Name: 3D 세포 배양을 위한 미세 다공성 어닐링 입자 스캐폴드의 입자 분획 제어 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 배우세요 MAP 스캐폴드에서 입자 분획을 정밀하게 제어하는 방법을. 이 기술은 조직 공학 및 재생 의학에서 재현 가능한 실험과 향상된 세포 반응을 가능하게 합니다.

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저자는 국립 보건원, 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599) 및 국립 알레르기 및 전염병 연구소 (1R01AI152568)에 감사드립니다. 이 작업은 노스 캐롤라이나 연구 삼각형 나노 기술 네트워크 (RTNN)의 회원 인 듀크 대학교 공유 재료 계측 시설 (SMIF)에서 부분적으로 수행되었으며, 이는 국립 나노 기술 조정 인프라 (NNCI)의 일환으로 국립 과학 재단 (수상 번호 ECCS-2025064)이 지원합니다. 저자들은 실험실의 전 박사후 연구원인 Lucas Schirmer 박사와 세포 배양 실험을 위한 3D 인쇄 장치를 생성하는 데 도움을 준 Ethan Nicklow에게 감사드립니다.

<ol><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).</li>
<li>Darling, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+by+click+Microporous+Annealed+Particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Click by click Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391(2020).</li>
<li>Truong, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+annealed+particle+hydrogel+stiffness%2C+void+space+size%2C+and+adhesion+properties+impact+cell+proliferation%2C+cell+spreading%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer.</a> Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2020).</li>
<li>Pfaff, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+improved+photoannealing+of+Microporous+Annealed+Particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Selective and improved photoannealing of Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).</li>
<li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li>
<li>Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clickable+microgel+scaffolds+as+platforms+for+3D+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254(2017).</li>
<li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Advanced Materials. 34 (12), 2109194(2022).</li>
<li>Wilson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometric+post+modification+of+hydrogel+microparticles+dictates+neural+stem+cell+fate+in+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Stoichiometric post modification of hydrogel microparticles dictates neural stem cell fate in microporous annealed particle scaffolds.</a> Advanced Materials. 34 (33), 2201921(2022).</li>
<li>Muir, V. G., Qazi, T. H., Shan, J., Groll, J., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+microgel+fabrication+technique+on+granular+hydrogel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).</li>
<li>Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jammed+microgel+inks+for+3D+printing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Jammed microgel inks for 3D printing applications.</a> Advanced Science. 6 (1), 1801076(2018).</li>
<li>Anderson, A. R., Nicklow, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+fraction+as+a+bioactive+cue+in+granular+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Particle fraction as a bioactive cue in granular scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 150, 111-127 (2022).</li>
<li>Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+heterogeneous+epidermal+growth+factor+release+from+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogel+for+improved+wound+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).</li>
<li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+emulsion-to-powder+technology+for+the+high-fidelity+preservation+of+molecular%2C+colloidal%2C+and+bulk+properties+of+hydrogel+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Polymer+Materials%22%5BJournal%5D)">Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions.</a> ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).</li>
<li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+variable+height+photolithography+for+valved+multilayer+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55276(2017).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Magnetic+Resonance+%28NMR%29+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database.+Organic+Chemistry.+JoVE%22%5BJournal%5D)">Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy.</a> JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. JoVE. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Roosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+microgel+building+blocks+for+microporous+annealed+particle+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold.</a> Journal of Visualized Experiments. (184), e64119(2022).</li>
<li>Zhang, H., Dicker, K. T., Xu, X., Jia, X., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacial+bioorthogonal+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Macro+Letters%22%5BJournal%5D)">Interfacial bioorthogonal crosslinking.</a> ACS Macro Letters. 3 (8), 727-731 (2014).</li>
<li>Welzel, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogel+micromechanics+unraveled+by+atomic+force+microscopy-based+nanoindentation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Cryogel micromechanics unraveled by atomic force microscopy-based nanoindentation.</a> Advanced Healthcare Materials. 3 (11), 1849-1853 (2014).</li>
<li>Plieva, F., Huiting, X., Galaev, I. Y., Bergenståhl, B., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroporous+elastic+polyacrylamide+gels+prepared+at+subzero+temperatures%3A+control+of+porous+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macroporous elastic polyacrylamide gels prepared at subzero temperatures: control of porous structure.</a> Journal of Materials Chemistry. 16 (41), 4065-4073 (2006).</li>
<li>Rommel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+microgel+rods+interlinked+into+soft+macroporous+structures+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture.</a> Advanced Science. 9 (10), 2103554(2022).</li>
<li>Kurt, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+delivery+from+granular+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid delivery from granular hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867(2021).</li>
<li>Isaac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+bio-orthogonally+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).</li>
<li>Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+governing+polyethylenimine+polyplex+transfection+in+Microporous+Annealed+Particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in Microporous Annealed Particle scaffolds.</a> Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).</li>
<li>Koh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vivo+delivery+of+stem+cells+using+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds.</a> Small. 15 (39), 1903147(2019).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+tissue+formation+through+assembly+of+microgels+containing+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cartilage tissue formation through assembly of microgels containing mesenchymal stem cells.</a> Acta Biomaterialia. 77, 48-62 (2018).</li>
</ol>

ARA와 TS는이 기술에 대한 임시 특허를 출원했습니다.

