Name: 사카로마이세스 세레비시아에 5-에티닐-2-데옥시우리딘 혼입을 사용한 S상 지속 시간 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 배우세요 Saccharomyces cerevisiae에서 EdU 혼입과 Click 화학을 이용한 S상 지속 시간 측정법을. 이 방법은 DNA 복제 결함을 정밀하게 감지하여 세포 주기 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 재정 지원을 위해 JDDBT와 Agence Nationale pour la Recherche (ANR) 및 Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC)를 J.d.DBT에 대한 박사 학위 펠로우십과 ANR(Agence Nationale pour la Recherche)로 인정하고자 합니다(보조금 ANR-18-CE12-0018-01). 세포 분석 및 현미경 검사는 Montpellier MRI BioCampus 이미징 시설에서 수행되었습니다.

1. S. 세레비시아에 세포 배양
참고: 사용된 효모 균주는 표 1에 나열되어 있습니다.
알림: S상 지속 시간은 다양한 방법으로 모니터링할 수 있습니다. 다루어야 할 질문에 따라, 세포는G1 정지 후에 비동기적으로 또는 동기적으로 성장될 수 있다.
<ol><li>비동기적으로 성장하는 S. 세레비시아에 세포에서 참고: 이 방법을 사용하면 비동기적으로 증가하는 세포 집단에서 S 단계의 세포 백분율을 결정할 수 있습니다. 배가 시간을 결정함으로써 S 상 (및 다른 상)의 지속 시간을 외삽 할 수 있습니다.<ol><li>S. cerevisiae 세포를 낮은 세포 농도(5 × 104 cells/mL)의 합성 완전(SC) 배지 10mL에 접종하여 130rpm에서 궤도 교반으로 30°C에서 밤새 배양합니다. 알림: 농도는 세포 카운터로 측정됩니다. 배가 시간을 효율적으로 계산하려면 아직 지수 단계에 있는 야간 배양(즉, 이상적으로는 2 × 107 cells/mL 미만)에서 배양을 접종하는 것이 좋습니다. 풍부한 배지(YPD)에서 세포를 성장시키는 것은 EdU 검출이 효율적이지 않기 때문에 권장되지 않습니다.</li>
		<li>다음날, 세포를 5 × 105 cells/mL의 최종 농도로 20 mL의 새로운 SC 배지에 희석한다.</li>
		<li>세포를 120 rpm에서 수평 진탕과 함께 진탕수조에서 30°C에서 배양한다.</li>
		<li>1 × 107 cells/mL에 도달할 때까지 매시간 세포 농도를 측정합니다. 참고: 이 단계에서는 시간 경과에 따른 세포 농도 증가를 그래픽으로 표현할 수 있습니다. 배가 시간을 계산하는 데 사용되는 공식은 표 2의 범례에 설명되어 있습니다.</li>
		<li>세포 농도가 약 2 × 10 6-5 × 106 cells/mL인 경우 EdU 라벨링을 위한 2단계와 병행하여 진행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>G1 동기화 된 S. 세레 비시 애 세포에서 참고: 이 방법을 사용하면 유세포 분석 및/또는 현미경 분석을 통해 S상이 시작되고 끝나는 시기를 결정할 수 있습니다.<ol><li>S. cerevisiae 세포를 낮은 세포 농도(5 × 104 cells/mL)의 SC 배지 10mL에 접종하여 130rpm에서 궤도 교반과 함께 30°C에서 밤새 배양합니다. 참고: 1.1.1단계 이후의 참고를 참조하십시오.</li>
		<li>다음날, 세포를 2 × 106-3 × 106 cells/mL의 최종 농도로 20mL의 새로운 SC 배지에 희석한다.</li>
		<li>물에 희석한 1mg/mL α인자 40μL를 추가합니다.</li>
		<li>세포를 30°C에서 1시간 동안 130rpm으로 오비탈 교반하면서 배양한다.</li>
		<li>물에 희석한 1mg/mL α인자 40μL를 다시 추가합니다.</li>
		<li>세포를 30°C에서 1시간 동안 130rpm으로 오비탈 교반하면서 배양한다.</li>
		<li>G1 정지를 모니터링하기 위해 광학 현미경으로 세포를 시각화합니다. 세포의 90 % 이상이 shmoo를 표시하고 나머지는 둥글고 싹이 트지 않은 세포 인 경우 진행하십시오. 참고: 사용된 배경에 따라 shmoo 시각화 전에 셀을 초음파 처리하는 것이 좋습니다. W303 배경의 경우 2-2의 진폭에서 매번 40초 동안 50x를 초음파 처리합니다.</li>
		<li>1,500 × g에서 3 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.</li>
		<li>세포를 20mL의 SC 배지에 재현탁시킨다.</li>
		<li>1.2.8-1.2.9단계를 한 번 반복합니다. 참고: α 인자는 이러한 단계로 씻겨 나가고 세포는 세포 주기에서 방출됩니다. 대안적으로, α-인자는 진공 펌프에 연결된 측-암 플라스크 상의 깔때기 세트를 사용하여 1.2μm 니트로셀룰로스 필터로 효모 세포를 여과함으로써 세척될 수 있다.</li>
		<li>5분마다 2x 세포 1mL를 수집하고 EdU 라벨링을 위해 2단계로 진행합니다. 알림: 두 튜브 중 하나의 셀에만 EdU를 사용하여 펄스 라벨을 붙입니다. 펄스 표지되지 않은 세포는 이변량 프로피듐 요오드화물(PI)-EdU 그래프에서 EdU 양성 세포와 EdU 음성 세포를 구별하는 데 사용됩니다.</li>
		<li>방출 후 30분 후에 물에 희석한 1mg/mL α인자 400μL를 추가합니다. 참고: 이 고용량의 α인자는 다음 세포 주기의 G1 단계에서 세포를 정지시키고 세포가 후속 S 단계로 다시 들어가는 것을 방지하는 데 필요합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. EdU 라벨링
<ol><li>1mL의 세포 배양물을 1μL의 10mM EdU가 들어 있는 2.0mL 미세원심분리 튜브로 옮깁니다. 반전으로 잘 섞는다. 참고: PI-EdU 이변량 FACS에서 EdU 양성 세포와 EdU 양성 세포를 구별하려면 1μL의 DMSO가 포함된 2.0mL 미세원심 분리 튜브에 또 다른 1mL의 세포 배양물을 옮깁니다.</li>
	<li>진탕 수조에서 교반 하에 30°C에서 3-5분 동안 배양합니다. 참고: 현미경으로 EdU 검출에는 3분이면 충분합니다. 유세포분석기에서 최적의 EdU 검출을 위해서는 5분이 필요합니다.</li>
	<li>100 μL의 100% 에탄올을 첨가하여 반응을 중지시킨다.<ol><li>세포 크기 측정이 필요한 경우 100 μL의 20% 파라포름알데히드를 첨가하여 반응을 중지합니다. 참고: 유사분열 세포의 핵 구조를 클릭 반응 후 추가 분석을 위해 그대로 유지해야 하는 경우, 세포를 얼음 위에 두는 것보다 실온(RT)에서 2% 파라포름알데히드로 세포를 고정하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>100 % 에탄올 100 μL를 첨가하기 전에 세포를 고정하기 위해 가변 속도 로커에서 20 틸트 / 분으로 가벼운 교반하에 RT에서 20 분 동안 세포를 그대로 두십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 세포 고정 및 투과화
<ol><li>미세원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 진공 피펫을 사용하여 상청액을 제거한다.</li>
	<li>세포 펠릿을 500μL의 70% 에탄올에 재현탁시킨다. 소용돌이로 잘 섞는다.</li>
	<li>세포를 투과시키기 위해 가변 속도 로커에서 RT에서 ≥1 틸트 / 분으로 20 시간 동안 그대로 두십시오. 참고: SC 배지에서 성장한 세포는 미세 원심 분리 벽에 달라붙는 경향이 있으므로 펠릿이 잘 되지 않습니다. 에탄올을 첨가하면 펠릿이 개선되고 세포 손실이 감소합니다. 세포는 4°C에서 밤새 또는 -20°C에서 더 긴 기간 동안 저장될 수 있다.</li>
	<li>마이크로 원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.</li>
	<li>세포를 PBS 중 500 μL의 10% 에탄올로 2x 세척한다. 알림: 세척은 세포에서 통합되지 않은 EdU를 제거하는 데 중요합니다.</li>
</ol>4. 클릭 잇 반응
