클래식 배지(10% FBS 포함)를 사용하여 위의 1.1.1-1.1.4단계를 따르십시오. 참고: P12 이후의 구절은 사용하지 마십시오.</li>
		<li>성상세포를 함유하는 조직 배양 6-웰 플레이트와 혈관주위세포를 함유하는 웰 삽입물(6-웰 포맷)을 37°C에서 5%CO2 배양기로부터 꺼낸다. 조직 배양 6-웰 플레이트로부터 성상세포 배지를 흡인한다. 각 웰에 1mL의 혈관주위세포 배지와 1mL의 성상세포 배지를 추가합니다.</li>
		<li>웰 삽입물로부터 혈관주위세포 배지를 흡인하고, 이를 파종된 성상교세포가 들어 있는 조직 배양 6-웰 플레이트에 넣는다. HBMEC를 2mL의 완전한 클래식 배지에 300,000 세포/웰 밀도로 동일한 웰 삽입물의 정점 쪽에 시드합니다. 참고: 내피 세포는 웰 인서트의 내강 쪽에 혈관주위세포를 파종하고 조직 배양 6웰 플레이트에 성상세포를 파종한 후 다음 날 웰 삽입물의 정점 쪽에 파종해야 합니다. 세포는 BBB 유사 특성을 유도하기 위해 6일 동안 삼중 배양에서 유지되어야 합니다. 세포 배양 배지는 실험 24시간 전에 두 웰 삽입 구획 모두에서 교체해야 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 산소-포도당 박탈의 유도
<ol><li>DPBS로 세포를 3 배 세척하십시오. OGD를 거친 삼중 세포 배양의 경우 포도당이없는 배지 (L- 글루타민 및 페놀 레드없이)를 정점 및 기저 측 구획 모두에 추가하십시오. 배양 배지를 정상 제어 세포 배양에서 새로운 배지로 교체하십시오. 대조군 삼중 배양물을 37°C의 5%CO2 배양기에 두었다. 참고: OGD 유도 전 또는 OGD 직후의 배지 변화는 내피 세포 단층에 더 영향을 미치는 기계적 스트레스를 생성할 수 있습니다. 따라서, 배지 치환을 갖는 단계는 정상 대조 세포 배양을 위해 포함된다.</li>
	<li>저산소증 인큐베이터 챔버에 멸균수 20mL가 들어있는 페트리 접시를 놓아 배양 물을 적절하게 가습합니다. 링 클램프를 풀어 챔버를 엽니다. 선반에 세포 배양 물을 배열하십시오. 링 클램프를 고정하여 챔버를 밀봉하십시오.</li>
	<li>챔버의 입구 및 출구 포트를 모두 엽니다. 유량계 상단에서 나오는 튜브를 챔버에 부착합니다. 유량계 바닥에서 나오는 튜브를 에어 필터를 통해 95 % N 2 / 5 % CO2의 가스 혼합물이 들어있는 가스 탱크에 부착하십시오. </li>
	<li>탱크 유량 제어 밸브를 시계 반대 방향으로 돌려 열어 가스 흐름을 최소화하십시오. 시계 방향으로 돌려 압력 조절기 밸브를 천천히 엽니다.</li>
	<li>5분 동안 20L/min의 유속으로 가스 혼합물로 챔버를 세척합니다. 가스 공급원에서 챔버를 분리하고 두 흰색 플라스틱 클램프를 단단히 닫습니다.</li>
	<li>시계 방향으로 돌려 탱크 유량 제어 밸브를 끕니다. 시계 반대 방향으로 돌려 압력 조절기 밸브를 닫습니다.</li>
	<li>저산소증 챔버를 37 ° C의 기존 인큐베이터에 4 시간 동안 놓습니다. 참고: 후속 재산소화 기간을 추가하려면 DPBS로 세포를 3배 세척하고 모든 삼중 배양에서 신선한 배지를 추가한 다음 37°C의 5%CO2 인큐베이터에서 추가로 24시간 동안 유지합니다. 제조업체의 지침에 따르면 챔버에 남아있는 산소 농도는 20L/min에서 혐기성 가스 혼합물로 4분 이상 퍼징한 후 0%입니다.</li>
</ol>3. 티어 측정
<ol><li>멸균된 TEER 기기를 생물안전 캐비닛에 넣고 전극을 상피 전압저항계에 꽂습니다. 전극을 30mL의 70% 이소프로필 알코올 용액에 최소 30분 동안 소독합니다.</li>
	<li>TEER 기기를 켜고 기능을 옴으로 설정합니다.</li>
	<li>70% 이소프로필 알코올 용액에서 전극을 제거하고 TEER 장치의 디지털 판독값이 0옴이 될 때까지 최소 30분 동안 20mL의 DPBS에 넣습니다.</li>