HA-NB 마이크로젤의 미세유체 생산은 에멀젼 배치 생산보다 더 좁은 범위의 크기 분포를 갖는 마이크로겔을 생성하는 것으로 나타났다 3,9. 이 프로토콜에 기재된 마이크로겔은 물질 분해를 지지하기 위해 MMP-절단가능한 가교결합제 (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2)를 사용하여 제형화하였다. 그러나, HA-NB 마이크로겔은 또한 비분해성인 디티오트레이톨 (DTT)과 같은 대안적인 디티올 링커를 사용하여 가교결합될 수 있다. 유사하게, 다른 광개시제, 예컨대 Irgacure 2959 2-히드록시-4-(2-히드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논은 티올-엔 가교결합을 촉진하기 위해 LAP 대신 HA-NB 전구체에 사용될 수 있다(10). 이들 마이크로겔은 3.5 wt% 전구체 용액의 점도가 마이크로유체 플랫폼6 상의 액적...

미세 다공성 어닐링 입자 (MAP) 스캐 폴드는 마이크로 겔 (μgel) 빌딩 블록이 상호 연결되어 벌크 다공성 스캐 폴드를 형성하는 입상 재료의 하위 클래스입니다. 이러한 입상 스캐폴드의 고유한 마이크로아키텍처를 통해 상호 연결된 구형 마이크로겔 사이의 빈 공간에 의해 생성된 타고난 다공성은 가속화된 세포 침투및 이동을 지원합니다1. MAP 스캐폴드의 마이크로겔 빌딩 블록은 화학적 변형2을 갖는 합성 및 천연 중합체 둘 다로부터 제조될 수 있다. 여기에 설명된 방법은 기능성 노르보르넨(NB) 핸들로 변형된 히알루론산(HA) 백본으로 구성된 마이크로젤의 사용을 구체적으로 강조합니다. HA 폴리머의 NB 기능적 핸들은 마이크로겔을 형성하고 이들을 함께 연결하여 MAP 스캐폴드 3,4를 생성하기 위한 클릭 화학 반응을 지원합니다. 마이크로겔을 함께 연결(즉, 어닐링)하기 위해 효소1, 광기반 5,6 및 무첨가 클릭 화학 3,7 반응과 같은 수많은 방식이 사용되었습니다. 무첨가 클릭 화학은 HA-NB 마이크로겔을 상호 결합시키기 위한 테트라진-노르보르넨 역전자 요구량 딜스-알더 컨쥬게이션을 사용하여 본 작업에 기술된다.
MAP 스캐폴드를 제조하기 위해 사용자는 먼저 배치 시스템 또는 미세유체 장치 내에서 역에멀젼을 사용하고 전기유체역학 스프레이, 리소그래피 또는 기계적단편화2를 사용하여 마이크로겔 빌딩 블록을 생성합니다. 구형 HA-NB 마이크로겔의 제조는 배치 에멀젼2 및 마이크로유체 액적 생성 기술 8,9,10,11 둘 다를 사용하여 잘 기술되고 이전에 보고되었다. 이 작업에서, 구형 HA-NB 마이크로겔은 앞서 설명한바와 같이 제어된 크기 및 형상을 위해 유동 집속 마이크로유체 플랫폼 상에서 생성되었다 8,9,10. 정제 후, 마이크로겔은 수성 현탁액에 존재하며 걸림 상태를 유도하기 위해 농축되어야 합니다. 걸림이 있을 때, 마이크로젤은 전단 박화 특성을 나타내어 주사 가능한 공간 채우기 물질1로 기능할 수 있습니다. 걸림 상태를 유도하는 한 가지 방법은 동결건조 또는 동결건조를 통해 마이크로겔을 건조시킨 다음, 건조된 생성물을 제어된 부피(12)에서 후속적으로 재수화시키는 것이다. 대안적으로, 과량의 완충액은 스트레이너를 통한 원심분리를 통해 또는 흡인 또는 흡수성 물질을 사용하여 마이크로겔 펠릿으로부터 완충액을 수동으로 제거함으로써 마이크로겔 슬러리로부터 제거될 수 있다. 그러나, 마이크로겔을 건조시키기 위해 원심분리를 사용하는 것은 과립형 스캐폴드(12)를 제조할 때 매우 다양한 범위의 입자 분획 및 공극 분획을 생성할 수 있다. 마이크로겔을 동결건조하기 위한 기술은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 마이크로겔13에 대해 70% IPA, 젤라틴 메타크릴로일 (GelMa) 마이크로겔 14에 대한 불소화 오일, 및 HA 마이크로겔12에 대해 70% 에탄올을 사용하여 설명되었다. 이 프로토콜은 건조 공정 중에 원래의 마이크로젤 특성을 유지하기 위해 표준 실험실 시약인 70% 에탄올을 사용하여 구형 HA 마이크로젤을 동결 건조하는 방법을 강조합니다. 동결건조된 HA 마이크로겔은 MAP 스캐폴드12에서 최종 입자 분획을 제어하기 위해 사용자 정의된 중량 백분율로 칭량 및 재수화될 수 있습니다.
MAP 스캐폴드 형성의 마지막 단계는 마이크로겔을 어닐링하여 벌크, 다공성 스캐폴드(1)를 생성하는 것에 의존한다. 천연 세포외 매트릭스 성분을 활용하고 생체 직교 어닐링 방식을 사용함으로써 MAP 스캐폴드는 시험관 내 세포 배양 및 생체 내 조직 복구3 모두를 위한 생체 적합성 플랫폼 역할을 합니다. 이러한 접근법을 통해, MAP 스캐폴드는 조직 공학 애플리케이션(12)에서의 사용을 위해 사용자 정의된 입자 분획을 갖는 HA-NB 빌딩 블록으로부터 제조될 수 있다. 하기 프로토콜은 MAP 스캐폴드에서 입자 분획을 제어하기 위한 동결건조 및 재수화에 따른 HA-NB 마이크로겔의 미세유체 생산을 설명합니다. 마지막으로, 마이크로젤을 어닐링하는 단계는 시험관 내 3D 세포 배양 실험을 위해 생체 직교 화학을 사용하여 설명됩니다.