<ol><li>세포분석용<ol><li>미세원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.</li>
		<li>0.1 mg/mL RNase A 및 0.2 mg/mL 프로테이나제 K를 함유하는 200 μL의 PBS에 펠릿을 재현탁시킨다.</li>
		<li>가끔 흔들면서 50 ° C에서 1-2 시간 동안 배양합니다 (또는 37 ° C에서 밤새).</li>
		<li>마이크로 원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.</li>
		<li>세포를 500 μL의 PBS로 세척한다.</li>
		<li>미세원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.</li>
		<li>세포 펠릿을 200μL의 PBS + 1% 소 혈청 알부민(BSA)에 재현탁합니다. RT에서 30 분 동안 배양하십시오. 참고: 더 긴 시간은 필요하지 않으며 클릭 반응의 효율성에도 해롭습니다.</li>
		<li>마이크로 원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.</li>
		<li>펠릿을 300μL의 PBS + 1% BSA에 재현탁시킨다.</li>
		<li>클릭 반응을 위해 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 200μL, Sytox Green 염색을 위해 다른 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 100μL의 두 튜브 사이에 세포를 분배합니다.</li>
		<li>마이크로 원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.</li>
		<li>사이톡스 그린 염색용 참고: 고품질 DNA 함량 참조 프로필을 얻기 위해 Sytox Green 염색(클릭 제외)에 대한 부분 표본을 복용하는 것이 좋습니다. 실제로, 클릭 반응은 사이톡스 그린 및 PI 형광을 포함한 인터칼란트 형광을 강력하게 소멸시킵니다. 결과적으로 클릭 반응은 DNA 함량의 판독을 왜곡 할 수 있습니다.<ol><li>세포 펠릿을 100μL의 PBS에 재현탁시킨다.</li>
			<li>10-30 μL (세포 농도에 따라 다름)를 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 및 0.5 μM Sytox Green의 300 μL를 포함하는 유세포 분석기 튜브로 옮깁니다.</li>
			<li>2-2의 진폭에서 매번 2 초 동안 40x를 초음파 처리합니다.</li>
			<li>유세포 분석기에서 샘플을 처리 할 때까지 어둠 속에 두십시오. 참고: 셀은 이 단계에서 며칠 동안 4°C로 보관할 수 있습니다.</li>
		</ol></li>
		<li>클릭 반응의 경우<ol><li>시약을 다음 순서(튜브 1개당 수량)로 혼합하여 새로운 아지드 염료 완충액을 준비합니다: 36μL의 PBS, 2μL의 0.2MCuSO4, 0.2μL의 2mM Cy5 아지드, 2μL의 1M 아스코르브산. 참고: Azide Dye 버퍼의 마스터 믹스를 제조할 수 있습니다. 시약은 위에서 언급한 것과 동일한 순서로 혼합되어야 합니다.</li>
			<li>새로 만든 Azide 염료 혼합물 40μL로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 어둠 속에서 RT에서 60 분 동안 배양하십시오.</li>
			<li>마이크로 원심 분리기에서 10,000×g에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.</li>
			<li>세포를 PBS 중 300 μL의 10% 에탄올로 3x 세척한다. 알림: 세척은 모든 용해성 EdU-Cy5 아지드를 제거하는 데 중요합니다.</li>
			<li>세포를 PBS에서 50μg/mL PI의 100μL에 재현탁시킨다. 어둠 속에서 10 분 동안 그대로 두십시오.</li>
			<li>10-30 μL의 세포 현탁액 (세포 농도에 따라 다름)을 50 mM Tris-HCl, pH 7.5의 300 μL를 함유하는 유세포 분석기 튜브로 옮깁니다.</li>
			<li>2-2의 진폭에서 매번 2 초 동안 40x를 초음파 처리합니다.</li>
			<li>세포 분석기에서 샘플을 처리 할 때까지 어둠 속에 두십시오. 참고: 셀은 이 단계에서 며칠 동안 4°C로 보관할 수 있습니다.</li>
		</ol></li>
		<li>488nm의 여기 청색 레이저와 530/30BP 필터를 사용하여 Sytox Green 샘플을 판독합니다. 일반적인 결과는 그림 1A 를 참조하십시오. 488nm의 여기 청색 레이저와 PI(x축)의 경우 615/20BP 필터, 640nm의 여기 적색 레이저 및 660/20BP 필터(y축)를 사용하여 점도표에서 이변량 PI-EdU 샘플을 읽습니다. 일반적인 결과는 그림 1B 를 참조하십시오. 참고: 그림 1C 는 EdU 음성 셀에 대한 일반적인 PI-EdU 이변량 FACS 결과를 나타냅니다. EdU 음성 세포와 EdU 양성 세포를 구별 할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>현미경 분석용<ol><li>마이크로 원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.</li>
		<li>펠릿을 200 μL의 PBS + 1% BSA에 재현탁시킨다. RT에서 30 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>미세원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.</li>
		<li>36 μL의 PBS, 2 μL의 0.2 M CuSO4, 0.2 mM Dy-530 아지드의 0.2 μL, 1 M 아스코르브산의 2 μL의 순서로 시약을 혼합하여 새로운 Azide Dye 완충액을 준비합니다(한 튜브의 수량). 참고: Azide Dye 완충액의 마스터 혼합물은 앞서 언급한 순서대로 시약을 혼합하여 신선하게 준비할 수 있습니다.</li>
		<li>새로 만든 Azide 염료 버퍼 40μL로 펠릿을 재현탁합니다. 어둠 속에서 RT에서 60 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>세포를 미세분리 기에서 10,000×g에서 2분 동안 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.</li>
		<li>세포를 PBS 중 300 μL의 10% 에탄올로 2x 세척한다. 알림: 세척은 모든 가용성 Dy-530 azide를 제거하는 데 중요합니다.</li>
		<li>마이크로 원심분리기에서 10,000 × g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.</li>
		<li>세포를 PBS에 0.5μg/mL 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)의 100μL에 재현탁시킨다. 실온에서 어둠 속에서 30 분 동안 그대로 두십시오.</li>
		<li>마이크로 원심 분리기에서 10,000 ×g에서 2 분 동안 세포를 펠릿합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.</li>
		<li>300μL의 PBS로 세척하여 과도한 DAPI를 제거합니다.</li>
		<li>세포를 미세원심분리 기에서 10,000×g에서 2분 동안 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.</li>
		<li>세포 농도에 따라 10-50 μL의 PBS로 펠릿을 재현탁합니다.</li>
		<li>2-2의 진폭에서 매번 2 초 동안 40x를 초음파 처리합니다. 참고: 셀은 이 단계에서 며칠 동안 4°C로 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>1.7 μL의 세포를 유리 현미경 슬라이드 상에 피펫팅하고 깨끗한 커버슬립으로 덮는다.</li>
