Name: 환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 배우세요 환자 유래 종양 세포에서 3차원 스페로이드를 배양하고 약물 민감도를 평가하는 방법입니다. 이 기술은 실제 종양 생물학을 재현하여 항암 치료 효과를 예측하고 맞춤형 치료 전략을 수립하는 데 활용됩니다.

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원발성 종양 세포 배양에 사용된 인간 종양 샘플의 수집은 환자의 서면 동의와 함께 Rabin Medical Center에서 IRB(Institutional Review Board) 승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 연구에 참여할 수 있는 환자는 비전이성 유방암, 결장암, 간암, 폐암, 신경내분비암, 난소암 또는 췌장암, 소아암 또는 전이성 암이 있는 남성 및 여성 성인 및 소아암 환자를 포함했습니다. 유일한 제외 기준은 정보에 입각한 동의를 제공할 수 있는 능력이 부족하다는 것이었습니다.
1. 스페로이드의 생성 및 수집
참고: 원발성 종양 세포의 분리는 Kodak et al.8에 설명된 대로 수행할 수 있습니다. 중요하게도, 스페로이드를 생성하는데 사용되는 원발성 종양 세포는 생검, 절제 등에 의해 얻어진 환자 샘플로부터 직접 유도될 수 있거나, Moskovits et al.9에 의해 기술된 바와 같이, 환자-유래 이종이식 (PDX) 모델로부터의 종양 샘플을 사용하여 간접적으로 유래될 수 있다.
<ol><li>단일 세포 부착 일차 세포 배양액이 있는 작은 플라스크(T25)를 취하여 75%-100% 합류의 부착성 원발성 종양 세포 배양액의 단일 세포 현탁액을 준비하고, 세포 배양 배지를 제거하고, PBS로 세척한 다음, 1x Accutase(세포 분리 용액)( 재료 표 참조) 1mL를 37°C에서 3분 동안 첨가합니다.</li>
	<li>세포 배양 배지 5mL(10% FBS, 1:100 페니실린-스트렙토마이신, 1% 비필수 아미노산 및 1% L-글루타민이 보충된 RPMI-1640 배양 배지, 재료 표 참조)를 추가하여 Accutase 용액을 중화합니다.</li>
	<li>10mL 혈청학적 피펫으로 세포를 흡인하고 15mL 원뿔형 튜브에 증착합니다. 튜브를 실온에서 800 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>세포 배양 배지를 제거하고 세포 펠릿 위에 신선한 세포 배양 배지 5mL를 넣고 부드럽게 혼합합니다.</li>
	<li>혈구계10으로 생존 세포를 계수한다. 이를 위해 세포 현탁액 50μL의 분취량을 취하여 50μL의 트리판 블루와 혼합합니다. 살아있는 세포(파란색에 대해 음수인 세포)를 세고 현탁액에 있는 살아있는 세포의 총 수를 계산합니다.</li>
	<li>"3D 배양 배지"(5% 기저막 매트릭스로 보충된 세포 배양 배지; 재료 표 참조)를 준비합니다. 참고: "3D 배양 배지"는 실온에서 액체와 같습니다. 37°C에서는 농도가 더 겔처럼 되어(세포가 함께 유지되도록) 피펫팅할 수 있습니다(기저막 매트릭스가 5%만 포함되어 있기 때문에).</li>
	<li>분석에 필요한 세포 수와 필요한 총 부피를 계산합니다. 각 웰은 200μL의 배지에 2,000-8,000개의 세포를 포함해야 합니다.</li>
	<li>200 μL의 "3D 배양 배지"에 원하는 수의 세포(예: 4,000개 세포)의 세포 현탁액을 준비하고 균질한 분포를 보장하기 위해 피펫과 부드럽게 혼합합니다.</li>
	<li>현탁액을 피펫팅 저장소로 옮깁니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 200μL의 세포 현탁액을 초저 부착 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다( 재료 표 참조). 세포를 채취하기 전에 현탁액을 잘 섞는다.</li>
	<li>플레이트를 실온에서 10분 동안 300 x g 에서 원심분리하여 세포의 클러스터링을 시행하고, 세포 응집을 개선하고, 플레이트를 5%CO2 가습 인큐베이터에서 37°C에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>2-3일마다 "3D 배양 배지"를 새로 고칩니다. 플레이트를 실온에서 10분 동안 300 x g 로 원심분리하고, 배지(100 μL)의 50%를 부드럽게 제거 및 버리고, 100 μL의 신선한 "3D 배양 배지"를 추가하여 기존 용액을 대체합니다. 단계 1.11을 반복하고, 플레이트를 다시 37°C, 5%CO2 가습 인큐베이터에 넣는다. 참고: 배지 제거는 플레이트를 45°로 유지한 상태에서 수행해야 하며, 배지는 세포가 수집되지 않도록 상부에서만 수집해야 합니다. 진공 흡입 시스템을 사용해서는 안 됩니다. 신선한 배지는 이미 형성되기 시작한 스페로이드를 방해하지 않도록 천천히 부드럽게 첨가해야 합니다.</li>
