Microdialysis System을 사용한 의식이 있는 쥐의 해마 세포외 유체의 실시간 동적 수집
2022년 10월 21일
여기서 프로토콜은 미세 투석 시스템을 사용하여 깨어 있는 쥐의 해마에서 세포외액의 상세한 실시간 동적 샘플링을 제공합니다.
뇌 미세투석 기술에 의한 해마 세포외액 및 군중은 중추신경계 질환의 질병 특이적 마이크로를 모니터링하는데 기여한다. 뇌 미세 투석 기술은 마취되지 않은 쥐의 특정 뇌 영역에서 간질 뇌액의 역동적이고 지속적인 조사를 달성합니다. 마취된 쥐를 정위 뇌 탐지기에 고정하고 수술 전에 면도한 수술 부위를 포비돈 요오드와 에탄올 면봉으로 세 번 닦습니다.
그런 다음 수술 용 가위로 중간에 1.5cm 두개골 안면 절개를하고 수술 용 가위와 안과 겸자를 사용하여 골막을 제거합니다. 브레그마를 기저 위치로 간주하여 두개골 드릴을 사용하여 내두개를 뚫어 해마 CA1 영역에 2mm 구멍을 뚫습니다. 이제 카테터 스틸렛을 정위 뇌 탐지기의 그리퍼에 고정하고 전후, 내측 및 등쪽 복부 위치에서 미세 투석 케이싱의 위치를 조정합니다.
뇌 입체 탐지기의 배측 밸브를 조정하고 미세 투석 케이싱을 3.5mm 깊이의 CA1 영역에 이식합니다. 직경이 2mm인 조리개 3개를 더 뚫어 3개의 구멍이 프로브 구멍이 중앙에 위치하는 삼각형을 형성하도록 합니다. 1mm 깊이의 구멍에 나사를 이식하고 프로브 카테터를 치과 용 시멘트로 고정합니다.
그런 다음 4-O 수술 봉합사를 사용하여 피부를 닫습니다. 미세 투석 펌프 미세 주사기를 ACSF 각성 활동 장치 및 극저온 s와 연결하십시오.amp제조업체의 지침에 따라 수집기. 다음으로, 파이프 라인의 공기를 배출하기 위해 미세 투석 펌프를 분당 1 마이크로 리터의 속도로 설정하십시오.
그런 다음 파이프라인과 뇌 미세 투석 프로브를 연결하고 분당 1마이크로리터의 속도로 미세 투석 펌프를 작동하여 프로브 표면이 약간 촉촉해질 때까지 프로브에 ACSF를 주입합니다. 후속 사용을 위해 프로브를 헤파린 나트륨 주입 용액에 담그십시오. 깨어 있는 쥐에게서 HECF를 수집하려면 뇌 미세 투석 프로브를 프로브 카테터에 삽입하고 쥐가 자유롭게 움직일 수 있도록 패딩이 있는 챔버에 쥐를 넣습니다.
쥐가 자유롭게 움직이는 동안 미세 투석 파이프 라인이 얽히지 않도록 다중 채널 회전 컨트롤러를 켭니다. 그런 다음 마이크로 주사기 펌프를 켜고 분당 1 마이크로 리터의 속도로 ACSF를 펌핑하십시오. 미세투석 HECF 수집 시스템의 60분 평형 후, 주기적으로 HECF를 수집한다.
샘플링 종료 후 프로브 카테터에서 뇌 미세 투석 프로브를 꺼냅니다. 프로브를 탈이온수에 담그고 탈이온수로 12시간 동안 세척하여 파이프라인과 프로브에서 좌초된 염 침전물을 제거합니다. 프로브를 제거하고 섭씨 4도에서 0.05% 트립신 용액에 넣습니다.
뇌 미세 투석 기술로 획득 한 해마 세포 외액은 물과 같고 무색이며 설정된 샘플링 속도에서 투명합니다. 가장 중요한 절차는 미세 투석을 CA1 영역에 조심스럽게 이식하고 프로브를 팝 카테터에 삽입하는 것입니다. 미세 투석 기술은 특정 뇌 영역에서 질병 마커의 동적 변화, 약물 효능의 물질 및 약물 성분의 조직 이화 작용을 도울 수 있습니다.
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요
개요
본 논문은 뇌 미세투석 기술을 이용하여 깨어 있는 쥐의 해마 세포외액(HECF)을 실시간으로 동적 샘플링하는 프로토콜을 제시합니다. 이 공정은 피실험체를 마취하지 않고 특정 뇌 영역에서 지속적으로 샘플링을 수행함으로써, 중추 신경계 질환의 질병 특이적 마커를 모니터링할 수 있게 해줍니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 신경퇴행성 질환
- 미세투석 기술
배경
- 세포외액 역학을 이해하는 것은 신경 세포 메커니즘과 가소성을 연구하는 데 매우 중요합니다.
- 현재의 방법들은 일반적으로 생물학적 맥락에 영향을 줄 수 있는 침습적 기술을 포함합니다.
- 미세투석법은 피험자가 깨어 있는 상태에서 간질액을 수집할 수 있게 하여 더 관련성 높은 데이터를 제공합니다.
- 본 프로토콜은 살아있는 모델에서 뇌액 성분을 지속적으로 모니터링해야 하는 필요성을 해결합니다.
연구 목적
- 비침습적 샘플링 방식을 도입하여 해마 내 질병 마커의 모니터링을 강화하기 위함입니다.
