Name: Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells에서 망막 오가노이드 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 배우세요 hiPSC에서 신경망막 오가노이드를 분화시키는 효율적인 방법을. 부착 및 현탁 배양을 활용하여 망막 오가노이드와 RPE 세포를 선택적으로 분리하고 풍부하게 할 수 있습니다. 이 기술은 망막 퇴행성 질환 연구와 세포 기반 치료 개발에 유용한 모델을 제공합니다.

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저자는 유전학자인 Dr. Chitra Kannabiran의 과학적, 기술적 지원을 인정합니다. Subhadra Jalali 박사, 망막 컨설턴트; Milind Naik 박사, 안과 성형 외과 의사; 하이데라바드에 있는 LV Prasad Eye Institute의 안과 종양 전문의인 Dr. Swathi Kaliki는 정상 및 환자 맞춤형 iPSC 라인 생성을 위해 노력하고 있습니다. 저자는 과학 및 공학 연구위원회, 과학 기술부 (IM), (SB / SO / HS / 177 / 2013), 생명 공학부 (IM), (BT / PR32404 / MED / 30 / 2136 / 2019) 및 ICMR (S.M., D.P.), UGC (TA) 및 CSIR (V.K.P.), 인도 정부의 선임 연구원.

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<li>Chichagova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+retinal+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95(2019).</li>
<li>Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+development+of+rod+photoreceptors+in+retinal+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+by+supplementation+with+9-cis+retinal%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100033(2020).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP%2C+TGFbeta+and+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Mellough, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF-1+signaling+plays+an+important+role+in+the+formation+of+three-dimensional+laminated+neural+retina+and+other+ocular+structures+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).</li>
<li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li>
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모든 저자는 이해 상충이나 재무 공개가 없습니다.

hiPSC는 시험관 내에서 장기 및 조직 발달을 연구하는 강력한 도구입니다. 건강한 hiPSC와 질병 특이적 hiPSC를 망막 계통으로 구별하여 질병 표현형을 요약하면 다양한 형태의 유전성 망막 이영양증의 병태생리학에 대한 새로운 통찰력을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. PSC를 망막 세포 유형으로의 시험관 내 분화를 위해 여러 프로토콜이 설명되고 채택되었습니다. 대부분은 N1, N2 및 B27 보충제와 같은 재조합 성장 인자, 보충제, 소분자 및 시약의 복잡한 칵테일을 포함하는 배양 배지의 사용을 포함합니다. BMP 및 TGFβ 신호전달 차단제, 예컨대 Noggin, SB431542, LDN193189, 및 폴리스타틴, 또는 유도제, 예컨대 Activin A, Lefty, 및 IDE1; DKK1, SFRP, IWP-2 및 IWR-1-endo와 같은 표준 Wnt 신호 차단제 또는 CHIR99021, SB216763 및 CKI-7과 같은 유도제; FGF 수용체 신호전달 차단제, 예컨대 PD0325...

