Name: 새로운 3D 프린팅 홀더를 사용한 온전한 생체 외 구체의 라이브 셀 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: 배우세요 3D 프린팅 홀더를 사용한 생체 외 각막 구체의 라이브 셀 이미징 방법을 통해 손상된 각막 상피의 실시간 칼슘 신호 활동을 관찰하는 기술입니다.

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동물 피험자와 관련된 절차는 안과 치료 및 시력 연구에서 동물 사용을위한 시력 및 안과 연구 협회 및 보스턴 대학 IACUC 프로토콜 (201800302)의 승인을 받았습니다.
1. 3D 프린팅 홀더 및 커버 바 디자인
<ol><li>마우스 글로브의 평균 직경을 고려하여 3D 프린팅된 홀더와 커버 바를 설계하고 디자인을 3D 프린팅합니다(그림 1A, B).</li>
	<li>개별 마우스의 다양한 크기를 설명하기 위해 홀더의 내벽 직경을 지구의 평균 직경보다 약간 크게 유지하십시오. 홀더의 높이를 지구 직경의 약 절반으로 유지하여 3D 인쇄 커버 바에 고정할 때 지구본이 꼭 맞도록 합니다.</li>
	<li>홀더 덮개 막대의 크기를 홀더 직경의 1/4에서 1/2 너비로 홀더 외경의 길이에 맞춥니다. 커버 바는 실험이 끝날 때 수화 및 눈 제거를 위해 홀더에 고정될 때 지구본에 접근할 수 있는 크기입니다.</li>
	<li>홀더와 커버 바를 인쇄합니다.</li>
</ol>2. 샘플 수집
<ol><li>기관 지침에 따라 확립된 프로토콜을 사용하여 마우스(9-12주 및 27주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 이 연구에 사용함)를 안락사시킵니다. 이 프로토콜의 경우 이산화탄소로 안락사를 수행 한 후 참수하십시오.</li>
	<li>마우스 머리를 제거하고 즉시 얼음 위에 놓아 조직의 생존력을 보존하십시오. 해부 도구를 사용하여 지구본을 핵을 제거하고 조직 손상을 방지합니다.</li>
	<li>핀셋을 사용하여 지구를 보호하십시오. 핀셋으로 잡은 곳 바로 아래에 해부 가위를 사용하여 시신경을 자릅니다. 알림: 추가 예방 조치를 위해 층류 후드에서 다음 단계를 수행하십시오.</li>
	<li>저조도 조건의 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 칼슘 지시약 및/또는 세포막 염색이 포함된 p35 세포 배양 접시에 2mL의 배지에 글로브를 배양합니다. 균일한 염색을 위해 글로브가 염색 매체에 잠겨 있는지 확인하십시오.<ol><li>여기에서 수행된 실험의 경우 칼슘 지시약인 Fluo4-AM (1:100)2 및 세포막 카운터 염색, 진한 적색 원형질막 염색(1:10,000)2, 최종 농도가 1%(v/v) DMSO 및 0.1%(w/v) 플루론산인 각질세포 무혈청 배지(KSFM) 2mL에 다음 성장 보조제와 함께 사용하십시오: 25μg/mL 소 뇌하수체 추출물, 0.02 nM 표피 성장 인자, 0.3 mMCaCl2 및 페니실린-스트렙토 마이신 (각각 100 단위 / mL 및 100 μg / mL). 참고: 배양 조건과 시간은 칼슘 지시약, 조직 유형 및 샘플 부피에 따라 다릅니다. 플루론산을 사용할 때는 조직 투과성을 제공하므로 주의가 필요합니다. 이 프로토콜은 10 % 플루 론산을 요구합니다. 낮은 농도의 플루 론산은 실험적으로 효과가없는 것으로 결정되었으며, 높은 농도는 조직에 손상을 줄 위험이 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 시료 홀더의 준비
<ol><li>홀더를 이전에 사용하지 않은 접착제로 깨끗한 유리 바닥 커버 슬립에 부착하십시오. 이 프로토콜에 사용되는 접착제는 무균을 보장하기 위해 일회용 용기에서 나오며 매번 개봉하지 않은 새 용기가 사용됩니다.</li>
	<li>홀더를 70 % 에탄올로 씻으십시오. 홀더에 접착제를 바르고 홀더를 유리 바닥 커버슬립에 부착합니다. 접착제가 형광을 발하여 이미징을 복잡하게 만들 수 있으므로 홀더의 내부 영역 내에 접착제가 없는지 확인하십시오.</li>