	<li>스페로이드 형성을 모니터링하기 위해 1-2일마다 현미경으로 세포를 검사합니다. 이미징 소프트웨어의 "스케일" 도구를 사용하여 형성된 스페로이드의 직경을 측정합니다( 재료 표 참조). 참고: 현미경 검사는 먼저 시간이 지남에 따라 스페로이드 모양을 취하는 불규칙한 원형에서 타원형의 몸체를 밝혀야 합니다11,12.<ol><li>스페로이드 직경이 100-200 μm에 도달하면 약물 효능 실험을 수행합니다. 참고: 약물 효능 실험은 스페로이드가 이 직경에 도달할 때 수행되며, 그 당시 대부분의 세포가 증식하여 치료에 대한 반응을 평가하는 데 도움이 됩니다. 더 큰 직경의 스페로이드는 괴사 코어와 정지 층11,12를 함유하여, 치료에 반응하는 증식 세포의 비율이 더 작다.</li>
	</ol></li>
	<li>스페로이드 수집을 위해 1,000μL 피펫을 사용하여 각 웰에서 스페로이드를 수집하고 15mL 코니컬 튜브에 증착합니다. 알림: 스페로이드는 본질적으로 깨지기 쉬우므로 조심스럽게 다루어야 합니다. 스페로이드가 있는 매체를 원뿔형 튜브로 옮길 때 튜브를 45°로 잡고 튜브 벽에 천천히 피펫을 끼웁니다. 스페로이드는 눈으로 볼 수 있습니다.</li>
	<li>원뿔형 튜브를 실온에서 300 x g 로 5분 동안 원심분리하고 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인하고 버립니다.</li>
	<li>세포 배양 배지 0.5mL를 넣고 펠렛을 잘 그러나 부드럽게 재현탁합니다. 거품을 만들지 마십시오.</li>
	<li>아래 단계에 따라 스페로이드 카운팅을 수행합니다.<ol><li>96웰 플레이트를 사용하고 우물 밑면에 더하기 기호를 그려 우물을 사분면으로 나눕니다(계수 추적에 도움이 됨).</li>
		<li>50 μL의 현탁액을 웰에 넣고 현미경으로 수동으로 스페로이드를 계수합니다(10x 대물 렌즈 사용).</li>
		<li>각 사분면의 스페로이드를 세고, 두 번 세지 않도록 주의하고, 우물에 있는 스페로이드의 총 수를 계산합니다. 알림: 계산의 정확성을 위해 우물에서 최소 50개의 스페로이드를 계수하십시오. 스페로이드가 50개 미만인 경우 현탁액을 부드럽게 혼합하여 균질한 분포를 보장하고 새 웰에 추가된 더 많은 양의 현탁액을 사용하여 다시 계산합니다. 또는 웰에 스페로이드가 50개 미만인 경우 스페로이드를 원심분리하고 <0.5mL 부피로 부드럽게 재현탁할 수 있습니다. 스페로이드가 100개 이상인 경우 세포 배양 배지를 스페로이드 현탁액에 추가하고 부드럽게 혼합한 다음 다시 계산합니다.</li>
		<li>스페로이드 농도(스페로이드 수/계수 부피[μL])를 계산한 다음 현탁액의 총 스페로이드 수(스페로이드 농도 × 총 부피)를 계산합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 약효 분석(MTT assay)
참고: 자세한 내용은 van Meerloo et al.13을 참조하십시오. 또한 MTT 분석의 경우 "3D 배양 배지"가 아닌 세포 배양 배지만 사용해야 합니다(기저막 매트릭스를 추가할 필요가 없으며 잠재적으로 MTT 분석을 방해할 수 있음).
<ol><li>새로운 튜브에서 세포 배양 배지 200μL당 스페로이드 200개 농도의 스페로이드 현탁액을 준비합니다(10% FBS, 1:100 페니실린-스트렙토마이신, 1% 비필수 아미노산 및 1% L-글루타민이 보충된 RPMI-1640 배양 배지).<ol><li>각 약물 처리에 대해 15mL 튜브에 스페로이드 스톡을 준비합니다. 반복에 필요한 웰 수로 각 약물에 필요한 양을 계산하십시오 : (5-8) × 200 μL. 필요한 최종 농도까지 튜브에 약물을 첨가하십시오. 참고: 현재 연구에 사용된 약물 및 복용량에 대한 대표 결과 섹션을 참조하십시오. 또한 약물의 상업적 세부 사항은 재료 표에 나와 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>200 μL의 스페로이드 현탁액을 초저부착 96-웰 플레이트의 웰 내로 옮기고, 플레이트를 5%CO2 가습 인큐베이터에서 37°C에서 인큐베이션한다. 분석을 위해 96-웰 플레이트의 외부 행과 열을 사용하지 마십시오., 이러한 웰은 증가된 증발을 특징으로 하므로 반복 실험 간의 변동성이 증가할 수 있습니다.; 대신 이 웰에 PBS를 추가합니다. 참고: 배양물이 96웰 플레이트에 분주되기 전에 스페로이드의 배양이 균질해야 합니다. 또한 모든 실험에는 대조 조건(즉, 처리되지 않은 스페로이드)이 포함되어야 합니다.</li>
