Name: 장기 및 단기 조혈모세포의 분리 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: 배우세요 Hoxb5 리포터 시스템을 활용한 장기 및 단기 조혈모세포 분리 방법을 통해 세포 재생 메커니즘과 조혈모세포 구획 내 이질성의 생물학적 기초를 이해하세요.

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동물 관리와 RIKEN BDR의 수혜 마우스를 제공한 키요나리 히로시, 고베 대학의 실험실 관리를 위해 오가 히토미, 나가사카 카요코, 미야하시 마사키에게 감사드립니다. 저자는 또한 이 작업에 대한 지속적인 지원에 크게 감사드립니다. 미야니시 마사노리는 일본 과학 진흥 협회 (JSPS) KAKENHI 보조금 번호 JP17K07407 및 JP20H03268, 모치다 의료 및 제약 연구 재단, 일본 생명 과학 재단, 다케다 과학 재단, 아스텔라스 대사 장애 연구 재단 및 AMED-PRIME, AMED의 지원을 받았습니다. 허가 번호 JP18gm6110020. Taro Sakamaki는 JSPS KAKENHI 보조금 번호 JP21K20669 및 JP22K16334의 지원을 받았으며 JSPS Core-to-Core 프로그램 및 RIKEN Junior Research Associate Program. 니시 카츠유키는 JSPS 보조금 번호 KAKENHI JP18J13408의 지원을 받았습니다.