	<li>접착제가 고형화 될 때까지 기다리십시오. 홀더가 커버슬립에 고정되어 있는지 확인하십시오. 참고: 유리 바닥 커버슬립이 있는 P35 셀 플레이트가 이 원고에 제시된 실험에 사용되었습니다. 다른 유리 바닥 슬라이드 및/또는 플레이트는 실험의 필요에 따라 대체될 수 있습니다.</li>
</ol>4. 눈 구체의 상처
<ol><li>멸균 점안기를 사용하여 염색 용액에서 지구본을 제거하고 관심 부위의 조직 손상을 방지하도록 주의하십시오. 멸균 인산염 완충 식염수를 사용하여 실온에서 5분 동안 글로브를 세척하여 과도한 얼룩을 제거하고 글로브를 배지에 넣어 현미경으로 운반합니다.</li>
	<li>관심 부위에 멸균 된 25G 바늘을 사용하여 지구본을 감습니다.<ol><li>멸균 점안기를 사용하여 눈 뒤쪽에서 지구본을 집어 들고 잡습니다. 이렇게 하면 지구본이 안정적으로 유지되고 구르는 것을 방지하며 일관된 상처가 생길 수 있습니다. 이 설정을 사용하면 시신경이 스포이드 노즐 내부에 있고 각막이 바깥쪽을 향하게됩니다.</li>
		<li>긁힌 상처의 경우 멸균 된 25G 바늘을 노출 된 각막을 가로 질러 부드럽게 움직입니다. 찔린 상처의 경우 바늘을 중앙 각막으로 직접 부드럽게 누르십시오. 상처가 각막을 뚫지 않도록하십시오. 참고: 실험에 상처 반응 또는 상처 환경이 필요하지 않은 경우 이 단계를 건너뜁니다. 이전 연구에 따르면 이 방법을 사용하여 만든 쥐 각막의 긁힌 상처와 찔린 상처는 직경과 깊이10 모두에서 일치합니다. 독립적 인 구체 사이의 상처 치수 확인은 관심 영역 분석을 사용하여 수행되었습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 홀더에 샘플 배치
<ol><li>각막 또는 윤부 부위를 홀더 내부 영역의 커버 슬립에 놓고 3D 인쇄 커버를 사용하여 안정화합니다(그림 1C-H).</li>
	<li>지구본이 올바른 위치에 있고 관심 부위가 유리 커버슬립과 접촉하고 있는지 확인합니다. 지구본을 홀더에 넣은 후에는 조직 손상을 일으킬 수 있으므로 지구본을 제거하지 마십시오.</li>
	<li>접착제를 사용하여 3D 인쇄 커버를 홀더에 부착하여 안정화를 보장합니다. 커버 바가 지구본이 아닌 홀더에 부착되는지 확인하십시오. 참고: 이미징할 영역은 프로토콜이 도립 현미경에서 사용하도록 작성되었기 때문에 아래로 배치됩니다. 이 프로토콜은 내부 반경이 더 작은 홀더와 커버 바 제거를 사용하는 정립 현미경에 맞게 조정할 수 있습니다. 이로 인해 지구 안정화가 줄어 듭니다.</li>
</ol>6. 샘플 이미징
<ol><li>현미경과 환경 챔버를 켜고 챔버가 가습되었는지 확인합니다. 실험 기간 동안 환경 챔버를 35°C 및 5%CO2 로 설정하였다. 참고: 이 절차에는 탈수를 방지하고 지구를 최적의 온도로 유지하기 위해 환경 챔버가 있는 현미경이 선호되지만 필수는 아닙니다.</li>
	<li>커버슬립, 홀더 및 안정화된 지구본을 환경 챔버 내의 현미경 스테이지에 놓고 라이브 셀 이미징 기술을 사용하여 이미지를 만듭니다9.</li>
	<li>탈수를 방지하고 조직 생존력을 유지하기 위해 커버슬립에 추가 성장 배지를 피펫팅합니다. 홀더의 지구본을 덮을 수 있는 충분한 매체가 우물에 있는지 확인하십시오. 이미징 기간에 따라 실험 전반에 걸쳐 필요할 때 새 배지를 추가합니다.</li>
	<li>라이브 셀 이미징 기술 및 프로토콜을 사용하여 실험을 시작합니다. 저전력 레이저 설정을 사용하여 조직을 보존하고 장기 실험에서 조직 손상을 방지합니다. 긴 작동 거리에 적절한 대물렌즈를 사용하십시오. 이 원고의 실험은 20x 대물렌즈를 사용하여 수행되었습니다. 참고: 레이저 출력 및 게인, 실험 기간, 위치 및 이미징 평면은 모두 실험 매개변수에 따라 달라집니다. 1 시간에서 4 시간 사이의 손상되지 않은 지구본에 대한 이미징 실험은 과거 간행물10에서 성공적으로 수행되었습니다.</li>
	<li>원하는 파일 형식으로 데이터를 기록하고 저장합니다. 현미경에 의해 사용되는 소프트웨어는 데이터 기록을위한 .czi 파일을 생성합니다.</li>
	<li>프로토콜 끝에 있는 표준 기관 프로토콜에 따라 지구본을 폐기하십시오.</li>
</ol>