망막은 척추동물의 눈 뒤쪽에 존재하는 빛에 민감한 조직으로, 광전달 경로로 알려진 생화학적 현상에 의해 빛 신호를 신경 자극으로 변환합니다. 망막의 광수용체 세포에서 생성된 초기 신경 자극은 다른 망막 중간 뉴런과 망막 신경절 세포(RGC)로 변환되어 뇌의 시각 피질에 도달하여 이미지 인식 및 시각 반응을 돕습니다.
세계보건기구(WHO)에 따르면 약 150만 명의 어린이가 맹인이며 그 중 100만 명이 아시아에 있습니다. 유전성 망막 이영양증(Inherited Retinal Dystrophy, IRD)은 전 세계 인구 4,000명 중 1명에게 영향을 미치는 주요 실명 질환이며1,2,3, 개발도상국에서는 연령 관련 황반변성(AMD)과 관련된 실명 유병률이 0.6%-1.1%에 이른다4. IRD는 망막 발달 및 기능에 관여하는 300개 이상의 서로 다른 유전자의 유전적 결함에 의해 발생한다5. 이러한 유전적 변화는 정상적인 망막 기능의 파괴와 망막 세포, 즉 광수용체 세포와 망막 색소 상피(RPE)의 점진적인 퇴행을 초래하여 심각한 시력 상실 및 실명을 초래합니다. 각막, 수정체 등과 관련된 다른 실명 상태에서 엄청난 진전이 이루어졌습니다. 그러나 망막 이영양증과 시신경 위축은 현재까지 입증된 치료법이 없습니다. 성체 인간 망막에는 줄기세포가 없기 때문에6, 배아줄기세포(ESC)와 환자 유래 유도만능줄기세포(iPSC)와 같은 대체 공급원은 원하는 세포 유형을 무제한으로 공급할 수 있으며, 체외 질환 모델링 연구 및 재생 요법 개발에 필요한 복잡한 조직 오가노이드 개발에 큰 가능성을 지니고 있다7. 8,9,10.
수년간의 망막 연구를 통해 초기 망막 발달을 조율하는 분자 사건에 대한 더 나은 이해가 이루어졌습니다. PSC에서 망막 세포와 3D 오가노이드를 생성하는 대부분의 프로토콜은 알려진 생물학적 과정을 단계적으로 조절하기 위해 성장 인자와 소분자의 복잡한 칵테일에서 세포를 배양함으로써 시험관 내에서 이러한 발달 사건을 요약하는 것을 목표로 합니다. 이렇게 생성된 망막 오가노이드는 망막 신경절 세포(RGC), 중간 뉴런, 광수용체 및 망막 색소 상피(RPE)와 같은 주요 망막 세포로 구성됩니다.11,12,13,14,15,16,17,18,19. 망막 오가노이드를 사용하여 IRD를 모델링하려는 성공적인 시도에도 불구하고, 분화 중 성장 인자와 소분자의 복잡한 칵테일에 대한 요구 사항과 망막 오가노이드 생성의 상대적으로 낮은 효율은 대부분의 프로토콜에서 주요 과제를 제기합니다. 그들은 주로 배아체의 형성을 포함하고, 시험관 내 발달의 여러 단계에서 복잡한 배양 조건을 사용하여 망막 계통으로의 단계적 분화를 포함합니다20,21,22.
여기에서는 건강한 대조군 및 망막 질환 특이적 hiPSC에서 복잡한 3D 신경-망막 오가노이드를 개발하는 간단하고 강력한 방법이 보고되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 배아체 형성 없이 거의 합류에 가까운 hiPSC 배양의 직접적인 분화를 활용합니다. 또한 배양 배지의 복잡성이 단순화되어 새로운 연구자들이 쉽게 채택할 수 있는 비용 효율적이고 재현 가능한 기술입니다. 여기에는 망막 분화의 처음 4주 동안 뚜렷하고 자기 조직화된 안구 필드 원시 클러스터(EFP)가 출현할 때까지 부착성 단층 배양으로 구성된 하이브리드 배양 시스템이 포함됩니다. 또한, 각 EFP 내의 원형 신경-망막 섬을 수동으로 채취하여 1-2주 동안 현탁 배양에서 성장시켜 PAX6+ 및 CHX10+ 증식 신경-망막 전구체로 구성된 다층 3D 망막 컵 또는 오가노이드를 준비합니다. 100μM 타우린 함유 배지에서 추가로 4주 동안 망막 오가노이드를 장기간 배양한 결과 RCVRN+ 및 CRX+ 광수용체 전구체와 기본적인 내부 세그먼트 유사 확장을 가진 성숙 세포가 출현했습니다.