		<li>DAPI 및 TexasRed 또는 Cy3 필터를 사용하여 형광 현미경으로 즉시 관찰하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Bell, S. P., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+duplication+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).</li>
<li>Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+replication+of+individual+replicons+in+eukaryotic+replication+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories.</a> Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).</li>
<li>Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+in+budding+yeast%3A+Sister+chromatid+cohesion+and+related+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms.</a> Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).</li>
<li>Lengronne, A., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+CDK+inhibitor+Sic1+prevents+genomic+instability+by+promoting+replication+origin+licensing+in+late+G1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1.</a> Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).</li>
<li>Tanaka, S., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulated+G+1-cyclin+expression+induces+genomic+instability+by+preventing+efficient+pre-RC+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation.</a> Genes & Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).</li>
<li>Teixeira, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+E+deregulation+promotes+loss+of+specific+genomic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions.</a> Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).</li>
<li>Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+of+Saccharomyces+cerevisiae+in+populations+growing+at+different+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).</li>
<li>McNeil, J. B., Friesen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+herpes+simplex+virus+thymidine+kinase+gene+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics%22%5BJournal%5D)">Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).</li>
<li>Vernis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+an+efficient+thymidine+salvage+pathway+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 31 (19), 120(2003).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+instability+of+yeast+cdc6-1%2Fcdc6-1+mutants+involves+chromosome+structure+and+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination.</a> Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).</li>
<li>Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+control+of+Mcm5+interaction+with+chromatin+in+cdc6-1+mutated+in+CDC-NTP+motif%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif.</a> DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).</li>
<li>Saner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+association+of+neighboring+replicons+creates+replication+factories+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast.</a> Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).</li>
<li>Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORC-dependent+and+origin-specific+initiation+of+DNA+replication+at+defined+foci+in+isolated+yeast+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei.</a> Genes & Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).</li>
<li>Lengronne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+S+phase+progression+globally+and+locally+using+BrdU+incorporation+in+TK%2B+yeast+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains.</a> Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).</li>
<li>Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+and+spindle+checkpoints+cooperate+during+S+phase+to+delay+mitosis+and+preserve+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).</li>
<li>Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EdU+incorporation+for+FACS+and+microscopy+analysis+of+DNA+replication+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast.</a> Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).</li>
<li>Ivanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+yeast+complete+DNA+synthesis+after+chromosome+segregation+begins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins.</a> Nature Communications. 11 (1), 2267(2020).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