<ol><li>Kneer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+induces+pre-type+2+diabetes+with+regional+changes+in+corneal+sensory+nerves+and+altered+P2X7+expression+and+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization.</a> Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+Ca2%2B+mobilizations%3A+A+quantitative+approach+to+predict+their+importance+in+cell-cell+communication+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing.</a> PLoS One. 14 (4), 0213422(2019).</li>
<li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).</li>
<li>Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+but+not+gap+junctions+play+a+role+in+injury-induced+Ca2%2B+waves+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+changes+in+Ca%282%2B%29+mobilization+and+protein+phosphorylation+implicated+in+impaired+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).</li>
<li>Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2Y2+receptor+mediates+the+epithelial+injury+response+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).</li>
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<li>Segars, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+dependent+changes+in+corneal+epithelial+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721(2022).</li>
<li>Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+epithelial+and+stromal+corneal+stiffness+occur+with+age+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity.</a> Bioengineering. 7 (1), 14(2020).</li>
<li>Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinoreceptor+P2X7+regulation+of+Ca%282%2B%29+mobilization+and+cytoskeletal+rearrangement+is+required+for+corneal+reepithelialization+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury.</a> The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).</li>
<li>Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+euthanasia+and+enucleation+on+mouse+corneal+epithelial+axon+density+and+nerve+terminal+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology.</a> The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).</li>
</ol>

우리는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

이 프로토콜은 3D 프린팅 홀더를 사용하여 손상되지 않은 동물의 눈을 안정화하고 고정시키는 라이브 셀 이미징 기술을 설명합니다. 이는 생체 외 각막 조직의 이전 라이브 셀 이미징 프로토콜에서 인식된 몇 가지 중요한 단점을 우회하도록 설계되었습니다. 이 프로토콜은 온전한 구체의 라이브 셀 이미징에 많은 이점을 제공합니다. 실험적으로 유도 된 스크래치 상처에 대한 상처 치유 반응을 방해 할 수있는 불필요한 조직 손상을 크게 줄입니다. 여기에는 해부 및 자외선 노출로 인한 신경 및 상피 손상이 포함됩니다. 또한, 이 프로토콜은 성장 배지가 실험의 중단 없이 주기적으로 적용될 수 있도록 하는 방식으로 조직을 고정시킴으로써 조직 수화 및 생존성을 촉진합니다. 홀더에서 눈의 방향을 변경함으로써 프로토콜은 지구상의 다른 영역의 이미징을 허용합니다. 이 프로토콜과 함께 컨포칼 현미경을 사용하면 지구의 다른 평면을 이미징할 수 있으므로 조직 구조 간의 상호 작용을 관찰할 수 있습니다. 이 프로토콜은 매우 다재다능하며 생쥐 및 기...

