Name: 개별 골격근에서 정지 줄기 세포 집단의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: 배우세요 생쥐 개별 골격근에서 근육 줄기세포와 섬유지방성 전구세포를 분리하는 방법을. 형광 활성화 세포 분류와 면역형광 염색을 활용하여 세포 순도를 검증하고 재생의학 연구에 활용할 수 있습니다.

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세포 분류는 덴마크 오르후스 대학교의 FACS Core Facility에서 수행되었습니다. 그림은 Biorender.com 사용하여 만들어졌습니다. 토끼 항-PDGFRa 항체를 공유해 주신 J. Farup 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 E.P.에 대한 AUFF 시작 보조금 및 NovoNordiskFonden에서 E.P. (0071113) 및 A.D.M. (0071116)에 대한 시작 패키지 보조금으로 지원되었습니다.

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<li>Shea, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sprouty1+regulates+reversible+quiescence+of+a+self-renewing+adult+muscle+stem+cell+pool+during+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration.</a> Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).</li>
<li>Fukada, S. -I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signature+of+quiescent+satellite+cells+in+adult+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle.</a> Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).</li>
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<li>de Morrée, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staufen1+inhibits+MyoD+translation+to+actively+maintain+muscle+stem+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).</li>
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저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계와 이해 상충이 없습니다.

좋은 수율을 달성하기 위해 이 프로토콜을 실행하는 데 몇 가지 단계가 중요합니다. 개별 근육은 대량 격리 프로토콜에 사용되는 근육의 양에 비해 부피가 작습니다. 이로 인해 해부 중에 근육이 건조되어 수율이 감소할 위험이 있습니다. 이를 방지하려면 해부 직후 근육에 배지를 추가하는 것이 중요합니다. 또한 해부가 더 오래 걸리면 한 번에 한쪽 팔다리에서 피부를 제거하여 근육이 공기에 노출되는 시간을 줄일 수 있습니다. 부피가 작을수록 과소화 위험이 증가합니다. 이에 대응하기 위해, 본 방법은 벌크 근육 프로토콜에 비해 더 적은 양의 콜라게나제 II 효소와 감소된 소화 시간을 필요로 한다 9,16. 효소 분해는 또한 효소의 순도에 따라 달라지며 순도가 낮으면 수율에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 또한 기계적 소화가 중요합니다. 절단이 불충분 한 경우, 감소 된 표면적은 효소 소화를 방해하고 줄기 세포 수율을 낮 춥니 다. 너...