	<li>스페로이드를 연구 약물과 함께 24-72시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 실온에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리하고, 170 μL의 세포 배양 배지를 부드럽게 제거하고, 30 μL(스페로이드 포함)를 웰 바닥에 남겨둔다. 참고: 170μL의 세포 배양 배지는 스페로이드가 제거되지 않도록 조심스럽게 제거해야 합니다. 플레이트를 45°로 잡고 한 손(대비를 위해 어두운 장갑을 끼고)을 웰 아래에 놓아 스페로이드가 보이도록(흰색 점) 합니다.</li>
	<li>MTT 용액(페놀이 없는 RPMI에서 0.714mg/mL, 재료 표 참조)을 준비합니다.</li>
	<li>70μL의 MTT 용액을 각 웰에 웰당 100μL의 최종 부피에 추가합니다(웰의 최종 MTT 농도는 100μL당 0.05mg임). 또한, 세포가없는 MTT 용액으로 "블랭크 (Blank)"웰을 준비하십시오. 알림: MTT는 빛에 민감합니다. 따라서 후드의 조명을 꺼야 하며 MTT 용액이 들어 있는 튜브를 알루미늄 호일로 덮어야 합니다.</li>
	<li>플레이트를 37°C에서 5%CO2 가습 인큐베이터에서 웰 내의 용액의 색 변화(보라색은 살아있는 세포를 나타냄)가 관찰될 때까지 3-4시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>변화가 관찰되면 각 웰에 정지 용액(이소프로판올 중 0.1N HCl) 100μL를 추가하고 기포를 생성하지 않고 웰의 내용물을 부드럽게 혼합합니다.</li>
	<li>570 nm의 파장과 630-690 nM의 배경 파장에서 Fluorometer-ELISA 판독기 ( 재료 표 참조)에서 플레이트의 흡광도를 읽습니다. 알림: 사용 가능한 형광계-ELISA 판독기가 초저 부착 96웰 플레이트를 읽을 수 없는 경우 각 웰의 내용물을 해당 평평한 바닥 96웰 플레이트로 옮깁니다.</li>
	<li>아래 단계에 따라 세포 생존율을 계산하십시오.<ol><li>각 웰에 대해 "특정 신호"( "특정 신호"= 570 nm의 신호 - 630-690 nm의 신호)를 계산하십시오. 그런 다음 "블랭크" 웰의 평균값을 계산하고 각 웰에서 이 값을 뺍니다.</li>
		<li>연구 약물("AV-SS-unt")로 처리되지 않은 세포를 포함하는 대조군 웰에서 "특정 신호"의 평균을 계산합니다.</li>
		<li>처리되지 않은 세포가 있는 웰에 대한 각 웰의 세포 생존율(백분율)을 계산합니다. 참고: 생존율 = (각 웰의 특정 신호/"AV-SS-unt") × 100</li>
	</ol></li>
</ol>3. 스페로이드의 형태학적 변화 모니터링 및 분석
참고: MTT 분석의 경우 이 평가에는 "3D 배양 배지"가 아닌 세포 배양 배지만 사용해야 합니다(기저막 매트릭스를 추가할 필요가 없으며 잠재적으로 분석을 방해할 수 있음).
<ol><li>스페로이드를 계수한 후 세포 배양 배지(10% FBS, 1:100 페니실린-스트렙토마이신, 1% 비필수 아미노산 및 1% L-글루타민이 보충된 RPMI-1640 배양 배지)에서 현탁액을 20μL당 약 1-2개의 스페로이드로 희석합니다.</li>
	<li>80μL의 세포 배양 배지를 초저 부착 96웰 플레이트의 웰에 넣은 다음 20μL의 스페로이드 현탁액을 웰에 추가합니다. 참고: 따라서 웰에는 100μL 용량의 스페로이드 1-2개가 포함됩니다.</li>
	<li>현미경으로 웰을 주의 깊게 확인하고 이 분석에 사용될 스페로이드 하나가 포함된 웰을 표시합니다.</li>
	<li>관심 농도의 2배인 농도로 연구 약물을 준비합니다. 100 μL의 약물 용액을 관련 웰에 추가합니다 (웰의 총 농도는 1x가 됨).</li>
	<li>0일(연구 약물을 추가하기 전)에 각 웰의 이미지를 캡처하고 이미징 소프트웨어의 "스케일" 도구( 재료 표 참조)를 사용하여 스페로이드의 직경을 결정합니다.</li>
	<li>플레이트를 5%CO2 가습 인큐베이터에서 37°C로 배양하고, 약물 효과가 관찰되는 시기(예: 세포 파종, 침습성 포드, 구조 파괴 등)에 따라 3-7일 동안 매일 형태를 검사하고 스페로이드의 직경을 측정합니다("스케일" 도구 사용).</li>
	<li>실험이 끝나면 시간 경과에 따른 스페로이드 직경의 변화(0일 기준)를 플로팅합니다. 참고: 변화(백분율) = (특정 날짜의 스페로이드 직경/0일의 해당 스페로이드 직경) × 100</li>
</ol>