효모는 세포주기 연구의 주요 모델 유기체이지만 DNA 복제의 추적자로 사용되는 BrdU와 같은 외인성 뉴 클레오 사이드를 통합 할 수 없기 때문에 S 단계의 특성화는 오랫동안 방해 받아 왔습니다. 효모에 단순 포진 티미 딘 키나아제 (TK)의 높은 발현을 장착하고 인간 뉴 클레오 시드 수송 체 (hENT)를 첨가하면이 문제가 크게 해결되었습니다15,16. EdU는 항 BrdU 항체17과 달리 작은 형광 아지드 및 클릭 화학을 사용한 검출이 투과화된 효모 세포 및 FACS 분석에 적합하기 때문에 BrdU보다 더 다재다능합니다. 여기에서 우리는 이 TK-hENT1 균주에서 EdU 라벨링 및 검출 조건을 최적화하고 이전에 검출되지 않은 복제 결함을 FACS 또는 현미경으로 이 프로토콜을 사용하여 정량화할 수 있음을 보여주었습니다.
동일한 ...

유사분열 분열을 통한 게놈 안정성은 완전하고 동일한 염색체 세트를 생산된 두 세포 자손으로 전달함으로써 보장됩니다. 이것은 세포주기의 각 단계에서 주어진 시간에 발생하는 일련의 사건의 정확한 완료에 의존합니다. G 1에서 복제 원본은 Cdc61을 포함한 여러 라이센스 요소를 모집할 때 라이센스가 부여됩니다. S 단계에서 전체 게놈 복제는 여러 활성 복제 기점에서 시작되고 복제 공장2이라는 현미경으로 보이는 초점에 모이는 복제 기계에 의해 수행됩니다. M 단계에서, 복제 된 자매 염색분체는 유사 분열 방추에 부착되고 이중 배향되어 유사 분열 세포3의 반대 극으로 분리 될 수 있습니다. 각 단계의 조절, 적절한 완료 및 기간은 게놈 안정성을 보장하는 데 중요합니다. 실제로, 이러한 단계에서 조기 종료는 게놈 불안정성을 초래합니다. 예를 들어, 출아 효모 CDK 억제제 Sic1의 결실 또는 G1 사이클린의 과발현에 의해 유도된 더 짧은G1은 후속 S상 4,5,6을 변화시킬 것이다. 결과적으로, 복제 스트레스와 관련이 있든 없든 이러한 규제 완화는 염색체 파괴, 재 배열 및 잘못된 분리 4,5,6을 초래합니다. 따라서 S 단계의 지속 기간 및보다 광범위하게는 세포주기의 다른 단계의 지속 시간을 모니터링하는 것은 다른 돌연변이 체 및 다른 스트레스 조건에서 발생하는 결함을 식별하는 데 중요 할 수 있습니다.
세포 주기 단계 기간을 측정하는 전통적인 방법에는 간단한 DNA 함량 유세포분석(그림 1A)이 포함되며 집단을 1C 및 2C 피크에서 G1, S 및 G2 + M 상 분획으로 분리하는 데 사용되는 피팅 알고리즘(대부분의 세포분석 소프트웨어에서 사용 가능)에 의존합니다. 그런 다음 분수에 인구 배가 시간7을 곱합니다. 그러나 이 방법은 추정된 값만 제공하고 주어진 분획 내에서 균질한 세포 크기 분포가 필요하며 동기화된 배양에는 적용할 수 없습니다. 포유류 세포에서 S- 기 지속 시간을 연구하기 위해 EdU를 포함한 여러 티미 딘 유사체가 개발되어 널리 사용되었습니다. 세포 외 배지로부터의 흡수와 티미 딘 키나아제 (이하 TK라고 함)에 의한 인산화는 DNA 중합 효소가 DNA 합성 (복제, 재조합, 복구) 부위에 이들을 통합 할 수있게한다. 사카로마이세스 세레비지애 세포에서 TK 유전자의 부재를 우회하기 위해 효모 균주는 단순 포진 바이러스 TK8 및 인간 평형 뉴클레오시드 수송체(hENT1)9의 안정적이고 구성적인 발현을 허용하도록 설계되었습니다. 일단 DNA에 통합되면, EdU는 선택적 클릭 반응을 통해 검출되며, 이는 알킨 부분을 아지드-개질된 플루오로크롬10에 화학적으로 결합시킨다.
이 백서는 현미경 및 유세포 분석을 통해 단일 세포 및 집단 수준 모두에서 높은 공간 및 시간 분해능으로 DNA 복제 기간 및 역학뿐만 아니라 세포 주기의 다른 단계의 지속 시간을 정확하게 시각화하고 측정하기 위해 EdU를 사용하여 비동기 및 동기식 TK-hENT1 엔지니어링 세포에 대한 두 가지 최적화된 포괄적인 프로토콜을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>&알파;-팩터&nbsp;</td><td>Genescript</td><td>RP01002</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Euromedex</td><td>04-100--812-E</td><td></td></tr><tr><td>구리 황산</td>염 <td>시그마</td><td>C1297</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>디-설포-시아닌5 아지드 (Cy5 아지드)</td><td>Interchim</td><td>FP-JV6320</td><td>Alexa647-Azide</td></tr><tr><td>Dy-530 아지드</td><td>Dyomics</td>에 대한 대안<td>&nbsp; 530-10</td><td></td></tr><tr><td>EdU(5-에티닐-2'-데옥시우리딘)</td><td>Carbosynth</td><td>NE08701</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 앱솔루트</td><td>Carlo Erba 시약</td><td>P013A10D16</td><td>또는 등가</td></tr>물 <tr><td>L-아스코르브산</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Euromedex</td><td>EU0090</td><td></td></tr><tr><td>Rnase</td><td>SIGMA</td><td>R5000</td><td></td></tr><tr><td>Sytox Green</td><td>Invitrogen</td><td>S-7020</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>OLS</td><td>CASY</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>Agilent</td><td>NovoSampler Pro</td><td></td></tr><tr><td>진탕 인큐베이터</td><td>Infors</td><td>444-4230</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>진탕수 bath</td><td>Julabo</td><td>SW22</td><td>또는 동급의</td></tr><tr><td>제품, Sonicator</td><td>, Sonics,</td><td>Vibra cell</td><td></td></tr><tr><td>, 광시야 현미경,</td><td>Leica,</td><td>THUNDER Imager</td><td>또는 동급의</td></tr></tbody></table> 제품