	<li>블랭크 웰 인서트 컨트롤의 웰 인서트 행거에 있는 세 개의 구멍 중 하나를 통해 전극의 긴 갈래를 삽입하고 웰 바닥에 닿을 때까지 내립니다. 짧은 갈래가 웰 인서트 바닥의 정점 배양 물 위에 놓여 있는지 확인하십시오. 참고: 빈 웰 삽입 대조군은 정점 구획에 2mL의 완전한 클래식 배지와 기저측 구획에 1mL의 혈관주위세포 배지와 1mL의 성상세포 배지의 조합으로 구성됩니다. TEER 측정을 수행하는 동안 전극이 웰 인서트에 대해 90°로 유지되는지 확인합니다. 동일한 웰(개구당)에서 얻은 2개 또는 3개의 판독값의 평균을 사용하면 변동성을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.</li>
	<li>값을 기록하기 전에 TEER 기기의 디지털 판독값이 꺼질 때까지 기다리십시오. 전극을 DPBS에 다시 넣어 측정 사이에 세척하십시오. 두 개의 빈 웰 삽입 컨트롤에 대한 모든 TEER 측정값을 계속 수집합니다.</li>
	<li>대조 측정을 위해 취해진 단계 3.4-3.5를 사용하여 샘플 플레이트의 TEER 측정값을 수집합니다. 모든 측정이 완료되면 전극을 70% 이소프로필 알코올 용액에 30분 동안 다시 넣습니다. TEER 기기에서 전극을 분리하고 자연 건조시킵니다.</li>
	<li>TEER 값을 계산합니다. 식 (1)을 사용하여 샘플의 옴 값에서 블랭크 웰 인서트 대조군의 평균 옴 값을 뺀 다음 이 저항 값에 멤브레인 인서트 면적(cm2)을 곱하여 보고된 TEER 값을 Ω∙cm2로 제공합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64469/64469eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1)</li>
</ol>4. BBB 초세포 투과성 평가
참고: 조명을 끈 상태에서 세포 배양 생물안전 캐비닛에서 FITC-덱스트란과 관련된 모든 단계를 수행하십시오. FITC-덱스트란 용액을 알루미늄 호일로 덮어 광퇴색을 최소화합니다.
<ol><li>페놀 레드가 없는 내피 세포 성장 배지를 사용하여 20 및 70kDa(0.1mg/mL)의 FITC-덱스트란을 함유한 용액을 준비하고 로킹 플랫폼 쉐이커에서 1시간 동안 교반합니다. 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 여과합니다.</li>
	<li>기저측 구획에서 배지를 흡인하고 삼중 세포 배양 BBB 모델에서 페놀 레드가 없는 내피 세포 성장 배지 2mL로 교체합니다. 정점 구획의 세포를 행크스의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)으로 두 번 씻으십시오.</li>
	<li>정점 구획에 FITC- 덱스 트란 용액 1mL를 추가하고 플레이트를 알루미늄 호일로 덮습니다. 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 5%CO2 인큐베이터에 넣습니다.</li>
	<li>기저측 구획에서 100μL의 배지를 꺼내 검은색 96웰 플레이트로 옮깁니다. 여기 및 방출 파장이 각각 480nm 및 530nm로 설정된 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 형광을 측정합니다.</li>
</ol>5. 살아있는 세포에서 저산소증 검출
<ol><li>200 μL의 HBMEC, HA 및 HBVP를 폴리 -d- 라이신 코팅 된 35mm 유리 바닥 접시의 중앙에 150,000 셀 / 접시의 밀도로 시드합니다. HBMEC를 파종하기 전에 접시 바닥에 부착 계수를 코팅하십시오. 세포를CO2 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 방치함으로써 유리 표면에 부착되도록 한다. 참고: OGD용 저산소증 챔버에 트리플 웰 삽입 BBB 모델과 동시에 인간 일차 세포와 접시를 놓는 것이 중요합니다.</li>
	<li>합류점에 도달하면 배양 배지를 버리고 참조된 Image-iT 녹색 저산소증 시약(최종 농도 1μM)의 1mM Hoechst 33342(최종 농도 0.2μM) 2μL와 5mM 스톡 용액 0.5μL를 포함하는 예열된 포도당이 없는 배지(OGD용) 또는 정상 배지(대조군용) 2mL를 추가합니다. OGD 처리 후 모든 접시에서 배지를 이미징 최적화 배지로 교체하십시오.</li>
	<li>앞서 설명한 대로 GFP 필터와 최상위 컨포칼 현미경 인큐베이터를 사용하여 형광 라이브 셀 이미징을 수행합니다14,15.</li>
</ol>