<table><tbody><tr><td>1 mL Luer-Lok 주사기 멸균, 일회용, 폴리카보네이</td>트 <td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Luer-Lok 주사기 멸균, 일회용, 폴리카보네이</td>트 <td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 C5 maleimide</td><td>Invitrogen</td><td>A10254</td><td>형광 표지된 테트라진</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>합성용 세포 배양 시료 염색</td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>VWR</td><td>89107-726</td><td></td></tr><tr><td>플런저가 있는 생검 펀치, 1.0mm</td><td>Integra Miltex</td><td>69031-01</td><td></td></tr><tr><td>생검 펀치, 4mm</td><td>Integra Miltex</td><td>33-34</td><td></td></tr><tr><td>무딘 바늘, 23G 0.5", 비멸균, 뚜껑이 있는</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>B23-50</td><td></td></tr><tr><td>병 상단 진공 필터, 0.22 &mu; m</td><td>Corning</td><td>CLS430521</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>VWR</td><td>1B1110</td><td>마이크로 젤 세척 완충액</td></tr><tr><td>용 포지티브 변위 피펫 용 모세관 피스톤 어셈블리, 1000 &mu; L 최대 용량</td><td>Rainin</td><td>17008609</td><td></td></tr><tr><td>포지티브 치환 피펫용 Capillary-piston 어셈블리, 25 &mu; L 최대 부피</td><td>Rainin</td><td>17008605</td><td></td></tr><tr><td>용적식 파이펫용 Capillary-piston 어셈블리, 250 &mu; L 최대 부피</td><td>Rainin</td><td>17008608</td><td></td></tr><tr><td>Countess 세포 계수 챔버 슬라이드</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 자동 세포 계수기</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브, 15 mL</td><td>CELLTREAT</td><td>667015B</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브, 50 mL</td><td>CELLTREAT</td><td>229421</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름, ACS 등급, 유리병</td><td>Stellar Scientific</td><td>CP-C7304</td><td>형광 표지 테트라진</td></tr><tr><td>코로나 플라즈마 건의 합성, BD-10A 고주파 발생기</td><td>ETP</td><td>11011</td><td></td></tr><tr><td>CryoTube 바이알, 폴리프로필렌, 나사 캡이 있는 내부 나사산</td><td>Nunc</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>D1 마우스 중간엽 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-12424</td><td>MAP 겔 배양을 위한 세포주</td></tr><tr><td>예 DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>세포 배양 시료 염색용</td></tr><tr><td>중수소산화물, 99.9 원자% D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td>NMR 분광법용</td></tr><tr><td>투석 튜브, 재생 셀룰로오스 멤브레인, 12-14kDa 분자량 컷오프</td><td>Spectra/Por</td><td>132703</td><td>HA-NB 및 HA-Tet</td></tr><tr><td>디에틸 에테르</td><td>정제용 VWR</td><td>BDH1121-4LPC</td><td>형광 표지된 테트라진 합성용</td></tr><tr><td>디메틸포름아미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>277056</td><td>형광 표지된 테트라진</td></tr><tr><td>4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM)의 합성을 위해&nbsp;</td><td>TCI-Chemicals</td><td>D2919</td><td>HA</td></tr><tr><td>디티오트레이톨(DTT)</td> 수정용<td>Thermo Scientific</td><td>R0861</td><td>비분해성 디티올 링커(MMP 절단 펩타이드 대체)</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 고포도당, w/ 4500 mg/L 포도당, L-글루타민, 피루브산나트륨 및 중탄산나트륨, 액체, 멸균 여과, 세포 배양에 적합</td> D1용 <td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-500ML</td><td> 세포 배양</td></tr><tr><td>EMS 파라포름알데히드, 과립 VWR</td><td></td><td>100504-162</td><td>4% PFA</td></tr><tr><td>에탄올 절대 제조용(200 프루프)</td><td>KOPTEC</td><td>89234-850</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td>D1 세포 배양</td></tr><tr><td>가열판</td>용 <td>Kopf Instruments</td><td>HP-4M</td><td></td></tr><tr><td>혈구계(커버 글라스 포함</td>) <td>Daigger Scientific</td><td></td><td></td>EF16034F</tr><tr><td>2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hyaluronate, 79 kDa 평균 분자량, 박테리아에서 생산 Streptococcus zooepidemicus, 제약 등급, 미생물 오염 < 100 CFU/g, 세균성 내독소 < HA-Tet 합성에는 0.050 IU/mg</td><td>Contipro</td><td>N/A</td><td>79 kDa 평균 분자량이 사용되었지만, 이러한 방법은 다른 분자량에 맞게 조정할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>IMARIS Essentials 소프트웨어 패키지</td><td>Oxford