Name: 연체 동물의 원유 및 정제 추출물의 추정 항 크립토 코커스 특성 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 학습하세요 연체 동물 Cipangopaludina chinensis에서 항진균 화합물을 추출하여 Cryptococcus neoformans의 독성 인자를 억제하는 방법을. 이 기법은 생물막 형성을 70~80% 감소시켜 새로운 항진균 치료제 개발에 기여합니다.

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저자는 이 조사와 원고 피드백 전반에 걸쳐 귀중한 지원을 해준 Geddes-McAlister Lab 회원들에게 감사를 표합니다. 저자는 온타리오 대학원 장학금 및 국제 대학원 연구상 - University of Guelph에서 D.G.-G까지, 캐나다 혁신 재단(JELF 38798) 및 온타리오 대학 및 대학부 - J.G.-M에 대한 조기 연구원 상.

1. 연체 동물에서 단백질 추출
<ol><li>지정되고 승인된 자연 지역(예: Speed River, Guelph, Ontario)에서 연체동물을 수집합니다. 이 연구에서는 광범위한 잠재적 항진균 효과를 평가하기 위해 토착 종과 침입 종을 모두 선택했습니다.</li>
	<li>유봉과 절구를 사용하여 연체 동물 (예 : Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi 및 Cipangopaludina chinensis)의 껍질을 부드럽게 부수고 핀셋으로 단단한 조각을 제거합니다. 일반적으로 프로토콜 전체에서 사용하기 위해 10개의 연체동물이 풀링됩니다.</li>
	<li>장기를 수집하고 무게를 잰다. 약 15-20g의 샘플이 최적입니다. 가위를 사용하여 장기를 약 0.5-1cm 크기의 작은 조각으로 자릅니다.</li>
	<li>해부된 장기 샘플을 급속 동결하고 액체 질소로 절단합니다. 그런 다음 유봉과 박격포를 사용하여 장기 샘플을 미세한 분말로 분쇄합니다.</li>
	<li>장기 샘플 분말(약 15g)을 차가운 증류수(4°C) 30mL에 넣어 1:2 비율(w/v)을 얻습니다.</li>
	<li>시료 2mL를 고충격 2mL 튜브에 붓습니다. 3mm 스테인리스 스틸 비드(약 500μg)를 각 튜브에 한 스쿱 정도 넣고 1,200rpm 및 4°C에서 3분 동안 블렌더( 재료 표 참조)를 사용하여 균질화합니다.</li>
	<li>4°C에서 20분 동안 12,000× g 에서 원심분리합니다. 신선한 50mL 튜브에 피펫으로 모든 상층액을 수집하고 펠릿을 버립니다.</li>
	<li>필터-0.22 μm 멤브레인을 사용하여 상층액을 멸균한다. 샘플을 얼음에 보관하고 해당되는 경우 정화 프로토콜(섹션 2)로 진행합니다. 참고: 샘플은 액체 질소에서 급속 냉동하고 -20°C에서 보관하여 조추출물로 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 연체 동물 추출물의 정화
<ol><li>단계 1.8의 상청액 샘플을 60°C의 열조에 30분 동안 넣습니다. 그런 다음 샘플을 얼음이 담긴 양동이에 20분 동안 옮겨 빠르게 식힙니다.</li>
	<li>시료를 15,000 × g 에서 4°C에서 45분 동안 원심분리합니다. 신선한 50mL 튜브에 상청액을 모으고 펠릿을 버립니다. 0.22μm 멤브레인 필터를 사용하여 샘플을 필터 멸균한 다음 얼음에 보관합니다.</li>
	<li>정량 분석법(예: 비신코닌산 분석법17)을 사용하여 단계 1.8(즉, 조추출물) 및 단계 2.2(즉, 정제된 추출물)의 샘플 중 단백질 농도를 측정합니다. 최적의 단백질 농도 범위는 4-8mg/mL입니다.</li>
	<li>샘플을 얼음에 최대 1시간 동안 보관하거나 액체 질소에서 급속 동결하고 필요할 때까지 -20°C에서 보관합니다.</li>
</ol>3. 저해활성 분석
<ol><li>조추출물 및 정제된 추출물의 저해활성을 효소적 분석법을 이용하여 측정하였다. 참고: 각 효소 분석은 효소(예: 곰팡이 독성 16,17,18에 관여하는 서브틸리신 A, 발색 기반 분석의 경우 일반적으로 약 1 x 10-9 mol/L), 완충액 및 기질로 구성됩니다. 기질이 효소를 만나면 반응이 시작됩니다. 효소 활성은 생성물로의 기질 전환 속도에 비례합니다.</li>