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</ol>

모든 저자는 이해 상충이 없다고 밝혔습니다.

이 프로토콜에서, 우리는 시험관 내 허혈성 뇌졸중의 설정에서 BBB 기능 장애를 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 삼중 내피 세포-pericyte-성상세포 배양 BBB 모델을 설정하는 방법을 설명합니다. 혈관주위세포가 생체내에서 내피 세포의 가장 가까운 이웃이라는 것을 고려 하면, HBVP는 이 모델16에서 웰 삽입물의 밑면에 도금된다. 이러한 구성은 성상 세포와 내피 세포 사이의 직접적인 세포 간 통신이 부족하지만,이 배열은 분비 된 가용성 인자를 통해 세포 유형 간의 간접적 인 세포 간 통신을 허용합니다. 이 시스템에 성상 세포와 혈관 주위 세포가 존재하면 HBMEC 무결성이 크게 향상되어 단층의 세포 투과성을 작은 크기의 추적자로 제한합니다. 또한, 성상 세포 및 혈관 주위 세포는 OGD 조건에서 HBMEC에 대한 보호 효과가 있습니다.
개발된 프로토콜에서는 기저측 구획에 대한 세포 비율...

뇌졸중은 전 세계적으로 사망 및 장기 장애의 주요 원인 중 하나입니다1. 뇌졸중 발병률은 나이가 들면서 급격히 증가하여 55 세 이후 10 년마다 두 배로 증가합니다2. 허혈성 뇌졸중은 혈전 및 색전성 사건으로 인한 뇌 혈류 장애의 결과로 발생하며, 이는 모든 뇌졸중 사례의 80 % 이상을 포함합니다3. 지금도 허혈성 뇌졸중 후 조직 사망을 최소화 할 수있는 치료 옵션은 상대적으로 적습니다. 존재하는 치료법은 시간에 민감하며 결과적으로 항상 좋은 임상 결과로 이어지는 것은 아닙니다. 따라서 뇌졸중 후 회복에 영향을 미치는 허혈성 뇌졸중의 복잡한 세포 메커니즘에 대한 연구가 시급합니다.
BBB는 혈액과 뇌 실질 사이의 분자 교환을위한 동적 인터페이스입니다. 구조적으로, BBB는 기저막, 혈관주위세포, 및 성상세포 말단발4에 의해 둘러싸인 접합 복합체에 의해 상호 연결된 뇌 미세혈관 내피 세포로 구성된다. Pericytes 및 성상 세포는 강하고 단단한 접합부 5,6의 형성에 필요한 다양한 인자의 분비를 통해 BBB 무결성 유지에 필수적인 역할을합니다. BBB의 고장은 허혈성 뇌졸중의 특징 중 하나입니다. 뇌 허혈과 관련된 급성 염증 반응 및 산화 스트레스는 성상 세포, 혈관주위세포 및 내피 세포 사이의 단단한 접합 단백질 복합체 및 조절 장애 누화의 파괴를 초래하여 BBB7에 걸쳐 부세포 용질 투과성을 증가시킵니다. BBB 기능 장애는 뇌부종의 형성을 촉진하고 출혈성 변형의 위험을 증가시킵니다8. 위의 모든 것을 고려할 때, 허혈성 뇌졸중 중 및 후에 BBB 수준에서 발생하는 분자 및 세포 변화를 이해하는 데 큰 관심이 있습니다.
많은 시험관 내 BBB 모델이 최근 수십 년 동안 개발되어 다양한 연구에 사용되었지만 그 중 어느 것도 생체 내 조건을 완전히 복제 할 수 없습니다9. 일부 모델은 잘 삽입된 투과성 지지체에서 단독으로 또는 혈관주위세포 또는 성상세포와 함께 배양된 내피 세포 단층을 기반으로 하지만, 보다 최근의 연구에서만 삼중 세포 배양 모델 설계를 도입했습니다. 거의 모든 기존 삼중 배양 BBB 모델은 동물 종으로부터 단리된 성상세포 및 혈관주위세포 또는 인간 만능 줄기 세포10,11,12,13으로부터 유래된 세포와 함께 일차 뇌 내피 세포를 통합한다.
인간 BBB를 시험관 내에서 더 잘 요약할 필요성을 인식하고, 인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMEC), 일차 인간 성상교세포(HA) 및 일차 인간 뇌 혈관 혈관주위세포(HBVP)로 구성된 삼중 세포 배양 시험 관 내 BBB 모델을 확립했습니다. 이 삼중 배양 BBB 모델은 0.4μm 공극 크기의 6웰 플레이트, 폴리에스테르 멤브레인 삽입물에 설정됩니다. 이 웰 인서트는 세포 부착을 위한 최적의 환경을 제공하며 중간 샘플링 또는 복합 적용을 위해 정점(혈액) 및 기저측(뇌) 구획 모두에 쉽게 접근할 수 있도록 합니다. 이 제안된 삼중 세포 배양 BBB 모델의 특징은 시험 관 내에서 허혈성 뇌졸중을 모방한 TEER 및 역세포 플럭스를 측정하여 평가되며, 가습되고 밀봉된 챔버를 사용하여 달성된 산소(<1%O2) 및 영양소(무포도당 배지 사용)의 부족이 있습니다. 또한, 이 모델에서 유도된 허혈성 유사 조건은 저산소 세포의 직접적인 시각화에 의해 정확하게 검증된다.