각막 각막은 눈의 앞쪽 표면을 덮고 있는 투명한 무혈관 구조로, 빛을 굴절시켜 시력을 가능하게 하고 눈 내부를 손상으로부터 보호합니다. 각막은 환경에 노출되기 때문에 기계적 원인(긁힘)과 감염으로 인한 손상을 받기 쉽습니다. 건강한 환자의 각막 손상은 일반적으로 1-3 일 이내에 치유됩니다. 그러나 윤부 줄기 세포 결핍 및 제 2 형 당뇨병을 포함한 기저 질환이있는 환자의 경우 각막 상처 치유 과정이 크게 연장 될 수 있습니다1. 각막이 고도로 신경이 분포되어 있기 때문에 이러한 치유되지 않는 각막 궤양과 재발성 각막 침식은 매우 고통스럽고 이를 경험하는 환자의 삶의 질을 크게 저하시킵니다1.
세포 신호 전달 건강한 각막이 손상되면 상처에 인접한 세포에서 칼슘 신호 이벤트가 선행되어 상처 침대로 세포 이동을 촉진하여 흉터 2,3의 위험없이 손상을 닫습니다. 이러한 신호전달 이벤트는 라이브세포 이미징을 사용하는 각막 상피 세포 배양 모델에서 잘 특성화되었습니다2. 예비 실험은 당뇨병 세포에 비해 비 당뇨병 세포에서 손상 후 훨씬 더 많은 칼슘 신호 전달을 보여줍니다. 그러나 생체 외 글로브에서 세포 신호 전달 이벤트의 특성 분석은 기술적 과제임이 입증되었습니다.
라이브 셀 이미징 이전 연구에서는 각막 상처 치유의 시험관 내 세포 배양 모델에서 칼슘 신호 전달 이벤트를 성공적으로 기록했습니다 4,5,6. 생체 외 조직에서 이러한 신호 이벤트의 고품질 이미지를 생성하는 방법론을 개발하는 것은 보다 복잡하고 실제와 같은 시스템에서 이러한 이벤트를 연구할 수 있기 때문에 큰 관심을 끌고 있습니다. 이전의 접근법은 각막의 해부에 이어 UV 유도 PEG 겔 7,8,9에서의 고정화를 포함하였다. 고정화는 살아있는 조직으로 작업할 때 필수적이지만 어려운 단계로, 실험 과정 내내 실행 가능하고 수분을 유지해야 합니다. 또한, 고정은 조직을 손상시키지 않아야합니다. PEG 용액이 조직을 고정화하는 동안, 생성된 이미지의 해상도와 품질은 일관되지 않았다. 따라서 3D 프린팅 홀더는 손상되지 않은 지구본을 고정하여 조직 손상 위험이 적은 고품질 이미지를 생성하기 위해 개발되었습니다.
접근 방식 고유한 3D 프린팅 홀더는 라이브 셀 이미징을 위해 손상되지 않은 생체 외 글로브를 고정하기 위해 개발되었습니다. 이 홀더는 두 가지 주요 원인으로 인한 손상을 방지합니다: 각막을 해부할 필요 없이 핵이 있는 지구를 이미징할 수 있고 자외선에 대한 노출을 제거합니다. 이러한 손상 원이 없으면 얻은 이미지는 실험적으로 만들어진 스크래치 부상에 대한 반응을보다 정확하게 나타냅니다. 또한 3D 인쇄 홀더는 쥐 눈의 정확한 치수로 보정되었습니다. 이는 PEG 용액에 고정화하는 것보다 훨씬 더 잘 맞았으며, 조직 움직임 감소로 인해 저전력 대물렌즈에서 더 높은 품질의 이미지를 얻을 수 있었습니다. 홀더 상단에 부착된 커버 바는 실험 기간 동안 지구가 움직이지 않고 수화와 생존력을 유지하기 위해 성장 배지를 적용할 때 지구본이 변위되지 않도록 합니다. 홀더를 정확한 치수로 인쇄 할 수있는 기능을 통해 연령이나 질병 상태로 인해 다양한 크기의 쥐 눈에 최적의 맞춤을 생성 할 수 있습니다. 이 기술은 크기에 따라 다른 종의 눈을 위한 홀더를 개발하는 데 보다 광범위하게 적용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1.75 블루 폴리락트산(PLA) 플라스틱</td><td>Creality(중국 선전)</td><td>N/A</td><td>홀더용 재료</td></tr><tr><td>35mm 접시, No. 1.5 커버슬립, 14mm 유리 직경, 폴리-D-라이신 코팅</td><td>MatTek Corporation(Ashland, MA)</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td>이미징용 우물.</td></tr><tr><td>Autodesk Fusion 360 소프트웨어</td><td>Autodesk(캘리포니아주 산라파엘).</td><td>N/A</td><td>홀더 인쇄에 사용되는 소프트웨어.</td></tr><tr><td>BD 25 G 7/8 멸균 바늘 일회용 100 바늘/상자</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>305124</td><td>지구본에 대한 실험적으로 유도된 상처의</td></tr><tr><td>경우 CellMask DeepRed</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>C10046</td><td>세포막 대조염색. 칼슘 지표. 1%(v/v) DMSO 및 0.1% (w/v) pluronic acid의 최종 농도를 가진 1:10,000</td></tr><tr><td>농도 Complete Home Super</td><td>Glue Walgreens (Deerfield, IL)</td><td>N/A</td><td>이미징 웰에 홀더를 부착하기 위한</td></tr><tr><td>Ender 3 Pro 3D 프린터&nbsp;</td><td>Creality (Shenzen, China)</td><td>N/A</td><td>홀더 인쇄용</td></tr><tr><td>FIJI/ImageJ</td><td>ImageJ (Bethesda, MD)</td><td>라이선스 번호: GPL2</td><td>소프트웨어관심 영역 분석을 사용하여 독립 글로브 간의 상처 깊이와 직경의 일관성을 확인하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>Fluo-4</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>F14201</td><td>칼슘 지시약.1:100 농도, 최종 농도 1%(v/v) DMSO 및 0.1%(w/v) 플루론산</td></tr><tr><td>케라티노사이트 무혈청 배지</td><td>Gibco (Waltham, MA)</td><td>17005042</td><td>25 mg/mL 소 뇌하수체 추출물, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2 및 페니실린-스트렙토마이신(100 units/mL, 100 &micro; 배지에 g/mL, 각) 첨가</td></tr><tr><td>Phophate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Corning, Medlabtech (Manassas, VA)</td><td>21-040-CV</td> AiryScan Zeiss (Thornwood, NY)N/A 20x 배율 대물렌즈를 사용한 Zeiss Confocal 880 Microscope를 <td>이미징하기 전에 각막의 과도한 얼룩을 씻어내는 데 사용</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