	<li>두 매개변수 사이에 선형 의존성이 얻어질 때까지 효소 활성(EA)에 대한 효소 농도(EC)의 영향을 평가합니다. 다음 단계에서는 측정된 선형 범위 내에서 효소 농도를 사용합니다. 참고: 펩티다아제 서브틸리신 A에 대한 효소 분석은 다음 단계에 자세히 설명되어 있습니다.</li>
	<li>미정제(단계 1.11) 또는 정화(단계 2.5)를 10μL의 서브틸리신 A(3.2단계에서 결정된 농도) 및 pH 8.6에서 100mM Tris-HCl 220μL(대조군의 경우 추출물을 추가하지 않고 Tris 완충액 230μL 추가)와 함께 96웰 평면 바닥 플레이트에서 25°C에서 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>서브틸리신 A의 기질인 N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide 10μL을 최종 농도1Km (Michaelis-Menten 상수, 서브틸리신 A가 있는 이 기질의 경우 0.2mM)로 첨가하여 최종 반응 부피 250μL를 만듭니다.</li>
	<li>3분 동안 15초마다 405nm에서 광학 밀도(OD)를 판독하여 시간 경과에 따른 제품의 외관을 모니터링하여 효소 활성을 측정합니다.</li>
	<li>잔류 효소 활성을 결정하여 연체동물 추출물의 존재 하에서의 효소 활성과 추출물의 부재 시의 효소 활성의 비율을 계산한다.</li>
	<li>저해 활성이 관찰되면(즉, 잔류 활성이 1 미만인 경우) 표준 방법19에 따라 추출물의 농도 범위(예: 200μg/mL에서 1μg/mL까지 2배 희석 시리즈)를 사용하여 억제 농도50(IC50) 값을 측정합니다.</li>
</ol>4. 연체 동물 추출물이 C. neoformans 성장에 미치는 영향
<ol><li>10μL 피펫 팁을 사용하여 C. neoformans var. grubii H99 야생형(WT) 5mL의 효모 추출물-펩톤-포도당(YPD) 배지(10g/L 효모 추출물, 20g/L 펩톤 및 20g/L 덱스트로스, pH 6.5)에 단일 콜로니를 넣고 30°C 및 200rpm에서 16-18시간 동안 배양합니다. 생물학적 삼중 및 기술 복제로 실험을 수행하십시오.</li>
	<li>배양액 500 μL를 큐벳에 모으고, 600 nm에서 OD를 판독하여 성장을 측정하였다. 배양물을 효모 질소 염기(YNB) 배지로 희석하여 최종OD600 0.02가 되도록 하였다.</li>
	<li>C. neoformans 추출물(즉, 미정제 및 정제)의 농도가 다른 세포(예: 440μg/mL에서 15μg/mL 단백질의 3배 희석 시리즈)를 공동 배양합니다. 이를 위해 10 μL의 추출물과 희석 된 C. neoformans 배양 물 190 μL의 (4.2 단계)를 96 웰 플레이트에 혼합합니다.</li>
	<li>200 rpm 및 37°C에서 72시간 동안 1시간 간격으로 플레이트 리더를 사용하여 OD600 을 판독하여 성장을 측정합니다.</li>
</ol>5. 연체 동물 추출물이 C. neoformans 멜라닌 생성에 미치는 영향
<ol><li>L-3,4-디하이드록시페닐알라닌(L-DOPA) 플레이트를 준비합니다.<ol><li>14g/L 한천 230mL를 오토클레이브하고 50-60°C에 도달할 때까지 식힙니다.</li>
		<li>3.25 mL의 1 M 글리신, 7.35 mL의 1 M KH2PO4, 2.5 mL의 1 M MgSO4.7H 2O, 0.6 mL의 40 % 글루코스, 70 μL의 10 mM 티아민 및 2.5 mL의 100 mM L-DOPA (필터-멸균)를 액체 한천에 첨가한다.</li>
		<li>혼합물 15mL를 페트리 플레이트에 붓고 어두운 곳에서 약 1시간 동안 건조시킨 다음 2-4°C에서 최대 1주일 동안 보관합니다. 한천이 제대로 건조되도록 뚜껑이 부분적으로 들어 올려졌는지 확인하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>5mL의 YNB 배지에 4.1단계의 C. neoformans 배양액 50μL를 접종합니다. 30°C 및 200rpm에서 16-18시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>세포를 1,000 × g 에서 4°C에서 5분 동안 스핀 다운합니다. pH 7.4에서 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 2배 세척합니다.</li>