사카로마이세스 세레비시아에 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 혼입을 사용한 s상 지속 시간 측정

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

진핵생물 DNA 복제는 염색체 분리 전에 세포의 유전적 청사진이 올바르게 복제되도록 하는 고도로 조절된 과정입니다. DNA 합성 결함이 염색체 재배열의 기초가 됨에 따라 DNA 복제 모니터링은 게놈 불안정성의 기초를 이해하는 데 필수적이 되었습니다. 사카로마이세스 세레비지애 는 세포 주기 조절을 연구하는 고전적인 모델이지만 S기의 세포 분율 또는 S기 기간과 같은 주요 DNA 복제 매개변수는 여전히 결정하기 어렵습니다. 이 프로토콜은 조작된 TK-hENT1 효모 세포에서 티미딘 유사체인 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)의 짧고 독성이 없는 펄스를 사용한 다음 클릭 반응으로 검출하여 현미경 및 유세포분석을 통해 단일 세포 및 집단 수준 모두에서 높은 공간 및 시간 분해능으로 DNA 복제를 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 이 방법은 효모 돌연변이체의 S 단계 및 세포주기 진행에서 이전에 간과 된 결함을 식별 할 수 있으므로 게놈 안정성을 보장하는 데 필수적인 새로운 플레이어의 특성화를 허용합니다.

