Name: Plastoglobule 지질 액적 분리 식물 잎 조직 및 시아노박테리아 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 배우세요 플라스토글로불 지질 액적 분리 방법을 옥수수와 시아노박테리아에서 적용하는 기술입니다. 초원심분리와 자화장치를 활용하여 순수한 플라스토글로불을 신속하게 분리하고 생화학적 분석을 위한 견고한 초기 단계를 제공합니다.

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Lundquist 실험실 그룹의 연구는 NSF (MCB-2034631) 및 USDA (MICL08607)에서 PKL에 대한 보조금으로 지원됩니다. 저자는 시아노박테리아 플라스토글로불 분리 방법의 개발에 대한 지원에 대해 Dr. Carrie Hiser(MSU)에게 감사를 표합니다.

1. 원유 플라스토글로블 분리
<ol><li>스트레스를받지 않은 옥수수 잎 조직에서 추출한 원유 플라스토글로블 추출<ol><li>약 3 주 된 6 개의 건강한 옥수수 묘목을 획득하고 거의 V5 성장 단계에 있으며 무게는 약 120g입니다.</li>
		<li>줄기 바닥에있는 모든 잎을 잘라 내고 얼음 욕조에 빠르게 담그고 차가운 방으로 옮깁니다.</li>
		<li>녹색 안전 램프 아래에서 작업하면서 얼음 욕조에서 옥수수 잎을 제거하고 가위를 사용하여 더 작은 조각 (약 5cm x 5cm)으로 자릅니다.</li>
		<li>350mL의 분쇄 완충액에 상업용 블렌더에서 잘린 잎 조직의 절반을 부드럽지만 철저히 분쇄합니다(표 1). 블렌더 5x-6x를 시작하여 모든 잎이 잘리는지 확인하십시오. 블렌더에서 레벨 7 이상을 사용하지 마십시오.</li>
		<li>큰 깔때기에 있는 25μm 나일론 천의 한 층을 통해 균질액을 4개의 250mL 원심분리기 병으로 여과합니다. 그런 다음 잘린 잎 조직의 후반부에 대해 1.1.4단계를 반복합니다.</li>
		<li>여과액을 4개의 병 사이에 고르게 나누고 4°C에서 1,840 x g 에서 6분 동안 원심분리합니다. 잎 여과액의 분취량을 제거하고 대표적인 전체 잎 샘플로서 저장하기 위해 원심분리 전에 따로 보관한다.</li>
		<li>생성된 상청액을 붓고, 브러시를 부드럽게 움직이면서 소용돌이 치고 재현탁하여 0.2M 슈크로스를 함유하는 배지 R 0.2 12mL에 펠릿을 부드럽게 재현탁시킨다(표 1). 각 펠릿을 재현탁한 후 현탁액을 다음 병으로 옮기고 재현탁을 반복합니다. 서스펜션을 한 병에 모으십시오.</li>
		<li>풀링된 현탁액을 6개의 3mL 초원심분리 튜브 사이에 분배하여 각 튜브에서 최대 부피 2.5mL에 도달합니다.</li>
		<li>각 튜브를 4x, 매번 10 초 동안, 팁 초음파 처리기를 사용하여 100 %. 거품을 방지하기 위해 초음파 처리기 혼을 물에 잠기고 액체 표면에서 멀리 두십시오.</li>
		<li>각 라운드 동안 서스펜션 내에서 초음파 처리기 혼을 위아래로 천천히 움직입니다. 4 개의 튜브를 번갈아 가며 각 초음파 처리 후 각 튜브를 얼음 양동이에 돌려 샘플을 식힐 수 있습니다.</li>
		<li>초음파 처리된 조 틸라코이드 현탁액을 4°C에서 30분 동안 150,000 x g 에서 원심분리한다. 주사기 및 22G 바늘을 사용하여 자당 쿠션의 표면으로부터 원유 플라스토글로불의 생성된 플로팅 패드를 수확하고, 바늘의 개구부로 쿠션의 표면을 스키밍하여 각 튜브로부터 약 500μL를 회수한다. 2.0 mL 튜브에 담습니다.</li>
		<li>plastoglobules의 초음파 처리 및 방출 전후에 원유 틸라코이드의 분취량을 수집하십시오. 2.1단계를 계속합니다. 또는 미정제 플라스토글로블을 -80°C에 보관하고 나중에 정제하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>건조된 E. nindensis 잎 조직에서 추출한 원유 플라스토글로불 추출<ol><li>완전히 건조 된 8-9 주 된 E. nindensis (거의 40g의 조직)의 화분 (화분 당 3 개의 개별 식물로 구성)을 얻습니다.</li>
		<li>가위를 사용하여 토양 바로 위의 식물 바닥에서 모든 잎 조직을 잘라 내고 즉시 얼음 욕조에 조직을 담그십시오. 조직을 차가운 방으로 운반하십시오.</li>
		<li>녹색 안전 램프 아래에서 작업하면서 E를 자르십시오. 닌덴시스는 가위를 사용하여 더 작은 조각(약 5cm x 5cm)으로 잎을 남깁니다.</li>
		<li>상업용 블렌더에서 100mL의 분쇄 완충액 (표 1)으로 잎을 부드럽지만 철저히 분쇄합니다. 블렌더를 여러 번 시작하여 모든 잎이 잘리는지 확인하십시오. 블렌더에서 레벨 7 이상을 사용하지 마십시오.</li>
		<li>큰 깔때기에 있는 25μm 나일론 천의 한 층을 통해 균질액을 250mL 원뿔형 플라스크로 여과합니다. 잎 여과액의 분취량을 제거하고 대표적인 전체 잎 샘플로서 저장하기 위해 원심분리 전에 따로 보관한다.</li>
		<li>적절한 양의 자당을 첨가하여 최종 농도 0.5M이 되도록 하고 용액을 250mL 원심분리 튜브에 분배합니다. 참고: Z. mays 준비에 비해 더 높은 농도의 자당은 틸라코이드 결합 플라스토글로불의 후속 초음파 처리/방출 전에 세포질 지질 방울의 부유선을 보장하는 데 사용됩니다.</li>
		<li>튜브를 45,000 x g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다. 플라스토글로불 및 세포질 지질 방울의 혼합물은 자당 쿠션의 표면 위 또는 그 근처에서 노란색의 기름진 패드로 쉽게 볼 수 있습니다(그림 1B). 바늘의 개구부로 쿠션의 표면을 훑어내어 22G 바늘이 있는 주사기를 사용하여 부유 물질을 수집하고 튜브에 침전합니다.</li>
		<li>자유 부유 플라스토글로불/지질 액적 혼합물을 수집한 후 나머지 상청액을 폐기하십시오.</li>
		<li>잔류 틸라코이드에 연결된 플라스토글로우를 분리하려면 브러시를 부드럽게 움직여 소용돌이 치고 다시 현탁하여 12mL의 배지 R 0.2에 펠릿을 다시 현탁합니다. 서스펜션을 한 병에 모으십시오. 1.1.8단계를 계속합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>시아노박테리아에서 추출한 원유 플라스토글로블 추출<ol><li>Synechocystis sp. PCC 6803의 50mL 배양액을 고정상(약 7-10일)으로 성장시키고 분광 광도계를 사용하여 세포 밀도를 OD750 2.0으로 조정합니다. 배양 조건의 경우 BG-11 배지를 사용하고 150μmol 광자/m2/s, 2%CO2, 32°C의 광도로 150rpm에서 연속 진탕으로 인큐베이터에서 성장합니다.</li>
		<li>다당류를 제거하기 위해, 배양된 50 mL를 6,000 x g 에서 4°C에서 45분 동안 원심분리하여 세포를 세척하고, 이어서 상청액을 제거하였다. 세포를 완충액 A 50 mL에서 2회 세척하여 계속한다(표 1). 세포 균질액의 분취량을 제거하고 원심분리 전에 따로 보관하여 대표적인 전체 세포 샘플로 보관합니다.</li>
		<li>세척된 펠릿을 25mL의 완충액 A에 재현탁하고 1,100psi의 프렌치 압력 셀을 사용하여 세포를 분해하고 용해된 색상이 백색광 아래에서 녹색에서 빨간색-파란색-녹색으로 변할 때까지 과정을 3x 반복합니다(단백질 변성을 피하기 위해 각 주기 사이에 샘플을 얼음에 놓음). 사전 냉각 된 셀을 사용하고 냉장실에서이 단계를 수행하십시오.</li>
		<li>생성된 균질액을 각 튜브에 최대 2.5mL까지 채워진 8개의 3mL 초원심분리 튜브 사이에 분배한 다음 400μL의 배지 R로 조심스럽게 오버레이하여 단계 그래디언트를 생성합니다. 참고: 자당 구배 준비25,26에 대한 자세한 설명은 Yang, et al. 및 Kelekar, et al.을 참조하십시오.</li>
		<li>필요에 따라 매체 R을 추가하여 튜브의 균형을 조심스럽게 맞추고 4°C에서 150,000 x g 에서 30분 동안 원심분리합니다. 틸라코이드 및 기타 더 무거운 세포 기관 (폴리 하이드 록시 알카 노 에이트 체 포함)은 펠릿을 사용하는 반면, 플라스토 글로불은 자당 구배의 상단 또는 그 근처에서 노란색의 기름진 패드로 쉽게 볼 수 있습니다 (그림 1C).</li>
		<li>주사기와 22G 바늘로 원유 플라스토글로불의 플로팅 패드를 수확하고 2mL 튜브에 침전시킵니다. 필요한 경우 바늘 끝으로 초원심분리기 튜브 벽의 측면에서 플라스토글로블을 긁어냅니다.</li>
		<li>2.2단계를 계속합니다. 또는 조 플라스토글로블을 -80°C에 보관하고 나중에 정제하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 순수한 플라스토글로블 수확