<table><tbody><tr><td>24mm 트랜스웰(0.4 &마이크로); m 기공 폴리 에스테르 멤브레인 인서트</td><td>Corning</td><td>3450</td><td></td></tr><tr><td>35mm 유리 바닥 접시</td><td>MatTek Life Sciences (FISHERSCI)</td> <td>P35GC-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyte Medium</td><td>Science Cell</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>부착 계수</td><td>세포 시스템 (Fisher Scientific)</td> <td>4Z0-201</td><td></td></tr><tr><td>BD 60 mL 주사기</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>BrainPhys 이미징 최적화된 매체</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5791</td><td></td></tr><tr><td>완전한 클래식 매체 with serum and CultureBoost</td><td>4Z0-500</td><td>세포 시스템</td><td></td></tr><tr><td>Corning 50 mL PP 원심분리기 튜브 (CentriStar Cap이 있는 원뿔형 바닥</td><td>VWR</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Corning 75cm&sup2; U-형 경사형 목 미처리 세포 배양 플라스크;</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black 폴리스티렌 마이크로플레이트</td><td>Corning</td><td>3340</td><td></td></tr><tr><td>Countes 세포 계수 챔버 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 자동 세포 계수기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ZGEXSCCOUNTESS2FL</td><td></td></tr><tr><td>Decon CiDehol 70 이소프로필 알코올 용액&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>04-355-71</td><td></td></tr><tr><td>일회용 페트리 접시</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 매체 (포도당 없음, 글루타민 없음, 페놀 레드 없음)</td><td>ThermoFisher</td><td>A14430-01</td><td>무포도당 매체</td></tr><tr><td>DPBS (칼슘 없음, 마그네슘 없음)</td><td>ThermoFisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>EBM 내피 세포 성장 기초 배지, 페놀 레드 프리, 500 mL</td><td>Lonza</td><td>CC-3129</td><td></td></tr><tr><td>EVOM2 상피 볼트/옴 (TEER) 미터, STX2 전극이 있는</td><td>세계 정밀 기기</td><td>NC9792051</td><td>상피 전압저항계&nbsp;</td></tr><tr><td>플루오레세인 이소티오시아네이트&ndash; dextran (wt 20,000)</td><td>Millipore Sigma</td><td>FD20-250MG</td><td></td></tr><tr><td>플루오레세인 이소티오시아네이트&ndash; Dextran (wt 70,000)</td><td>Millipore Sigma</td><td>FD70S-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Fluorview FV3000 컨포칼 현미경</td><td>Olympus</td><td>FV3000</td><td></td></tr><tr><td>가스 탱크 (95% N2, 5% CO2)</td><td>Airgas</td><td>X02NI95C2003071</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드 없음)</td><td>Thermofisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL 물 용액</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Human Astrocytes</td><td>Science Cell</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>Human Brain Vascular Pericytes</td><td>Science Cell</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxia Incubator Chamber</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27310</td><td></td></tr><tr><td>Image-iT Green Hypoxia Reagent</td><td>ThermoFisher</td><td>I14834</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte Medium</td><td>Science Cell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells</td><td>ACBRI 376</td><td>Cell Systems</td><td></td></tr><tr><td>Rocking Platform Shaker, Double</td><td>VWR</td><td>10860-658</td><td></td></tr><tr><td>단일 유량계</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27311</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax iD3 Microplate Reader</td><td>분자 장치</td><td>75886-128</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터, 25mm, 0.22 &mu; m, PVDF, 멸균</td><td>NEST Scientific</td><td>380121</td><td></td></tr><tr><td>TPP Mutli-well 플레이트(6웰)</td><td>MidSci</td><td>TP92406</td><td></td></tr><tr><td>TPP 조직 배양 플라스크 T-75 플라스크</td><td>MidSci</td><td>TP90075</td><td>세포 접착을 위한 활성 표면이 있는 플라스크</td></tr><tr><td>트립신-EDTA(0.25%), 페놀 레드</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 증류수</td><td>Invitrogen(Life Technologies)</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>우노 스테이지 탑 인큐베이터-</td><td>오코랩</td><td>UNO-T-H-CO2-TTL</td><td></td></tr></tbody></table>