	<li>혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. 세포를 PBS 1mL에 재현탁하여 최종 농도 106 cells/mL에 도달합니다.</li>
	<li>미정제 및 정제된 연체동물 추출물의 희석 시리즈(예를 들어, 2배)를 준비한다. 유사하게, 96웰 플레이트에서 멸균 PBS를 사용하여 1 x 106 cells/mL에서 1 x 101 cells/mL까지 C. neoformans 세포(단계 5.4)의 10배 희석 시리즈(단계 96)를 준비합니다.</li>
	<li>면봉을 사용하여 L-DOPA 한천이 들어 있는 페트리 플레이트에 추출물 200μL를 바르고 15분 동안 건조시킵니다.</li>
	<li>각 웰에서 배양액 5μL를 L-DOPA 플레이트에 스팟하고 방울 사이에 1cm를 남겨 둡니다. 어두운 곳에서 15분 동안 말리십시오.</li>
	<li>플레이트를 30°C 및 37°C의 정적 인큐베이터에서 3-5일 동안 배양하고 카메라 또는 플레이트 이미저(예: 스캐너)로 24시간마다 이미지를 캡처합니다. 참고: 연체동물 추출물의 성장 억제 효과에 대한 온도의 영향을 조사하기 위해 두 가지 온도 조건이 사용되며, 30°C는 환경을, 37°C는 인간의 생리적 온도를 나타냅니다.</li>
</ol>6. 연체 동물 추출물이 C. neoformans 다당류 캡슐 생산에 미치는 영향
<ol><li>아래 설명과 같이 저철분 매체(LIM)를 준비합니다.<ol><li>킬레이트 수지 5g( 재료 표 참조)을 초순수 60mL에 녹이고 유리 컬럼(직경 2cm x 길이 25cm)에 포장합니다. 100mL의 물로 컬럼을 세척하고 수집된 물을 버립니다.</li>
		<li>킬레이트 컬럼에 멸균 초순수 2L를 통과시켜 저철분수(LI-water)를 준비합니다. LI-water를 4°C에서 최대 3개월 동안 보관합니다.</li>
		<li>5g의 포도당을 100mL의 LI-물에 녹입니다. 별도의 비커에 5g의 L-아스파라긴을 200mL의 LI-water에 녹입니다.</li>
		<li>500 mL의 LI-water에 다음을 순서대로 첨가한다: 4.78 g의 HEPES, 0.4 g의 K2HPO4, 0.08 g의 MgSO4.7H2O, 1.85 g의 NaHCO3, 0.25 g의 CaCl2.2H2O.</li>
		<li>6.1.3단계와 6.1.4단계의 솔루션을 결합합니다. 100 μM의 최종 농도에 100 mM bathophenanthrolinedisulfonic acid sodium salt (BPS)의 1 mL를 첨가한다.</li>
		<li>7.2M LI-MOPS로 pH를 1로 조정합니다. LI-water를 최종 부피 1L에 첨가하고 배지를 0.22μm 멤브레인을 통과시켜 여과 멸균합니다. 100 μL의 멸균 티아민 (4 mg / mL)을 배지에 첨가하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>5mL의 YNB 배지에 4.1단계의 C. neoformans 배양액 50μL를 접종합니다. 30°C 및 200rpm에서 16-18시간 동안 배양합니다. 이 배양액을 사용하여 5mL의 LIM을 105 cells/mL의 최종 농도로 접종합니다.</li>
	<li>적절한 부피의 연체동물 추출물(예: 2배 희석 또는 이전 독성 분석에서 측정된 부피)을 추가하여 원하는 농도에 도달합니다. 느슨한 캡으로 37°C 및 200rpm에서 72시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 1 mL의 세포를 수집하고, 멸균 PBS, pH 7.4, 4°C에서 2분 동안 1,500 × g 으로 2x 세척하였다.</li>
	<li>세포를 PBS 1mL에 부드럽게 재현탁합니다. 유리 현미경 슬라이드 위에 India Ink와 1:1 비율(예: India Ink 4μL과 세포 현탁액 4μL)로 세포를 혼합합니다. 슬라이드 위에 커버슬립을 놓습니다.</li>
	<li>63x 오일 대물렌즈가 있는 미분 간섭 대비(DIC) 현미경을 사용하여 샘플을 시각화합니다( 재료 표 참조). 콘트라스트를 자동으로 설정하고 현미경 다이얼을 사용하여 수동으로 초점을 맞춥니다. 모든 사진을 선택하고 TIFF 형식으로 내보냅니다. 필터를 적용할 필요가 없습니다.</li>