골격근은 근육 줄기 세포(MuSC)의 존재로 인해 재생 능력이 높습니다. MuSC는 기저층 아래의 근섬유에 위치하며 1,2,3,4번 출구로 나오는 장기간의 가역적 세포 주기의 정지 상태에 있습니다. 손상 시 MuSC는 활성화되고 세포 주기에 들어가 분화 및 융합하여 새로운 근섬유를 형성할 수 있는 증폭 전구체를 생성합니다 2,5. 이전 연구에서는 MuSC가 근육 재생에 절대적으로 필수적이라는 것을 보여주었습니다 6,7,8. 또한, 단일 MuSC는 새로운 줄기세포와 새로운 근섬유를 생착시켜 생성할 수 있다9. 골격근은 또한 섬유 지방 생성 전구 세포 (FAPs)라고 불리는 중간 엽 기질 세포 집단을 보유하고 있으며, 이는 근육 재생동안 MuSC 기능을 지원하는 데 중요한 역할을합니다 6,10,11,12.
근육 재생을 조정할 수 있는 잠재력으로 인해 MuSC와 FAP의 작동 방식을 이해하는 데 엄청난 관심이 있었습니다. 정지 MuSC는 전사 인자 Pax7 및 Sprouty1 및 세포 표면 단백질 칼시토닌 수용체의 발현으로 표시되는 반면, 정지 FAP는 세포 표면 단백질 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파(PDGFRa)10,12,13,14,15에 의해 표시됩니다. 이전 연구에서는 MuSC 및 FAP가 세포 표면 마커 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)9,15,16,17,18,19,20,21을 사용하여 골격근에서 정제될 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 프로토콜은 MuSC 및 FAP를 연구하는 능력을 크게 향상시켰지만 한 가지 단점은 이러한 프로토콜의 대부분이 서로 다른 근육 조직 풀에서 MuSC를 분리해야 한다는 것입니다. 우리와 다른 사람들의 최근 연구는 다른 조직에서 분리된 MuSC 간의 세포 표현형과 유전자 발현 수준의 차이를 밝혀냈습니다22,23. 횡격막, 삼두근 및 흉근의 MuSC는 하부 뒷다리 근육의 MuSC보다 빠른 활성화를 보이는 반면(22), 외안근의 MuSC는 횡격막과 하부 뒷다리 근육의 MuSC보다 더 빠른 분화를 보인다23.
이 프로토콜은 개별 골격근에서 MuSC 및 FAP의 분리를 설명합니다(그림 1). 여기에는 횡격막, 삼두근, 그라실리스, 전경골근(TA), 가자미근, 장신근(EDL), 비복근(GA) 및 교근의 박리가 포함됩니다. 해부된 근육은 콜라게나제 II(콜라겐의 Pro-X-Gly-Pro 아미노 서열을 특이적으로 표적으로 하여 결합 조직의 분해 및 조직 해리를 가능하게 하는 프로테아제)와 디스파아제(피브로넥틴과 콜라겐 IV를 절단하여 추가 세포 해리를 가능하게 하는 프로테아제)를 사용하는 효소 분해에 의해 해리됩니다25). MuSC 및 FAP는 FACS에 의해 단일 세포 현탁액으로부터 분리된다. 세포 분석을 위한 다운스트림 분석의 예로, 줄기 세포 활성화는 5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU) 혼입을 분석하여 측정하고, 세포 순도는 세포 유형 특이적 마커인 Pax7 및 PDGFRa에 대한 면역형광 염색으로 측정합니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 튜브(PCR 성능 테스트 완료, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile )</td><td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>72.706.700</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>tube 15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile)</td><td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>62.554.502</td><td>15 mL tube</td></tr><tr><td>5 mL 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브</td><td>Falcon, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>352054</td><td>FACS 튜브 스트레이너 캡</td></tr><tr><td>없음 5 mL 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브 셀 스트레이너 캡</td><td>Falcon, Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>스</td><td>트레이너 캡이 있는 352235 FACS 튜브</td></tr><tr><td>5 mL 튜브(PP, 비멸균 오토클레이브 가능)</td><td>VWR collection</td><td>525.0946</td><td>5 mL 튜브</td></tr><tr><td>50 mL 튜브( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, sterile)</td><td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>62.547.254</td><td>50 mL tube</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>Lot: 2387458 (Cat # A31572)</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 당나귀-안티 마우스 IgG (H+L)</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>Lot: 2420713 (Cat#A31571)</td><td></td></tr><tr><td>ARIA 3</td><td>BD</td><td></td><td>FACS, 핵심 시설 Aarhus University</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>eppendorf</td><td>EP022628188</td><td>Centrifuge</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>Lot: 2387287 (Cat# C10337)</td><td>세포 증식 키트</td></tr><tr><td>콜라겐 송아지 피부&nbsp;</td><td>생물 시약, Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>출처: SLCK6209 (Cat# C8919)</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 유형 II</td><td>Worthington, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>로트: 40H20248 (cat# L5004177 )</td><td>Collagenase</td></tr><tr><td>dispase</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Lot: 2309415 (cat# 17105-041 )</td><td>Dispase</td></tr><tr><td>Donkey serum (non-sterile)</td><td>Sigma Aldrich, Merck</td><td>Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL)</td><td></td></tr><tr><td>Dumont nr. 5, 110 mm</td><td>Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>1606.327</td><td>Straight junps with fine tips</td></tr><tr><td>Dumont nr. 7, 115 mm</td><td>Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>1606.335</td><td>곡선 집게</td></tr><tr><td>F-10 영양소 혼합물 (햄) (1x), +L-글루타민</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>2453614 (cat# 31550-023)</td><td></td></tr><tr><td>FITC 안티-마우스 CD31</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>MEC13.3 (Cat # 102506)</td><td></td></tr><tr><td>FITC 안티-마우스 CD45</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>30-F11 (Cat# 103108)</td><td></td></tr><tr><td>빙산 (100%)</td><td>EMSURE, Merck&nbsp; &nbsp;</td><td>K44104563 9Cat # 1000631000)</td><td></td></tr><tr><td>헤드 오버 헤드 미니 튜브 로테이터&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>15534080 (모델 번호 88861052)</td><td>헤드 오버 헤드 미니 튜브 로테이터</td></tr><tr><td>호스 세럼</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Lot. 2482639 (cat# 10368902 )</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp SWB 15</td><td>FisherBrand, Fisher Scientific</td><td>15325887</td><td>쉐이킹 워터 배스</td></tr><tr><td>MS2 미니 쉐이커&nbsp;</td><td>이카&nbsp;</td><td></td><td>소용돌이 단위</td></tr><tr><td>바늘 20G (0.9 mm x 25 mm)</td><td>BD 마이크로랜스, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>304827</td><td>20G 바늘&nbsp;</td></tr><tr><td>중성 포르말린 완충액 10%</td><td>CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002)</td><td></td></tr><tr><td>Non-pyrogenic cell strainer (40 &micro; M)</td><td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>83.3945.040</td><td>세포 여과기&nbsp;</td></tr><tr><td>퍼시픽 블루 안티 마우스 Ly-6A/E(Sca-1)</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>D7(Cat# 108120)</td><td></td></tr><tr><td>Pax7 1차 항체</td><td>DSHB</td><td>Lot: 2/3/22-282ug/mL(Cat# AB 528428)</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x 분말 농축</td>액 <td>Fisher BioReagents, Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 안티 마우스 CD106(VCAM1)</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>429(MVCAM. A) (Cat # 105720)</td><td></td></tr><tr><td>Pen/strep</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>163589 (cat# 11548876 )</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 p10</td><td>Art tips, 자가 밀봉 장벽, Thermo Scientific</td><td>2140-05</td><td>Low Retention, pre-sterilized, 필터 팁</td></tr><tr><td>피펫 팁 p1000</td><td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td><td>2279-05</td><td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td></tr><tr><td>p20</td><td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td><td>2149P-05</td><td>저보유, 사전 멸균, 필터 팁</td></tr><tr><td>피펫 팁 p200</td><td>아트 팁, 자체 밀봉 장벽, Thermo Scientific</td><td>2069-05</td><td>저보유, 사전 멸균, 필터 팁</td></tr><tr><td>보호용 언더패드</td><td>Abena&nbsp;</td><td>ACTC-7712</td><td>&nbsp; 60 x 40cm, 8 레이어</td></tr><tr><td>Rainin, 피펫 라이트 XLS</td><td>Mettler Toledo, Thermo Scientific&nbsp;</td><td>2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05</td><td>피펫 (P10, P20, P200, P1000)</td></tr><tr><td>재조합 anti-PDGFR-alpha</td><td>RabMAb, abcam</td><td>AB134123</td><td></td></tr><tr><td>메스(샤프트 번호 3)</td><td>Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>1902.502</td><td>메스</td></tr><tr><td>메스 블레이드 번호 11</td><td>Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>1902.0911</td><td>메스</td></tr><tr><td>Scanlaf 화성</td><td>Labogene</td><td>클래스 2 캐비닛: Mars</td><td>Flow bench</td></tr><tr><td>ScanR</td><td>Olympus</td><td></td><td>현미경, 핵심 시설 Aarhus University</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>FST</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Series 8000 DH</td><td>Thermo Scientific</td><td>3540-MAR</td><td>인큐베이터</td></tr><tr><td>혈청학 피펫 10 mL</td><td>VWR</td><td>612-3700</td><td>멸균, 비발열성</td></tr><tr><td>혈청학 피펫 5 mL</td><td>VWR, Avantor VWR</td><td>612-3702</td>에 의해 전달 <td>멸균, 비발열성</td></tr><tr><td>주사기 5 mL, 루어 팁 (6%), 멸균;</td><td>BD 에메랄드, 피셔 사이언티픽</td><td>307731</td><td>시린지</td></tr><tr><td>TC 디쉬 100, 표준</td><td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>83.3902</td><td>페트리 디쉬&nbsp;</td></tr><tr><td>조직 배양(TC) 처리 표면, 검은색 폴리스티렌, 평평한 바닥, 멸균, 뚜껑, 20개 팩</td><td>Corning, Sigma Aldrich</td><td>3764</td><td>96웰 절반 바닥 플레이트</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich, Merck</td><td>출처: SLCJ6163 (Cat # T8787)</td><td></td></tr></tbody></table>

