Name: Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 학습하세요 생쥐 골수 유래 대식세포 분리 및 배양 방법을 통해 면역학 및 세포생물학 연구에 활용할 수 있는 고수율의 비자극 대식세포를 얻는 기술입니다.

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이 연구는 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), Rede de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) 및 Rede Mineira de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular - REMETTEC (RED-00570-16) 및 브라질 국가 과학 기술 개발 위원회(CNPq)의 보조금으로 지원되었습니다.

이 프로토콜은 국가 동물 실험 통제 위원회(Concea)와 동물 윤리 및 사용 위원회(CEUA)의 승인에 따라 수행되었습니다. C57BL/6 마우스는 브라질 벨루오리존치에 있는 미나스 제라이스 연방대학교(UFMG)의 Biotério Central에서 구입하였다. 실험실 가운, 장갑 및 눈 보호구와 같은 개인 보호 장비(PPE)는 이 프로토콜에 설명된 모든 단계에서 사용해야 합니다.
1. M-CSF의 공급원으로서의 섬유아세포 L-929 계통 상층액의 제조
<ol><li>L-929 섬유아세포 계통 세포(American Type Culture Collection Certified Cell Line-ATCC CCL1)를 해동하고 생존력을 보존하기 위해 즉시 배양 과정을 시작합니다.</li>
	<li>층류 생물 안전 작업대에서 1,000 μL 피펫을 사용하여 바이알의 L-929 섬유아세포 계통 세포를 50 mL 멸균 원심분리기 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>혈청학적 피펫을 사용하여 칼슘과 마그네슘이 없는 멸균 인산염 완충 식염수(PBS) 50mL를 추가합니다.</li>
	<li>300 x g, 4 °C에서 10분 동안 원심분리기 상층액을 버립니다.</li>
	<li>혈청학적 피펫을 사용하여 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신(P/S)(DMEM/F12-10)이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle′s medium-F12 20mL에 펠릿을 재현탁시킵니다.</li>
	<li>재현탁 세포를 T75 세포 배양 플라스크로 옮깁니다.</li>
	<li>37 °C, 5%CO2 인큐베이터에서 완전히 합류할 때까지 배양합니다. 알림: 플라스크를 조작하는 동안 오염원이 될 수 있으므로 용액으로 덮개를 적시지 않도록 주의하십시오. 편리한 양의 상층액을 얻으려면 세포 배양 플라스크의 전체 표면을 덮은 후 세포를 복제해야 합니다. L-929 세포는 접촉에 의해 억제됩니다. 다음 단계에 설명된 대로 트립신/에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액, DMEM/F12-10 및 멸균 PBS를 37°C로 가열하여 세포 배양 팽창을 시작합니다.</li>
	<li>완전히 합류하는 지점에 도달하면 세포 배양 플라스크에서 상층액을 층류 생물안전 캐비닛 내부에 버리십시오.</li>
	<li>혈청학적 피펫을 사용하여 20mL의 멸균 PBS로 세포 배양 플라스크를 세척하고 용액을 버립니다.</li>
	<li>부착된 세포가 들어 있는 세포 배양 플라스크에 10mL의 트립신/EDTA(0.05% 용액)를 추가합니다.</li>
	<li>세포 배양 플라스크를 층류에서 37°C, 5%CO2 인큐베이터로 옮기고 3분 동안 배양합니다.</li>
	<li>세포 배양 플라스크를 흔들어 배양 플라스크 표면에서 세포를 해리하고 현미경을 사용하여 모든 세포가 해리되었는지 확인합니다.</li>
	<li>10mL의 DMEM/F12-10 배지와 함께 trypsin/EDTA(0.05% 용액)를 비활성화합니다.</li>
	<li>혈청학적 피펫을 사용하여 용액을 50mL 멸균 원심분리기 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>4 °C에서 300 x g 으로 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버립니다.</li>
	<li>펠릿을 DMEM/F12-10 배지 10mL에 재현탁시킵니다.</li>
	<li>세포 현탁액 1mL를 T175 세포 배양 플라스크(1:10 배양)에 추가합니다.</li>
	<li>이 절차를 반복하여 T175 세포 배양 플라스크 10개를 얻습니다.</li>
	<li>각 세포 배양 플라스크에 50mL의 DMEM/F12-10을 추가합니다.</li>
	<li>37 °C, 5%CO2 인큐베이터에서 완전히 합류할 때까지 배양합니다. 참고: 이 단계는 500mL의 L-929 세포 상층액을 보장합니다. 5일째, 세포가 T175 세포 배양 플라스크 표면을 덮은 후, 상층액은 M-CSF를 위해 농축될 것이며 반드시 수집되어야 한다14.</li>
	<li>접촉 억제 후 5일째에 인큐베이터에서 세포 배양 플라스크를 제거합니다.</li>