	<li>ImageJ20의 눈금자 도구를 사용하여 셀 본체 크기에 대한 전체 셀 크기(캡슐 포함)의 비율을 정량화합니다.</li>
</ol>7. 연체 동물 추출물이 C. neoformans 생물막 생산에 미치는 영향
<ol><li>5mL의 YNB 배지에 4.1단계의 C. neoformans 배양액 50μL를 접종합니다. 30°C 및 200rpm에서 16-18시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>5mL 배양물에서 세포를 수확합니다. 세포를 멸균 PBS, pH 7.4, 4°C에서 2분 동안 1,500 × g 으로 세척한다.</li>
	<li>혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 3mL의 세포를 최종 농도 107 cells/mL로 재현탁합니다.</li>
	<li>300 μL의 세포 현탁액을 멸균된 폴리스티렌 바닥이 평평한 24웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 미디어가 있는 웰은 컨트롤로만 사용하십시오.</li>
	<li>적절한 부피의 연체 동물 추출물(예: 2배 희석 또는 이전 독성 분석에서 측정된 부피)을 추가하여 10-20 μg/mL 단백질의 최종 농도에 도달합니다. 추출 볼륨이 총 볼륨의 10%를 초과하지 않는지 확인합니다.</li>
	<li>플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고(배지 증발을 방지하기 위해) 30°C 및 37°C에서 정적 인큐베이터를 사용하여 48시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>병이나 디스펜서를 사용하여 웰을 멸균 수로 2 배 세척하고 실온에서 10-15 분 동안 자연 건조시킵니다. 그런 다음 0.3% 크리스탈 바이올렛 용액 100μL를 각 웰(배지 전용 대조군 웰 포함)에 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>멸균 된 물로 우물을 3 번 철저히 씻으십시오 (세척 중에 생물막이 파괴되지 않습니다). 100% 에탄올 200μL를 넣고 RT에서 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>75 μL를 새로운 96-웰 플랫 바닥 플레이트로 옮기고 OD550을 판독합니다. 생물막 형성을 (샘플의 OD550nm - 블랭크의 OD550nm)으로 정량화한다. </li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

여기에 설명된 추출 프로토콜은 캐나다 온타리오에서 수집한 연체동물에서 화합물을 분리하는 방법을 설명하고 인간 진균 병원체인 C. neoformans에 대한 연체동물 추출물 사용에 대한 새로운 조사를 보여줍니다. 이 프로토콜은 무척추동물의 펩티다아제 억제제 활성을 조사하는 연구의 증가에 추가된다13. 추출하는 동안 일부 추출물 샘플은 필터 멤브레인을 막는 가용성 다당류 및/또는 안료의 존재로 인해 필터 멸균이 어려웠습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 먼저 5μm 멤브레인을 통해 필터링하여 큰 화합물(예: 파괴된 세포막, 게놈 DNA)을 배제하여 단백질이 필터를 통과하도록 한 다음 0.22μm 멤브레인을 통해 다시 필터링하는 것이 좋습니다. 이러한 단계는 샘플을 오염시키고 다운스트림 실험을 방해할 수 있는 미생물의 존재를 제한하기 때문에 프로토콜에 매우 중요합니다.
이 조사 동안, 펩티다아제 억제제는 서브틸리신의 S8 계열...

크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)는 HIV/AIDS 보균자와 같은 면역 저하 숙주에서 심각한 질병을 일으키는 인간 진균 병원체이며1, AIDS 관련 사망의 약 19%를 차지한다2. 곰팡이는 아졸, 폴리엔 및 플루시토신을 포함한 여러 종류의 항진균제에 취약하며, 이는 뚜렷한 메커니즘을 사용하여 살균 및 살균 활성을 발휘합니다 3,4. 그러나 임상 및 농업 환경에서 항진균제의 광범위한 사용과 균주 교잡은 C. neoformans5를 포함한 여러 곰팡이 종에서 내성의 진화를 증폭시켰다.