개별 골격근에서 정지 줄기 세포 집단의 분리

Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles

골격근은 조직의 항상성과 복구에 기여하는 뚜렷한 성체 줄기 세포 집단을 가지고 있습니다. 골격근 줄기 세포(MuSC)는 새로운 근육을 만드는 능력이 있는 반면, 섬유 지방 생성 전구세포(FAP)는 기질 지지 조직에 기여하고 섬유아세포와 지방 세포를 만드는 능력이 있습니다. MuSC와 FAP는 모두 정지라고 하는 장기간의 가역적 세포 주기 종료 상태에 있습니다. 정지 상태는 기능의 핵심입니다. 정지 줄기 세포는 일반적으로 단일 샘플에 함께 모인 여러 근육 조직에서 정제됩니다. 그러나 최근 연구에서는 다른 근육에서 분리된 MuSC의 분자 프로파일과 정지 깊이에서 뚜렷한 차이가 있음이 밝혀졌습니다. 현재 프로토콜은 개별 골격근에서 MuSC 및 FAP의 분리 및 연구를 설명하고 줄기 세포 활성화의 분자 분석을 수행하기 위한 전략을 제시합니다. 횡격막, 삼두근, 그라실리스, 전경골근(TA), 비복근(GA), 가자미근, 장신근(EDL) 및 교근과 같은 다양한 발달 기원, 두께 및 기능의 근육을 분리하고 소화하는 방법을 자세히 설명합니다. MuSC 및 FAP는 형광-활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 정제되고, 면역형광 염색 및 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 (EdU) 혼입 분석에 의해 분석된다.

개별 골격근 분리를 위한 프로토콜(그림 2)에 따라 그라실리스, TA, EDL, GA, 가자미근, 삼두근, 교근 및 횡격막 근육을 지역 육종 프로그램에서 중단된 3마리의 스위스 수컷 이종 교배 마우스에서 분리했습니다(그림 2). 조직 해리 및 항체 염색에 이어 개별 근육의 MuSC 및 FAP를 FACS로 정제했습니다(그림 3). 염색되지 않은 샘플로 초기 게이팅을 얻어 세포를 식별하고 이중선에서 싱글렛을 분리했습니다(그림 3A). 염색 역치를 식별하기 위해 FMO 대조군을 사용하여 후속 게이트를 설정했습니다(그림 3B). 그런 다음 염색된 샘플을 CD31/CD45-FITC 및 Sca1-PacBlue에 대해 게이팅했습니다. SCA1+/CD31<su...

이 프로토콜은 마우스의 개별 골격근에서 근육 줄기 세포와 섬유 지방 생성 전구체의 분리를 설명합니다. 이 프로토콜에는 단일 근육 해부, 형광 활성화 세포 분류에 의한 줄기 세포 분리, 면역형광 염색에 의한 순도 평가, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine 혼입 분석에 의한 S상 진입의 정량적 측정이 포함됩니다.

Skeletal muscle harbors distinct populations of adult stem cells that contribute to the homeostasis and repair of the tissue. Skeletal muscle stem cells ...