기술된 모든 동물 실험은 RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research의 승인을 받았습니다.
1. 수용자 마우스의 전처리
<ol><li>8-10주령의 수컷 C57BL/6 동종 마우스를 수용 마우스로 준비합니다. 수용 마우스의 수는 실험 프로토콜에 따라 다릅니다. 우리는 일반적으로 각 조건에 대해 10-20마리의 마우스를 준비합니다.<ol><li>생쥐에게 enrofloxacin (170 mg / L)이 보충 된 멸균 된 물을 먹이십시오. 방사선 조사를 받은 수혜자 마우스는 감염에 매우 취약하므로 케이지를 가능한 한 깨끗하게 유지하십시오. 참고: 항생제 보충은 방사선 조사 24시간 전에 시작하여 감염을 피하기 위해 이식 후 3주 동안 계속됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>전신 조사<ol><li>전신 방사선 조사는 수혜자 골수 세포를 파괴하여 기증자 세포의 생착을 보장합니다. 수용자 마우스를 방사선 조사 케이지로 옮깁니다. 이식 전 12-16 시간에 8.7 Gy의 단일 용량으로 수용자 마우스를 치명적으로 조사하십시오. 알림: 방사선량과 시간은 장비에 따라 다를 수 있습니다. 치사량은 연구자의 방사선 조사기와 마우스 균주로 확인해야 합니다.</li>
		<li>전신 조사 후 새장으로 돌려 보내십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 기증자 골수 세포 수집
<ol><li>생후 12주령의 수컷 Hoxb5-tri-mCherry 마우스를 준비하고,CO2 노출에 이어 자궁경부 탈구에 의해 또는 지역 동물 윤리 위원회에 의해 승인된 방법을 사용하여 마우스를 안락사시킨다. 참고: 마우스당 시약 부피는 다음 단계에 설명되어 있습니다.</li>
	<li>무균 상태에서 피부를 제거하고 뼈 (대퇴골, 경골, 골반, 상완골)를 노출시킵니다. 주요 근육을 자르고 마우스에서 뼈 (대퇴골, 경골, 골반, 상완골)를 가져옵니다. Ca 2+- 및 Mg2+가 없는 얼음처럼 차가운 PBS가 포함된 멸균 세포 배양 접시에 넣습니다.</li>
	<li>오염을 방지하기 위해 핀셋, 작은 가위, 물티슈를 사용하여 뼈에서 근육과 섬유 조직을 다듬습니다. 이 단계에서 뼈가 부러지지 않도록 주의하십시오. 불임 상태를 유지하기 위해 부러진 뼈는 버리십시오.</li>
	<li>절구와 유봉을 70 % 에탄올 (EtOH)로 소독하고 완전히 건조시킵니다. 세포 염색 완충액(2% 열 비활성화 FBS, 2mM EDTA, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신으로 보충된 Ca 2+- 및 Mg2+-free PBS)으로 평형을 이룹니다.</li>
	<li>뼈를 박격포에 넣고 세포 염색 완충액 3mL를 추가합니다. 유봉으로 뼈를 부수십시오. 부드러운 피펫팅으로 세포 덩어리를 분해하고 100μm 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 50mL 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>해결책이 명확해질 때까지 2.5 단계를 반복하십시오. 일반적으로 세 번이면 충분합니다.</li>
</ol>3. 자기 선별에 의한 c-kit+ 세포 분리
<ol><li>마그네틱 선별을 위한 항체 염색<ol><li>샘플을 400 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고, 펠렛을 1 mL의 세포 염색 완충액에 재현탁시킨다. 비특이적 항체 결합을 줄이기 위해 10μL의 rat-IgG(5mg/mL)를 추가하고 P1,000 피펫을 사용하여 위아래로 부드럽게 피펫합니다. 얼음에서 15분 동안 배양합니다.</li>
		<li>c-Kit 항체(클론 2B8)를 4μg/mL 농도로 추가하고 P1,000 피펫과 혼합합니다. 얼음에서 15분 동안 배양합니다.</li>
		<li>세포 염색 완충액 5mL를 넣고 잘 섞는다. 시료를 400 x g, 4°C, 5분에서 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고, 펠렛을 500 μL의 세포 염색 완충액에 재현탁시킨다.</li>
		<li>35μL의 항-APC 마이크로비드를 추가하여 c-Kit+ 세포를 농축하고 P1,000 피펫과 혼합합니다. 얼음에서 15분 동안 배양합니다.</li>
		<li>4-5 mL의 cell-staining buffer를 추가합니다. 샘플을 400 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고, 펠렛을 1 mL의 세포 염색 완충액에 재현탁시킨다.</li>
	</ol></li>
	<li>c-Kit+ 셀을 자기적으로 분류<ol><li>제조업체의 지침에 따라 셀을 정렬합니다. 간단히 말해서, 마그네틱 분류 컬럼을 3mL의 세포 염색 완충액으로 프라이밍합니다. 40μm 셀 스트레이너를 통해 시료(1mL)를 여과하고 시료를 자기 선별 컬럼에 로드합니다.</li>
		<li>세포 염색 완충액 3 mL를 가하여 3회 세척한다. 컬럼 저장소가 비어 있는 경우에만 세포 염색 버퍼를 추가합니다.</li>
		<li>얼음처럼 차가운 15mL 튜브 위에 마그네틱 선별 컬럼을 놓고 5mL의 세포 염색 완충액을 추가합니다. 플런저를 컬럼에 단단히 밀어 넣어 세포를 씻어냅니다. 얼음 위에 흐름을 유지하십시오. 참고: 우발적인 샘플 손실의 경우 실험이 끝날 때까지 흐름을 유지합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 조혈모세포 염색
<ol><li>단계 3.2.3에서 제조된 시료를 400 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 흡인합니다.</li>
	<li>CD34 항체(클론 RAM34)를 50μg/mL 농도로 펠릿에 넣고 얼음에서 60분 동안 배양합니다. 참고: CD34로 배양한 첫 시간 동안 지지 세포를 준비하는 것은 처리 시간을 단축하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>표 1에 따라 항체 마스터 믹스를 준비한다. 마스터 믹스 100μL를 샘플에 추가하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다. CD34 항원에 대한 항체(clone; RAM34)는 충분한 염색을 위해 90분이 필요합니다.</li>
	<li>4-5 mL의 세포 염색 완충액을 첨가한다. 시료를 400 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인합니다. 펠릿에 3μg/mL 농도의 스트렙타비딘-BUV737을 첨가하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>4-5 mL의 세포 염색 완충액을 첨가한다. 시료를 400 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고, 펠렛을 400 μL의 세포 염색 완충액에 재현탁시킨다. 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.</li>
</ol>5. 세포 준비 지원
<ol><li>12주령의 CD45.1+ CD45.2+ 선천성 마우스를 준비하고; 이상적으로는 기증자 마우스와 같은 나이여야 합니다. CO2 노출에 이어 자궁경부 탈구에 의해 또는 지역 동물 윤리 위원회에 의해 승인된 방법을 사용하여 마우스를 안락사시킨다. 참고: 제공된 예에서, CD45.1+ CD45.2+ 선천성 마우스는 B6을 교배하여 사내에서 사육되었습니다. CD45.1 선천성 마우스와 C57BL/6J 마우스16.</li>
