항체 의존성 세포 독성 변형 화합물의 식별을 위한 High-content screening assay

항체 의존성 세포 독성 또는 줄여서 ADCC는 NK 세포, 과립구 및 대 식세포라고하는 자연 살해 세포에 의해 매개될 수 있습니다. 이들은 ADCC의 이펙터 세포입니다. 표피 성장 인자 수용체인 HER2를 표적으로 하는 트라스투주맙과 같은 항체가 종양 세포에 결합하는 경우, 이들 이펙터 세포는 FcyR 수용체를 사용하여 항체의 일정한 FC 영역에 결합합니다.

항체는 종양 세포와 FcyR 수용체 보유 이펙터 세포를 연결하여 세포 독성 과립의 방출을 유발합니다. 이것은 암세포의 세포 사멸로 이어진다. ADCC는 트라스투주맙의 항증식 효과에 반응하지 않는 종양에 효과적일 수 있습니다.

ADCC 시스템을 설정하려면 항-HER2 항체 트라스투주맙이 있는 상태에서 항-HER2 양성 JIMT-1 유방암 세포를 NK-92 세포주와 공동 배양해야 합니다. 분석에 사용하는 JIMT-1 세포주는 녹색 형광 단백질을 안정적으로 발현합니다. 먼저, 96웰 고함량 스크리닝 플레이트를 JIMT 배지로 코딩합니다.

50 마이크로리터의 배지를 플레이트의 각 웰에 피펫팅합니다. 플레이트를 CO2 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다. 코팅은 JIMT-1 세포를 플레이트의 유리 표면에 부착하는 데 중요합니다.

코팅 단계 동안, JIMT-1 세포를 트립신화한다. 2 밀리리터의 멸균 PBS로 세포를 세척하십시오. 그런 다음 플라스크에 1밀리리터의 트립신-EDTA를 추가합니다.

플라스크를 CO2 인큐베이터에 10분 동안 다시 넣습니다. 배양 후 플라스크를 두드려 JIMT-1 세포가 분리되었는지 확인합니다. 2 밀리리터의 JIMT-1 배지로 소화를 중지하고 세포 현탁액을 15 밀리리터 튜브에 모으십시오.

이어서, 청색 캐스트 챔버에서 트리판 블루로 JIMT-1 세포를 계수한다. 세포 수를 ml 당 133, 000 세포로 조정하십시오. 코팅 배지를 흡인하고, 그 후, 75 마이크로리터의 세포 현탁액을 각 웰에 첨가한다.

CO2 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하는 동안 세포가 부착되도록 합니다. 다음날, 배지를 흡인하고, 50 마이크로리터의 신선한 JIMT-1 배지를 웰에 첨가하고, 플레이트를 고처리량 스크리닝 실험실로 옮긴다. 로봇은 테스트 화합물을 고함량 스크리닝 마이크로플레이트로 옮기는 데 사용됩니다.

로봇 팔을 사용하여 로봇은 25나노리터를 전송하도록 보정된 핀 도구 장치를 잡습니다. 총 100 나노리터의 시험 화합물을 화합물 라이브러리 플레이트에서 분석 플레이트로 4단계로 옮깁니다. 시험 화합물의 최종 농도가 20마이크로몰인지 확인하십시오.

각 단계 사이에 먼저 핀 도구를 50% DMSO로 세척한 다음 70% 에탄올로 세척합니다. 섭씨 37도의 CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. NK 세포를 T25 조직 배양 플라스크에서 배양합니다.

JIMT-1 세포의 약물 처리가 진행되는 동안 T25 플라스크에서 NK 세포를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 채취합니다. NK-92 세포를 청색 계수 챔버에서 트리판 블루로 계수합니다. 세포 수를 ml 당 400, 000 세포로 조정하십시오.

ml 당 400, 000 개의 세포를 함유하는 NK 세포 현탁액을 실온에서 3 분 동안 150g에서 원심 분리한다. JIMT-1 배지에 항-HER2 항체 트라스투주맙 ml당 20마이크로그램을 첨가하여 ADCC 배지를 준비합니다. 20, 000 NK 세포를 50 마이크로리터 ADCC 배지에 피펫팅하여 JIMT-1 GFP 세포를 표적으로 한다.