Instruments</td><td>N/A</td><td>현미경 이미지 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>주입 펌프, 이중 주사기</td><td>Chemyx</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>지지 실험실 클램프가 있는 실험실 스탠드</td><td>Geyer</td><td>212100</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td>에어 가스</td><td>NI 180LT22</td><td></td></tr><tr><td>리튬 페닐(2,4,6-트리메틸벤조일)포스피네이</td>트 <td>TCI-Chemicals</td><td>L0290</td><td></td></tr><tr><td>동결건조기</td><td>Labconco</td><td>N/A</td><td>Labconco FreeZone 6 plus는 단종되었지만 이 프로토콜에는 다른 실험실 등급 콘솔 동결 건조기를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Methyltetrazine-PEG4-maleimide</td><td>Kerafast</td><td>FCC210</td><td>형광 표지 테트라</td></tr>진 <tr><td>2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td>HA</td></tr><tr><td>마이크로 커버 유리 수정용, 24 x 60 mm No. 1</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>미세유체 장치 SU8 마스터 웨이퍼</td><td>FlowJem</td><td></td><td>사내에서 만든 맞춤형 디자인 클린 룸 또는 아웃소싱</td></tr><tr><td>미네랄 오일, 무거운</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760</td><td></td></tr><tr><td>MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2)</td><td>GenScript</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>5-Norbornene-2-methylamine</td><td>TCI-Chemicals</td><td>95-10-3</td><td>HA-NB 합성</td></tr><tr><td>용 포장 테이프</td><td>스카치</td><td>3M 1426</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>PEG(thiol)2</td><td>JenKem Technology USA</td><td>A4001-1</td><td>형광 표지된 테트라</td></tr>진 <tr><td>페니실린-스트렙토마이신 합성용, 10,000 units/mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>D1 세포 배양</td></tr><tr><td>페트리 접시용, 폴리스티렌, 일회용, Dia. x H=150 x 15 mm</td><td>Corning</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>HMP 세척용</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS) 1x</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>RainX 발수 유리 처리</td><td>Grainger</td><td>465D20</td><td>미세유체 장치 처리를 위한 합성 소수성 처리 솔루션</td></tr><tr><td>RGD 펩타이드(Ac-RGDSPGERCG-NH2)</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>고무 밴드</td><td>스테이플</td><td>112417</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Chem-Impex</td><td>30070</td> 투<td>석용</td></tr><tr><td>스팬 80 합성용</td><td>시그마-알드리치</td><td>1338-43-8</td><td></td></tr><tr><td>실가드 184 실리콘 엘라스토머</td><td>전자 현미경 과학</td><td>4019862</td><td>폴리디메틸실록산(PDMS) 엘라스토머 미세유체 장치 및 조직 배양 장치 제조용 엘라</td></tr><tr><td>스토머 주사기 필터, Whatman Uniflo, 0.2 &mu; m PES, 직경 13mm</td><td>Cytvia</td><td>09-928-066</td><td></td></tr><tr><td>Tetraview LCD 디지털 현미경</td><td>Celestron</td><td>44347</td><td></td></tr><tr><td>Tetrazine-amine HCl salt</td><td>Chem-Impex</td><td>35098</td><td>HA-Tet 합성용</td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471283</td><td>형광 표지 된 tetrazine</td></tr><tr><td>Tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP)</td> <td>Millipore Sigma</td> 합성<td>51805-45-9</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>VWR</td><td>97063-864</td><td></td></tr><tr><td>Trypan 블루 솔루션, 0.4 %</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA (0.25 %), 페놀 레드</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-200-056</td><td>MAP 젤</td></tr><tr><td>Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal Diameter = 0.020, Outer 지름 = 0.060 인치</td><td>토마스 사이언티픽</td><td>1204G82</td><td></td></tr><tr><td>UV 경화 시스템 컨트롤러, LX500 LED&nbsp;</td><td>OmniCure</td><td>010-00369R</td><td></td></tr><tr><td>UV 경화 헤드, LED 스폿 UV</td><td>OmniCure</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>UV 조도계, 추적 가능한</td><td>VWR</td><td>61161-386</td><td></td></tr><tr><td>진공 건조기</td><td>Bel-Art</td><td>08-594-15C</td><td></td></tr><tr><td>X-Acto Z 시리즈 정밀 유틸리티 나이프</td><td>Elmer's</td><td>XZ3601W</td><td></td></tr></tbody></table>