	<li>무균 상태에서 대퇴골과 경골을 모두 채취하여 Ca 2+- 및 Mg2+가 없는 얼음처럼 차가운 PBS가 포함된 멸균 세포 배양 접시에 넣습니다. 핀셋과 작은 가위를 사용하여 뼈에서 근육과 섬유 조직을 다듬습니다.</li>
	<li>날카롭고 멸균 된 가위로 뼈의 양쪽 끝을 자릅니다. 23G 바늘과 얼음처럼 차가운 세포 현탁액 완충액(2% 열 비활성화 FBS, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신으로 보충된 Ca 2+- 및 Mg2+-free PBS)으로 채워진 5mL 주사기를 사용하여 골수를 세포 현탁액 완충액이 있는 멸균 세포 배양 접시로 씻어냅니다. 부드러운 피펫팅으로 세포 덩어리를 분해합니다.</li>
	<li>P1,000 피펫을 사용하여 40μm 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 여과합니다. 혈구계를 사용하여 세포 현탁액의 세포 수를 세고 1 x 106 cells/mL를 포함하는 골수 세포 현탁액을 준비합니다.</li>
	<li>200 μL의 골수 세포 현탁액(2 x 105 세포)을 96웰 둥근 바닥 플레이트로 옮깁니다. 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 알림: 쉬운 세포 수집을 위해 둥근 바닥 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>6. Hoxb5pos 또는 Hoxb5neg pHSC 정렬
<ol><li>게이팅 설정<ol><li>4.5단계에서 준비한 샘플 400μL를 35μm 셀 스트레이너 스냅 캡이 있는 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관으로 옮깁니다. 죽은 세포 염색 시약을 준비하고 제조업체의 지침에 따라 분석하기 전에 샘플에 추가합니다.</li>
		<li>유세포 분석기를 켜고 제조업체의 지침에 따라 분석 소프트웨어를 시작합니다. 그런 다음 로드를 누르고 데이터를 수집합니다. 참고: 분류된 세포의 순도를 높이기 위해 5개의 레이저와 70μm 노즐이 장착된 유세포 분석기를 사용하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>이중선, 죽은 세포 및 계통 양성 세포를 제외 한 후 Lineage-c-Kit+Sca-1+ 분획을 게이트합니다. 다음으로 Flk2+ 분수를 게이트아웃합니다. 그런 다음 CD150+CD34-/저 분획에서 Hoxb5pos 또는 Hoxb5neg pHSC를 게이트합니다(그림 2). 첫 번째 실험에서 스펙트럼 중첩에 대한 보상을 수행합니다. 참고: Hoxb5 양성 세포는 Lineage-c-Kit+Sca-1+CD150+CD34-/lowFlk2- 분획의 20%-25%를 차지할 것으로 예상됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Hoxb5pos 또는 Hoxb5neg pHSC 정렬<ol><li>10% 열 비활성화 FBS가 보충된 600μL의Ca2+- 및 Mg2+ -free PBS가 있는 1.5mL 저단백질 결합 튜브를 준비합니다.</li>
		<li>정렬 수집 장치에 1.5mL 저단백질 결합 튜브를 설정하고 6.1.3단계에서 설정한 게이팅 전략을 사용하여 Hoxb5pos 또는 Hoxb5neg pHSC를 1.5mL 튜브로 정렬합니다. 첫 번째 정렬에서는 정렬 정밀도 모드의 출력량을 사용합니다.</li>
		<li>단계 5.5에서 제조된 지지세포가 있는 96웰 플레이트를 자동 세포 증착 장치(ACDU) 스테이지에 세팅한다. 단계 6.2.2에서 제조한 1.5 mL 저단백질 결합 튜브를 유세포 분석기의 로딩 포트에 세팅한다.</li>
		<li>Hoxb5pos 또는 Hoxb5neg pHSC를 6.1.3단계에서 설정된 게이팅 전략을 사용하여 지지 세포가 있는 96웰 플레이트로 분류합니다. 10개의 Hoxb5pos 또는 Hoxb5neg pHSC를 정렬하여 자가 재생 능력을 테스트합니다. 알림: 순도를 높이기 위해 이중 분류하는 것이 좋습니다. 두 번째 정렬에서는 순도를 권장 정렬 정밀도 모드로 사용합니다.</li>
		<li>전형적으로, 500-1,000 Hoxb5pos pHSC 및 1,500-4,000 Hoxb5neg pHSC는 이중 분류 후에 수확된다. 세포 생존율을 향상시키기 위해 HSC 분류 후 가능한 한 빨리 이식 절차를 진행하십시오(이상적으로는 1-2시간 이내).</li>
	</ol></li>
</ol>7. 이식
<ol><li>단계 6.2.4에서 준비한 HSC 분류된 96웰 플레이트를 얼음 위에 놓습니다. HSC로 분류된 96웰 플레이트를 무균 상태, 이상적으로는 셀 후드에서 취급합니다.</li>
	<li>가스 마취 유도 챔버에서 2% 이소플루란으로 수용자 마우스를 마취합니다. 동물이 완전히 마취되면 제거하고 옆으로 눕힙니다. 충분한 마취를 보장하려면 유해한 자극에 반응하여 움직임이 없는지 확인하십시오.</li>
	<li>적절한 마취를 확인한 후 마우스가 의식을 회복하지 못하도록 가능한 한 빨리 안와 주사를 시행하십시오. 역궤도 주입은 30초 미만이 소요됩니다. 참고: 주입 시간이 짧기 때문에 눈에 안과용 연고를 바르지 않고 시술을 마칩니다. 그러나 시술 시간이 오래 걸리면 안과 용 연고를 사용하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>HSC로 분류된 96웰 플레이트의 세포를 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 30G 인슐린 주사기를 사용하여 분류 플레이트에 기증자 세포를 수집하고 수용자 마우스의 안와 후 정맥 신경총에 주입합니다. 권장 주사 용량은 ≤200μL입니다.</li>
	<li>생쥐가 의식을 잃고 깨끗한 새장에서 움직일 때까지 관찰하십시오. 회복을 확인한 후 새장으로 돌려 보내십시오.</li>
</ol>8. 말초 혈액 분석
<ol><li>꼬리 정맥에서 말초 혈액 50μL를 수집하고 100μL의 Ca 2+- 및 Mg2+가 없는 PBS와 2mM EDTA로 재현탁합니다. 모든 샘플을 96웰 플레이트로 옮깁니다. 400 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 버린다.</li>
	<li>적혈구 용해 완충액 200μL를 넣고 얼음에서 3분 동안 배양합니다. 샘플을 400 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 한 번 더 반복하십시오.</li>
	<li>200 μL의 세포 염색 완충액을 추가합니다. 샘플을 400 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.</li>
	<li>표 2에 따라 항체 마스터 믹스를 준비한다. 항체 마스터 믹스 50μL를 추가하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>150 μL의 세포 염색 완충액을 추가합니다. 샘플을 400 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.</li>
	<li>200 μL의 세포 염색 완충액을 추가합니다. 샘플을 400 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 200 μL의 세포 염색 완충액에 재현탁하고, 제조사의 지시에 따라 분석하기 전에 죽은 세포 염색 시약을 첨가한다.</li>
	<li>앞서 설명한 바와 같이 유세포 분석기를 사용하여 말초 혈액 키메라를 분석한다16. 이식 후 4주, 8주, 12주, 16주에 혈액을 채취하여 다계통 재구성을 따릅니다. 대표적인 유세포 분석 플롯은 그림 3에 나와 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이 연구와 관련된 이해 상충을 선언하지 않습니다.