<ol><li>식물 조직 가공<ol><li>500μL의 배지 R 0.7과 혼합된 1.1단계 또는 1.2단계의 미정제 플라스토글로불 500μL로 먼저 적층하여 2.5mL 초원심분리 튜브에서 자당 구배를 생성하여 총 부피 1mL가 되도록 한 다음 400μL의 배지 R 0.2로 오버레이한 다음 400μL의 배지 R로 오버레이합니다. 참고: 자당 구배 준비25,26에 대한 자세한 설명은 Yang et al. 및 Kelekar et al.을 참조하십시오.</li>
		<li>필요에 따라 상단 레이어에 과도한 매체 R을 추가하여 튜브의 균형을 조심스럽게 잡습니다. 그런 다음 4°C에서 1.5시간 동안 150,000 x g 로 원심분리합니다.</li>
		<li>주사기와 22G 바늘로 순수한 플라스토글로불(그림 1A)의 플로팅 패드를 수확하고 2mL 튜브에 침전시킵니다. 필요한 경우 바늘 끝으로 원심 분리기 튜브 벽 상단에서 플라스토글로블을 긁어냅니다.</li>
		<li>순수한 플라스토글로불을 분취하여 액체 질소에서 급속 동결시킵니다. -80 °C에서 직접 보관하거나 건조 분말로 동결 건조하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>시아노박테리아 가공<ol><li>750μL의 배지 R 0.7과 혼합된 단계 1.3의 미정제 플라스토글로불 500μL로 먼저 적층된 4개의 2.5mL 초원심분리 튜브에서 자당 구배를 생성한 다음 750μL의 배지 R 0.2로 오버레이합니다. 참고: 자당 구배 준비25,26에 대한 자세한 설명은 Yang et al. 및 Kelekar et al.을 참조하십시오.</li>
		<li>자당 구배를 150,000 x g 에서 4°C에서 90분 동안 원심분리합니다. 자당 구배의 상단 단계에서 주사기와 22G 바늘로 순수한 플라스토글로불(그림 1C)을 수집하고 1.5mL 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>순수한 플라스토글로불을 분취하고 액체 질소에서 급속 동결합니다. -80 ° C에서 직접 보관하거나 건조 분말로 동결 건조하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+throughout+the+evolutionary+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets throughout the evolutionary tree.</a> Progress in Lipid Research. 78, 101029(2020).</li>
<li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+network+of+the+Arabidopsis+plastoglobule+proteome+based+on+quantitative+proteomics+and+genome-wide+coexpression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis.</a> Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).</li>
<li>Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+profiling+of+plastoglobules+in+chloroplasts+and+chromoplasts.+A+surprising+site+for+differential+accumulation+of+metabolic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes.</a> Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).</li>
<li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+plastoglobule+kinases+ABC1K1+and+ABC1K3+causes+conditional+degreening%2C+modified+prenyl-lipids%2C+and+recruitment+of+the+jasmonic+acid+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).</li>
<li>Vidi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tocopherol+cyclase+%28VTE1%29+localization+and+vitamin+E+accumulation+in+chloroplast+plastoglobule+lipoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobuli+and+the+fine+structure+of+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Endeavour%22%5BJournal%5D)">Plastoglobuli and the fine structure of plastids.</a> Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobuli+in+different+types+of+plastids+from+Allium+cepa+L%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L.</a> Planta. 72 (1), 1-13 (1966).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+Plastoglobuli+von+Spinat%2C+ihre+Gr%C3%B6%CE%B2e%2C+Isolierung+und+Lipochinonzusammensetzung%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung.</a> Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobuli+and+lipoquinone+content+of+chloroplasts+from+Cereus+peruvianus+%28L%29+Mill%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill.</a> Planta. 87 (4), 304-310 (1969).</li>
<li>Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromoplast+ultrastructure+of+Capsicum+carotenoid+mutants+I.+Ultrastructure+and+carotenoid+composition+of+a+new+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Pflanzenphysiologie%22%5BJournal%5D)">Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant.</a> Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).</li>
<li>Hansmann, P., Sitte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+molecular+structure+of+chromoplast+globules+of+Viola+tricolor%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor.</a> Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).</li>
<li>Steinmuller, D., Tevini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+function+of+plastoglobuli+%3A+I.+Isolation+and+purification+from+chloroplasts+and+chromoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts.</a> Planta. 163 (2), 201-207 (1985).</li>
<li>Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proteins+associated+with+plastoglobules+isolated+from+pea+%28Pisum+sativum+L.%29+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 208 (1), 107-113 (1999).</li>
<li>Grennan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobule+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Plastoglobule proteome.</a> Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).</li>