새로운 3d 프린팅 홀더를 사용한 온전한 생체 외 구체의 라이브 셀 이미징

Live-Cell Imaging of Intact Ex Vivo Globes Using a Novel 3D Printed Holder

각막 상피 상처 치유는 상피 세포에서 발현되는 퓨린 성 수용체의 활성화에 의해 시작되는 이동 과정입니다. 이 활성화는 세포에서 세포로 전파되는 칼슘 동원 이벤트를 초래하며, 이는 상처 침대로의 세포 운동성을 시작하여 효율적인 상처 치유를 촉진하는 데 필수적입니다. 트링카우스-랜달 연구실은 생체 외 쥐 구체에서 각막 상처 치유 반응을 실시간으로 이미징하는 방법론을 개발했습니다. 이 접근법은 확립 된 프로토콜에 따라 안락사 된 마우스에서 손상되지 않은 지구를 핵 제거하고 칼슘 지시제 염료로 지구를 즉시 배양하는 것을 포함합니다. 이 단계에서 세포의 다른 특징을 염색하는 카운터 염색을 적용하여 이미징을 돕고 세포 랜드 마크를 보여줄 수 있습니다. 이 프로토콜은 액틴을 염색하는 SiR 액틴과 세포막을 염색하는 진한 적색 원형질막 염색을 포함하여 카운터 염색에 사용되는 여러 가지 살아있는 세포 염료와 잘 작동했습니다. 상처에 대한 반응을 검사하기 위해 25G 바늘을 사용하여 각막 상피를 손상시키고 지구본을 3D 인쇄 홀더에 넣습니다. 3D 프린팅 홀더의 치수는 실험 기간 동안 지구본의 고정을 보장하도록 보정되며 다양한 크기의 눈을 수용하도록 수정할 수 있습니다. 상처 반응의 라이브 셀 이미징은 컨포칼 현미경을 사용하여 시간이 지남에 따라 조직 전체에 걸쳐 다양한 깊이에서 연속적으로 수행됩니다. 이 프로토콜을 사용하면 컨포칼 현미경에서 20x 공기 대물렌즈를 사용하여 고해상도 출판 품질의 이미지를 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 다른 목표도 사용할 수 있습니다. 이는 생체 외 뮤린 글로브에서 생세포 영상의 품질을 크게 개선했으며 신경과 상피의 식별을 허용합니다.