시험관 내 허혈성 뇌졸중 연구를 위한 인간 혈액-뇌 장벽의 삼중 일차 세포 배양 모델

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

허혈성 뇌졸중은 치료 옵션이 제한된 전 세계적으로 사망 및 장애의 주요 원인입니다. 허혈성 뇌졸중의 신경 병리학은 뇌로의 혈액 공급 중단으로 세포 사멸 및인지 기능 장애를 일으키는 특징이 있습니다. 허혈성 뇌졸중 중 및 후에 혈액-뇌장벽(BBB) 기능 장애는 부상 진행을 촉진하고 환자 회복 불량에 기여합니다. 현재의 BBB 모델은 주로 내피 단일 배양 및 성상 세포 또는 pericytes와의 이중 공동 배양을 포함합니다.
이러한 모델은 세포 간 통신에 필수적인 동적 뇌 미세 환경을 완전히 모방하는 능력이 부족합니다. 또한 일반적으로 사용되는 BBB 모델에는 종종 불멸화 된 인간 내피 세포 또는 번역 제한이 있는 동물 유래(설치류, 돼지 또는 소) 세포 배양이 포함됩니다. 이 논문은 시험관 내에서 허혈성 뇌 손상의 조사를 가능하게 하는 일차 인간 세포(뇌 미세혈관 내피 세포, 성상세포 및 뇌 혈관 혈관주위세포)만 포함하는 새로운 웰 삽입 기반 BBB 모델을 설명합니다. 
장벽 무결성에 대한 산소-포도당 박탈(OGD)의 효과는 수동 투과성, 경내피 전기 저항(TEER) 측정 및 저산소 세포의 직접 시각화에 의해 평가되었습니다. 제시된 프로토콜은 생체 내에서 BBB의 세포 간 환경을 모방하는 뚜렷한 이점을 제공하여 허혈성 뇌 손상 설정에서 새로운 치료 전략을 개발하기 위한 보다 현실적인 시험관 내 BBB 모델로서 작용합니다.