<li>Peramuna, A., Summers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+occurrence+of+lipid+droplets+in+the+cyanobacterium+Nostoc+punctiforme%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme.</a> Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).</li>
<li>Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobules+are+lipoprotein+subcompartments+of+the+chloroplast+that+are+permanently+coupled+to+thylakoid+membranes+and+contain+biosynthetic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes.</a> The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).</li>
<li>Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid+lipid+droplets+at+the+crossroads+of+prenylquinone+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).</li>
<li>Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+plastoglobules+in+metabolite+repair+in+the+tocopherol+redox+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 298(2014).</li>
<li>Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+and+functional+connections+between+cytoplasmic+and+chloroplast+triacylglycerol+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage.</a> Progress in Lipid Research. 80, 101069(2020).</li>
<li>Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+isolation+from+Arabidopsis+thaliana+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Bio-Protocols. 10 (24), 3867(2020).</li>
<li>Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+changes+of+Arabidopsis+thaliana+plastoglobules+facilitate+thylakoid+membrane+remodeling+under+high+light+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress.</a> Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).</li>
<li>Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plastoglobule-localized+protein+AtABC1K6+is+a+Mn2%2B-dependent+kinase+necessary+for+timely+transition+to+reproductive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762(2022).</li>
<li>Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+topology+and+membrane+interaction+characteristics+of+plastoglobule-localized+AtFBN1a+and+AtLOX2%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signalling+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2.</a> Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213(2021).</li>
<li>Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBesagni%2C+C+%22Chloroplast+Research+in+Arabidopsis%22">Chloroplast Research in Arabidopsis</a>. Jarvis, R. P. , Humana Press. Totowa, NJ. Chapter 12 223-239 (2011).</li>
<li>Yang, H., Murphy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+preparation%2C+sucrose+density+gradients+and+two-phase+separation+fractionation+from+five-day-old+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings.</a> Bio-Protocols. 3 (24), 1014(2022).</li>
<li>Kelekar, P., Wei, M., Yang, P. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKelekar%2C+P+%22Cilia%3A+Motors+and+Regulation.+Methods+in+Cell+Biology%22">Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology</a>. Pazour, G. J., King, S. M. 92, Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 12 181-196 (2009).</li>
<li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear-encoded+synthesis+of+the+D1+subunit+of+photosystem+II+increases+photosynthetic+efficiency+and+crop+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield.</a> Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).</li>
<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy+reveals+that+senescence+induces+in-situ+and+vacuolar+degradation+of+plastoglobules+in+aging+watermelon+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves.</a> Micron. 80, 135-144 (2016).</li>
<li>Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+FIBRILLIN4+gene+expression+in+apple+decreases+plastoglobule+plastoquinone+content%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content.</a> PLoS One. 7 (10), 47547(2012).</li>
<li>Singh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIBRILLIN4+is+required+for+plastoglobule+development+and+stress+resistance+in+apple+and+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gardenia+carotenoid+cleavage+dioxygenase+4a+is+an+efficient+tool+for+biotechnological+production+of+crocins+in+green+and+non-green+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2022).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Biochemistry+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li>
</ol>