이 프로토콜은 출판물 품질의 데이터 및 이미지를 일관되게 생성하는데 사용되어 왔다(10). 얻은 이미지는 이전 접근 방식과 비교할 때 상당한 개선을 나타냅니다(그림 2). 3D 프린팅 홀더를 사용하여 각막 층 전체에서 이미지를 캡처하고 다양한 Z 평면에서 칼슘 동원을 관찰할 수 있습니다(그림 3). 이 접근법은 젊은 마우스와 늙은 마우스의 상처에서 정점 및 기저 세포층 사이의 세포-세포 신호 전달을 비교하기 위해 사용되었습니다10.
향상된 안정성은 또한 이전보다 훨씬 더 오랫동안 지구본을 이미징할 수 있게 했습니다. 이를 통해 상처 침대로의 세포 이동에 대한 연구가 이전 능력보다 몇 시간 연장 될 수있었습니다. 이러한 연장된 타임라인으로, 각막 손상 후 젊은 마우스와 늙은 마우스 사이의 상...

본 연구는 핵이 있는 구체의 고해상도 라이브 셀 이미징을 가능하게 하기 위해 3D 프린팅 홀더를 활용하는 새로운 실험 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜을 통해 생체 외 글로브 에서 상처 입은 각막 상피의 세포 칼슘 신호 전달 활성을 실시간으로 관찰 할 수 있습니다.

새로운 3D 프린팅 홀더를 사용한 온전한 생체 외 구체의 라이브 셀 이미징

Corneal epithelial wound healing is a migratory process initiated by the activation of purinergic receptors expressed on epithelial cells. This activation ...