3d 세포 배양을 위한 미세 다공성 어닐링 입자 스캐폴드의 입자 분획 제어

Controlling Particle Fraction in Microporous Annealed Particle Scaffolds for 3D Cell Culture

마이크로젤은 미세다공성 어닐링 입자(MAP) 스캐폴드의 빌딩 블록으로, 체외 세포 배양 및 생체 내 조직 복구를 위한 플랫폼 역할을 합니다. 이러한 입상 스캐폴드에서 마이크로젤 사이의 빈 공간에 의해 생성된 선천성 다공성은 세포 침윤 및 이동을 가능하게 합니다. 공극률과 입자 분획을 제어하는 것은 MAP 스캐폴드 설계에 매우 중요한데, 이는 다공성이 세포의 생리활성 신호이기 때문입니다. 구형 마이크로겔은 크기 및 형상을 제어하기 위해 마이크로유체 디바이스 상에서 생성될 수 있고, 후속적으로 중합체 네트워크의 파쇄를 방지하는 방법을 사용하여 동결건조될 수 있다. 재수화 시, 동결건조된 마이크로겔은 MAP 스캐폴드에서 제어된 입자 분획으로 이어진다. 마이크로겔 동결건조를 위한 이러한 방법의 구현은 입자 분획이 거대분자 확산 및 세포 확산에 미치는 영향을 보여주는 재현 가능한 연구로 이어졌습니다. 다음 프로토콜은 MAP 스캐폴드에서 입자 분획을 제어하기 위한 마이크로젤의 제조, 동결건조 및 재수화뿐만 아니라 시험관 내 3D 세포 배양을 위한 생체 직교 가교를 통해 마이크로젤을 어닐링하는 방법을 다룹니다.

이 프로토콜의 목적은 3D 세포 배양을 위한 제어된 입자 분획뿐만 아니라 생체 직교 가교 구조를 사용한 미세 다공성 어닐링 입자(MAP) 스캐폴드의 제조를 입증하는 것입니다. 먼저, HA는 마이크로겔 형성 및 MAP 스캐폴드를 형성하기 위한 상호 결합 모두에 사용되도록 노르보르넨 펜던트 그룹으로 변형되었습니다. 이러한 방법을 사용하여 HA 반복 단위의 약 31%가 노르보르넨 기능 핸들로 성공적으로 수정되었습니다(그림 1A). 유동 초점 영역(그림 1B)이 있는 미세유체 장치는 직경이 ~50μm 또는 ~100μm인 HA-NB μgel을 생성하는 것으로 나타났습니다(그림 1C, D). 이 작업의 나머지 부분에서 사용된 μgels는 평균 직경이 92μm(Q1 = 79μm, Q3 = 103μm)였습니다(그림 1...