선언할 이해 상충이 없습니다.

재료의 생리적/생화학적 변화를 최소화하고 플라스토글로불의 풍부한 성분인 특정 광학적 및 열에 불안정한 프레닐 지질 안료를 보호하려면 4°C에서 분리를 수행하고 빛으로부터 보호하는 것이 중요합니다. 위에서 지적한 바와 같이, 초기 단계는 녹색 발광 전구를 사용하여 안전 램프 아래의 냉장실에서 수행됩니다. 실험실에서 수행되는 후속 단계는 희미한 조명 아래에서 얼음 또는 냉장 원심 분리를 사용합니다. 유사한 이유로, 신선한 프로테아제 억제제 (및 단백질의 포스 포 조절 연구에 관심이있는 경우 포스파타제 억제제)를 포함하는 것이 중요합니다 (표 2 및 표 3).
다른 방법 (예 : Dounce 균질 기, 동결 - 해동 사이클)은 원칙적으로 고등 식물 엽록체의 틸라코이드에서 플라스토 글로 블을 방출하는 데 사용될 수 있지만, 초음파 처리는 최상의 수율과 순도를 제공하는 데 훨씬 우수한 것으로 밝혀졌습니다 (미공개 결과). 초음파...

플라스토글로불 구성 및 기능에 대한 현재의 이해는 상세한 단백질체학 및 지질체 연구 1,2,3,4,5를 통해 나타났습니다. 이러한 연구는 자당 구배를 사용하여 효율적인 분리를 위해 매우 낮은 밀도에 의존하는 신속하고 효과적인 분리 방법에 의해 크게 도움이되었습니다. 너도밤 나무 (Fagus sylvatica), 스카치 빗자루 (Sarothamnus scoparius), 양파 (부추 속 세파), 시금치 (Spinacia oleracea), 팬지 (비올라 삼색), 후추 (고추 일년) 및 완두콩 (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. 엽록체 플라스토글로블을 보다 효율적이고 더 나은 수율 방식으로 분리하는 업데이트된 방법이 나중에 Ytterberg et al.3,14에 의해 제시되었습니다. 처음에는 Arabidopsis thaliana 잎 엽록체의 플라스토글로블 연구에 사용되었지만 옥수수(Zea mays), 토마토(Solanum lycopersicum), 러브그래스(Eragrostis nindensis), 보라색 거짓 브롬(Brachypodium distachyon) 및 야생 담배(Nicotiana benthamiana)를 포함한 다른 식물 종의 건강한 잎 조직에 이 업데이트된 방법을 성공적으로 사용했습니다. ; 미공개 결과). 또한, 분리 방법은 Synechocystis sp. PCC 6803 및 Anabaena sp. PCC 712015를 포함한 시아 노 박테리아의 플라 스토 글로 블과 부활 식물 인 E. nindensis의 건조 된 잎 조직에 성공적으로 적용되었습니다.
건강한 잎 조직의 엽록체 플라스토글로블은 틸라코이드 막(16)에 물리적으로 연결되어 있다. 이러한 물리적 연속성에도 불구하고, 2개의 엽록체 서브-구획은 뚜렷한 지질 및 단백질 조성을 유지하지만, 2개의 구획 사이의 지질과 단백질의 조절된 교환이 제안되었다 2,4,17,18,19. 사실, 흥미로운 반 융합 모델이 최근 엽록체와 세포질19 사이의 중성 지질 밀매에 대해 제안되었습니다. 플라스토글로블과 틸라코이드의 물리적 연속성으로 인해, 건강한 잎 조직을 이용한 분리 방법은 펠렛화된 조잡한 틸라코이드 제제의 수집으로 시작되며, 이어서 초음파 처리되어 플라스토글로블을 틸라코이드로부터 분리하는데, 이는 세포질 지질 방울을 분리하는 데 사용되는 방법과 대조된다20 . 그런 다음 자당 쿠션에서 초원심분리하면 저밀도 플라스토글로블이 자당을 통해 위로 떠올라 틸라코이드, 핵 및 기타 고밀도 물질에서 효과적으로 분리됩니다. 대조적으로, 시아노박테리아의 플라스토글로구와 건조된 잎 조직의 플라스토글로불은 생체 내에서 자유롭게 떠다니는 형태로 존재하는 것 같습니다. 따라서 이들의 격리에는 자당 구배에 직접 떠 있는 것이 포함됩니다. 이 기사는 건강한 잎 조직에서 분리 방법을 보여주고 건조 된 잎 조직 또는 시아 노 박테리아 배양에서 플라 스토 글로 블을 분리하는 데 사용할 수있는 두 가지 변형을 보여 주어 플라 스토 글로 불을 연구 할 수있는 생리 학적 폭과 진화 적 맥락을 크게 확장합니다.
분리된 플라스토글로불은 분자 특성을 조사하기 위해 여러 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다. 우리는 다양한 환경 조건 또는 유전자형에서 광범위한 단백질체 및 지질체 분석을 위해 A. thaliana 잎 조직에서 분리된 플라스토글로불을 사용하여 스트레스 2,4,21,22에 적응하여 단백질 및 지질 조성의 선택적 변형을 입증했습니다. 또한, 단리된 플라스토글로불과의 연관된 트랜스-인산화 활성을 입증하는 시험관내 키나아제 분석이 수행되었고(22), 단백질 성분의 올리고머 상태가 천연 겔 전기영동(21)을 사용하여 조사되었으며, 프로테아제-면도 분석(23)이 수행되었다.
이 방법의 주요 이점은 절차의 상대적 속도입니다. 경험상 아래에 설명된 프로토콜은 약 4시간 이내에 완전히 완료될 수 있습니다. 잎 조직으로부터 플라스토글로불을 단리하는 대안적인 방법이 설명되었으며, 이는 다른 엽록체 하위구획(24)의 동시 단리를 허용한다. 이 대안적인 방법은 다른 엽록체 하위 구획과의 정량적 비교가 필요하거나 원할 때 몇 가지 분명한 이점을 제공합니다. 그러나,이 대체 방법은 또한 더 지루하며 비슷한 양의 잎 조직으로부터 분리 된 플라스토 글로 블의 수율을 상당히 낮출 것이다. plastoglobules에 대한 집중적 인 연구가 목표 인 경우 여기에 설명 된 방법론이 최적의 선택입니다. 그럼에도 불구하고 샘플 준비 중에 총 잎 및 미정제 틸라코이드 분취량을 수집할 수 있으며 후속 비교를 위해 참조 샘플을 확보하는 것이 좋습니다.