S기 지속기간 및, 보다 광범위하게는G1 및G2+M의 지속기간을 결정하기 위해(프로토콜 단계 1.1), S. 세레비지애 W303 야생형 세포(WT, 표 1)를 SC 배지에서 7시간 동안 비동기적으로 성장시켰다. 매 시간마다, 세포 농도를 모니터링하여 배가 시간을 결정하였다(도 2B). 이들 성장 조건에서, 계산된 배가 시간은 25°C에서 120분 ± 13분이었다(표 2). 세포가 지수기(2 × 10 6-5 × 106 cells/mL)에 있을 때, 세포의 분취량을 5분 동안 EdU(10μM)로 펄스 라벨링하여 S 페이즈의 셀을 선별하고G1, S 및G2+M 페이즈에 있는 셀의 백분율을 결정하였다. 3개의 세포 집단이 이변량 EdU-PI 세포분석기 분석에서 관찰되었다(<strong clas...

우리는 생체 내에 통합되고 현미경 및 유세포 분석에 의한 Click 화학을 사용하여 검출되는 티미딘 유사체인 EdU를 사용하여 S. cerevisiae에서 S상 지속 시간을 정확하게 결정하기 위한 두 가지 보완 프로토콜을 설명합니다. 이를 통해 DNA 복제 기간을 쉽게 특성화하고 돌연변이의 복제 결함을 간과할 수 있습니다.

사카로마이세스 세레비시아에 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 혼입을 사용한 S상 지속 시간 측정

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...