전통적으로, 세포 표면 마커로 정의된 HSC는 자가 재생 능력 및 다능성과 같은 HSC의 기능을 연구하기 위해 준비되었다 19,20,21. 그러나 면역 표현형으로 정의된 (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/lo Flk2−) HSC 분획에는 LT-HSC 및 ST-HSC의 두 가지 개별 HSC 집단이 포함됩니다 9,10. 따라서 선의의 HSC, LT-HSC의 구체적인 분석은 아직 이루어지지 않았습니다. 따라서 Hoxb5 리포터 시스템을 사용하는 LT-HSC의 분리 방법은 자가 재생 능력의 ...

조혈모세포(HSC)는 자가재생 능력과 분화능을 지니고 있으며, 조혈 계층의 정점에 위치한다 1,2. 1988년 Weissman과 동료들은 유세포 분석을 사용하여 마우스 HSC의 분리를 달성할 수 있음을 처음으로 입증했습니다3. 그 후, 세포 표면 마커의 조합에 의해 정의된 분획인 Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−는 마우스 4,5,6,7,8에서 모든 HSC를 포함하는 것으로 보고되었습니다.
면역표현형으로 정의된 (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC(이하 pHSC)는 이전에 기능적으로 동질적인 것으로 간주되었습니다. 그러나 최근의 단일 세포 분석에 따르면 pHSC는 자가 재생 능력9,10 및 다분화성11,12와 관련하여 여전히 이질성을 나타냅니다. 특히, pHSC 분획에는 자가 재생 능력과 관련하여 두 가지 집단이 존재하는 것으로 보입니다: 지속적인 자가 재생 능력을 가진 장기 조혈 줄기 세포(LT-HSC)와 일시적인 자가 재생 능력을 갖는 단기 조혈 줄기 세포(ST-HSC) 9,10.
현재까지 LT-HSC와 ST-HSC를 구별하는 자가 재생 능력의 분자 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 자가 재생 능력에 따라 두 세포 집단을 분리하고 기본 분자 메커니즘을 발견하는 것이 중요합니다. LT-HSC13,14,15를 정제하기 위해 여러 리포터 시스템도 도입되었습니다. 그러나 각 리포터 시스템에서 정의한 LT-HSC 순도는 가변적이며 현재까지 독점적인 LT-HSC 정제가 달성되지 않았습니다.
따라서 LT-HSC 및 ST-HSC에 대한 격리 시스템을 개발하면 pHSC 부분의 자가 재생 용량에 관한 연구가 가속화될 것입니다. LT-HSC와 ST-HSC의 분리에서 다단계 편향되지 않은 스크리닝을 사용한 연구에서는 pHSC 분획16에서 이질적으로 발현되는 단일 유전자 Hoxb5를 확인했습니다. 또한, Hoxb5 리포터 마우스의 골수 분석은 pHSC 분획의 약 20%-25%가 Hoxb5 pos 세포로 구성되어 있음을 밝혀냈다. Hoxb5pos pHSC 및 Hoxb5 neg pHSC를 사용한 경쟁적 이식 분석에서 Hoxb5pos pHSC만이 장기 자가 재생 능력을 갖는 반면 Hoxb5neg pHSC는 단기간 내에 자가 재생 능력을 상실하는 것으로 나타났으며, 이는 Hoxb5가 pHSC 분획16에서 LT-HSC를 식별함을 나타냅니다.
여기에서는 Hoxb5 리포터 시스템을 사용하여 LT-HSC와 ST-HSC를 분리하는 단계별 프로토콜을 시연합니다. 또한 Hoxb5pos/neg pHSC의 자가 재생 능력을 평가하기 위한 경쟁력 있는 이식 분석을 제시합니다(그림 1). 이 Hoxb5 리포터 시스템을 통해 LT-HSC와 ST-HSC를 전향적으로 분리할 수 있으며 LT-HSC 특정 특성을 이해하는 데 기여합니다.