- 연구자들이 해당 절차를 재현할 수 있도록 상세한 방법론적 체계를 제공하기 위함입니다.
- 시간 경과에 따른 약물 효과 및 대사 변화를 관찰하기 위한 신뢰할 수 있는 시스템을 구축하기 위함입니다.
사용된 방법
- 본 연구에서는 해마의 CA1 영역에 삽입된 미세투석 시스템을 사용합니다.
- 마취하지 않은 각성 상태의 쥐를 HECF 샘플링을 위한 생물학적 모델로 사용합니다.
- 미세투석 기술을 통해 분당 1 µL의 속도로 액체를 측정합니다.
- 주요 단계에는 정밀한 카테터 삽입, 평형 도달 및 정기적인 샘플링 간격 설정이 포함됩니다.
- 데이터 무결성을 보장하기 위해 샘플링 후 미세투석 프로브 세척을 수행합니다.
주요 결과
- 수집된 HECF는 투명하고 무색으로, 질병 마커 분석이 가능합니다.
- 심층적인 방법론을 통해 신경세포 환경의 동적인 변화에 대한 실험을 수행할 수 있습니다.
- 이 방법으로 얻은 정보는 약물 효능 평가 및 조직 이화작용을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
결론
- 본 연구는 뇌 유체 역학 및 질환 과정에 대한 이해를 높이는 데 있어 미세투석의 잠재력을 입증합니다.
- 지속적인 모니터링 기능을 통해 약물 작용 및 대사 상태의 실시간 변화를 평가할 수 있습니다.
- 이러한 통찰은 신경계 질환을 해결하기 위한 전략을 강화하는 데 매우 중요합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
의식 상태의 쥐에서 해마 세포외액(HECF)을 실시간으로 동적 수집함으로써 중추신경계(CNS) 질환 진행 및 약물 효능과 관련된 신경화학적 변화를 직접 모니터링할 수 있습니다. 이러한 기능은 질환 관련 뇌 영역에서 정량적이고 시간 분해능이 높은 바이오마커 데이터를 제공함으로써 중개 신경과학의 예측 신뢰도를 높여줍니다. 이 접근 방식은 해마 경로를 표적으로 하는 신경 치료 포트폴리오의 조기 발견 및 기전적 리스크 완화를 지원합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- in vivo에서 중추신경계(CNS) 질환 기전의 기초가 되는 신경화학적 역동성의 분석을 가능하게 합니다.
- 해마 내 약물 및 대사체 효과를 정량화하여 기능적 타겟 검증을 지원합니다.
- 질환 관련 세포외 마커의 직접 측정을 통해 기전적 리스크 감소(de-risking)를 촉진합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 후속 화합물 스크리닝을 위해 뇌 세포외액의 검증된 정량적 샘플링을 제공합니다.
- 각성 상태의 동물 모델에서 신경화학 데이터의 재현 가능하고 표준화된 수집을 가능하게 합니다.
- CNS 활성 화합물에 대한 약력학적 반응 평가를 위한 분석법 개발을 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개 신경과학 분야에서 전임상 바이오마커 측정과 질환 관련 엔드포인트를 일치시킵니다.
- in vivo에서 약물의 동적인 효과를 추적함으로써 발견 단계부터 전임상 검증까지의 연속성을 가능하게 합니다.
- 실시간 신경화학적 판독값을 기반으로 위험 조정된 진행 결정을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 마이크로다이얼리시스법은 깨어 있는 쥐의 해마 세포외액에 대한 실시간 정량 분석을 가능하게 함으로써, 신약 발견부터 전임상 단계까지 이어지는 연속 과정에 통합되어 활용됩니다.
- 발견 생물학: 동적인 바이오마커 변화를 모니터링함으로써 CNS 타겟에 대한 가설 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 화합물 평가를 위해 어세이(assay)에 즉시 적용 가능한 재현성 있는 신경화학적 데이터를 제공합니다.
- 분석: 실험 조건 전반에 걸쳐 약물 효과와 질병 상태를 비교하기 위한 정량적 결과물을 제공합니다.
- 중개 연구: 바이오마커 측정치를 임상 평가 지표와 일치시킴으로써 전임상 연구와 중개 연구를 연결합니다.
- 기업 내 재사용: CNS 신약 발견 및 바이오마커 검증 워크플로우를 위해 재사용 가능한 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: CNS 표적 검증의 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 신경화학적 샘플링을 표준화하고 연구 간 재현성을 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 실행 가능한 바이오마커 데이터를 제공함으로써 go/no-go 결정 및 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 동적인 in vivo 증거를 기반으로 신경치료제 후보 물질의 위험 조정 우선순위 선정을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 정위 고정 수술 및 마이크로다이얼리시스 프로브 삽입에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 마이크로다이얼리시스 샘플링 및 정량 분석을 위한 전문 기기가 필요합니다.
- 샘플링 속도 및 분석 프로토콜에 대한 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- 다른 뇌 영역이나 질환 모델에 적용할 경우 프로토콜 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 프로브의 컷오프 사양으로 인해 샘플링은 20 kDa 미만의 분석물로 제한됩니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Brain Microdialysis Probe Implantation Surgery
2:24
Microdialysis System Connection and Probe Check
3:15
Collection of Hippocampal Extracellular Fluid (HECF) from the Awake Rat
4:02
Maintenance of the Microdialysis System and Devices After Sampling
4:36
Results: Analysis of HECF Collected Using the Microdialysis Sampling Equipment
4:54
Conclusion
