장기 및 단기 조혈모세포의 분리 방법
May 19th, 2023
우리는 Hoxb5 리포터 시스템을 사용하여 장기 조혈 줄기 세포(LT-HSC) 및 단기 HSC(ST-HSC)의 분리를 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다.
장기 및 단기 조혈 줄기 세포 또는 HSC 분리 방법은 연구자들이 HSC 구획의 이질성에 대한 세포 재생 메커니즘과 생물학적 기초를 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 장기 HSC의 독점적인 마커일 수 있는 전사 인자인 Hoxb5가 확인되었습니다. 이를 바탕으로 Hoxb5 리포터 마우스 라인을 구축하고 장기 및 단기 HSC를 성공적으로 분리했습니다.
기증자 골수 세포 수집을 시작하려면 절구와 유봉을 70 % 에탄올로 멸균하고 완전히 건조시킵니다. 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 함유 보충제로 구성된 세포 염색 완충액으로 평형을 유지하십시오. 기증자 수컷 Hoxb5-tri-mCherry 마우스에서 분리한 뼈를 박격포에 넣고 3밀리리터의 세포 염색 완충액을 추가합니다.
유봉으로 뼈를 닦은 다음 부드러운 피펫팅으로 세포 덩어리를 분해하고 100미크론 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 50밀리리터 튜브로 옮깁니다. 용액이 투명해질 때까지 새로운 세포 염색 완충액으로 이 과정을 반복합니다. 일반적으로 세 번 반복하면 명확한 솔루션을 얻을 수 있습니다.
CD45.1.2 선천성 마우스에서 대퇴골과 경골을 분리한 후 날카로운 멸균 가위로 뼈의 양쪽 끝을 자릅니다. 얼음처럼 차가운 세포 현탁액 완충액으로 채워진 5밀리리터 주사기가 장착된 23게이지 바늘을 사용하여 세포 현탁액 완충액이 들어 있는 멸균 세포 배양 접시에 골수를 씻어냅니다. 부드러운 피펫팅으로 세포 덩어리를 분해한 다음 P1000 피펫을 사용하여 40미크론 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과합니다.
게이팅 설정의 경우 텍스트에 제공된 지침에 따라 샘플을 준비하고 400마이크로리터를 35미크론 셀 스트레이너 스냅 캡이 있는 둥근 바닥 폴리스티렌 테스트 튜브로 옮깁니다. 제조업체의 지침에 따라 분석하기 전에 죽은 세포 변형 시약을 준비하고 샘플에 추가합니다. 그런 다음 유세포 분석기를 켜고 제조업체의 지침에 따라 분석 소프트웨어를 시작합니다.
그런 다음 로드를 눌러 데이터 수집을 시작합니다. 이중선, 죽은 세포 및 계통 양성 세포를 제외한 후 계통 음성, c-kit-양성, Sca-1 양성 분획을 게이트합니다. 다음으로, Flk2 양성 분획을 게이트아웃합니다.
그런 다음 CD150 양성, CD34 음성 또는 저 분획에서 Hoxb5 양성 또는 Hoxb5 음성 pHSC를 게이트합니다. 다음으로, 600 마이크로 리터의 칼슘과 마그네슘이없는 PBS로 1.5 밀리미터의 저 단백질 결합 튜브를 준비하고, 10 % 열 비활성화 FBS로 보충한다. Hoxb5-양성 또는 Hoxb5-음성 pHSC 분류를 수행하기 위해, 준비된 1.5-밀리리터-저-단백질 결합 튜브를 분류 수집 장치에 설정하고, 앞서 언급한 게이팅 전략을 사용하여 Hoxb5-양성 또는 Hoxb5-음성 pHSC를 튜브 내로 분류한다.
첫 번째 정렬에서는 정렬 정밀도 모드의 출력량을 사용합니다. 미리 준비된 지지 세포가 있는 96웰 플레이트를 자동 세포 증착 장치 스테이지에 설정합니다. 그런 다음 1.5밀리리터의 저단백질 결합 튜브를 유세포 분석기의 로딩 포트에 설정합니다.
앞서 언급한 게이팅 전략을 사용하여 Hoxb5 양성 또는 Hoxb5 음성 pHSC를 지지 세포가 있는 96웰 플레이트로 분류합니다. 10개의 Hoxb5 양성 또는 Hoxb5 음성 pHSC를 분류하여 자가 재생 능력을 테스트합니다. 공여자 Hoxb5-tri-mCherry 마우스의 골수 분석의 유세포 분석 플롯은 계통 음성, c-kit-양성, Sca-1-양성, CD150-양성, CD34-음성 또는 낮은, Flk2-음성에 의해 정의된 pHSC 분획에서 세포의 약 20 내지 25%가 Hoxb5 양성 pHSC였다.
여기에 제시된 것은 수용자 마우스의 말초 혈액 분석의 대표적인 유세포 분석 플롯이다. 또한, 1차 이식 후 수용자 마우스의 말초 혈액 분석에서 Hoxb5 양성 및 Hoxb5 음성 pHSC가 이식 4주 후에 유사한 기증자 키메라를 나타내었지만, Hoxb5 양성 pHSC 수용자에서만 지속적인 조혈이 관찰되는 것으로 나타났다. Hoxb5 음성 HSC는 이식 후 8주 후에 조혈 세포를 생산하는 능력을 잃기 시작했습니다.
2차 이식 분석에서 Hoxb5 양성 pHSC 수혜자만이 강력한 조혈을 나타냈습니다. 대조적으로, Hoxb5 음성 pHSC 수용자 마우스에서는 공여 세포가 거의 관찰되지 않았으며, 이는 Hoxb5 음성 pHSC가 1차 이식 후 16주 이내에 자가 재생 능력을 상실했음을 시사합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 9시간에서 12시간이 걸리므로 세포 생존력을 유지하기 위해 절차 전반에 걸쳐 샘플을 섭씨 4도로 유지하는 것이 중요합니다.
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개요
본 연구는 Hoxb5 리포터 시스템을 사용하여 장기 조혈 줄기 세포(LT-HSCs)와 단기 조혈 줄기 세포(ST-HSCs)를 분리하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 분리 방법은 세포 갱신 메커니즘과 HSC 구획 내 생물학적 이질성의 이해를 향상시킵니다.
주요 연구 요소
연구 분야
- 조혈 줄기 세포 생물학
- 세포 갱신 메커니즘
- 줄기 세포 이질성
배경
- Hoxb5가 LT-HSCs의 잠재적 배타적 마커로 식별됨.
- 표적화된 분리를 위한 Hoxb5 리포터 마우스의 확립.
- 더 나은 이해를 위한 특정 HSC 집단 분리의 중요성.
사용된 방법
- 골수 분리 기술.
- 세포 분류를 위한 흐름 세포계 분석.
- 자기 갱신 능력 평가를 위한 P93 기반 분석.
주요 결과
- Hoxb5 양성 및 Hoxb5 음성 pHSCs의 성공적인 분리.
- 이식 후 자기 갱신 능력의 차이를 입증함.
- 시간이 지남에 따라 Hoxb5 음성 pHSCs가 조혈 잠재력을 상실한다는 증거.
결론
- 본 프로토콜은 HSC의 특성 및 행동 연구에 도움을 줍니다.
- 줄기 세포 기능 이해에서 Hoxb5의 중요성을 강조합니다.