<table><tbody><tr><td>AEBSF</td><td>밀리포어 시그마</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Antipain.2HCl</td><td>Bachem</td><td>H-1765.0050BA</td><td></td></tr><tr><td>아프로티닌</td><td>밀리포어 시그마</td><td>A6106</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>BDH</td><td>BDH9242</td><td></td></tr><tr><td>베스타틴</td><td>시그마 알드리치</td><td>B8385</td><td></td></tr><tr><td>베타-글리세로포스페이트. 2Na5H2O</td><td>EMD 밀리포어</td><td>35675</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Proliant Biological</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>Chymostatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>Eragrostis nindensis</td><td>N/A</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>E-64</td><td>Milipore Sigma</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>프랑스어 압력 셀 (모델 FA-079)</td><td>SLM/Aminco</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마 Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>류펩틴</td><td>시그마 Aldrich</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>시그마 Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Multitron 진탕 인큐베이터</td><td>Infors HT</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>포스포 라미돈.2 Na</td><td>시그마 Aldrich</td><td>R7385</td><td></td></tr><tr><td>수산화 칼</td>륨 <td>피셔 화학 물질</td><td>M16050</td><td></td></tr><tr><td>감소된 시스테인</td><td>MP 생화학 물질</td><td>101444</td><td></td></tr><tr><td>불화나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>오르토바나데이트</td><td>나트륨 시그마 알드리치</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>피로인산나트륨 &미드도트; 10H2O</td><td>시그마 알드리치</td><td>3850</td><td></td></tr><tr><td>소르비톨</td><td>시그마 알드리치</td><td>S3889</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Sylvania 15 W 형광 Gro-Lux 튜브 전구, 18"</td><td>Walmart</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Synechocystis sp. PCC 6803</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>Waring Blender (1.2 L)</td><td>VWR</td><td>58977-227</td><td>상업용 블렌더</td></tr><tr><td>제아 메이스</td><td>해당 없음 N/A</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

plastoglobule 지질 액적 분리 식물 잎 조직 및 시아노박테리아

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Plastoglobule 지질 방울은 식물 엽록체와 시아 노 박테리아의 동적 하위 구획입니다. 광합성 종들 사이에서 유비쿼터스로 발견되는 그들은 빠르게 변화하는 환경 조건에서 틸라코이드 막의 적응 및 리모델링에 중심적인 역할을 하는 것으로 믿어집니다. 고순도의 플라스토글로블을 분리할 수 있는 능력은 단백질체, 지질 및 기타 방법론을 통해 연구를 크게 촉진했습니다. 고순도 및 수율의 플라스토글로블을 사용하면 다른 가능한 분자 특성 중에서 지질 및 단백질 조성, 효소 활성 및 단백질 토폴로지를 조사할 수 있습니다. 이 기사는 식물 잎 조직의 엽록체에서 플라스토글로불을 분리하기 위한 신속하고 효과적인 프로토콜을 제시하고 옥수수 잎, 부활 식물의 건조된 잎 조직, Eragrostis nindensis 및 시아노박테리움, Synechocystis 에서 플라스토글로블 및 관련 지질 방울 구조를 분리하기 위한 방법론적 변형을 제시합니다. PCC 6803. 분리는 이러한 지질이 풍부한 입자의 낮은 밀도에 의존하며, 이는 자당 밀도 부유선광에 의한 정제를 용이하게 합니다. 이 방법론은 다양한 종의 플라스토글로블 연구에 가치가 있음이 입증될 것입니다.