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</ol>

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본 프로토콜은 인간 종양 샘플로부터 유래된 3D 일차 세포 배양물(스페로이드)을 생성하기 위한 간단한 방법을 설명한다. 이러한 스페로이드는 잠재적인 약물 후보 및 약물 조합 평가, 잠재적인 바이오마커 또는 치료 표적 식별, 반응 및 내성 메커니즘 조사를 포함한 다양한 분석에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 환자 샘플에서 직접 파생된 원발성 종양 세포 또는 환자 샘플을 사용하여 확립할 수 있는 PDX 모델의 종양 세포를 사용합니다. 후자의 접근법은 동일한 원발성 종양으로 시험관 내 및 생체 내 실험을 수행 할 수 있습니다. PDX 모델과이들 모델에서 파생된 3D 배양 간의 약물 감수성 실험 결과에서 일관성이 이전에 나타났으며9, 따라서 이러한 in vitro/in vivo 접근법의 관련성을 뒷받침한다.
현재 프로토콜의 주요 장점은 대부분의 고형 종양에 대한 광범위한 적용 ...

시험관 내 및 생체 내 연구는 암 치료법 개발을 위한 보완적인 접근 방식을 나타냅니다. 체외 모델은 대부분의 실험 변수를 제어하고 정량적 분석을 용이하게 합니다. 그들은 종종 저비용 스크리닝 플랫폼 역할을 하며 기계론적 연구에도 사용할 수 있습니다1. 그러나, 이들의 생물학적 관련성은 본질적으로 제한적인데, 그러한 모델은 종양 미세환경을 부분적으로만 반영하기 때문이다1. 대조적으로, 환자 유래 이종이식(PDX)과 같은 생체 내 모델은 종양 미세 환경의 복잡성을 포착하고 환자의 중개 연구 및 개별화 치료(즉, 개별 환자에서 파생된 모델에서 약물에 대한 반응 조사)에 더 적합합니다1. 그러나 생체 내 모델은 실험 매개 변수를 시험관 내 모델만큼 엄격하게 제어 할 수 없으며 개발에 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며 비용이 많이 들기 때문에 약물 스크리닝을위한 고 처리량 접근법에 도움이되지 않습니다 1,2.
시험관 내 모델은 100년 이상 사용되어 왔으며 세포주는 70년 이상 사용되어 왔습니다3. 그러나 지난 수십 년 동안 고형 종양의 시험관 내 모델의 복잡성이 극적으로 증가했습니다. 이러한 복잡성은 종양 유래 확립된 세포주 또는 1차 세포주인 2차원(2D) 배양 모델(단층 구조)에서 3차원(3D) 모델을 포함하는 최신 접근 방식에 이르기까지 다양합니다1. 2D 모델 내에서, 확립된 세포주와 일차 세포주 사이의 중요한 차이점이 있다4. 확립 된 세포주는 불멸화됩니다. 따라서 동일한 세포주를 수년에 걸쳐 전 세계적으로 사용할 수 있으며, 이는 역사적 관점에서 협업, 데이터 축적 및 많은 치료 전략의 개발을 용이하게 합니다. 그러나 이러한 세포주의 유전적 이상은 모든 통과와 함께 축적되어 생물학적 관련성을 손상시킵니다. 또한, 이용가능한 세포주의 제한된 수는 환자에서 종양의 이질성을 반영하지 않는다 4,5. 원발성 암 세포주는 생검, 흉막 삼출액 또는 절제를 통해 얻은 절제된 종양 샘플에서 직접 파생됩니다. 따라서 원발성 암 세포주는 종양 미세 환경 및 종양 특성의 요소, 예를 들어 세포간 행동(예: 건강한 세포와 암세포 간의 누화) 및 암세포의 줄기 유사 표현형을 보존하기 때문에 생물학적으로 더 관련이 있습니다. 그러나, 일차 세포주의 복제 능력은 제한되어 있어 배양 시간이 짧아지고 분석에 사용할 수 있는 종양 세포의 수가 제한된다 4,5.
3D 배양을 사용하는 모델은 생체 내 조건이 유지되기 때문에 2D 배양 모델보다 생물학적으로 더 관련성이 높습니다. 따라서 3D 배양 모델은 자연적인 세포 형태와 성장을 보존하고 저산소증, 괴사 및 세포 부착과 같은 종양 환경의 요소를 복제합니다. 암 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 3D 모델에는 다세포 스페로이드, 스캐폴드 기반 구조 및 매트릭스 내장 배양이 포함됩니다 4,6,7.
현재 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델(다세포 스페로이드)을 생성하고 세포 생존력 분석(MTT)과 현미경 검사의 두 가지 보완 접근 방식을 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가합니다. 본원에 제시된 대표적인 결과는 유방암 및 결장암; 그러나 이 프로토콜은 다른 고형 종양 유형(예: 담관암, 위암, 폐암 및 췌장암)에 광범위하게 적용할 수 있으며 전문 장비에 의존하지 않고 일반적인 암 연구/세포 생물학 실험실에서 전체를 수행할 수 있기 때문에 비용 효율적입니다. 이 접근법을 사용하여 생성된 다세포 스페로이드는 잠재적인 약물 후보를 평가하고, 잠재적인 바이오마커 또는 치료 표적을 식별하고, 반응 및 내성 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 세 부분으로 나뉩니다: (1) 약물 효능을 테스트하기 위한 모델로 사용하기 위한 준비에서 스페로이드의 생성, 수집 및 계수; (2) 스페로이드에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 MTT 분석; (3) 약물 효능을 평가하기 위한 또 다른 접근 방식으로서 스페로이드를 약물로 처리한 후 형태학적 변화를 현미경으로 평가합니다(그림 1).