HBMEC의 장벽 기능에 대한 성상 세포 및 주변 세포의 영향을 조사하기 위해 HBMEC 단일 배양 및 대조군으로 두 개의 이중 공동 배양 모델 (그림 1B)과 함께 세포 배양 삽입물 (그림 1A)에 대한 삼중 세포 배양 BBB 모델을 구성했습니다. 이중 공동 배양 통제에는 HBMEC와 HA의 비접촉 공동 배양 및 HBMEC와 HBVP의 접촉 공동 배양이 포함되었습니다. 공동 배양에서 6일 후, 모든 실험 셋업을 4시간 동안 OGD에 적용하였다. 표시된 BBB 구성에서 내피 단층의 장벽 무결성은 OGD 전후와 24시간의 재산소화 후 TEER을 결정하여 평가되었습니다(그림 1C). 4 시간 동안 OGD는 HBMEC 단일 배양 및 HBMEC 및 HBVP와의 공동 배양 모델에서만 TEER 값을 크게 감소시켰다. 이러한 감소된 수준은 24시간의 재산소 공급 후 기준 수준에 도달...

여기에서는 일차 인간 뇌 미세 혈관 내피 세포, 성상 세포 및 혈관 주위 세포를 기반으로 혈액 뇌 장벽의 삼중 세포 배양 모델을 구축하는 방법을 설명합니다. 이 다세포 모델은 시험관 내 허혈성 뇌졸중 중 신경 혈관 단위 기능 장애의 연구 또는 약물 후보의 스크리닝에 적합합니다.

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is ...

우리의 프로토콜은 뇌졸중 후 회복에 영향을 미치는 복잡한 세포 메커니즘의 연구를 위해 시험관 내에서 인간의 혈액-뇌 장벽을 더 잘 요약할 필요성을 인식하고 있습니다. 당사의 트리플 모델은 부분적으로 웰 인서트의 큰 구획과 관련된 견고한 무결성을 보여 주므로 변경 빈도를 줄이고 모집단의 중단을 피할 수 있습니다. 우리의 모델은 허혈성 뇌졸중 중 및 후에 혈액 뇌 장벽에서 발생하는 분자 및 세포 변화를 연구하기위한 훌륭한 도구입니다.우리의 프로토콜은 뇌졸중 후 회복을 개선하기 위해 새로운 표적과 치료제의 발견을 허용합니다. 허혈성 뇌졸중에 대한 현재의 치료법은 시간에 민감하며 결과적으로 항상 효과적인 것은 아닙니다. 합류할 때까지 섭씨 37도의 5%이산화탄소 인큐베이터 내에서 세포 접착을 위한 활성화된 표면을 가진 T75 배양 플라스크에서 HBVP를 배양하는 것으로 시작합니다.합류점에 도달하면 오래된 pericyte 배지를 흡인하고 따뜻한 Dulbecco의 PBS 5 밀리리터로 세포를 씻습니다. Dulbecco의 PBS를 흡인하고 4 밀리리터의 따뜻한 트립신 EDTA 용액과 1 밀리리터의 Dulbecco의 PBS를 조합하여 플라스크에서 세포를 분리합니다. 플라스크를 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 5 분 동안 배양합니다.현미경으로 보고 세포가 플라스크에서 분리되었는지 확인합니다. 2%FBS를 포함하는 5밀리리터의 따뜻한 혈관주위세포 배지를 플라스크에 추가하고 분리된 세포를 50밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다. 세포 현탁액을 200 g에서 3분 동안 원심분리하여 세포가 튜브의 바닥에 펠릿을 형성하도록 한다.튜브에서 배지를 흡입하여 세포 펠릿이 손상되지 않도록 합니다. 세포 펠릿을 혈관주위세포 배지에 재현탁시킨다. 세포의 합류점과 필요한 웰 삽입물의 수에 따라 배지의 양을 계산하십시오.10 마이크로 리터의 재 부유 세포를 취하여 세포 계수 슬라이드에 넣고 세포 수를 세십시오. 세포 밀도를 결정하고 1 밀리리터의 pericyte 배지에 삽입물 당 300, 000 세포를 웰 삽입물의 abluminal 측에 놓습니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 2%FBS를 포함하는 성상세포 배지를 사용하여 1차 인간 성상교세포를 배양합니다.세포 밀도를 결정하고 웰당 300, 000개의 세포를 조직 배양 6-웰 플레이트의 바닥에 놓는다. 증발을 방지하기 위해 플레이트를 덮고 밤새 배양하십시오. 유사하게, 텍스트 원고에 설명된 대로

a-triple-primary-cell-culture-model-human-blood-brain-barrier-for

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 방법은 마우스의 뇌에서 microvascular 내피 세포를 분리하고 불멸하게하다하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 뇌 조직, 소화 단계, 시딩하고 세포의 불멸화의 균질화부터 단계별로 절차를 설명합니다. 보통, 그것은 동질, 불후의 microvascular 내피 세포 라인을 얻기 위해 다섯 주 소요됩니다.