<table><tbody><tr><td>8 튜브의 0.2 mL 스트립, 돔 캡</td><td>SSIbio</td><td>3230-00</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA pH 8.0</td><td>Iinvtrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m 세포 여과기</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>30G 인슐린 주사기</td><td>BD</td><td>326668</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관, 셀 스트레이너 스냅 캡 포함</td><td>FALCON</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD 생존도 염색 용액</td><td>BioLegend</td><td>420404</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 U-Bottom</td><td>FALCON</td><td>351177</td><td></td></tr><tr><td>Anti-APC-MicroBeads</td><td>Milteny biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>트랩 포함 흡인기 플라스크</td><td>Biosan</td><td>FTA-1</td><td></td></tr><tr><td>B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)</td><td>BioLegend</td><td>103232</td><td></td></tr><tr><td>B220-Biotin (RA3-6B2)</td><td>BioLegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>B220-BV786 (RA3-6B2)</td><td>BD Biosciences</td><td>563894</td><td></td></tr><tr><td>B6. CD45.1 선천성 마우스&nbsp;</td><td>Sankyo Labo 서비스</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Baytril 10%</td><td>BAYER</td><td>341106546</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II 특별 주문 시스템&nbsp;</td><td>BD</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>브릴리언트 염색 완충액</td><td>BD</td><td>566349</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>101222</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-Biotin (M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BUV395 (M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>563553</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BV711 (M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>563168</td><td></td></tr><tr><td>CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)</td><td>Invitrogen</td><td>56-1271-82</td><td></td></tr><tr><td>CD150-BV421 (TC15-12F12.2)</td><td>BioLegend</td><td>115943</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)</td><td>Invitrogen</td><td>56-0161-82</td><td></td></tr><tr><td>CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)</td><td>BD Biosciences</td><td>560230</td><td></td></tr><tr><td>CD34-FITC (RAM34)</td><td>Invitrogen</td><td>11034185</td><td></td></tr><tr><td>CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)</td> <td>BioLegend</td><td>100216</td><td></td></tr><tr><td>CD3 &epsilon; -Biotin (145-2C11)</td> <td>BioLegend</td><td>100304</td><td></td></tr><tr><td>CD3 &epsilon; -BV421 (145-2C11)</td> <td>BioLegend</td><td>100341</td><td></td></tr><tr><td>CD45.1 / CD45.2 / CD45.2 congenic 마우스</td><td>N</td><td>/ A</td><td>우리 실험실에서 자란</td></tr><tr><td>해당 없음 CD45.1-FITC (A20)</td> <td>BD Biosciences</td><td>553775</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-PE (104)</td><td>BD Biosciences</td><td>560695</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100430</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Biotin (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100404</td><td></td></tr><tr><td>CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100730</td><td></td></tr><tr><td>CD8a-Biotin (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100704</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브 15ml</td><td>NICHIRYO</td><td>00-ETS-CT-15</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브 50ml</td><td>NICHIRYO</td><td>00-ETS-CT-50</td><td></td></tr><tr><td>c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)</td><td>Invitrogen</td><td>47117182</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-) Ca 및 Mg 없음, 액체&nbsp;</td><td>Nacalai</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Thermo Fisher</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)</td><td>eBioscience</td><td>46135182</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 버전 10</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</tr><tr><td>Gmmacell 40</td><td>Exactor 최고의 theratronics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108422</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1-Biotin (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>Hoxb5-tri-mCherry 마우스 (C57BL/6J 배경)&nbsp;</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>우리 실험실에서 자란</td></tr><tr><td>쥐 혈청에서 IgG, 기술 등급, >=80% (SDS-PAGE), 완충 수용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8015-100MG</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>화이자</td><td>4987-114-13340-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes S200</td><td>일본 종이 크레시아&nbsp;</td><td>6-6689-01</td><td></td></tr><tr><td>LS 컬럼</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>용해 완충액&nbsp;</td><td>BD</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>MACS&nbsp; 조직</td> 배양용 MultiStand <td>Milteny biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 플레이트(접착 세포용) 6Well</td><td>IWAKI</td><td>3810-006</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS 세퍼레이터</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>마우스 파이 케이지</td><td>나츠메 제작소</td><td>KN-331</td><td></td></tr><tr><td>다목적 냉장 원심분리기</td><td>TOMY</td><td>EX-125</td><td></td></tr><tr><td>NARCOBIT-E (II)</td><td>나츠메 제작</td>소 <td>KN-1071-I</td><td></td></tr><tr><td>NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)</td><td>BioLegend</td><td>108728</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 혼합 용액</td><td>나칼라이</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>도자기 모르타르 &phi; 120mm Pestle</td><td>Asone</td><td>6-549-03</td><td></td></tr><tr><td>단백질 LoBind 튜브 1.5 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Sca-I-BUV395 (D7)</td><td>BD Biosciences</td><td>563990</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 메스 블레이드</td><td>FastGene</td><td>FG-B2010</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-BUV737</td><td>BD Biosciences</td><td>612775</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX-red</td><td>Invitrogen</td><td>S34859</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner Restrainer for Mice standard</td><td>Braintree</td><td>TV-150 STD</td><td></td></tr><tr><td>TCRb-BV421 (H57-597)</td><td>BioLegend</td><td>109230</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119)</td><td>BioLegend</td><td>116220</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119-Biotin (TER-119)</td><td>BioLegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>Terumo 5ml 동심원 Luer-Slip 주사기</td><td>TERUMO</td><td>SS-05LZ</td><td></td></tr><tr><td>테루모 피하 주사 바늘 23G x 1</td><td>TERUMO</td><td>NN-2325-R</td><td></td></tr></tbody></table>