프로토콜의 단계 1이 완료되면, 상당한 양의 플라스토글로불/지질 액적 물질이 슈크로스 쿠션의 최상층 상(또는 그 근처)에 떠 있는 것을 쉽게 볼 수 있어야 한다(도 1B-C). 이 단계에서 다른 분획도 수집 할 수 있습니다. 예를 들어, 틸라코이드는 펠릿화되고 후속 분석을 위해 중간 R 0.2로 재현탁될 수 있습니다. 후속 원심분리 후, 정제 된 플라스토 글로불은 그림 1A, C에 도시된 바와 같이 자당 구배의 표면 또는 그 근처에서 얻어 질 것이다. 특정 상황 (예 : 특정 유전형 선 또는 환경 조건)에서 plastoglobules는 구배의 다른 층에서 분리되는 두 개의 별개의 하위 집단으로 분리됩니다 : 구배 표면의 저밀도 분획과 상위 두 구배 층 사이의 계면에 정착하는 두 번째, 더 조밀 한 분획. 분리 분획에 대한 신중한 비교...

다양한 광합성 유기체와 관련된 플라스토글로불 지질 방울의 분리를 위한 빠르고 효율적인 프로토콜이 제시됩니다. 분리된 플라스토글로불의 성공적인 준비는 단백질체학 및 지질체 분석과 같은 상세한 분자 조사에 앞서 중요한 첫 번째 단계입니다.