로 불후의 손쥐 뇌 Microvascular 내피 세포 라인의 생성<em&gt; 체외에서</em&gt; 혈액 뇌 장벽 모델

이 비디오는 인간의 뇌 주위 세포, 성상 세포 및 내피 세포의 공동 배양을 보여줍니다. 각 세포층은 개별적으로 형성된 다음 함께 배양되어 혈액-뇌 장벽의 세포 배열을 모방한 3층 시스템을...

인간 혈액-뇌 장벽의 삼중 세포 배양 모델 개발

혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​의 인체 모델의 확립 BBB 장애와 관련된 뇌 상태에 대한 연구를 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 여기서, 다공질 막의 양측에 인간 성상 세포와 뇌 내피 세포의 공동 배양을 허용 접촉 BBB 모델의 제조를위한 개선 된 기술을 설명한다.

방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

프로토콜의 목표는 생체 외에서 혈액-뇌 장벽 (BBB) 기반 모델 기본 돼지 뇌 내 피 세포 (pBECs)의 설립에 대 한 최적화 절차를 제시 하는입니다. 모델 쇼 높은 재현성, 높은 견고, 전송 및 세포내 매매 신약의 연구에 적합.

생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

이 절차의 전반적인 목표는 비보에 허 혈 성 뇌졸중의 쥐 모델에서 뇌혈관 장애의 평가 대 한 높은 재현 기법을 제공 하는입니다.

허 혈 성 뇌졸중의 쥐 모델에서 뇌혈관 장애의 비보에 평가

인간의 뇌 조직에서 분리 된 뇌 모세 혈관 장벽 기능 생리 및 병 태 생리 조건에서 공부 하는 전 임상 모델으로 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관을 분리 하는 최적화 된 프로토콜을 제시.

신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관의 절연

여기에 우리가 현재에 cellulo BBB (혈액 뇌 장벽)의 설정을 설명 하는 프로토콜-Minibrain 폴리에스터 다공성 막 문화 인간의 BBB에 걸쳐 생체 또는 전염 성 요원의 전송 평가 시스템 삽입 및 그들의 이웃 뇌 세포에 생리 적 영향입니다.

병원 체 또는 의약품 및 두뇌와 그들의 상호 작용에 의해 장벽 횡단 연구를 인간의 혈액-뇌 인터페이스 모델

여기서, 우리는 높은 수율과 재현성을 가진 배아 피질에서 뉴런 및 성상세포 농축 배양, 또는 뉴런 glia 배양을 확립할 수 있는 특정 배양 매체를 사용하여 간단한 접근법을 제시합니다.

이혈증에서 신경 신경-Glia 상호 작용의 역할을 공부 하기 위한 세포 배양 모델

이 프로토콜은 인간 혈액-뇌 장벽(BBB) 시험관내 모델을 확립하는 방법을 설명합니다. 내피 세포와 혈관주위세포는 삽입 필터의 양쪽(혈액 구획)에 파종되고 성상세포는 하단 웰(뇌 구획)에 파종됩니다. 상기 모델 특성화는 나노입자 수송 실험에 사용되었다.

인간 혈액-뇌 장벽을 모델링하는 삼중 배양 세포 시스템

혈액뇌장벽(BBB)은 안정적이고 건강한 뇌 환경을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. BBB 기능 장애는 많은 신경 질환과 관련이 있습니다. 우리는 뇌혈관 병리, BBB 무결성, BBB가 유전학 및 질병에 의해 어떻게 변형되는지 조사하기 위해 BBB의 3D 줄기세포 유래 모델을 개발했습니다.

신경 질환을 모델링하고 치료적으로 표적화하기 위한 체외 혈액-뇌 장벽 재건

학습하세요 혈액-뇌 장벽의 삼중 일차 세포 배양 모델을 이용한 허혈성 뇌졸중 연구 방법을. 이 기법은 뇌졸중 후 회복에 영향을 미치는 세포 메커니즘을 조사하고 신약 후보 물질을 선별하는 데 활용됩니다.

시험관 내 허혈성 뇌졸중 연구를 위한 인간 혈액-뇌 장벽의 삼중 일차 세포 배양 모델

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