이 프로토콜은 다양한 골격근에 걸친 줄기 세포 기능을 연구할 수 있게 하여 줄기 세포가 항상성, 재생 및 질병 진행에 어떻게 기여하는지에 대한 이해를 심화할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 프로토콜을 사용하여 특정 근육에서 살아있는 줄기 세포의 두 집단을 분리하고 작동 방식을 연구할 수 있습니다. 근육 격리를 시작하려면 안락사 된 마우스에 에탄올을 뿌리고 복부가 위를 향하도록 놓습니다.가위를 사용하여 복부 피부에 0.5cm 길이의 수평 절개를하십시오. 양손으로 피부를 당겨 몸통과 하지가 뒷다리까지 노출되도록 합니다. 그라실리스 또는 허벅지 안쪽 근육을 찾아 한 쌍의 구부러진 집게를 사용하여 근육을 잡고 근육을 약간 들어 올립니다.가위를 사용하여 0.5cm 절개하여 그라실리스 근육을 잘라냅니다. 다른 다리에서도 절차를 반복하십시오. 메스를 사용하여 경골의 측면을 따라 0.5 센티미터 절개를하여 근막을 자릅니다.그런 다음 구부러진 집게를 사용하여 근막을 잡고 잡아 당겨 제거하여 뒷다리의 말단부에 힘줄이 노출되도록 합니다. 다음으로, TA의 원위 힘줄과 EDL 근육 사이에 초미세 팁이 있는 한 쌍의 직선 집게를 삽입합니다. 집게를 근육의 근위 끝으로 밀어 근육을 분리합니다.집게를 말단부로 되돌리고 원위부 힘줄을 자릅니다. 구부러진 집게로 TA의 원위 힘줄을 부드럽게 잡고 근위 부착물 위로 근육을 들어 올립니다. 근위 힘줄을 조심스럽게 자르려면 다른 쪽 끝을 부착물에 가장 가깝게 자르고 TA를 페트리 접시로 옮깁니다.그런 다음 매우 미세한 팁이 있는 직선 집게를 사용하여 EDL의 원위 힘줄 아래로 이동하고 집게를 근육의 근위 끝으로 밀어 근육을 서로 분리합니다. 집게를 말단부로 되돌리고 근육을 손상시키지 않고 원위 힘줄을 자릅니다. 구부러진 집게로 EDL의 원위 힘줄을 부드럽게 잡고 근위 부착물 위로 근육을 들어 올려 근위 힘줄을 부착물에 최대한 가깝게 조심스럽게 자릅니다.다른 쪽 끝을 자르고 EDL 근육을 페트리 접시에 옮깁니다. 다른 뒷다리에 대해 절차를 반복하십시오. 아킬레스건과 하부 뒷다리 뼈 사이에 닿도록 매우 미세한 팁이 있는 직선 집게를 사용합니다.집게를 근육의 근위 끝으로 밀어 근육과 뼈를 분리합니다. 집게를 말단부로 되돌리고 원위부 힘줄을 자릅니다. 비복근 또는 GA 근육을 비골 위로 당깁니다.근위 가자미근 힘줄을 찾습니다. 가자미근과 GA 근육 사이에 직선 집게를 삽입하고 집게를 근육의 말단부로 움직여 가자미근과 GA를 분리합니다. 이제 근위 가자미근 힘줄을 자릅니다. 구부러진 집게로 잡고 수스를 조심스럽게 들어 올려 말단 힘줄에 접근합니다.GA에서 가자미근을 분리하기 위해 원위 힘줄을 자르고 세척 매체가 들어 있는 페트리 접시에 가자미근을 놓습니다. 그런 다음 GA를 자르고 페트리 접시에 넣으십시오. 삼두근을 분리하려면 삼두근과 상완골 사이에 닿을 수 있는 매우 미세한 팁이 있는 직선 집게를 사용하고 집게를 근육의 근위 끝으로 밀어 근육과 뼈를 분리합니다.다음으로 삼두근의 말단부를 자르고 구부러진 집게를 사용하여 팔꿈치 위로 당겨 근위 힘줄에 접근합니다. 삼두근의 근위 힘줄을 자르고 근육을 페트리 접시로 옮깁니다. 다른 네 팔다리에 대해 절차를 반복하십시오.턱에서 모피와 피부를 제거하려면 가위를 사용하여 눈 아래 0.5 센티미터를 절개하여 꼬리 방향으로 자릅니다. 그런 다음 양손의 엄지와 검지를 사용하여 절개 부위의 양쪽을 꼬집고 피부를 위아래로 당겨 제거합니다. 교근의 주요 힘줄을 눈 아래 꼬리 쪽에 놓고 납작한 메스 칼날을 뼈와 근육 사이에 삽입하여 힘줄을 자릅니다.