이 프로토콜에 사용되는 3D 프린팅 홀더를 사용하면 상처 입은 각막의 단기 세포 신호 전달 및 장기 세포 이동 이벤트를 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다. 지구를 온전하고 실행 가능하며 움직이지 않게 유지함으로써 이 프로토콜은 상피와 신경을 포함한 각막 세포의 고품질 라이브 이미지를 생성합니다. 3D 프린팅 홀더는 다양한 크기와 종의 지구본에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다.또한 다른 영역을 이미지화하거나 나노 압흔 실험을 수행하기 위해 눈의 방향을 다르게 지정할 수도 있습니다. 시작하려면 안락사 된 마우스의 머리를 제거한 후 즉시 얼음 위에 놓아 조직의 생존력을 보존하십시오. 그런 다음 핀셋을 사용하여 지구본을 졸려서 핵을 공급하십시오.그리고 핀셋으로 잡히는 곳 바로 아래에 해부 가위를 사용하여 시신경을 자릅니다. 칼슘 지시약 및/또는 세포막 염색을 포함한 P-35 세포 배양 접시에 2밀리리터의 배지에 글로브를 배양하여 섭씨 37도 및 저조도 조건의 5%이산화탄소의 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하여 글로브가 얼룩 배지에 잠기도록 하여 균일한 염색을 위해 글로브가 얼룩 배지에 잠기도록 합니다. 홀더를 깨끗한 유리 바닥 커버 슬립에 부착하려면 홀더를 70 % 에탄올로 씻고 홀더에 접착제를 바르십시오.그런 다음 홀더를 유리 바닥 덮개 슬립에 부착하여 접착제가 형광을 발하여 이미징을 복잡하게 만들 수 있으므로 홀더의 내부 영역 내에 접착제가 없는지 확인합니다. 접착제가 굳은 후 홀더가 덮개 슬립에 고정되어 있는지 확인하십시오. 멸균 스포이드를 사용하여 염색 용액에서 글로브를 제거하고 관심 부위의 조직 손상을 방지하도록 주의하십시오.멸균 인산염 완충 식염수를 사용하여 실온에서 5분 동안 글로브를 세척하여 과도한 얼룩을 제거하고 글로브를 배지에 넣어 현미경으로 운반합니다. 관심 부위에 멸균 25게이지 바늘을 사용하여 지구본을 감으려면 멸균 스포이드를 사용하여 눈 뒤쪽에서 지구본을 집어 들고 잡고 지구본을 안정적으로 유지하고 구르는 것을 방지합니다. 긁힌 상처의 경우 멸균 된 25 게이지 바늘을 노출 된 각막을 가로 질러 부드럽게 움직이거나 바늘을 중앙 각막으로 직접 부드럽게 눌러 상처가 각막 기저막을 관통하지 않도록합니다.각막 또는 윤부 부위를 홀더 내부 영역의 커버 슬립에 놓고 지구본이 올바르게 배치되고 관심 부위가 유리 커버 슬립과 접촉하는지 확인합니다. 접착제를 사용하여 홀더에 부착 된 3D 인쇄 커버를 사용하여 안정화하십시오. 조직 손상을 일으킬 수 있으므로 지구본을 제거하려고하지 마십시오.현미경을 켜고 환경 챔버를 섭씨 35도 및 5% 이산화탄소로 설정하고 가습 챔버를 확인합니다. 커버 슬립 홀더와 안정화된 지구본을 라이브 셀 이미징 기술을 사용하여 환경 챔버 및 이미지 내의 현미경 스테이지에 놓습니다. 탈수를 방지하고 조직 생존력을 유지하기 위해 커버 슬립에 추가 성장 배지를 조사하여 홀더의 지구본을 덮을 수 있는 충분한 배지가 우물에 있는지 확인합니다.라이브 셀 이미징 기술을 사용하여 실험을 시작하면서 저전력 레이저 설정을 사용하여 조직을 보존하고 조직 손상을 방지하며 장기간 실험을 위한 적절한 목표를 달성합니다. 데이터 기록을 위해 CZI 파일의 기본 파일 형식으로 데이터를 기록하고 저장합니다. X 생체 각막에 대해 다층 구조의 고품질 이미징 데이터를 얻었으며 3D 인쇄 홀더로 안정화하여 각막의 정점, 기저 및 기질층에서 칼슘 신호 전달 이벤트를 입증했습니다.스크래치 상처에서 3D 인쇄 홀더에 고정 된 각막의 Z 스택 이미지를 얻어 각막 층 전체의 세포막과 칼슘 신호 전달 및 다른 Z 평면에서의 칼슘 동원을 시각화했습니다. 치유 반응 동안 상처 침대로의 세포 이동을 연구하기 위해 각막의 시계열 실험을 수행하여 X, Y 또는 Z 방향으로 지구의 움직임이 거의 없음을 보여주었습니다. 지구본을 홀더에 놓으면 각막의 다른 영역이 중앙 및 각막 윤부 영역 모두에서 시각화 될 수 있음이 관찰되었습니다.이 프로토콜을 통해 상처 치유의 차이를 나타내는 질병 모델의 눈을 이미지화할 수 있습니다. 우리는 세포 신호 전달의 이상과 살아있는 조직의 운동성을 특성화 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

개발 및 성인의 준비 Drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 Retinae

Xenopus 배아 상피 조직은 상피 morphogenesis 동안 극성 개발 및 형태의 변화와 같은 세포 행위를 연구하는 이상적인 모델 시스템입니다. 고정 샘플 전통 조직학 점점 라이브 셀 이미징 공촛점에 의해 보완되고있다. 여기 개구리 조직을 분리 및 라이브 세포 공촛점 현미경을 사용하여 라이브 상피 세포 및 cytoskeleton을 시각화하는 방법을 보여줍니다.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

이러한 세포 마이 그 레이션으로 세포 프로세스 전통적으로 2 차원, 딱딱한 플라스틱 표면에 연구하고 있습니다. 이 보고서는 직접 단백질 지방화를 시각화하고보다 생리학 관련, 3 차원 매트릭스에서 마이 그 레이션 세포의 단백질 역학을 분석하는 기술을 설명합니다.