항진균 내성 문제를 극복하고 전 세계적으로 진균 감염의 유병률을 줄이기 위해, 유망한 접근법은 크립토코커스 종의 독성 인자(예: 온도 적응성, 다당류 캡슐, 멜라닌 및 세포외 효소)를 잠재적인 치료 표적으로 사용하는 것이다 4,6 . 이러한 독성 인자는 문헌에 잘 특성화되어 있고, 이러한 인자를 표적으로 삼으면 세포 성장을 표적으로 삼는 것이 아니라 독성을 손상시켜 더 약한 선택 압력을 가함으로써 항진균 내성 비율을 잠재적으로 감소시킬 수 있기 때문에 이러한 접근법은 몇 가지 장점이 있다6. 이러한 맥락에서 많은 연구에서 크립토코커스 종 7,8,9의 독성을 감소시키거나 억제하기 위해 세포외 효소(예: 프로테아제, 펩티다아제)를 표적으로 삼을 가능성을 평가했습니다. 
무척추 동물 및 식물과 같은 유기체는 병원체로부터 자신을 보호하기 위한 적응 면역 체계를 가지고 있지 않습니다. 그러나 그들은 미생물과 포식자를 다루기 위해 엄청난 양의 화합물을 가진 강력한 선천성 면역 체계에 의존합니다10. 이러한 분자에는 펩티다아제 억제제가 포함되어 있는데, 이는 체림프 응고, 사이토카인 및 항균 펩타이드의 합성, 병원체의 프로테아제를 직접 불활성화하여 숙주를 보호하는 것과 같은 무척추동물 면역의 세포 과정을 포함하여 많은 생물학적 시스템에서 중요한 역할을 한다11. 따라서, 연체동물과 같은 무척추동물의 펩티다아제 억제제는 잠재적인 생물의학적 응용을 가지고 있지만, 많은 것들이 특성화되지 않은 채로 남아 있다10,12,13. 이러한 맥락에서 온타리오에는 약 34종의 육상 연체동물이 있고 캐나다에는 180종의 민물 연체동물이 있습니다14. 그러나 심층적 인 프로파일 링 및 특성화는 여전히 제한적입니다15. 이 유기체들은 잠재적인 항진균 활성을 가진 새로운 화합물의 식별을 위한 기회를 제공한다10.
이 프로토콜에서는 무척추동물(예: 연체동물)에서 추출물을 분리하고 명확히 하는 방법(그림 1)을 설명한 후 추정되는 펩티다아제 억제 활성을 측정하는 방법을 설명합니다. 그런 다음 표현형 분석을 사용하여 C. neoformans 독성 인자 생산에 미치는 영향을 측정하여 이러한 추출물의 항진균 특성을 평가합니다(그림 2). 원유 추출물과 정제 추출물 사이의 항진균 특성의 차이는 연체 동물의 미생물 인자(예: 숙주 미생물군집에 의해 생성된 2차 대사 산물 또는 독소)를 나타낼 수 있으며, 이는 실험적 관찰에 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이러한 발견은 작용 방식을 밝히기 위해 조잡한 추출물과 정제된 추출물을 독립적으로 평가하기 위한 이 프로토콜의 필요성을 뒷받침합니다. 또한 추출 공정은 편향되지 않으며 과다한 곰팡이 및 박테리아 병원체에 대한 항균 특성을 검출할 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 C. neoformans 에 대한 항진균 특성을 가진 연체동물 종의 우선 순위를 정하기 위한 시작점과 추정 억제 메커니즘을 통해 효소 활성과 독성 인자 생산 사이의 연관성을 평가할 수 있는 기회를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>0.2 &무; m Filters</td><td>VWR</td><td>28145-477 (북미)</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브 (Safe-Lock)</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 튜브 (Safe-Lock)</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9628-5G</td><td>CAS #: 59-92-7</td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Costar (Corning)</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm 24</td><td>NEXT ADVANCE</td><td>BBY24M</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000010</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100 Resin</td><td>BioRad</td><td>142-1253</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator (Static)</td><td>SANYO</td><td>사용할 수</td><td></td> 없음</tr><tr><td>Cryptococcus neoformans H99</td><td>ATCC</td><td>208821</td><td></td></tr><tr><td>DIC 현미경</td><td>올림푸스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DIC 현미경 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>포도당(D-포도당, 무수, 시약 등급)</td><td>BioShop</td><td>GLU501</td><td>CAS #: 50-99-7</td></tr><tr><td>글리신</td><td>피셔 