<table><tbody><tr><td>5 Fluorouracil</td><td>TEVA Israel</td><td>lot 16c22NA</td><td>Fluorouracil, Adrucil</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>StemPro Accutase Cell Dissociation</td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>TEVA Israel</td><td>20B06LA</td><td>Abiplatin,&nbsp;</td></tr><tr><td>컬트렉스&nbsp;</td><td>Trevigen</td><td>3632-010-02</td><td>기저막 매트릭스, 타입 3</td></tr><tr><td>DMSO (디메틸 설폭사이드)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청 (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2391595</td><td></td></tr><tr><td>Flurometer&nbsp; ELISA 리더</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1</td><td>Gen5 3.11</td></tr><tr><td>염산 (HCl)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td>중지 솔루션</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA</td><td>&nbsp; 버전 1.52a</td><td>오픈 소스 소프트웨어 ImageJ</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Gadot</td><td>P180008215</td><td>정지 용액</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Gibco</td><td>1843977</td><td></td></tr><tr><td>MTT&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5655-1G</td><td>3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td></tr><tr><td>비필수 아미노산&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Palbociclib&nbsp; &nbsp;</td><td>Med Chem Express</td><td>CAS # 571190-30-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*칼슘과 마그네슘</td></tr><tr><td>페니실린 없음; 스트렙토마이신&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>2119399</td><td></td></tr><tr><td>페놀 프리 RPMI 1640</td><td>생물학 산업, 이스라엘</td><td>01-103-1A</td><td></td></tr><tr><td>피펫 저장소</td><td>Alexred</td><td>RED LTT012025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 배양 배지&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11530586</td><td></td></tr><tr><td>Sunitinib</td><td>Med Chem Express</td><td>CAS # 341031-54-7</td><td></td></tr><tr><td>Trastuzumab</td><td>F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland</td><td>10172154 IL</td><td>Herceptin</td></tr><tr><td>Trypan blue 0.5% 용액</td><td>생물학 산업, 이스라엘</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>초저 어태치먼트 96 웰 플레이트</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650970</td><td></td></tr><tr><td>비노렐빈</td><td>에베베</td><td>11733027-03</td><td>나벨빈</td></tr></tbody></table>

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

종양 생물학에 대한 이해의 놀라운 발전에도 불구하고, 임상 시험에 참여하는 종양학 약물 후보의 대다수는 종종 임상 효능의 부족으로 인해 실패합니다. 이 높은 실패율은 주로 종양 이질성과 종양 미세 환경을 반영하는 데 부적절하기 때문에 현재 전임상 모델이 임상 효능을 예측할 수 없음을 보여줍니다. 이러한 한계는 개별 환자에서 추출한 인간 종양 샘플에서 확립된 3차원(3D) 배양 모델(스페로이드)로 해결할 수 있습니다. 이러한 3D 배양은 종양 이질성을 반영하지 않는 기존 세포주보다 실제 생물학을 더 잘 나타냅니다. 또한 3D 배양은 저산소증, 괴사 및 세포 부착과 같은 종양 환경의 요소를 복제하고 자연적인 세포 형태 및 성장을 보존하기 때문에 2차원(2D) 배양 모델(단층 구조)보다 우수합니다. 본 연구에서는 3D 및 다세포 스페로이드에서 성장하는 개별 환자로부터 암세포의 1차 배양물을 제조하는 방법을 개발했습니다. 세포는 환자 종양 또는 환자 유래 이종이식으로부터 직접 유래될 수 있다. 이 방법은 고형 종양(예: 결장, 유방 및 폐)에 광범위하게 적용할 수 있으며 전문 장비에 의존하지 않고 일반적인 암 연구/세포 생물학 실험실에서 전체를 수행할 수 있으므로 비용 효율적입니다. 여기에서는 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델(다세포 스페로이드)을 생성하고 세포 생존력 분석(MTT)과 현미경 검사라는 두 가지 보완 접근 방식을 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이러한 다세포 스페로이드는 잠재적인 약물 후보를 평가하고, 잠재적인 바이오마커 또는 치료 표적을 식별하고, 반응 및 내성 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 원발성 종양 세포에서 스페로이드의 균질한 배양을 생성하고, 스페로이드 배양에 대한 약물 효능을 정량적으로 평가하고(MTT 분석), 스페로이드 형태에 대한 연구 약물의 효과를 결정하는 절차를 제시합니다. 결장암 및 유방암 세포 배양에서 생성된 스페로이드의 대표적인 실험 데이터가 제시됩니다. 담관암, 위암, 폐암 및 췌장암을 포함한 다른 종양 유형을 사용하여 유사한 실험을 수행하였다 (데이터는 나타내지 않음). 본원에 제시된 모든 실험은 삼중으로 수행되었다.
도 2 는 원발성 대장암 세포 배양물로부터 생성된 스페로이드를 나타낸 것이다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 생성되는 스페로이드의 수는 각 웰에 처음 파종된 세포의 수에 따라 달라집니다. 스페로이드가 직경 100μm 이상으로 성장하는 데 10-14일이 걸렸습니다. 종양 세포의 기원 (예를 들어, 상이한 환자 및 ...