Plastoglobule 지질 액적 분리 식물 잎 조직 및 시아노박테리아

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

고순도 색소 소구의 분리는 그들의 연구에 매우 중요합니다. 다운스트림 생화학적 조사를 용이하게 하는 신속하고 효과적인 분리 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 이 방법의 주요 이점은 절차의 상대적 속도와 수많은 식물 종 및 환경 조건에 대한 적응성입니다.틸라코이드 재현탁액을 초음파 처리하는 동안 틸라코이드에서 플라스토글로불을 제거하고 이후 자당 구배에서 플라스토글로불을 추출할 수 있는 충분한 힘을 보장하기 위해 특별한 주의를 기울여야 합니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사후 연구원 인 Elsinraju Devadasu 박사와 내 실험실의 박사 과정 학생 인 Febri Susanto입니다. V5 성장 단계와 약 120g의 무게를 가진 6 개의 건강한 옥수수의 3 주 된 묘목을 구입하는 것으로 시작하십시오.줄기 바닥에있는 모든 잎을 잘라 내고 차가운 방으로 옮기기 전에 얼음 욕조에 빠르게 담그십시오. 녹색 안전 램프 아래에서 작업하면서 얼음 욕조에서 옥수수 잎을 제거하고 가위를 사용하여 더 작은 5x5cm 조각으로 자릅니다. 절단 된 잎 조직의 절반을 350ml의 분쇄 완충액에서 상업용 블렌더에서 7보다 낮은 수준으로 부드럽고 철저하게 분쇄합니다.블렌더를 5-6 번 시작하고 중지하여 모든 잎이 잘리도록하십시오. 큰 깔때기에있는 25 미크론 나일론 천의 한 층을 통해 균질 액을 4 개의 250 밀리리터 원심 분리기 병으로 여과합니다. 남은 잘린 잎 조직으로 블렌딩 단계를 반복한 후 여액을 4개의 병 사이에 고르게 나눕니다.잎 여과액의 분취량을 제거하고 대표적인 총 잎 샘플로 저장하기 위해 따로 보관합니다. 다음으로, 여과액을 섭씨 1, 840 G 및 섭씨 4도에서 6분 동안 원심분리한다. 생성 된 상청액을 붓고, 브러시의 부드러운 소용돌이 움직임으로 0.2 몰 자당을 함유 한 12 밀리리터의 매체 R 0.2에 펠릿을 다시 현탁시킨다.펠릿을 한 병에 다시 현탁시킨 후 현탁액을 다음 병에 추가하고 재현탁을 반복하여 현탁액을 한 병에 모읍니다. 풀링된 현탁액을 6개의 3밀리리터 초원심분리기 튜브 사이에 분배하여 각 튜브에서 최대 부피 2.5ml에 도달합니다. 그런 다음 100%의 진폭에서 팁 초음파 처리기를 사용하여 각 튜브를 각각 10초 동안 4번 초음파 처리합니다.거품을 방지하기 위해 초음파 처리기 혼을 물에 잠기고 액체 표면에서 멀리 두십시오. 각 라운드 동안 서스펜션 내에서 초음파 처리기 혼을 위아래로 천천히 움직입니다. 4 개의 튜브를 번갈아 가며 각 초음파 처리 후 각 튜브를 얼음 양동이에 다시 넣어 샘플을 식히십시오.완료되면 초음파 처리 된 조 틸라코이드 현탁액을 섭씨 4도에서 30 분 동안 150, 000G에서 원심 분리합니다. 주사기 및 22 게이지 바늘을 사용하여 쿠션 표면을 탈지하고, 생성된 황색 및 유성 플로팅 패드를 수크로스 쿠션으로부터 조잡한 플라스토글로불로 수확한다. 각 튜브에서 약 500 마이크로 리터를 회수하여 2.0 밀리리터 튜브에 넣습니다.plastoglobules의 초음파 처리 및 방출 전후에 조잡한 틸라코이드 분취량을 수집하십시오. 완료되면 식물 조직 처리를 계속하거나 조 플라스토글로블을 섭씨 영하 80도에서 보관하고 나중에 정제합니다. 고정상에 도달하기 위해 BG11 배지에서 50 밀리리터의 synechocystis 종 PCC 6802 배양액을 7-10 일 동안 성장시킵니다.분광 광도계를 사용하여 셀 밀도를 750 나노 미터에서 2.0의 광학 밀도로 조정합니다. 다당류를 제거하기 위해, 배양물 50 밀리리터를 원심분리하고 상청액을 제거한다. 50 밀리리터의 완충액 A에서 세포를 2 회 반복한다.세척된 펠릿을 25 밀리리터의 완충액 A에 재현탁시키고, 1, 100 파운드 제곱인치의 프렌치 압력 셀을 사용하여 세포를 분해한다. 백색광 아래에서 용해 된 색상이 녹색에서 빨간색, 파란색, 녹색으로 바뀔 때까지 추운 조건에서 이 과정을 세 번 반복합니다. 세포 균질액의 분취량을 제거하고 대표 전체 세포 샘플로서 저장되도록 따로 보관한다.생성 된 균질 액을 각 튜브에 최대 2.5 밀리리터로 채워진 8 개의 3 밀리리터 초 원심 분리 튜브에 분배하십시오. 이 균질액을 400마이크로리터의 배지 R과 오버레이하여 스텝 그래디언트를 생성합니다. 튜브를 원심분리하기 전에 필요에 따라 매체 R을 추가하여 튜브의 균형을 조심스럽게 잡습니다.틸라코이드 및 폴리 하이드 록시 알카 노 에이트 체를 포함한 다른 무거운 세포 기관은 펠릿 형성을 나타내는 반면, 플라 스토 글로불은 자당 구배의 상단 또는 그 근처에서 노란색 유성 패드를 형성합니다. 앞에서 설명한 것처럼 주사기로 원유 플라스토글로불의 플로팅 패드를 수확하고 수확물을 2 밀리리터 튜브에 넣습니다. 필요한 경우 바늘 끝으로 초원심분리기 튜브 벽의 측면에서 플라스토글로블을 긁어냅니다.시아노박테리아 가공을 계속하거나 미정제된 플라스토글로블을 섭씨 영하 80도에서 보관하고 나중에 정제하십시오. 식물 조직 처리 방법을 사용하여 순수한 플라스토글로불을 수확하기 위해, 500 마이크로리터의 미정제 플라스토글로불, 400 마이크로리터의 배지 R0.2 및 400 마이크로리터의 배지 R을 사용하여 앞서 기술한 슈크로스 구배를 제조하고, 원심분리 후, 생성된 순수 플라스토글로불의 플로팅 패드를 2밀리리터 튜브로 수확한다. 순수한 플라스토글로불을 분취한 후 액체 질소에서 분취량을 급속 냉동한 후 섭씨 영하 80도에서 보관하거나 건조 분말로 동결건조합니다.시아 노 박테리아로부터 순수한 플라 스토 글로 불 (plastoglobules)을 수확하기 위해, 500 마이크로 리터의 원유 플라스토 글로불, 750 마이크로 리터의 배지 R 0.7 및 750 마이크로 리터의 배지 R 0.2를 사용하여 앞서 언급 한 바와 같이 자당 구배를 생성한다. 원심분리 후, 1.5 밀리리터 튜브에서 순수한 플라스토 글로블을 수집하고 순수한 플라스토 글로블을 분취한다. 완료되면 순수한 플라스토글로불 분취량을 액체 질소에 급속 냉동하고 섭씨 영하 80도에서 직접 보관하거나 건조 분말로 동결건조합니다.이 방법에서, 상당한 양의 플라스토글로불 또는 지질 액적 물질이 슈크로스 쿠션의 최상층에 부유하는 것을 볼 수 있었다. 후속 원심분리 후, 정제된 플라스토글로불은 슈크로스 구배의 표면 또는 그 근처에서 수득되었다. 플라스토글로불의 성공적인 분리 후, 애기장대 탈리아나 피브릴린 1a 및 애기장대 탈리아나 광계 II 서브유닛 D1에 대해 제기된 항체를 사용하여 순도 평가를 위해 개발된 면역블롯은 피브릴린 동족체가 플라스토글로불보다 주로 틸라코이드와 관련이 있음을 보여주었습니다.플로팅 패드의 효율적이고 집중된 추출을 보장하려면 완전히 잠긴 상태에서 주사기 바늘 오리피스를 버퍼의 액체 표면 바로 아래에 놓은 다음 부드럽게 위로 당깁니다. 분리된 플라스토글로불 샘플은 후속 단백질체학 또는 지질체 연구에 적합하며 다양한 환경 조건에서 표적화된 단백질-지질 조성의 변화를 입증하는 데 사용되었습니다. 이 기술은 후속 생화학 적 조사를 통해 관련 단백질 키나아제 활성의 발견 및 올리고머 단백질 복합체의 존재를 포함하여 플라스토글로불에 대한 새로운 연구를 촉진했습니다.

plastoglobule-lipid-droplet-isolation-from-plant-leaf-tissue

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

극지 지질 추출물의 조성과 개별 glycerolipids의 지방산 조성은 간단하고 강력한 지질 프로파일 실험에서 결정됩니다. 이를 위해 glycerolipids는 얇은 층 크로마 토그래피에 의해 격리되고 그들의 아실 그룹의 transmethylation를 받게. 지방산 아실 methylesters는 기체 - 액체 크로마 토그래피에 의해 계량입니다.