화학</td><td>G46-1</td><td>CAS #: 56-40-6</td></tr><tr><td>GraphPad 프리즘 9</td><td>Dotmatics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>VWR</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트 (MgSO4.7 H2O)</td><td>Honeywell</td><td>M1880-500G</td><td>CAS #: 10034-99-8&nbsp;</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BioShop</td><td>PEP403</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충염 pH 7.4</td><td>BioShop</td><td>PBS408</td><td>SKU: PBS408.500</td></tr><tr><td>Plate reader (Synergy-H1)</td><td>BioTek (Agilent)</td><td>Not</td><td></td></tr><tr><td>available Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td><td>Fisher Chemical</td><td>P285-500</td><td>CAS #: 7778-77-0</td></tr><tr><td>Subtilisin A</td><td>시그마 알드리치</td><td>P4860</td><td>CAS # : 9014-01-01</td></tr><tr><td>숙시닐 알라 알라 프로 페 - p- 니트로 아닐라이드</td><td>시그마 알드리치</td><td>573462</td><td>CAS # # : 70967-97-4</td></tr><tr><td>열욕</td><td>VWR</td><td>76308-834</td><td></td></tr><tr><td>티아민 염산염</td><td>피셔 - 생물 시약</td><td>BP892-100</td><td>CAS # : 67-03-8</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>BioShop</td><td>YEX401</td><td>CAS # : 8013-01-2</td></tr><tr><td>효모 질소 베이스 (아미노산 포함)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1250-250G</td><td>YNB&nbsp;</td></tr></tbody></table>

연체 동물의 원유 및 정제 추출물의 추정 항 크립토 코커스 특성 평가

Assessing the Putative Anticryptococcal Properties of Crude and Clarified Extracts from Mollusks

크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans )는 캡슐화된 인간 진균 병원체로 전 세계적으로 분포하여 주로 면역 저하 개체를 감염시킵니다. 임상 환경에서 항진균제의 광범위한 사용, 농업에서의 사용 및 균주 교잡은 내성의 진화를 증가시켰습니다. 항진균제에 대한 내성 증가율은 전 세계 임상의와 과학자들 사이에서 우려가 커지고 있으며 새로운 항진균 요법 개발의 시급성이 높아지고 있습니다. 예를 들어, C. neoformans 는 조직 분해, 세포 조절 및 영양소 획득에 역할을 하는 세포내 및 세포외 효소(예: 펩티다아제)를 포함한 여러 독성 인자를 생성합니다. 억제제에 의한 이러한 펩티다아제 활성의 중단은 곰팡이의 성장과 증식을 교란시켜 이것이 병원체 퇴치를 위한 중요한 전략이 될 수 있음을 시사합니다. 중요한 것은 연체 동물과 같은 무척추 동물이 생물 의학 응용 및 항균 활성을 가진 펩티다제 억제제를 생산하지만 곰팡이 병원체에 대한 사용 측면에서 충분히 연구되지 않았다는 것입니다. 이 프로토콜에서는 연체동물에서 글로벌 추출을 수행하여 조잡하고 정제된 추출물에서 잠재적인 펩티다제 억제제를 분리하고 고전적인 크립토코커스 독성 인자에 대한 효과를 평가했습니다. 이 방법은 항진균 특성을 가진 연체동물의 우선 순위를 지원하고 연체동물에서 발견되는 천연 억제제를 활용하여 항독성제를 발견할 수 있는 기회를 제공합니다.

본원에 기술된 워크플로우는 C. neoformans에 대한 잠재적인 항독성 특성을 갖는 연체동물로부터 단백질 및 펩티드의 분리를 가능하게 한다. 유사하게, 다양한 형태의 추출물(즉, 원유 및 정제)을 평가하면 잠재적인 활성 화합물의 반정제가 가능하고 다운스트림 평가(예: 질량 분석 기반 단백질체학)를 지원합니다. 일반적으로 단백질 추출 워크플로우는 단백질 농도가 4-8mg/mL인 균질화된 용액을 생성합니다. 여기에서 대표적인 결과는 C. chinensis 추출물의 효소 활성 및 항진균 특성의 평가를 보여줍니다. 조잡하고 정제된 추출물은 서브틸리신 A(C. neoformans의 독성과 관련됨)(그림 3)의 단백질 분해 활성을 억제할 수 있었으며, IC 50 값은 각각 5.3μg/mL 및 4.53μg/mL였습니다. C. chinensis 추출물의 활성은 곰팡이 성장, 캡슐 및 멜라...