현재 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델을 생성하고 세포 생존력 분석 및 현미경 검사를 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하는 것을 설명합니다.

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

우리의 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델의 생성을 설명하기 때문에 중요하며, 이 모델은 세포주보다 실제 종양 생물학을 더 잘 나타냅니다. 이 접근법은 다양한 고형 종양에 적용 할 수 있습니다. 또한 일반적인 세포 생물학 실험실에서 처음부터 끝까지 수행할 수 있으므로 비용 효율적입니다.이 접근법을 사용하여 생성된 3D 종양 모델은 항암 요법 또는 요법의 조합에 대한 종양의 민감도 및 내성에 대한 연구를 지원합니다. 이 접근 방식은 원발성 암세포에서 3D 모델을 생성합니다. 따라서 특정 환자에게 어떤 치료법이 효과적인지 식별하여 치료를 개인화하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사 과정 학생 인 Ella Itzhaki가 될 것입니다. 먼저, 단일 세포 부착성 1차 세포 배양이 있는 작은 T25 플라스크를 취하여 세포 배양 배지를 제거합니다. 세포를 PBS로 세척하고, 섭씨 37도에서 3분 동안 1x Accutase 1밀리리터를 첨가하여 75 내지 100% 합류의 부착성 원발성 종양 세포 배양액의 단세포 현탁액을 제조한다.5 밀리리터의 세포 배양 배지를 첨가하여 Accutase 용액을 중화시킨다. 10 밀리리터 혈청 학적 피펫으로 세포를 흡인하고 15 밀리리터 원추형 튜브에 증착합니다. 튜브를 800g에서 실온에서 5분 동안 원심분리합니다.세포 배양 배지를 제거하고 세포 펠릿 위에 8밀리리터의 신선한 세포 배양 배지를 추가한 다음 부드럽게 혼합합니다. 혈구계로 생존 가능한 세포를 계산하려면 50 마이크로 리터의 세포 현탁액을 취하여 50 마이크로 리터의 트리판 블루와 혼합하십시오. 그런 다음 살아있는 세포를 세고 현탁액에 있는 살아있는 세포의 총 수를 계산합니다.다음으로, 3D 배양 배지를 준비한다. 그리고 분석에 필요한 세포 수와 필요한 총 부피를 계산한 후 200마이크로리터의 3D 배양 배지에서 원하는 수의 세포로 세포 현탁액을 준비합니다. 균질한 분포를 보장하기 위해 피펫과 부드럽게 혼합하십시오.현탁액을 피펫팅 저장소로 옮기고, 200 마이크로리터의 세포 현탁액을 다중-채널 피펫을 갖는 초저 부착 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 300g에서 실온에서 10분 동안 원심분리하여 세포의 클러스터링을 시행하여 세포 응집을 개선하고, 플레이트를 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 배양합니다. 다시 300g에서 상온에서 10분간 원심분리한 후 배지의 50%를 부드럽게 제거하여 버리고 100마이크로리터의 신선한 3D 배양액을 첨가하여 기존 용액을 교체합니다.이 단계를 반복하고 플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에 다시 넣습니다. 스페로이드 형성을 모니터링하기 위해 1-2일마다 현미경으로 세포를 검사합니다. 이미징 소프트웨어의 스케일 도구를 사용하여 형성된 스페로이드의 직경을 측정합니다.그리고 스페로이드 직경이 100 내지 200 마이크로미터에 도달하면, 약물 효능 실험을 수행한다. 스페로이드 수집의 경우 1, 000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 각 웰에서 스페로이드를 수집하고 15 밀리리터 원뿔형 튜브에 증착합니다. 원뿔형 튜브를 300g에서 실온에서 5분간 원심분리하고, 피펫을 이용하여 상층액을 조심스럽게 흡인하여 버린다.세포 배양 배지 0.5 밀리리터를 첨가하고 펠렛을 잘 그러나 부드럽게 재현탁하십시오. 스페로이드 계수를 수행하려면 96웰 플레이트를 사용하고 웰 밑면에 더하기 기호를 그려 웰을 사분면으로 나눕니다. 50 마이크로 리터의 현탁액을 우물에 첨가하십시오.그리고 10x 대물 렌즈를 사용하여 현미경으로 수동으로 스페로이드를 계수합니다. 