장기 및 단기 조혈모세포의 분리 방법

Isolation Method for Long-Term and Short-Term Hematopoietic Stem Cells

자가 재생 능력과 다중 계통 분화 잠재력은 일반적으로 조혈 줄기 세포(HSC)의 정의 특성으로 간주됩니다. 그러나 많은 연구에서 HSC 구획에 기능적 이질성이 존재한다고 제안했습니다. 최근의 단일 세포 분석에서는 HSC 구획 내에서 서로 다른 세포 운명을 가진 HSC 클론이 보고되었으며, 이를 편향된 HSC 클론이라고 합니다. 이질적이거나 재현성이 낮은 결과의 기본 메커니즘은 거의 이해되지 않았으며, 특히 정제된 HSC 분획을 기존 면역염색에 의해 이식할 때 자가 재생 길이와 관련하여 거의 이해되지 않았습니다. 따라서 장기 HSC(LT-HSC) 및 단기 HSC(ST-HSC)에 대한 재현 가능한 격리 방법을 확립하는 것이 이 문제를 극복하는 데 중요합니다. 편향되지 않은 다단계 스크리닝을 사용하여 마우스 조혈 시스템에서 LT-HSC의 배타적 마커일 수 있는 전사 인자인 Hoxb5를 확인했습니다. 이 발견을 바탕으로 Hoxb5 리포터 마우스 라인을 구축하고 LT-HSC 및 ST-HSC를 성공적으로 분리했습니다. 여기에서는 Hoxb5 리포터 시스템을 사용하여 LT-HSC 및 ST-HSC를 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 분리 방법은 연구자들이 자가 재생 메커니즘과 HSC 구획의 이러한 이질성에 대한 생물학적 기초를 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다.

이전에는 경쟁적 이식 분석을 사용하여 자가 재생 능력을 측정했는데, 이 분석에서 기증자 HSC는 수혜자 말초 혈액에서 다중 계통 기증자 세포가 관찰되는 경우에만 자가 재생 능력을 유지하는 것으로 생각되었다17. 또한, 몇몇 보고서에서는 LT-HSC를 두 번째 골수 이식 후 몇 개월 후에 말초 혈액 세포를 계속 생산하는 세포로 정의하고 있다10,18. 따라서, 이들의 자가 재생 능력을 비교하기 위해, Hoxb5리포터 마우스로부터 분리된 10개의 Hoxb5 pos 또는 Hoxb5 neg pHSC를 2 x 105개의 전체 골수 세포로 치사적으로 조사된 1차 수용자 마우스에 이식하였다. 이어서, 1차 이식 16주 후, 1차 수용자 마우스로부터 분리된 1 x 107개의 골수 세포를 치사 조사된 2차...

우리는 Hoxb5 리포터 시스템을 사용하여 장기 조혈 줄기 세포(LT-HSC) 및 단기 HSC(ST-HSC)의 분리를 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다.