인간 진균 병원체인 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans )는 숙주 내에서 생존을 촉진하기 위해 다양한 독성 인자(예: 펩티다아제)를 생성합니다. 환경적 틈새는 새로운 천연 펩티다아제 억제제의 유망한 공급원입니다. 이 프로토콜은 연체 동물 추출물의 준비와 곰팡이 독성 인자 생산에 미치는 영향에 대한 평가를 간략하게 설명합니다.

Cryptococcus neoformans is an encapsulated human fungal pathogen with a global distribution that primarily infects immunocompromised individuals. The ...

이 프로토콜은 항 크립토 코카인 특성을 가진 연체 동물로부터 화합물을 분리 할 수 있습니다. 이 기술은 인간 곰팡이 병원체를 죽이는 것을 포함하여 잠재적인 특성을 가진 연체동물에서 화합물을 식별하고 분리하는 편견 없는 접근 방식을 제공합니다. HIV 프로테아제 억제제와 같은 다른 화합물이 HIV 환자를 치료하는 데 사용됩니다.그러나 다른 병원체로의 확장과 천연 자원 조사는 새로운 발견의 길을 나타냅니다. 마지막 단계는 샘플이 필터링되지 않을 수 있으므로 가장 어려운 단계입니다. 결과적으로 필터링을 위해 샘플을 희석해야 할 수 있습니다.지정되고 승인된 자연 지역에서 Cipangopaludina chinensis와 같은 연체동물을 수집하는 것으로 시작하십시오. 광범위한 잠재적 항진균 효과를 평가하기 위해 토착 및 침입 종을 선택하십시오. 유봉과 박격포를 사용하여 C.chinensis의 껍질을 부드럽게 부수고 핀셋으로 단단한 조각을 제거합니다.일반적으로 프로토콜을 위해 10개의 연체동물이 풀링됩니다. 약 15-20 그램의 샘플을 수집하고 무게를 측정하고 가위를 사용하여 장기를 약 0.5-1 센티미터 크기의 작은 조각으로 자릅니다. 유봉과 모르타르를 사용하여 장기 샘플을 미세 분말로 분쇄하기 전에 액체 질소를 사용하여 해부하고 절단한 장기 샘플을 급속 동결합니다.완료되면 약 15g의 장기 샘플 분말을 30ml의 차가운 증류수에 첨가하여 1:2의 비율을 얻습니다. 2 밀리리터의 샘플을 고 임팩트 2 밀리리터 튜브에 붓고 약 500 마이크로 그램의 3 밀리미터 스테인리스 스틸 비드를 각 튜브에 추가합니다. 불릿 블렌더 또는 비드 비터를 사용하여 섭씨 4도에서 1, 200 RPM으로 3 분 동안 균질화합니다.튜브를 섭씨 4도에서 20 분 동안 12, 000 G에서 원심 분리합니다. 신선한 50 밀리리터 튜브에 상청액을 모으고 펠릿을 버립니다. 0.22 마이크로 미터 멤브레인을 사용하여 상청액을 여과하고 추출물을 정화하기 전에 샘플을 얼음에 보관하십시오.상청액 샘플을 섭씨 60도의 열조에 30분 동안 넣고 샘플을 얼음으로 채워진 양동이에 20분 동안 옮겨 즉시 식힙니다. 차가운 샘플을 섭씨 4도에서 45 분 동안 15, 000 G에서 원심 분리합니다. 신선한 50 밀리리터 튜브에 상청액을 모으고 펠릿을 버립니다.필터는 0.22 미크론 멤브레인 필터를 사용하여 샘플을 멸균 한 다음 얼음에 보관합니다. 완료되면 정량 분석을 사용하여 원유 및 정제된 추출물의 단백질 농도를 결정합니다. 최적의 단백질 농도 범위는 밀리리터당 4-8마이크로그램입니다.샘플을 얼음 위에서 최대 1시간 동안 배양하거나 액체 질소에서 급속 냉동한 후 필요할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 96웰 편평한 바닥 플레이트에서, 밀리리터당 4밀리그램의 미정제 또는 정제된 연체동물 단백질 추출물 10마이크로리터, 측정된 선형 범위 내의 농도를 갖는 서브틸리신 A 10마이크로리터, 및 섭씨 25도에서 10분 동안 pH 8.6의 100밀리몰 트리스 염산염 220마이크로리터를 배양한다. 그런 다음 서브 틸리 신 A의 기질 인 N- 석시 닐 알라닌, 알라닌, 프롤린, 페놀알라닌, p- 니트로 아닐린 10 마이크로 리터를 최종 반응 부피 250 마이크로 리터에 대해 1KM의 최종 농도로 첨가한다.