각 사분면의 스페로이드를 세고 웰에 있는 총 스페로이드 수를 계산합니다. 그런 다음 부피를 계산하여 스페로이드 수를 두 배로 늘려 스페로이드 농도를 계산하고 현탁액의 총 스페로이드 수를 계산합니다.새 튜브에서 세포 배양 배지 200마이크로리터당 스페로이드 200개 농도의 스페로이드 현탁액을 준비합니다. 각 약물 처리에 대해 다른 튜브에 스페로이드 스톡을 준비하십시오. 반복에 필요한 웰 수로 각 약물에 필요한 총량을 계산하고 필요한 최종 농도까지 튜브에 약물을 추가합니다.200 마이크로리터의 스페로이드 현탁액을 초저 부착 96웰 플레이트의 웰로 옮기고, 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 플레이트를 섭씨 37도에서 배양합니다. 스페로이드를 연구 약물과 함께 24 내지 72시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 실온에서 5분 동안 300g에서 원심분리하고, 170 마이크로리터의 세포 배양 배지를 부드럽게 제거하고, 웰의 바닥에 30 마이크로리터를 남겼다. MTT 용액을 준비하고, 70 마이크로리터의 용액을 각 웰에 웰 당 100 마이크로리터의 최종 부피에 첨가한다.우물의 최종 MTT 농도는 100 마이크로 리터 당 0.05 밀리그램입니다. 또한 세포가없는 MTT 용액으로 빈 웰을 준비하십시오. 웰 내 용액의 색상 변화가 관찰 될 때까지 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 3-4 시간 동안 플레이트를 배양합니다.변화가 관찰되면 각 웰에 100 마이크로 리터의 정지 용액을 넣고 기포를 생성하지 않고 웰의 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 파라미터 ELISA 판독기에서 570 나노미터의 파장 및 630 내지 690 나노미터의 배경 파장에서 플레이트의 흡광도를 판독한다. 세포 생존율을 계산하려면 각 웰에 대한 특정 신호를 계산하십시오.그런 다음 빈 웰의 평균값을 계산하고 각 웰에서이 값을 뺍니다. 연구 약물로 처리되지 않은 세포를 포함하는 대조군 웰에서 특정 신호의 평균을 계산합니다. 마지막으로, 처리되지 않은 세포가 있는 웰에 대한 각 웰의 세포 생존율을 계산합니다.초기 시딩된 세포의 수에 의한 시간 경과에 따른 원발성 결장암 세포 배양으로부터의 스페로이드의 형성이 여기에 표시됩니다. 이 그림에서 생성된 스페로이드의 수는 각 웰에 처음 파종된 세포의 수에 따라 달라진다는 것을 알 수 있습니다. 웰 당 2, 000의 초기 세포 파종으로 배양 10 일 후 원발성 결장암 세포로부터의 스페로이드가 여기에 표시됩니다.결장암 스페로이드의 장기간 배양에 따라, 그들은 서로 부착되기 시작했고 균질한 배양을 방해하는 스페로이드와 포도 같은 구조의 클러스터를 형성하여 MTT 분석에서 스페로이드의 사용을 금지했습니다. 결장암과 유방암을 포함한 원발성 종양 세포의 스페로이드에 대한 palbociclib, sunitinib 및 이들의 조합의 효과가 여기에 나와 있습니다. 결장암 및 유방암 세포에서 유래한 스페로이드에 대해 MTT 분석을 수행했습니다.MTT 신호는 DMSO 처리된 세포로부터의 값으로 표준화되었다. 이 값은 4번에서 8번까지의 반복실험의 평균을 나타냅니다. 세포 성장에 대한 다양한 처리의 효과는 또한 결장암 및 유방암 세포에서 유래한 스페로이드의 치료 0일째와 3일 후에 현미경으로 평가되었습니다.트라스투주맙과 비노렐빈 및 5 플루오로우라실과 시스플라틴이 시간 경과에 따른 유방암 유래 스페로이드에 미치는 영향이 이 그림에 나와 있습니다. 치료 기간에 따른 0일째에 대한 스페로이드 직경의 변화가 여기에 표시됩니다. 각 처리 그룹은 각 웰에 하나의 스페로이드가 있는 4 내지 6개의 웰을 포함하였다.평균 변경 사항이 여기에 표시됩니다. 스페로이드는 항암 치료에 대한 반응을 넘어 많은 연구에서 중요한 도구입니다. 이러한 연구는 예를 들어 약물 전달 및 세포-세포 상호 작용과 같은 기본적인 생물학 질문까지 다룹니다.단일 세포 현탁액으로 스페로이드 생성 공정을 시작하는 것이 중요합니다. 또한 5%basic membrane metrics를 포함하는 매체와 함께 초저 부착 플레이트를 사용하는 것이 중요합니다.