<table><tbody><tr><td>0.22 & 마이크로; m 주사기 필터</td><td>TPP</td><td>99722&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원심분리기 튜브</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>6 well plates</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Chx10 항체; 마우스 단클론</td><td>Santa Cruz</td><td>SC365519</td><td>1:50 희석</td></tr><tr><td>Anti-CRX 항체; 토끼 단클론</td><td>Abcam</td><td>ab140603</td><td>1:300 희석</td></tr><tr><td>Anti-MiTF 항체, 마우스 단클론</td><td>Abcam</td><td>ab3201</td><td>1:250 희석</td></tr><tr><td>Anti-Recoverin 항체; 토끼 다클론성&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Millipore</td><td>AB5585</td><td>1:300 희석</td></tr><tr><td>B-27 보충제(50개), 무혈청</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar(50mL)</td><td>Tarson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel hESC 인증 매트릭스</td><td>코닝</td><td></td><td></td>354277</tr><tr><td>CryoTubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>V7884</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium)</td><td>Thermo Fisher</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA polymerase</td><td>Thermo Fisher</td><td>EP0709</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco' s 인산염 완충 식염</td>수 <td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>필수 8 매체 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Not TC-treated Petri Dish, 60 mm&nbsp;</td><td>코닝</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>태아&nbsp; 소&nbsp; 혈청, 자격, 미국&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>GelDocXR+와 이미지 랩 소프트웨어</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td>Agarose Gel 문서화 시스템&nbsp;</td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>염소 항 마우스 IgG (H + L), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>1 : 300 희석</td></tr><tr><td>염소 항 마우스 IgG (H + L), Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td>1 : 300 희석</td></tr><tr><td>염소 항 토끼 IgG (H + L), Alexa Fluo 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td>1 : 300 희석</td></tr><tr><td>염소 항 토끼 IgG (H + L), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:300 희석</td></tr><tr><td>HistoCore MULTICUT</td><td>Leica</td><td></td><td>For sectioning</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-Acsorbic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>N2 보충제 (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>RNA</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>퀄리겐</td><td>23995</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫, 9인치, 비멸균, 언플러그</td>드 <td>코닝</td><td>7095D-9</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>재조합 Anti-Otx2 항체, 토끼 단클론</td><td>Abcam</td><td>ab183951</td><td>1:300 희석</td></tr><tr><td>재조합 Anti-PAX6 항체; Rabbit Monoclonal</td><td>Abcam</td><td>ab195045</td><td>1:300 희석</td></tr><tr><td>재조합 Anti-RPE65 항체, Rabbit Monoclonal</td><td>Abcam</td><td>ab231782</td><td>1:300 희석</td></tr><tr><td>재조합 인간 Noggin 단백질</td><td>R& D Systems</td><td>6057-NG</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>혈청 피펫 10 mL</td><td>TPP</td><td>94010</td><td></td></tr><tr><td>혈청 피펫 5 mL</td><td>TPP</td><td>94005</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>구연산 나트륨 삼염 이수화물</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Starfrost ( 실란 코팅) 현미경 슬라이드</td><td>Knittel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Thermo Fisher</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&nbsp; 시약</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI&nbsp;</td><td>벡터 연구소</td><td>H-1200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A27940</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td><td>Zeiss</td><td></td><td>컨포칼 현미경</td></tr></tbody></table>

healthy and retinal disease-specific human-induced pluripotent stem cells에서 망막 오가노이드 생성

Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells

만능 줄기 세포는 체외 질병 모델링 연구 및 재생 요법 개발에 유용한 복잡한 조직 오가노이드를 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 망막 분화의 처음 4주 동안 뚜렷하고 자가 조직화된 안구 필드 원시 클러스터(EFP)가 출현할 때까지 부착성 단층 배양으로 구성된 하이브리드 배양 시스템에서 망막 오가노이드를 생성하는 더 간단하고 강력하며 단계적인 방법을 설명합니다. 또한, 각 EFP 내의 도넛 모양, 원형 및 반투명 신경-망막 섬을 수동으로 채취하여 망막 분화 배지에서 1-2주 동안 비부착성 배양 접시를 사용하여 현탁액 하에서 배양하여 다층 3D 광학 컵(OC-1M)을 생성합니다. 이 미성숙 망막 오가노이드는 PAX6+ 및 ChX10+ 증식, 다능성 망막 전구체를 함유하고 있습니다. 전구체 세포는 오가노이드 내에서 선형적으로 자가 조립되며 뚜렷한 방사형 줄무늬로 나타납니다. 현탁 배양 후 4주에 망막 전구체는 유사분열 후 정지 및 계통 분화를 거쳐 성숙한 망막 오가노이드(OC-2M)를 형성합니다. 광수용체 계통 커밋된 전구체는 망막 오가노이드의 가장 바깥쪽 층 내에서 발생합니다. 이러한 CRX+ 및 RCVRN+ 광수용체 세포는 형태학적으로 성숙하여 내부 세그먼트와 같은 확장을 표시합니다. 이 방법은 인간 배아 줄기 세포(hESC)와 유도만능 줄기 세포(iPSC)를 사용하여 망막 오가노이드를 생성하는 데 채택할 수 있습니다. 모든 단계와 절차는 복제 가능성을 보장하고 기초 과학 및 중개 연구에서 더 넓은 응용 분야를 위해 명확하게 설명되고 시연됩니다.