완료되면 3분 동안 15초마다 405나노미터의 광학 밀도를 모니터링하여 효소 활성을 측정합니다. 판독하는 동안 추출물이 없는 웰이 직선 곡선을 생성하는지 확인하십시오. 잔류 효소 활성을 결정하기 위해, 연체 동물 추출물의 존재 하에서의 효소 활성과 추출물의 부재 시의 효소 활성의 비율을 계산한다.저해 활성이 관찰되는 경우, 추출물의 농도 범위를 이용하여 저해 농도 50 또는 IC50 값을 측정한다. 10 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 5밀리리터의 효모 추출물, 펩톤, 포도당 또는 YEPD 배지에 C.neoformans H99 야생형의 단일 콜로니를 도입하고 섭씨 30도 및 200RPM에서 16-18시간 동안 배양합니다. 큐벳에 500 마이크로 리터의 배양 물을 수집하고 600 나노 미터에서 광학 밀도를 판독하여 성장을 측정합니다.배양물을 효모 질소 염기 또는 YNB 배지로 최종 광학 밀도 0.02로 희석한다. 96웰 플레이트에서 10마이크로리터의 추출물과 희석된 C.neoformans 배양물 190마이크로리터를 혼합하여 다양한 농도의 미정제 및 정제된 추출물을 갖는 C.neoformans 세포를 공동 배양합니다. 200 RPM 및 섭씨 37도에서 72시간 동안 15분 내지 1시간 간격으로 플레이트 리더를 이용하여 600 나노미터에서 광학 밀도를 판독하여 성장을 측정하였다.C.chinensis의 추출물은 크립토 코커스 네오 포르 만스의 독성과 관련된 서브 틸리 신 A의 단백질 분해 활성을 억제 할 수 있었으며, IC50 값은 조 추출물에서 밀리 리터당 5.3 마이크로 그램, 정제 추출물에서 밀리 리터당 4.53 마이크로 그램입니다. 곰팡이 성장을 포함하여 C.Neoformans 독성 인자 생산과 관련된 과정에 대한 C.chinensis 추출물의 평가는 원유 및 정제된 C.chinensis 추출물의 존재 하에 섭씨 37도에서 곰팡이 성장이 크게 감소한 것으로 나타났습니다. 캡슐, 멜라닌 생성 및 생물막 형성에 대한 추출물의 평가는 조잡하거나 정제된 C.chinensis 추출물의 존재 하에서 캡슐 또는 멜라닌 생성에 변화가 없음을 보여주었습니다.그러나, 생물막 형성에서 70 내지 80%의 현저한 감소가 처리되지 않은 대조군에 비해 고농도의 조잡하고 정제된 추출물에서 관찰되었다. 프로토콜의 성공 여부는 분쇄, 적절한 양의 효소 첨가 및 기질 첨가 후 판독을 포함한 적절한 추출 절차에 달려 있습니다. 이 기술은 중요한 크립토코커스 독성 인자로서 열 내성에 중점을 둡니다.그러나 멜라닌 및 캡슐 생성, 생물막 형성과 같은 다른 독성 인자를 평가할 수 있습니다. 이러한 결과는 더 많은 안정성, 특이성을 제공하고 내성이 적은 천연 화합물을 사용하는 항진균 전략에 대한 새로운 접근 방식을 구성하는 새로운 경로를 열어줍니다. 장기적인 목표는 이러한 곰팡이 병원체에 대한 새로운 방법을 찾고 저항성 메커니즘을 최소화하는 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 국물 미량 희석 분석을 사용하여 항진균 화합물을 스크리닝하는 체외 분석을 보여줍니다. 테스트 화합물은 마이크로타이터 플레이트에서 연속적으로 희석되고 진균 접종물로 배양됩니다. 배양 후, 테스트 화합물의 항진균 가능성과 최소 억제 농도(MIC)를 평가하기 위해 플레이트에 눈에 띄는 곰팡이 성장이 없는 웰이 있는지 검사합니다.

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이 연구는 박테리아 생존력을 신속하게 평가하기 위해 형광 및 발광을 사용하여 최근에 생성된 이중 리포터 균주를 사용하여 Mycobacterium abscessus 에 대한 고처리량 스크리닝을 위한 분석을 개발했습니다. 이 프로토콜은 이 약물 내성 박테리아에 대한 신약을 스크리닝하려는 연구자들과 관련이 있습니다.

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