establishing-3-dimensional-spheroids-from-patient-derived-tumor

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

주변 정상 조직의 침입은 악성 종양을 정의하는 특징입니다. 우리는 여기에서 여러 진행성 인간 암 모델로 예시된 자연 3D 바이오매트릭스로의 침입에 대한 간단한 반자동 마이크로 플레이트 분석을 제공합니다.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

교모세포종 다형성의 환자 유래 이종이식편은 3D 인간 바이오겔 배양 시스템을 사용하여 살아있는 미세종양으로 소형화할 수 있습니다. 이 생체 내 유사 3D 종양 분석은 키노믹 분석을 포함한 약물 반응 검사 및 분자 프로파일링에 적합합니다.

Kinomic 프로파일 의약품 응답 테스트를위한 3D 인간의를 Biogel 문화 시스템을 사용 Microtumors 및 환자 유래 아교 모세포종 세포의 생성

우리는 치료 평가 우리 셀 라인에 머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 실험적인 치료 regimens의 현재 표준 테스트를 가능 하 게 한 회전 타원 체를 기반으로, 3 차원 생체 외에서 모델의 진화 설명 민감성 및 미래에 인간의 표본에서 1 차 셀에 저항.

머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 회전 타원 체 기반 3D 셀 문화 모델에서 테스트 하는 치료

다양 한 질병의 표시 더 순수 관련 모델 개발 및 구현에 약물 발견 프로그램 되. 여기에 설명 된 새로운 모델 시스템 spheroids를 경작 하 고 종양학 신약에 대 한 검색 하는 높은 처리량 1536-잘 접시 기반 시스템에서 상영 될 수 방법을 3 차원 종양을 보여 줍니다.

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

광학 일관성 단층 촬영 (10 월), 3 차원 영상 기술, 모니터링 하 고 다세포 종양 spheroids의 성장 활동 특성 사용 되었다. 접근, 및 내장 광 감쇠 대비에 따라 spheroids에서 레이블 없는 죽은 조직 검출 복을 사용 하 여 종양 spheroids의 정확한 체적 정량화 시연 했다.

경도 형태 및 생리 적인 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 3 차원 종양 Spheroids의 모니터링

이 프로토콜은 약물 을 평가하기 위해 증식, 세포 독성 테스트, 유세포 분석, 면역 형광 염색 및 공초점 이미징의 정량화를 포함한 환자 유래 스페로이드 생성 및 하류 분석을 설명합니다. 반대로 신생물 치료제로 후보자의 잠재력. 이 프로토콜은 각 환자 및 질병 단계에 대한 특정 약물을 식별하여 정밀 의학을 지원합니다.

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

여기에서, 우리는 2D 문화 보다는 생체 내 종양의 물리 화학 구배를 모방하는 3D 암 세포 스페로이드에 있는 생존과 죽음을 평가하기 위한 몇몇 간단한 방법을 제시합니다. 따라서 스페로이드 모델은 생체 내 조건으로의 번역을 개선하여 암 약물 효능의 평가를 허용합니다.

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

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약물 평가 연구를 위한 3D 종양 스페로이드 생성

여기에서는 항종양 항체의 중요한 암세포 사멸 기전인 ADCC 기전을 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제시합니다. NK 세포의 세포독성 효과는 트라스투주맙이 있는 유방암 세포 스페로이드에서 측정됩니다. 이미지 분석은 스페로이드에서 살아있는 킬러와 죽은 킬러와 표적 세포를 식별합니다.

종양 스페로이드 모델에서 항체 의존성 세포 독성 정량화: 약물 발견을 위한 응용

여기에서 우리는 세포외 플럭스 분석을 통해 3차원(3D) 신경아교종 스페로이드와 이미징 기반 정규화를 통합하는 대사 프로파일링 플랫폼을 구축합니다. 이 접근법을 통해 약물 치료에 대한 종양 대사 반응을 보다 정확하게 평가할 수 있으며 잠재적인 내성 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

약물 스크리닝을 위한 3차원 뇌종양 스페로이드의 대사 프로파일링의 발전

배우세요 환자 유래 종양 세포에서 3차원 스페로이드를 배양하고 약물 민감도를 평가하는 방법입니다. 이 기술은 실제 종양 생물학을 재현하여 항암 치료 효과를 예측하고 맞춤형 치료 전략을 수립하는 데 활용됩니다.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

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