hiPSC를 눈 계통으로 분화하는 것은 그림 1에 설명된 바와 같이 보충제와 성장 인자를 포함하는 다양한 배양 배지에서 세포를 서로 다른 시점에서 순차적인 단계로 배양함으로써 달성됩니다. 상기 hiPSC 배양물은 만능줄기세포 유지 배지인 Essential 8 배지에서 유지된다. 70%-80% 밀도에 도달하면(그림 2A), 배지는 0일(3.2단계 참조)에 1ng/mL bFGF, 1ng/mL Noggin 및 1% N2 보충제를 포함하는 분화 유도 배지(DIM)로 교체됩니다. 신경 유도 N2 보충제와 함께 BMP 신호 전달 억제제 인 Noggin은 중배엽 및 내배엽 투입을 차단하여 세포를 신경 외배엽 계통으로 유도하는 데 중요한 역할을합니다. 1일, 2일,3 일에 Noggin의 농도가 10 ng / mL로 증가합니다 (3.3 및 3.4 단계 참조). 4일째</s...

이 프로토콜은 hiPSC를 안구 클러스터로 분화하고 부착 및 현탁 배양 시스템을 모두 포함하는 단순화된 배양 조건을 사용하여 신경-망막 오가노이드를 생성하는 효율적인 방법을 설명합니다. RPE 및 각막 상피와 같은 다른 안구 세포 유형도 망막 배양의 성숙한 안구에서 분리할 수 있습니다.

Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells에서 망막 오가노이드 생성

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative ...