씬 크로마 토그래피 (TLC)에 의해 Arabidopsis thaliana 폴라 Glycerolipid의 프로파일은 기체 - 액체 크로마 토그래피 (GLC)와 결합

출처: Shivaiah, K., et al. 식물 잎 조직 및 시아노박테리아에서 Plastoglobule 지질 방울 분리. J. Vis. 경험. (2022년)비디오는 시아노박테리아에서 플라스토글로불을 분리하는 방법을 보여줍니다. 이는 시아노박테리아 배양으로 시작하여 기계적 힘을 사용하여 세포 파괴를 통해 진행됩니다. 광합성 색소의 방출은 성공적인 용해를 나타냅니다. 그런 다음 자당 단계 구배를 사용하여 밀도에 따라 세포 성분을 분리하여 저밀도 편성소구가 상단에 뚜렷한 밴드를 형성할 수 있도록 합니다. 이 분획은 추가 분석을 위해 수집 및 보존됩니다.

광합성 박테리아에서 Plastoglobules의 추출 및 정제

출처: Shivaiah, K., et al. 식물 잎 조직 및 시아노박테리아에서 Plastoglobule 지질 방울 분리. J. Vis. 경험. (2022).이 비디오는 자당 밀도 구배 원심분리를 사용하여 시아노박테리아에서 장소구를 분리하는 방법을 보여주며, 지질이 풍부하고 밀도가 낮은 특성을 강조하고 다운스트림 분석을 위한 구조적 보존을 보장합니다.

시아노박테리아 플라스토소블의 밀도 구배 정제

1)에서 세포 지질 방울을 분리 효모 세포, 2) 인간의 태반이 제시하는 두 가지 기술. 두 절차의 핵심은 방울을 함유하는 생성 된 부동 층은 쉽게 눈에 의해 시각을 추출하고, 순도에 대한 웨스턴 블롯 분석에 의해 정량화 될 수있는 밀도 구배 원심 분리된다.

세포 지질 방울의 분리 : 효모 세포와 인간의 태반에서 시작 두 정화 기술

지질 폴리에스터는 두 개의 세포벽 변형, 즉 식물 큐티클과 수베린 함유 확산 장벽의 구조적 구성 요소를 구성합니다. 이 비디오에서는 탈지된 잎 전체에서 큐틴을 탈중합하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 큐틴 또는 수베린 생합성에서 손상된 돌연변이를 조사하는 데 적용할 수 있습니다.

식물 표피 지질 폴리 에스테르 단량체의 분리 및 성분 분석

높은 처리량, 자동화, 담배 원형질체 생산 및 변환 방법이 설명되어 있습니다. 로봇 시스템이 아닌 모델 작물로 번역해야한다 모델 BY-2 시스템에 대규모 병렬 유전자 발현 및 검색 할 수 있습니다.

높은 처리량 원형질체 분리 및 변환을위한 로봇 플랫폼

여기, 선물이 fucoxanthin 엽록소 a/c 바인딩 단백질 (FCP) 규조류에서 격리 하 여 이온 구성 변경 시 여기 에너지 전달 연구를 자연 지질 작곡과 리로 그들을 통합 하는 프로토콜.

분리 및 통합 규조류 Cyclotella Meneghiniana Thylakoid 지질으로 리에서에서 광 수확 안테나

여기, 우리 애기 잎 (봉투, 기질, 그리고 thylakoids), 그들의 세 가지 주요 하위 구획에서 그대로 엽록체를 정화 하는 방법을 설명 차동 centrifugations, 연속 Percoll 기울기의 조합을 사용 하 고 불연속 자당 기온 변화도입니다. 메서드는 subplastidial 및 immunoblotting과 proteomics에 의해 단백질의 subcellular 지 방화에 대 한 귀중 한.

단백질 지 방화 Immunoblotting 또는 단백질의 분석에 대 한 애기에서 엽록체 하위 구획의 준비

이 프로토콜 지질 작은 물방울 고립과 확고 바인딩과 그물 격리 키트를 사용 하 여 마우스 간에서 정화의 새로운 방법을 설정 합니다.

음 세포 기관이 격리 키트를 사용 하 여 급속 한 지질 작은 물방울 격리 프로토콜

현재 프로토콜은 불연속 자당 밀도 그라데이션을 통해 원심분리에 의한 시아노박테리아로부터의 피코빌리좀의 분리를 자세히 설명합니다. 그대로 피코빌리좀의 분획은 77K 형광 스펙트럼 및 SDS-PAGE 분석에 의해 확인된다. 결과 물리경분획은 TEM 및 질량 분광법 분석의 음수 염색에 적합합니다.

시아노박테리아의 피코빌리좀의 격리 및 특성화

배우세요 플라스토글로불 지질 액적 분리 방법을 옥수수와 시아노박테리아에서 적용하는 기술입니다. 초원심분리와 자화장치를 활용하여 순수한 플라스토글로불을 신속하게 분리하고 생화학적 분석을 위한 견고한 초기 단계를 제공합니다.

Plastoglobule 지질 액적 분리 식물 잎 조직 및 시아노박테리아

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