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

실시간 이미징 배아 조직은 오랜 기간 동안 도전합니다. 여기에서 우리는 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 오랜 기간 동안 여자가 척수의 세포와 하위 세포 변화를 감시하기위한 분석을 제시. 이 기술은 신경계와 개발 배아의 다른 지역에 맞게 조정 할 수 있습니다.

개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상

우리는 마우스 배아 피부의 해부와 생체의 문화를 설명합니다. 배양 시스템은 조직 표면에 걸쳐 공기 - 액체 계면을 유지하고 거꾸로 현미경의 이미징을 허용한다. Melanoblasts, 개발 피부의 구성 요소는, 형광 그들의 행동은 공 초점 현미경을 사용하여 관찰 할 수 있도록 표시되어 있습니다.

마우스 배아의 피부와 Melanoblast 이주의 라이브 영상의 생체 문화

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs) 및 골수 틈새 시장 사이의 상호 작용의 본질은 제대로 이해된다. 맞춤형 하드웨어 변형 및 다단계 획득 프로토콜은 생체 화상 골수 영역 내에 홈 표지 HSPCs 추적 상호 작용과 움직임 이광자 및 공 초점 현미경의 사용을 허용한다.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

우리는 세포와 배아를 연구하는 장치와 새로운 방법을보고합니다. 단일 세포는 정확하게 마이크로 공동 어레이에 정렬됩니다. 그들의 3D 감금은 생리 학적 조건에서 발생하는 3D 환경을 향한 단계이며 소기관 방향을 수 있습니다. 세포의 모양을 제어함으로써,이 설정은 표준 분석에보고 된 변동성을 최소화 할 수 있습니다.

단일 세포 및 3D 감금 단일 배아 주문 : 하이 콘텐츠 스크리닝을위한 새로운 장치

우리는 반복 패턴 형성을 얻기 위해 3 차원 기질에서 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하기 위한 절차를 제시. 포함 하는 두 개의 다른 hydrogels 입방 장치 다 방향 영상 조직 패턴 형성에 대 한 달성 하기 위해 채택 된다.

반복 패턴 형성을 위한 하이브리드 젤 큐브 장치에 초기 3D 셀 클러스터 제어

이 프로토콜은 신경계 발달 중H2 O2의생리적 신호 역할을 평가하기 위한 배양 된 제브라피시 뉴런 및 애벌레에서 유전으로 인코딩 된 과산화수소 (H2O2)-바이오센서의 사용을 설명합니다. 그것은 다른 세포 유형에 적용 하 고 일반적인 개발에 반응성 산소 종 (ROS)를 공부 하는 실험 치료와 함께 수정 될 수 있습니다.

신경 발달 도중 ROS 살아있는 세포 화상 진찰

우리는 심장 전구 세포의 3D + 시간 이미징을 가능하게 하는 마우스 배아 배양 및 이미징을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 비디오 툴킷은 텍스트 전용 출판물에서 얻기 어려운 성공적인 라이브 이미징에 필요한 핵심 기술을 다룹니다.

생쥐 배아에서 초기 심장 전구체의 생생한 영상

병아리 배아는 ovo에서 인간 교모세포종(GBM) 뇌종양을 연구하는 데 사용되며 생체 외 뇌 절편 공동 배양. GBM 세포 거동은 생체 외 공동 배양에서 타임랩스 현미경으로 기록할 수 있으며, 두 제제 모두 상세한 3D 공초점 분석을 통해 실험 종점에서 분석할 수 있습니다.

병아리 배아 뇌를 인간 교모세포종 세포 행동의 생체 내 및 생체 외 분석을 위한 모델로 사용

배우세요 3D 프린팅 홀더를 사용한 생체 외 각막 구체의 라이브 셀 이미징 방법을 통해 손상된 각막 상피의 실시간 칼슘 신호 활동을 관찰하는 기술입니다.

새로운 3D 프린팅 홀더를 사용한 온전한 생체 외 구체의 라이브 셀 이미징

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