이 프로토콜은 연구 및 재생 응용 분야를 위해 인간 IPC를 복잡한 3차원 신경 망막 오가노이드로 구별하는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 기술은 부착 배양과 현탁 배양을 모두 포함하며, 이를 통해 망막 오가노이드와 RP 세포 모두를 선택적으로 선별하고 농축할 수 있습니다. 망막 퇴행성 질환에 대한 세포 기반 치료법을 개발하기 위한 세포 공급원의 실행 가능하고 규칙적인 공급을 제공할 수 있습니다.이러한 줄기세포 유래 망막 오가노이드 및 RPE 세포는 눈 발달 및 유전성 망막 질환을 연구하기 위한 in vitro 모델로 유용하다. 이 방법은 이미 인간 IPSC 배양을 다루는 데 익숙한 연구실에서 쉽게 복제할 수 있습니다. 시각적 시연은 안구 식별과 공간적 위치 및 형태학적 특징을 기반으로 하는 신경 망막 컵의 분리를 크게 지원합니다.먼저, 6-웰 플레이트에서 70 내지 80%의 인간 IPSC 배양물을 흡인한다. PBS를 웰에 넣고 소용돌이 치고 세척 버퍼를 흡인합니다. 그런 다음 1 밀리리터의 세포 해리 용액 또는 CDS를 각 웰에 넣고 세포가 반올림 될 때까지 섭씨 37도에서 5-7 분 동안 플레이트를 배양합니다.CDS를 흡인하고 세포 현탁액을 15밀리리터 원심분리기 튜브에 수집합니다. 실온에서 4 분 동안 1, 000 RPM으로 튜브를 회전시킵니다. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 1.2 밀리리터의 Essential 8 배지에 재현탁합니다.200 마이크로리터의 세포 현탁액을 1.5 밀리리터의 IPSC 배양 배지 및 10 마이크로몰 Y27632를 함유하는 매트릭스-코팅된 6-웰 플레이트의 각 웰 내로 분배한다. 12 내지 24시간 후, 사용한 배지를 제거하고, Y27632 없이 예열된 완전한 상승 배지를 첨가하여 배양물을 유지한다. 배양이 70 내지 80% 합류에 도달할 때까지 24시간마다 배양 배지를 교체한다.0일째에 인간 IPSC 유지 배지를 흡인하고 밀리리터 BFGF당 1나노그램 및 밀리리터당 1나노그램 노긴을 포함하는 분화 유도 배지를 6웰 플레이트에 추가합니다. 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 첫째 날에, 소비 된 배지를 흡인하고 밀리 리터 BFGF 당 1 나노 그램 및 밀리리터 당 10 나노 그램 Noggin을 포함하는 분화 유도 배지를 추가하십시오.섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 세포를 다시 배양합니다. 2 일과 3 일째에 사용 된 배지를 제거하고 밀리 리터 당 10 나노 그램 Noggin을 함유 한 분화 유도 배지를 첨가하십시오. 6 웰 플레이트에 웰 배지 당 2 밀리리터를 첨가 한 후, 5 % 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37 도의 세포를 배양하고 24 시간마다 배지를 교체한다.4일째에 사용한 배지를 제거하고 망막 분화 배지 또는 RDM을 추가합니다. 동일한 절차에 따라 웰 배지 당 2 밀리리터를 6 웰 플레이트에 첨가하고 배양물을 배양합니다. 매일 매체를 변경하십시오.14일과 18일쯤에 초기 안구 전구체로 구성된 신경 로제트 유사 영역의 출현을 위해 10X 배율로 현미경으로 배양을 관찰합니다. 21일과 28일경에 4X 및 10X 배율로 현미경으로 배양을 관찰하여 신경 상피와 안구 표면 상피의 연속적인 파생물로 둘러싸인 원형 3D 신경 망막 구조의 중심 섬을 가진 자가 조직화된 별개의 EFP의 출현을 관찰합니다. 멸균 파스퇴르 피펫을 가지고 한 손에는 베이스를, 다른 한 손에는 모세관 끝을 잡습니다.유리가 유연해질 때까지 회전 운동으로 모세관 끝의 중간 근처 영역을 화염 살균하고 가열합니다. 그런 다음 화염에서 멀어지고 모세관 끝을 바깥쪽으로 빠르게 당겨 닫힌 내강이 있는 미세한 모세관 끝을 만듭니다. 가는 팁을 화염 앞에서 수평으로 잡고 바깥쪽으로 빠르게 화염을 통과시켜 부드러운 후크 또는 L자형 모세관 팁을 만듭니다.실체 현미경으로 모세관 후크의 부드러운 외부 곡률 영역을 미세한 스쿱으로 사용하여 개별 EFP에서 잘 형성된 신경 망막 컵을 수동으로 선택합니다. 25일과 30일에 4밀리리터의 미리 예열된 망막 분화 배지를 낮은 부착 60mm 접시에 넣고 배양하고 3D 망막 오가노이드를 생성하기 위한 망막 컵을 유지합니다. 이것은 신경 망막 컵을 채취하기 전에 수행해야 합니다.100마이크로리터를 흡인하기 위해 1밀리미터 마이크로피펫을 설정하고 넓은 구멍이 있는 1밀리리터 마이크로 팁을 사용하여 떠 있는 망막 컵을 흡인하고 이전에 준비한 신선한 저부착성 배양 접시에 옮깁니다. RDM의 망막 컵을 비부착성 현탁액 배양으로 유지하고 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양합니다. 30 일과 45 일에 부분 공급 방법에 따라 소비 된 배지의 부피를 절반으로 제거하고 동일한 양의 신선한 배지로 교체하십시오.45일과 60일에 신경 망막 전구체의 더 나은 생존과 계통 분화 및 성숙한 망막 세포 유형의 발달을 지원하기 위해 100마이크로몰 타우린을 함유한 RDM에서 추가로 2주 동안 망막 오가노이드를 배양합니다. 망막 오가노이드는 RT-PCR 및 면역조직화학을 사용하여 여러 망막 전구 마커의 발현을 위해 다양한 성숙 단계에서 특성화됩니다. RT-PCR 결과는 생후 1개월령의 망막 오가노이드와 생후 2개월령의 망막 오가노이드에서 망막 신경 마커의 유도 및 발현을 확인하였다.신경 망막 전구체 마커 Chx10, PAX6 및 Otx2에 대한 항체를 사용하는 미성숙 망막 오가노이드의 면역 표지 섹션과 광수용체 전구체 마커 recoverin 및 CRX에 대한 항체를 사용하는 성숙 망막 오가노이드의 공초점 이미지가 여기에 표시됩니다. 분화 광수용체 세포가 있는 망막 오가노이드의 표시된 가장 바깥쪽 층이 확대되어 이 이미지에 표시됩니다. 기본적인 내부 세그먼트와 같은 확장은 흰색 화살표로 표시됩니다.중앙에 신경 망막 컵이 있고 이동하는 RPE 파생물이 있는 EFP 클러스터는 앞쪽 가장자리를 따라 색소 침착을 나타냅니다. 신경 망막 섬 주변의 여러 EFP에서 잘 분화된 색소 상피 파생물이 여기에 표시됩니다. EFP의 더 높은 배율은 RPE 전구체의 이동 영역과 신경 망막 컵을 둘러싼 안구 표면 상피를 보여줍니다.색소 세포와 비색소 세포를 모두 포함하는 미성숙 RPE 세포의 단층을 발달시킨 확장된 부착 배양이 여기에 나와 있습니다. 완전히 성숙하고 착색된 RPE 세포의 단층 배양은 60일째에 조약돌 형태를 보여줍니다. PAX6, MITF 및 RPE65를 발현하는 RPE 세포가 이 그림에 나와 있습니다.이 이미지는 왜곡된 적층과 줄무늬가 없는 망막 전구체의 비정상적인 응집체가 있는 EFP를 나타냅니다. 미니어처 신경 망막 컵이 있지만 RPE의 주변 영역과 안구 표면 상피가 없는 EFP가 이 그림에 나와 있습니다. 대표 이미지는 현탁 배양에서 형성된 불규칙한 신경 망막 응집체를 보여줍니다.3-4주 이내에 안구의 효율적인 유도를 달성하기 위해 IPC의 거의 합류 성장 배양을 사용하여 분화 과정을 시작하는 것이 매우 중요합니다. 정상 및 환자 특이적 IPC에서 생성된 망막 오가노이드 및 RPE 세포는 망막 질환 모델 및 새로운 치료 약물 테스트에 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