Self-renewal capacity and multi-lineage differentiation potential are generally regarded as the defining characteristics of hematopoietic stem cells ...

장기 및 단기 조혈 줄기 세포 또는 HSC 분리 방법은 연구자들이 HSC 구획의 이질성에 대한 세포 재생 메커니즘과 생물학적 기초를 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 장기 HSC의 독점적인 마커일 수 있는 전사 인자인 Hoxb5가 확인되었습니다. 이를 바탕으로 Hoxb5 리포터 마우스 라인을 구축하고 장기 및 단기 HSC를 성공적으로 분리했습니다.기증자 골수 세포 수집을 시작하려면 절구와 유봉을 70 % 에탄올로 멸균하고 완전히 건조시킵니다. 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 함유 보충제로 구성된 세포 염색 완충액으로 평형을 유지하십시오. 기증자 수컷 Hoxb5-tri-mCherry 마우스에서 분리한 뼈를 박격포에 넣고 3밀리리터의 세포 염색 완충액을 추가합니다.유봉으로 뼈를 닦은 다음 부드러운 피펫팅으로 세포 덩어리를 분해하고 100미크론 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 50밀리리터 튜브로 옮깁니다. 용액이 투명해질 때까지 새로운 세포 염색 완충액으로 이 과정을 반복합니다. 일반적으로 세 번 반복하면 명확한 솔루션을 얻을 수 있습니다.CD45.1.2 선천성 마우스에서 대퇴골과 경골을 분리한 후 날카로운 멸균 가위로 뼈의 양쪽 끝을 자릅니다. 얼음처럼 차가운 세포 현탁액 완충액으로 채워진 5밀리리터 주사기가 장착된 23게이지 바늘을 사용하여 세포 현탁액 완충액이 들어 있는 멸균 세포 배양 접시에 골수를 씻어냅니다. 부드러운 피펫팅으로 세포 덩어리를 분해한 다음 P1000 피펫을 사용하여 40미크론 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과합니다.게이팅 설정의 경우 텍스트에 제공된 지침에 따라 샘플을 준비하고 400마이크로리터를 35미크론 셀 스트레이너 스냅 캡이 있는 둥근 바닥 폴리스티렌 테스트 튜브로 옮깁니다. 제조업체의 지침에 따라 분석하기 전에 죽은 세포 변형 시약을 준비하고 샘플에 추가합니다. 그런 다음 유세포 분석기를 켜고 제조업체의 지침에 따라 분석 소프트웨어를 시작합니다.그런 다음 로드를 눌러 데이터 수집을 시작합니다. 이중선, 죽은 세포 및 계통 양성 세포를 제외한 후 계통 음성, c-kit-양성, Sca-1 양성 분획을 게이트합니다. 다음으로, Flk2 양성 분획을 게이트아웃합니다.그런 다음 CD150 양성, CD34 음성 또는 저 분획에서 Hoxb5 양성 또는 Hoxb5 음성 pHSC를 게이트합니다. 다음으로, 600 마이크로 리터의 칼슘과 마그네슘이없는 PBS로 1.5 밀리미터의 저 단백질 결합 튜브를 준비하고, 10 % 열 비활성화 FBS로 보충한다. Hoxb5-양성 또는 Hoxb5-음성 pHSC 분류를 수행하기 위해, 준비된 1.5-밀리리터-저-단백질 결합 튜브를 분류 수집 장치에 설정하고, 앞서 언급한 게이팅 전략을 사용하여 Hoxb5-양성 또는 Hoxb5-음성 pHSC를 튜브 내로 분류한다.첫 번째 정렬에서는 정렬 정밀도 모드의 출력량을 사용합니다. 미리 준비된 지지 세포가 있는 96웰 플레이트를 자동 세포 증착 장치 스테이지에 설정합니다. 그런 다음 1.5밀리리터의 저단백질 결합 튜브를 유세포 분석기의 로딩 포트에 설정합니다.앞서 언급한 게이팅 전략을 사용하여 Hoxb5 양성 또는 Hoxb5 음성 pHSC를 지지 세포가 있는 96웰 플레이트로 분류합니다. 10개의 Hoxb5 양성 또는 Hoxb5 음성 pHSC를 분류하여 자가 재생 능력을 테스트합니다. 공여자 Hoxb5-tri-mCherry 마우스의 골수 분석의 유세포 분석 플롯은 계통 음성, c-kit-양성, Sca-1-양성, CD150-양성, CD34-음성 또는 낮은, Flk2-음성에 의해 정의된 pHSC 분획에서 세포의 약 20 내지 25%가 Hoxb5 양성 pHSC였다.여기에 제시된 것은 수용자 마우스의 말초 혈액 분석의 대표적인 유세포 분석 플롯이다. 또한, 1차 이식 후 수용자 마우스의 말초 혈액 분석에서 Hoxb5 양성 및 Hoxb5 음성 pHSC가 이식 4주 후에 유사한 기증자 키메라를 나타내었지만, Hoxb5 양성 pHSC 수용자에서만 지속적인 조혈이 관찰되는 것으로 나타났다. Hoxb5 음성 HSC는 이식 후 8주 후에 조혈 세포를 생산하는 능력을 잃기 시작했습니다.2차 이식 분석에서 Hoxb5 양성 pHSC 수혜자만이 강력한 조혈을 나타냈습니다. 대조적으로, Hoxb5 음성 pHSC 수용자 마우스에서는 공여 세포가 거의 관찰되지 않았으며, 이는 Hoxb5 음성 pHSC가 1차 이식 후 16주 이내에 자가 재생 능력을 상실했음을 시사합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 9시간에서 12시간이 걸리므로 세포 생존력을 유지하기 위해 절차 전반에 걸쳐 샘플을 섭씨 4도로 유지하는 것이 중요합니다.