최종 부피는 100 마이크로리터이고, 최종 트라스투주맙 농도는 ml 당 10 마이크로그램이다. 분석 플레이트를 섭씨 37도로 설정된 인큐베이터가 내장된 고함량 분석 장비에 넣습니다. 플레이트는 두 시점에서 이미지화됩니다.

먼저, 표적 세포에 이펙터 세포를 첨가한 직후의 영상을 획득하고, 두 번째 영상 세트는 NK 세포를 첨가한 후 3시간 후에 촬영합니다. 먼저 마이크로플레이트의 유형을 선택합니다. 96웰 고함량 스크리닝 플레이트를 사용하십시오.

초점이 선택되도록 선택하면 분석이 비공초점 모드에서 10x 대물렌즈가 있는 플레이트에서 수행되므로 초점을 선택합니다. 신호 대 잡음비를 두 배로 늘리려면 비닝 2를 선택하십시오. 적절한 채널, 노출 시간, 레이저 출력, 초점면 및 파장을 선택합니다.

650-760 나노미터에서 명시야 이미지를 촬영하고 488 나노미터 여기 및 500-550 나노미터 방출 파장으로 EGFP 형질도입된 JIMT-1 세포를 검출합니다. 측정을 시작하기 전에 스냅샷 기능으로 샘플 이미지를 촬영하여 올바른 설정을 확인하십시오. 마지막으로 이미징을 위한 필드 수와 시점 수를 설정합니다.

예를 들어 9개의 필드와 2개의 시점을 선택합니다. ADCC 효율을 분석하기 위해, 대조군 ADCC 웰에서 생존 가능한 JIMT-1 세포를 계수한다. 미세 셀 모듈을 사용하여 이미지에서 셀에 해당하는 영역을 감지합니다.

각 세포를 이미지에서 주변보다 더 높은 형광 강도를 갖는 영역으로 감지합니다. 직경이 80마이크로미터인 내장 M 알고리즘을 사용하여 셀을 선택합니다. 큰 객체를 작은 객체로 구획하는 분할 민감도 설정을 0.5 값으로 설정합니다.

픽셀 강도의 가장 낮은 수준인 공통 임계값을 0으로 조정합니다. EGFP 형광 강도가 높은 배경 영역의 검출을 두 단계로 제외합니다. 먼저, 강도 특성 계산 기능을 적용하여 이전에 선택된 세포 영역의 EGFP 형광 강도를 결정합니다.

그런 다음 모집단 선택 옵션을 사용하여 최소 및 최대 강도 임계값을 설정하여 ADCC가 끝날 때 생존 가능한 JIMT-1 GFP 표적 세포의 수를 얻습니다. 3시간 후 검출된 셀 수를 0 시점에 검출된 세포 번호로 나누어 ADCC 효율을 계산한다. 우리는 대표적인 결과로 우리 방법의 실제 적용을 보여주고 싶습니다.

우리는 선반에서 무작위로 꺼낸 16개의 화합물로 테스트 플레이트를 설치했습니다. 또한 예상되는 ADCC 억제 효과가 있는 콜히친, 빈크리스틴 및 포도필로톡신의 세 가지 화합물을 포함했습니다. DMSO는 음성 대조군으로 사용하였다.

각 약물은 플레이트 상에서 4회 반복하여 사용하였다. 그림은 테스트 화면의 결과를 보여줍니다. 마이너스 NK 그룹에서는 JIMT-1 세포에 대한 약물의 독성을 시험하였다.

플러스 NK 그룹에서는 NK 세포와 트라스투주맙을 첨가하여 약 50%의 세포독성을 나타냈다. 세 가지 테스트 화합물의 예상되는 ADCC 억제제 효과는 분석을 통해 검출 될 수 있습니다. 우리는 유방암 세포, NK 세포 및 치료용 단클론 항체 트라스투주맙 사이의 임상적으로 관련된 상호작용을 모델링하는 공동 배양 분석 시스템을 구축했습니다.

이 분석은 이미지 분석과 결합된 자동 현미경을 기반으로 하며 ADCC 변형 약물을 식별하기 위한 화합물 라이브러리를 스크리닝하는 데 적합합니다. 이 절차는 항종양 반응을 강화하는 보조 분자를 식별하거나 부작용이 있는 화학 물질을 식별하는 데 잠재적으로 사용될 수 있습니다.