구부러진 집게로 주요 교근 힘줄을 잡고 메스 날이나 가위로 방향으로 잘라 교근과 턱뼈를 분리합니다. 분리된 교근을 페트리 접시에 넣고 두 번째 교근에 대한 절차를 반복합니다. 가위를 사용하여 흉골 중앙에 개흉술을 하고 흉골을 자릅니다.흉곽을 통해 360도 절단하여 다이어프램을 노출시킵니다. 그런 다음 상체를 복부에서 분리하려면 가위를 사용하여 기관, 식도, 대정맥 및 복부 대동맥을 절단합니다. 다음으로 가위를 사용하여 흉골 아래 1cm에 개복술을 하고 약 360도 절단합니다.흉곽과 복부 장기 사이에 닫힌 가위를 놓고 아래로 누릅니다. 흉곽을 부드럽게 당겨 복부 장기에서 분리합니다. 다이어프램을 흉곽에서 분리하려면 두 손가락 사이에 다이어프램을 느슨하게 잡고 가위로 흉곽을 자릅니다.다이어프램을 리브에 최대한 가깝게 약 360도 자르고 분리된 다이어프램을 페트리 접시에 넣습니다. 고립 된 근육을 약 1 밀리미터의 조각으로 잘라서 하나씩 잘라냅니다. 다진 근육을 5 리터의 해리 완충액이 들어있는 15 리터의 원추형 튜브로 옮기고 분당 60 회전 속도로 진탕 수조에서 35 분 동안 섭씨 37도에서 튜브를 배양합니다.다진 근육의 효소 소화 후, 현탁액을 15 밀리리터 튜브에서 50 밀리리터 튜브로 옮긴다. 20 게이지 바늘이 장착 된 10 밀리리터 주사기를 사용하여 바늘을 통해 위아래로 5 번 당겨 샘플을 다시 일시 중단합니다. 세포 현탁액을 주사기에 넣고 상단에 세포 스트레이너가 장착된 새로운 50밀리리터 원뿔형 튜브에 샘플을 변형시킵니다.모든 단일 유핵 세포를 회수하려면 빈 원추형 튜브를 20ml의 세척 매체로 세척하고 스트레이너를 통해 부어 변형된 샘플과 결합합니다. P1000 피펫으로 셀 스트레이너 아래에 남아 있는 부피를 회수합니다. 조직 해리 및 항체 염색에 이어, 개별 근육으로부터의 골격근 줄기 세포 또는 MuSC 및 섬유 지방성 전구체 또는 FAP를 형광 활성화 세포 분류에 의해 정제하였다.세포를 식별하고 이중선에서 싱글렛을 분리하기 위한 초기 게이팅 후, 염색 역치를 식별하기 위해 FMO 대조군을 사용하여 후속 게이트를 설정했습니다. 염색 샘플을 게이팅하고, FAPs에 상응하는 SCA1 양성 CD31 음성 및 CD45 음성 집단을 별도의 수집 튜브로 분류하였다. 이중 음성 모집단은 MuSC에 해당하는 VCA 양성 모집단을 정렬하기 위해 추가로 게이트되었습니다.횡격막 및 삼두근 근육 단세포 현탁액은 다른 것과 달리 FAP보다 MuSC의 상대적 풍부도가 더 높았습니다. EDU 염색은 강력하지만 두 가지 줄기 세포 유형과 서로 다른 근육에 걸쳐 EDU 양성 세포의 분획에 차이가 있음을 나타냅니다. 그러나 모든 조직에서 EDU 양성 MuSC의 평균 분율은 EDU 양성 FAP의 평균 분율보다 높았습니다.EDL 및 GA에서 분리된 MuSC는 TA, 다이어프램, 그라실리스 또는 삼두근에서 분리된 MuSC에 비해 EDU 통합이 현저히 낮았습니다. 유사하게, EDU 혼입의 상당한 변화는 상이한 근육으로부터 분리된 FAP에서도 관찰되었다. 마지막으로, 면역형광염색으로 세포 순도를 확인하였으며, 이는 줄기세포 분리 프로토콜의 특이성을 나타낸다.가장 중요한 단계는 조직의 기계적 소화입니다. 조직이 너무 많이 절단되면 생존력이 떨어집니다. 조직이 너무 적게 절단되면 EEL이 감소합니다.이 프로토콜은 생체 내 줄기 세포 기능을 더 잘 이해하기 위해 이식 후 생착과 같은 세포 거동을 측정하는 분석과 결합할 수 있습니다. 이 기술은 개별 근육 내에서 줄기 세포 행동의 차이가 질병 표현형 및 영향을받는 근육의 독특한 패턴을 특징으로하는 질병에 기여할 수 있는지 여부에 대한 답을 줄 수 있습니다.