입상 스캐폴드 내에서 입자 분획의 변동성을 최소화하면 재현 가능한 실험이 용이해집니다. 이 작업은 시험관 내 조직 공학 응용 분야를 위해 제어된 입자 분획으로 과립 스캐폴드를 생성하는 방법을 설명합니다.

3D 세포 배양을 위한 미세 다공성 어닐링 입자 스캐폴드의 입자 분획 제어

Microgels are the building blocks of microporous annealed particle (MAP) scaffolds, which serve as a platform for both in vitro cell culture and in vivo ...

MAP 스캐폴드와 같은 입상 물질은 상호 연결된 마이크로 크기의 하이드로겔 입자로 만들어진 다공성 주사 가능한 재료입니다. 입자 분획을 제어하는 것은 재료 특성과 세포 반응에 매우 중요합니다. MAP 스캐폴드의 가변 입자 분획은 다양한 스캐폴드 특성과 세포 반응을 초래하지만, 이 기술을 통해 사용자는 자신이 만든 MAP 스캐폴드에서 최종 입자 분획을 정의할 수 있습니다.MAP 스캐폴드는 복잡한 상처의 복구 및 재생을 촉진하고 약물을 전달하는 데 사용할 수 있습니다. 입자 분획은, 예를 들어, 세포 침윤 및 재생의 속도 및 정도에 영향을 미친다. 이 방법은 모든 종류의 과립 하이드로겔에 적용할 수 있습니다.이제 사용자가 제어하는 입자 분획으로 MAP 스캐폴드를 만들 수 있으므로 이러한 물질의 생체 활성을 재현성 있게 연구하고 감금과 같은 고유한 세포 반응을 조사할 수 있습니다. 미세유체 마이크로겔 생성을 설정하려면 기술을 배울 때 시간과 인내가 필요합니다. 설정에 문제가 발생할 경우를 대비하여 여러 장치를 준비하고 준비하는 것이 가장 좋습니다.히알루론산 또는 HA 및 노르보르넨 또는 NB 마이크로젤의 미세유체 생산으로 시작하십시오. 마이크로젤을 건조하기 전에 극저온 안전 스크류 캡 튜브의 무게를 잰다. 그런 다음 멸균 후드에서 세척 및 정제된 마이크로젤을 정변위 피펫을 사용하여 극저온 안전 스크류 캡 튜브로 옮깁니다.정제 된 마이크로 젤에 70 % 에탄올을 첨가하고 잘 섞는다. 튜브를 5, 000 g에서 5 분간 원심 분리하십시오. 상청액을 흡인하고 70 % 에탄올을 첨가하십시오.잘 섞고 섭씨 4도에서 밤새 배양하십시오. 다음날, 마이크로젤이 튜브 바닥에 있는지 확인하기 위해 간단히 원심분리합니다. 극저온 용기에 액체 질소를 넣고 마이크로젤 튜브를 급속 동결에 놓습니다.5 분에서 10 분 후에 집게로 마이크로 젤 튜브를 제거하십시오. 캡을 빠르게 제거하고 실험실 등급 티슈로 튜브를 덮습니다. 고무 밴드로 조직을 고정하고 동결 건조 용기 또는 챔버로 옮깁니다.제조업체의 지침에 따라 동결 건조기에 샘플을 넣고 0.066 Torr 및 섭씨 영하 63도에서 동결 건조합니다. 동결건조된 마이크로젤을 실온에서 보관하기 전에 튜브에서 칭량합니다. 폴리디메틸실록산 또는 PDMS 엘라스토머 베이스를 경화제와 10:1질량비로 혼합한다.PDMS 혼합물을 큰 플라스틱 페트리 접시에 붓고 데시케이터에서 30분 동안 또는 모든 기포가 사라질 때까지 가스를 제거합니다. 모든 기포가 사라지면 3D 인쇄 금형을 PDMS에 조심스럽게 배치하여 새로운 기포 형성을 최소화합니다. PDMS를 경화시키기 위해 섭씨 60도의 오븐에 2시간 동안 두십시오.경화 후 칼이나 면도날을 사용하여 배양 장치의 둘레를 부드럽게 추적하고 곰팡이를 조심스럽게 제거하십시오. 4mm 생검 펀치를 사용하여 웰 바닥에서 PDMS를 제거하십시오. 유리 커버 슬립에 맞게 장치를 자릅니다.테이프를 사용하여 배양 장치의 바닥면에서 먼지를 제거하십시오. 깨끗한 유리 커버 슬립과 배양 장치를 섭씨 135도의 핫플레이트에 15분 동안 놓아 수분을 제거합니다. 흄 후드에서 유리 커버 슬립과 장치 바닥면에 코로나 플라즈마 건을 30초 동안 사용합니다.