이 프로토콜을 사용하면 동기화된 신진 효모 세포에서 S상 지속 시간을 정밀하게 측정할 수 있습니다. 빠르고 쉽고 재현 가능한 방법입니다. 또한 기존 프로토콜에서 감지되지 않는 경미한 합성 결함을 감지할 수 있을 만큼 민감합니다.이 방법은 신진 효모에서 세포주기 조절을 연구하는 많은 연구자들에게 유용 할 것입니다. 이 프로토콜을 시연하는 것은 선임 연구원 인 Nicolas Talarek과 실험실의 박사 과정 학생 인 Juan De Dios Barba Tena입니다. 사카로마이세스 세레비지애 세포를 낮은 세포 농도의 SC 배지 10밀리리터에 접종하여 분당 130회전의 안와 교반과 함께 섭씨 30도에서 밤새 배양합니다.다음날, 세포를 20 밀리리터의 신선한 SC 배지에서 10 밀리리터당 10 내지 6개의 세포에 2 내지 3배의 최종 농도로 희석한다. 물에 희석 된 밀리리터 알파 인자 당 1 밀리그램의 40 마이크로 리터에서. 그런 다음 세포를 섭씨 30도에서 배양하고 1 시간 동안 분당 130 회전의 궤도 교반을 수행합니다.이 단계를 한 번 반복합니다. G1 정지를 모니터링하기 위해 광학 현미경으로 세포를 시각화합니다. 셀의 90 % 이상이 shmoo를 표시하고 나머지는 둥근 고정되지 않은 셀이면 진행합니다.샘플을 1, 500 G에서 3 분 동안 원심 분리한 다음 진공 피펫으로 상청액을 버리고 세포를 20 밀리리터의 SC 배지에 재현탁시킨다. 이 단계를 한 번 반복합니다. 5 분마다 두 번 1 밀리리터의 세포를 수집하고 EDU 라벨링을 진행합니다.방출 30 분 후에 400 마이크로 리터의 알파 인자를 첨가하십시오. 1 밀리리터의 세포 배양 물을 10 밀리몰 EDU의 1 마이크로 리터를 포함하는 2 밀리리터 마이크로 원속 튜브로 옮기고 반전으로 잘 혼합합니다. Pi EDU 이변량 팩트에서 EDU 양성 세포와 EDU 양성 세포를 구별하려면 1 밀리리터의 세포 배양을 1 마이크로 리터의 DMSO가 들어있는 2 밀리리터 마이크로 원속 튜브로 옮깁니다.흔들리는 수조에서 교반 하에서 섭씨 30도에서 3-5 분 동안 배양하십시오. 100 마이크로 리터의 100 % 에탄올을 첨가하여 반응을 중지하십시오. 세포를 미세 원심 분리기에서 10, 000 G에서 2 분 동안 펠릿화한다.진공 피펫을 사용하여 상청액을 제거한다. 세포 펠릿을 500 마이크로 리터의 70 % 에탄올에 재현 탁시키고 vortexing하여 잘 혼합합니다. 샘플을 가변 속도 로커에서 분당 20 틸트로 최소 1 시간 동안 실온에 두어 세포를 투과시킵니다.세포를 미세원심분리기에서 10, 000 G에서 2분 동안 펠릿화하고 상층액을 진공 피펫으로 버린다. 세포를 500 마이크로리터의 10% 에탄올과 PBS로 두 번 세척한다. 세포를 마이크로원속에 10, 000 G에서 2분간 펠릿화하고, 상층액을 진공 피펫으로 버린다.RNase A 및 Proteinase K를 함유 한 200 마이크로 리터의 PBS에 펠릿을 재현 탁하십시오.가끔 흔들면서 섭씨 50도에서 1-2 시간 동안 또는 섭씨 37도에서 밤새 배양하십시오. 세포를 마이크로 원심분리기에서 10, 000 G에서 2분 동안 펠릿화하고 상층액을 진공 피펫으로 버린다. 세포를 500 마이크로리터의 PBS로 세척한다.그런 다음 세포를 펠릿화하고 앞에서 설명한 대로 상청액을 버립니다. 세포 펠릿을 200 마이크로 리터의 PBS에 1 % BSA로 재현 탁시킵니다. 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.그런 다음 세포를 펠릿화하고 앞에서 설명한 대로 상청액을 버리고 1%BSA를 포함하는 300마이크로리터의 PBS에 펠릿을 재현탁합니다. 세포를 두 개의 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 분배하십시오. 첫 번째 튜브는 클릭 반응을 위한 200마이크로리터의 세포 배양으로 구성되어야 하고 두 번째 튜브는 사이톡스 녹색 염색을 위한 100마이크로리터의 세포 배양을 포함해야 합니다.이어서, 세포를 펠릿화하고 앞에서 입증된 바와 같이 상청액을 버린다. 사이톡스 그린 염색을 위해, 세포 펠릿을 100 마이크로리터의 PBS에 재현탁시킨다. 이어서 세포 농도에 따라, 10 내지 30 마이크로리터를 300 마이크로리터의 사이톡스 녹색 혼합물을 함유하는 유세포분석기 튜브로 옮긴다.40-50%의 진폭에서 2초 동안 샘플을 두 번 초음파 처리하여 유세포분석기에서 샘플을 처리할 때까지 어둠 속에 두십시오. 클릭 반응의 경우, 새로 준비된 40 마이크로리터의 아지드 염료 완충액으로 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 어두운 곳에서 실온에서 60 분 동안 배양하십시오.세포를 펠릿화하고 앞에서 설명한 대로 상청액을 버립니다. 그런 다음 PBS에서 300 마이크로 리터의 10 % 에탄올로 세포를 3 회 세척하십시오. 다음으로 세포를 PBS에 밀리리터당 50 마이크로그램의 100 마이크로리터에 재현탁시키고 어둠 속에서 10분 동안 방치한다.세포 농도에 따라, 10 내지 30 마이크로리터의 세포 현탁액을 300 마이크로리터의 50 밀리몰 트리스 HCl, pH 7.5를 함유하는 유세포분석기 튜브로 옮긴다. 40에서 50의 진폭에서 2 초 동안 두 번 초음파 처리합니다. 세포 분석기에서 처리 할 때까지 샘플을 어둠 속에 두십시오.488 나노미터의 여기 청색 레이저와 530 x 30 대역 통과 필터를 사용하여 sytox 녹색 샘플을 판독합니다. 488나노미터의 여기 청색 레이저와 Pi X축의 경우 615 x 20 대역 통과 필터, 640나노미터의 적색 여기 레이저, Y축의 경우 660 x 20 대역 통과 필터를 사용하여 점도표에서 Bavaria Pi EDU 샘플을 읽습니다. 3개의 세포 집단이 이변량 EDU Pi 세포분석기 분석에서 관찰되었다.섭씨 25도에서 세포 집단의 약 27%가 G1 단계, 29%가 S 단계, 약 44%가 G2 플러스 M 단계에 있었습니다. 동기화된 세포에서, S 페이즈의 지속시간은 사이톡스 녹색 유세포분석기 프로파일 상에서 DNA 함량이 1C에서 2C로 변화된 시간에 기초하여 약 25분일 수 있다. EDU 펄스 라벨링은 S 위상 지속 시간을 정확하게 결정했습니다.방출 15 분 후, EDU 양성 세포의 분획이 검출되었고, 이는 S 단계의 시작을 나타냅니다. S 단계를 통한 진행은 바이에른 Pi EDU 그래프에서 위쪽과 오른쪽으로 이동하는 세포 구름에 의해 관찰되었습니다. 마지막으로, 방출 후 35 분에 세포의 분획은 EDU 음성이었지만 DNA 양의 두 배는 S 단계가 종료되고 세포가 G2 플러스 M 단계에 있음을 나타냅니다.관찰된 높은 동시성에도 불구하고, 일부 세포는 방출 후 60분 후에 S 페이즈를 완료하였고, S 페이즈는 방출 후 약 65분 후에 전체 집단에 대해 완료되었다. 완벽한 동기화를 유지하고 세포가 두 번째 S 단계로 들어가는 것을 방지하는 것이 중요합니다. 세포는 핵 DNA 복제 예측을 모니터링하고 정량화할 수 있는 현미경으로 이미지화할 수 있습니다.이 기술은 경미한 S 상 결함과 세포주기 기간 결함을 갖는 간과 된 돌연변이를 식별하는 데 도움이됩니다.

determination-s-phase-duration-using-5-ethynyl-2-deoxyuridine

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

염색체 복제 타이밍 분석을위한 정량 방법 설명되어 있습니다. 방법은 형광와 함께 BrdU의 설립을...