isolation-quiescent-stem-cell-populations-from-individual-skeletal

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

플라스크에 세포의 준수 속도에 따라 musculoskeletal 부드러운 조직에서 분리 성인 줄기 세포.

소프트 Musculoskeletal 조직에서 줄기 세포를 분리

마이크로 해부 explants 기술은 골격 근육 줄기 세포의 원천으로 청소년, 성인이나 배아 근육에서 proliferative 골격근 세포를 분리를위한 강력하고 안정적​​인 방법입니다. 유니 클리,이 세포는 clonally 생체내 이식에 사용되는 골격 근육 줄기 세포 라인을 생산하기 위해 파생되었습니다.

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

myofibers의 절연과 문화는 황금...

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

정지 위성 세포의 순수 인구의 분리 및 배양은 근육 줄기 세포 집단은 근육 줄기 세포 생물학 및 재생뿐만 아니라, 근육 퇴행 위축 및 기타 퇴행성 질환의 치료를위한 줄기 세포 이식의 이해에 중요하다.

근육 위성 세포의 분리, 문화, 및 이식

재생 애플리케이션에 이상적이다 인간의 골격 근육 항구 여러 멀티 혈통 전구체 집단 내에서 혈관. 내막 근육 조직에서 혈관 내피 세포, 혈관 주위 세포 매체 및 외막 세포 외막에서이 분리 방법은 혈관의 세 층 구조에서 각각 세 능성 전구 세포 집단의 동시 정제를 허용한다.

인간의 골격 근육에서 혈관 유래 다 능성 전구체의 분리

인간의 근육에서 유래한 주요 부착 세포 유형은 근육 세포와 섬유아세포입니다. 여기에서 세포 집단은 CD56 항원을 기반으로 하는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 농축됩니다. 이후 특정 항체를 사용한 면역 라벨링과 이미지 분석 기법을 사용하여 개별 세포의 세포질 및 핵 특성을 정량화할 수 있습니다.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

우리는 골격 근 생검 조직에서 얻은 인간 1 차적인 근육 전구 세포 (hMPCs)를 분리, 배양, 특성화 및 분화하는 기술을 제시합니다.  이러한 방법을 통해 획득되고 특징지어지는 hMPC는 인간 근생 및 골격 근 재생과 관련된 연구 질문을 이후에 해결하는 데 사용될 수 있다.

골격 근 생검 절차에서 인간 근육 선조 세포의 격리, 배양, 특성화 및 분화

여기서, 우리는 동종구균 돌연변이 라민 Δ8-11 마우스 모델, 에머리-드레이퍼스 근 위축증(EDMD)에 대한 매우 가혹한 모델으로부터 초기 산후 발달 단계에서 단일 근육 섬유를 효율적으로 획득하는 방법을 제안한다.

초기 산후 발달에 있는 에머리 드레이푸스 근 이영양증의 Murine 모형에서 단 근섬유 격리 및 문화

이 프로토콜에서 근육 줄기 세포에 대한 체외 배양 및 기능 분석 방법이 설명되어 있어 내인성 틈새 시장을 통해 대부분의 상호 작용을 보존합니다.

성인 근육 줄기 세포 기능 전 비보의 평가를위한 단일 근섬유 배양 분석

골격근은 상주 줄기세포를 포함한 여러 세포 유형으로 구성되어 있으며, 각 세포 유형은 근육 항상성과 재생에 특별한 기여를 합니다. 여기에서는 근육 줄기 세포의 2D 배양과 생리학적, in vivo 및 환경적 특성의 많은 부분을 보존하는 ex vivo 환경에서의 근육 세포 틈새에 대해 설명합니다.

틈새 및 줄기 세포 정지를 재현하기 위한 쥐 골격근의 분획되지 않은 대량 배양

이 프로토콜은 조직 해리, 순차적 여과, 사전 플레이트 및 정의된 배양 조건을 통해 성체 및 신생아 마우스 골격근에서 1차 근모세포를 분리하고 농축하는 표준화된 방법을 제공하여, 위성 세포 유래 근아세포 배양을 하위 실험 응용으로 구축하고 유지할 수 있게 합니다.

시험관 내 근형성 연구를 위한 골격근 위성 세포 분리

배우세요 생쥐 개별 골격근에서 근육 줄기세포와 섬유지방성 전구세포를 분리하는 방법을. 형광 활성화 세포 분류와 면역형광 염색을 활용하여 세포 순도를 검증하고 재생의학 연구에 활용할 수 있습니다.

개별 골격근에서 정지 줄기 세포 집단의 분리

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