그런 다음 처리 된 표면을 빠르게 결합하십시오. 배양 장치와 유리 커버 슬립 사이에 양호한 밀봉을 보장하기 위해 부드럽게 압력을 가하십시오. 장치를 섭씨 60도 오븐에 밤새 넣어 접착력을 고정합니다.다음날, 시험관 내에서 사용하기 전에 멸균하기 위해 장치를 오토 클레이브하십시오. 다음으로, MAP 스캐폴드에서 세포 배양을 위해 원하는 입자 분획을 기반으로 미세다공성 어닐링 입자 또는 MAP 스캐폴드 성분을 준비합니다. 동결건조된 마이크로젤의 무게를 측정하여 마이크로젤의 질량을 측정합니다.그런 다음 선택한 중량% MAP를 기준으로 세포 배지의 최종 MAP 부피의 84%에서 마이크로겔을 재구성합니다. 마이크로젤이 20분 동안 부풀어 오르도록 합니다. 히알루론산 또는 HA-테트라진과 세포 배지를 최종 MAP 부피의 16%에 녹입니다.세포가 원하는 컨플루언스에 도달하면 세포를 들어 올리고 계산합니다. 마이크로 리터 MAP 당 10, 000 개의 세포를 새 튜브로 옮깁니다. 세포를 원심분리하고, 세포를 흡인하지 않고 펠릿으로부터 상청액을 흡인한다.마이크로젤과 가교제를 치환 피펫을 사용하여 펠릿에 추가합니다. 잘 섞고 우물 당 10 마이크로 리터를 씨를 뿌린다. 혼합물을 우물에 고르게 분배하기 위해 원형 운동으로 피펫.마이크로젤을 섭씨 37도에서 25분 동안 어닐링한 후 웰을 채우기 위해 세포 배지를 추가합니다. 3D 배양을 섭씨 37도로 유지하고 필요에 따라 배지를 변경합니다. 비계를 흡인하지 않으려면 상부 우물의 융기 부분을 따라 피펫 팁을 안정화하십시오.원하는 시점에 실온에서 30분 동안 웰당 50마이크로리터의 4% 파라포름알데히드로 배지를 교체하여 샘플을 고정합니다. 샘플을 50 마이크로리터의 PBS, 또는 바람직한 완충액으로 3회 세척하고, 작업 부피 웰당 50 마이크로리터를 사용하여 면역형광 또는 형광 염색을 진행한다. 유동 초점 영역을 갖는 미세유체 장치는 직경이 50 또는 100 미크론인 HA-NB 마이크로겔을 생성하는 것으로 나타났다.마이크로겔을 동결건조하기 위한 배지는 70%에탄올을 사용하여 크라이오겔 형성을 최소화하도록 최적화되었습니다. 그러나 이소프로필 알코올, 물 및 아세토니트릴과 같은 다른 매체는 크라이오겔 형성을 촉진하기 위해 상호 교환적으로 사용할 수 있습니다. HA-NB 마이크로겔의 생체직교 상호결합을 용이하게 하기 위해 선형 HA-테트라진 가교결합제를 합성하였다.양성자 NMR 분광법은 테트라 진 펜던트 그룹을 사용하여 HA 반복 단위의 11 %를 성공적으로 변형 한 것을 보여줍니다. 건조된 동결건조된 마이크로겔 생성물을 특별한 부피로 재수화시키고, 어닐링하여 MAP 스캐폴드에서 마이크로겔의 상이한 중량% 제형을 달성하였다. MAP 스캐폴드에서 마이크로겔의 이러한 중량 백분율은 고유한 입자 분획에 해당합니다.MAP 스캐폴드에서의 세포 배양이 여기에 표시됩니다. MAP 스캐폴드에서 3D 배양된 세포를 5일째에 고정하고 염색하고 컨포칼 현미경으로 이미지화했습니다. 단일 Z-슬라이스는 상이한 중량% MAP를 포함하는 스캐폴드 및 세포 성장의 차이를 나타낸다.크라이오겔을 원하는지 여부에 따라 동결건조 매체를 적절하게 선택하십시오. 마이크로젤이 배지에서 팽창할 수 있는 충분한 시간을 갖도록 배양 단계를 건너뛰지 마십시오. 현미경, 유세포분석, RNA 시퀀싱 등과 같은 표준 기술을 사용하여 정의된 다공성을 가진 이러한 과립 물질 내에서 세포 반응을 평가할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 세 차원 세포 배양을위한 다공성 고분자 칩의 microfabrication 두 가지 프로세스를 제시한다. 첫 번째는 용매 증기 용접 공정과 결합 핫 엠보싱입니다. 두 번째는 생산의 중요한 단순화하기 위해 선도적인 이온 트랙 기술과 함께 최근에 개발된 microthermoforming 프로세스를 사용합니다.