형광등과 결합 염색체 복제 타이밍<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

여기에서는 (세포주기) 키나아제의 미토콘드리아 국소화를 연구하는 방법과 미토콘드리아 아래 위치 및 잠재적인 미토콘드리아 기질/표적을 결정하는 방법을 간략하게 설명합니다. 단백질을 미토콘드리아로 강제 발현하는 것은 관심 단백질의 미토콘드리아 국소화의 기능적 결과를 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

실험 접근법은 미토콘드리아 현지화 및 핵 세포주기 키나제,는 Cdk1의 기능을 연구하는

여기에 설명 된 프로토콜 4-thiouracil으로 표시 하는 효 모 세포에서 정화 하는 새로 합성된 mRNA의 게놈 넓은 정량화를 기반으로 합니다. 이 방법은 mRNA 합성 mRNA 감퇴에서 연결을 측정할 수 있게 그리고, 따라서, RNA 중 합 효소 II 전사의 정확한 측정을 제공 합니다.

Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

이미징 기반 메서드를 설명 하는 S 단계를 식별 하 고 사용 하는 티 미 딘 C. 선 충 자웅 동체 생식 세포 주기 역학을 분석 하는 데 사용할 수 있는 아날로그 듀. 이 메서드와 필요 없는 transgenes immunofluorescent 얼룩과 호환 됩니다.

티 미 딘 아날로그 듀와 선 충 C. 생식에 세포 주기 분석

이 프로토콜은 질량 세포 분석 플랫폼에서 사용하기 위해 세포 주기 측정을 조정합니다. 질량 세포분석의 다중 파라미터 기능을 통해 요오드 결합을 직접 측정하면 S상에서 세포를 식별할 수 있으며 세포 내 사이클링 마커를 통해 다양한 실험 조건에서 각 세포 주기 상태를 특성화할 수 있습니다.

세포 주기 마커와 함께 피리미딘 유사체, 5-요오도-2′-데옥시우리딘(IdU)을 사용하여 질량 세포분석 플랫폼에서 세포 주기 단계 설정

5-에티닐-2'-데옥시리딘(EdU) 및 인산히스톤 H3(pH3) 라벨링을 함유한 세포 주기 분석은 광범위한 최적화를 요구할 수 있는 다단계 절차이다. 여기서는 상이한 세포 주기 단계에서 세포를 구별하기 위해 이미지 분석 및 정량화를 포함한 이 절차에 대한 모든 단계를 설명하는 상세한 프로토콜을 제시합니다.

Drosophila 신경 줄기 세포에서 세포 주기 진행 분석을 위한 5-에티닐-2'-Deoxyuridine/인성-히스톤 H3 이중 라벨링 프로토콜

D-루프 포획(DLC) 및 D-루프 확장(DLE) 분석은 정량적 PCR과 함께 근접 결찰 원리를 활용하여 사카로마이세스 세레비시아에서 유도성 이중 가닥 절단 부위에서 D-루프 형성, D-루프 확장 및 생성물 형성을 정량화합니다.

사카로마이세스 세레비시아에서 근접 결찰 및 정량적 PCR을 통한 상동 재조합 중간체의 검출

타임 랩스 현미경은 신진 효모에서 감수 분열을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 프로토콜은 세포 주기 동기화, 타임랩스 현미경 검사 및 표적 단백질의 조건부 고갈을 결합하여 감수 분열 염색체 분리 동안 특정 단백질의 기능을 연구하는 방법을 설명하는 방법을 설명합니다.

S. cerevisiae에서 감수 분열을 연구하기 위해 타임 랩스 현미경 및 단백질의 단계 별 핵 고갈 사용

다음 프로토콜은 세포주기 동기화 후 RPA2 면역형광 염색을 사용하여 세포주기의 G1 단계에서 단일 가닥 DNA 병소를 검출하는 방법을 제시합니다.

세포 주기의 G1 단계에서 단일 가닥 DNA 병소 시각화

단백질 관련 신생 DNA의 풍부화 및 시퀀싱(eSPAN)은 두 개의 복제 DNA 가닥에서 염색질 관련 단백질의 상대적 풍부도를 검출하기 위해 개발되었으며, 이를 통해 염색질 복제와 그 결합 과정에 대한 분자적 통찰을 밝혀냈습니다. 이 프로토콜은 효모 및 마우스 배아 줄기(ES) 세포에서의 eSPAN 절차를 설명합니다.

단백질 관련 신생 DNA 농축 및 시퀀싱을 통한 DNA 복제 가닥 단백질의 가닥 특이적 분석

RNA 2차 구조는 주로 구조 탐사 방법을 통해 성숙한 RNA에서 관찰되었습니다. 공동전사구조추적시퀀싱(CoSTseq)은 핵 런온을 구조 탐지와 결합하여 신생 RNA의 중합효소 위치를 연구하는 데 사용되었습니다. CoSTseq는 활성 전사 상태에서 RNA 내 RNA 2차 구조를 관찰할 수 있게 합니다.

Saccharomyces cerevisiae에서 신생 및 성숙 전사체의 RNA 구조 비교 분석

배우세요 Saccharomyces cerevisiae에서 EdU 혼입과 Click 화학을 이용한 S상 지속 시간 측정법을. 이 방법은 DNA 복제 결함을 정밀하게 감지하여 세포 주기 연구에 활용됩니다.

사카로마이세스 세레비시아에 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 혼입을 사용한 S상 지속 시간 측정

더 많은 동영상 탐색