isolation-method-for-long-term-and-short-term-hematopoietic-stem-cells

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

분리 및 조혈 줄기 세포의 이식 (HSCs)

이 비디오는 태아의 난황과 대동맥 - 생식선 - mesonephros 영역을 미세 절개하다 및 조혈 줄기 세포를 정렬 유동세포계측법를 사용하는 방법을 보여줍니다.

Murine 난황과 AGM에서 조기 조혈 줄기 세포의 분리

Lentiviral - 중재 최저 동안 예 VIVO</em인간 조혈 줄기 세포의> 적혈구 조혈

여기 우리는 전체 murine 간, 조직 소화, 세포 강화, 그리고 유동세포계측법 절연을 요구하는 과정에서 CD133 표현 간 줄기 세포와 암 줄기 세포의 절연을 설명합니다. 우리는 고급 단일 세포 분리 및 clonal 확장 메서드를 포함합니다.

Clonal 확장 CD133 + 간 줄기 세포의 분리

유동세포계측법의 골수 조혈 progenitors의 유통뿐만 아니라 효율적으로 분리 고도 정화 조혈 줄기 세포 (HSCs)를 분석하는 방법을 설명합니다. 분리 절차는 본질적으로 세포 및 분자 연구를위한 HSCs를 정화 정렬 C-키트 + 세포와 세포의 자성 농축에 근거한다.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

이 비디오는 인간 면역 체계(HIS) 마우스를 생성하는 기술을 보여줍니다. CD34+ 조혈모세포(HSC)는 항체로 코팅된 마그네틱 비드를 사용하여 인간 제대혈 버피 코트 세포에서 분리됩니다. CD34+ HSC는 사이토카인이 풍부하고 동결 보존된 성장 배지에서 확장됩니다. 마지막으로, 해동된 HSC를 면역결핍 새끼 마우스에 주입하여 HIS 마우스 모델을 확립합니다.

제대혈 조혈 줄기세포를 분리하여 인간 면역계 마우스를 생성하다

이 프로토콜은 풍부한 지방산, 콜레스테롤, 사이토카인의 낮은 농도 및 저산소증을 사용하여 골수 마이크로 환경을 모방하여 체외에서 정지한 인간 조혈 줄기 세포의 유지를 가능하게 합니다.

정지 인간 조혈 줄기 세포를 유지하는 배양 방법

이 연구는 혈관벽 상주 CD34+ 줄기세포(CD34+ VW-SC)의 분리, 배양 및 기능적 결정을 위한 안정적이고 효율적인 방법을 확립했습니다. 이 따르기 쉽고 시간 효율적인 분리 방법은 다른 연구자가 심혈관 질환과 관련된 잠재적 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

생쥐의 혈관벽 거주자 CD34+ 줄기 세포의 면역자기 분리

여기에서는 쥐 뼈, 골수, 흉선 및 단일 세포 다생물체학(single-cell multiomics)과 호환되는 인간 흉선 조직에서 기질 세포를 분리할 수 있는 프로토콜을 제시합니다.

조혈 장기에서 기질 세포 분리(Stromal Cell Isolation from Hematopoietic Organs)

당사는 단일핵 차세대 염기서열분석 분석을 지원하기 위해 동결보존, 유도만능줄기세포, 유래 기질/내피세포 및 혈액 세포 유형에서 고품질 핵을 추출하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 고품질의 온전한 핵을 생산하는 것은 멀티오믹스 실험에 필수적이지만 일부 실험실에서는 이 분야의 진입 장벽이 될 수 있습니다.

Cryopreserved In Vitro 유래 혈액 세포로부터 핵 분리

배우세요 Hoxb5 리포터 시스템을 활용한 장기 및 단기 조혈모세포 분리 방법을 통해 세포 재생 메커니즘과 조혈모세포 구획 내 이질성의 생물학적 기초를 이해하세요.

장기 및 단기 조혈모세포의 분리 방법

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