입체 세포 배양을위한 칩 크기의 공사장 공중 발판의 Microfabrication

생체의 pH 응답 졸 - 겔 나노 센서는 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA) 전기 방사 지지체에 혼입 될 수있다. 생성 된 자기보고 지지체는 지지체에 세포를 배양하는 동안 미세 환경 조건 인 시츄 모니터링에 사용될 수있다. 3D 셀룰러 구조는 실험을 방해하지 않고 실시간으로 모니터링 할 수있는 이는 유익하다.

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

이 기사에서는 알려진 시딩 밀도와 비교하여 초기에 부착되는 세포의 수를 최대화하고 정량화하기 위해 표준 배양 웰 플레이트의 베이스를 덮지 않는 재료(이 경우 전기 방적사)에 인간 중간엽 줄기세포를 파종하기 위한 다양한 설정에 대해 설명합니다.

폴리 (ε 카프로 락톤) 전기 방사 원사에 인간 중간 엽 줄기 세포의 첨부 파일을 최적화

생체 재료 기술의 발전으로 3차원 다세포 유형의 구조를 개발할 수 있게 되었습니다. 우리는 기도의 주요 구조 세포를 배양하기 위해 3개의 개별 골격을 생산하여 기도 세기관지 벽의 3D 체외 모델을 제공하는 전기 방사 프로토콜을 개발했습니다.

전기 방사를 적응하는 것은 트라이 계층에 대한 세 가지 독특한 환경을 제공하기 위해<em&gt; 체외</em&gt;기도 벽의 모델

여기, 우리 자기 연골 같은 조직으로 dedifferentiated 인간의 관절 chondrocytes의 분화를 촉진 하는 펩 티 드 건설 기계 조립에 3D 문화 시스템을 얻기 위해 프로토콜을 제시.

3 차원 펩 티 드 건설 기계에 포유류 세포 배양

우리는 반복 패턴 형성을 얻기 위해 3 차원 기질에서 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하기 위한 절차를 제시. 포함 하는 두 개의 다른 hydrogels 입방 장치 다 방향 영상 조직 패턴 형성에 대 한 달성 하기 위해 채택 된다.

반복 패턴 형성을 위한 하이브리드 젤 큐브 장치에 초기 3D 셀 클러스터 제어

상보적인 반응성 그룹을 갖는 마이크로겔 로드는 수용액에서 상호 연결될 수 있는 능력을 가진 마이크로유체공학을 통해 생산됩니다. 아니소메트릭 마이크로젤은 구형 기반 시스템에 비해 더 큰 기공을 가진 안정적인 구조물로 막히고 상호 연결됩니다. GRGDS-PC로 변형 된 마이크로 겔은 세포 배양에 사용할 수있는 거대 다공성 3D 구조물을 형성합니다.

마이크로젤 로드의 상호 연결된 거대 다공성 3D 스캐폴드

이 프로토콜은 다양한 재생 의학 응용에 사용될 수 있는 미세다공성 어닐링된 입자 스캐폴드를 위한 마이크로겔 빌딩 블록을 합성하기 위한 일련의 방법을 기술한다.

미세 다공성 어닐링 입자 스캐폴드를위한 마이크로 겔 빌딩 블록의 미세 유체 합성

이 작품은 세부 3D 섬유소의 준비 culturing 및 plutipotent 줄기 세포를 구별을 위해 공사장 공중 발판. 이러한 공사장 공중 발판이 아니라 약물 전달 시스템을 포함하도록 수정으로 줄기 세포의 행동에 대한 다양한 생물 학적 화합물의 효과를 차단하는 데 사용할 수 있습니다.

3D 섬유소의 준비는 줄기 세포 배양 용도 공사장 공중 발판

마이크로 입자 영상 속도계 (μPIV)의 정확한 속도 프로파일을주고 간 상관 관계 혈액 흐름에 파종 마이크로 입자의 쌍 이미지를 시각화하는 데 사용됩니다. 임상 응용을 가지고 각각의 전단 속도, 최대 속도, 속도 프로파일 형태, 유량, 이러한 측정에서 파생 될 수 있습니다.

마이크로 혈액 흐름의 속도 분포 측정을위한 마이크로 입자 이미지 유속계

배우세요 MAP 스캐폴드에서 입자 분획을 정밀하게 제어하는 방법을. 이 기술은 조직 공학 및 재생 의학에서 재현 가능한 실험과 향상된 세포 반응을 가능하게 합니다.

3D 세포 배양을 위한 미세 다공성 어닐링 입자 스캐폴드의 입자 분획 제어

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