전문된 망막 세포 pluripotent 줄기 세포의 생산은 망막 질환 줄기 세포 기반 치료의 발전에 있는 전환 점을. 현재 종이, 변환, 기본 및 임상 연구에 대 한 organoids 망막과 망막 색소 상피의 효율적인 생성을 위한 간단한 방법을 설명합니다.

정의 된 이종 무료 및 급지대 무료 문화 세대의 인간 iPSC 파생 된 망막 세포 모델에 대 한

여기에서 우리는 성숙한 인간 망막 오가노이드를 생성하고 이를 광수용체 독성 분석에 활용하여 연령 관련 망막 퇴행성 질환 황반 모세혈관확장증 2형(MacTel)에 대한 제약 후보를 식별하는 단계별 프로토콜을 제시합니다.

제약 발견을 위한 인간 망막 오가노이드의 독성 스크리닝

자기 조직화 방법을 사용하여 광 수용체의 생성을 크게 증가시킬 수있는 COCO를 첨가 한 프로토콜을 개발합니다.

인간 만능 줄기 세포에서 망막 오가노이드의 지시 유도

여기서 우리는 다양한 인간 다능성 줄기 세포주에 적합한 최적화된 망막 오르간성 유도 시스템을 설명하여 높은 재현성과 효율성을 가진 망막 조직을 생성합니다.

인간 다능성 줄기 세포에서 3D 망막 조직의 파생을 위한 망막 오르간로이드 유도 시스템

본 프로토콜은 높은 반복성과 효율성으로 망막 오가노이드의 접착 및 융합을 감소시키는 최적화된 3D 신경 망막 유도 시스템을 설명합니다.

인간 만능 줄기세포에서 신경 망막 생성

줄기세포 유래 망막 색소 상피(RPE) 세포는 망막 변성을 위한 세포 기반 치료, 질병 모델링 및 약물 연구를 포함한 여러 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 여기에서는 줄기세포에서 RPE를 재현성 있게 유도하기 위한 간단한 프로토콜을 제시합니다.

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

이 보고서의 목적은 배아 체의 다른 크기를 이용하여 유도 된 다 능성 줄기 (IPS) 세포로부터 망막 색소 상피 (RPE)를 도출하는 프로토콜을 기술한다.

배아의 몸의 다른 크기에 의해 유도 다 능성 줄기에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 도출 (IPS) 세포

이 원고는 뽑은 모발에서 인간 각질세포를 유도 및 유지하고 우발적 벡터에 의한 통합이 없는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)를 후속 생성하기 위한 단계별 절차를 제공합니다.

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

여기에 제시된 방법은 다 능성 줄기 세포로부터 인간 간세포 - 유사 세포를 생성하기 위해 확장 및 우수 제조 기준 (GMP) 레디 분화 시스템을 설명한다. 이것은 기초 및 응용 연구 인간 간 인간 간세포 - 유사 세포를 생성하기위한 비용 효과적이고 표준화 된 시스템으로서 작용한다.

정의 및 간세포와 같은 세포의 확장 성 생성 인간 다 능성 줄기 세포에서

배우세요 hiPSC에서 신경망막 오가노이드를 분화시키는 효율적인 방법을. 부착 및 현탁 배양을 활용하여 망막 오가노이드와 RPE 세포를 선택적으로 분리하고 풍부하게 할 수 있습니다. 이 기술은 망막 퇴행성 질환 연구와 세포 기반 치료 개발에 유용한 모델을 제공합니다.

Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells에서 망막 오가노이드 생성

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