	<li>배지를 50mL 멸균 원심분리기 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>3,200 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기</li>
	<li>M-CSF가 농축된 상층액을 수집하고 용액을 50mL 멸균 원심분리 튜브로 옮깁니다. -20 °C의 냉동실에 보관하십시오. 참고: 원심분리는 상층액에서 세포와 파편을 제거하는 데 매우 중요합니다.</li>
	<li>L-929 상층액은 편리하고 저렴한 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF) 공급원이며 일반적으로 5-10ng/mL의 M-CSF 8을 함유하고있습니다. 이들 상등액은 또한 미량의 다른 사이토카인(cytokine)과 성장 인자(growth factor)를 함유하고 있지만, 대식세포 생리학에 지대한 영향을 미치지는 않는다15. 그러나, 정제된 M-CSF는 1 - 2 ng/mL8의 농도에서 L-929 상층액의 대체품으로 구입하여 사용할 수 있다.</li>
</ol>2. 대퇴골과 경골의 제거
<ol><li>이산화탄소 질식 후 자궁경부 탈구에 의한 8주 된 C57BL-6 야생형 수컷 마우스 안락사를 국가동물실험위원회(Concea)의 규범 결의안 번호 18과 동물윤리 및 사용 위원회(CEUA)의 승인에 따라 진행합니다.</li>
	<li>70% 에탄올 용액에 쥐를 담그고 멸균 가위를 사용하여 복부를 따라 1cm를 절개합니다.</li>
	<li>뒷다리 근육이 완전히 드러날 때까지 피부를 제거합니다.</li>
	<li>뒷다리를 엉덩이 높이에서 제거하고 대퇴골과 경골이 부러지지 않도록 주의합니다.</li>
	<li>뒷다리를 70% 에탄올 용액이 있는 원뿔형 원심분리기 튜브에 넣습니다. 알림: 항상 병원체가 없는 마우스를 사용하십시오. 더 많은 수의 세포를 얻으려면 두 다리를 모아야 합니다. 2단계는 비멸균 환경(벤치탑)에서 수행됩니다. 따라서 박테리아 오염을 피하기 위해 대퇴골과 경골을 조심스럽게 제거하여 손상되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 절차의 나머지 단계는 층류 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다. 다리를 70% 에탄올 용액에 노출시키는 시간은 10분으로 제한해야 합니다. 시간이 길어지면 골수 전구 세포가 영향을 받을 수 있습니다.</li>
</ol>3. 경골과 대퇴골의 내강에서 골수 전구 세포를 얻습니다.
<ol><li>70% 에탄올 용액에서 다리를 제거하고 멸균 PBS로 옮깁니다.</li>
	<li>집게와 소독 물티슈를 사용하여 모든 근육과 근막을 제거합니다. 이 단계가 끝나면 뼈가 깨끗해야 합니다.</li>
	<li>멸균 수술용 메스 칼날을 사용하여 양쪽 끝의 골단을 절단하여 골수를 노출시킵니다.</li>
	<li>20mL 주사기에 2% 페니실린/스트렙토마이신 용액이 보충된 10mL의 멸균 PBS를 채우고 26G 바늘을 연결합니다.</li>
	<li>한 손으로 해부학적 해부 겸자를 사용하여 뼈를 잡고 다른 손으로 바늘을 골강에 삽입합니다. 집게로 뼈를 부수지 않도록 주의하세요.</li>
	<li>PBS로 뼈 내부를 씻어내고 멸균 원추형 원심분리기에 골수를 채취합니다. 이 단계가 끝나면 골강이 하얗게 보여야 합니다.</li>
	<li>수집된 세포를 4°C에서 300 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 버리고 세포 펠릿을 DMEM/F12-10 1mL에 재현탁시킵니다.</li>
	<li>균질화하고 9mL의 DMEM/F12-10 배지를 추가하여 세포를 총 10mL까지 만듭니다.</li>
</ol>4. 대식세포 배양
<ol><li>100mm x 20mm 원형 플라스틱 페트리 접시(총 10개의 접시) 각각에 1mL의 세포 전구체를 추가하고 피펫으로 플레이트에 세포를 펴서 균일한 분포를 얻습니다. 조직 배양 처리된 접시를 사용하지 마십시오.</li>
	<li>각 접시에 L-929 세포 상층액 20%가 보충된 DMEM/F12-10 9mL를 추가합니다.</li>
	<li>37 °C, 5%CO2 인큐베이터에서 배양합니다.</li>
	<li>3일째 되는 날에는 L-929 세포의 상층액 20%가 보충된 DMEM/F12-10 배지 10mL를 각 접시에 추가합니다. 이러한 방식으로, 배양 접시는 이제 총 20mL의 배양 배지를 가지며, 이는 세포가 성숙이 끝날 때까지 세포의 성장에 충분합니다. 참고 사항 : 조직 배양 처리된 접시는 표면과의 강한 상호 작용으로 표시되는 자연 부착 세포인 대식세포가 나중에 접시에서 쉽게 분리되지 않기 때문에 사용해서는 안 됩니다. 일반적으로 한 마리의 쥐(두 개의 대퇴골)의 세포 전구는 10개의 배양 접시에 파종될 수 있습니다. 세포 전구 세포는 대식 세포로 변형되어 배양 7일에서 10일까지 사용할 수 있습니다. 성숙 확인은 대식세포의 형태에 대한 변화로 식별됩니다. 성숙한 대식세포는 부착되어 있으며 이질적인 형태를 보이며, 이는 다른 방향으로 pseudopodia가 방출되는 것으로 설명됩니다. 이러한 성숙한 세포의 예가 대표 결과에 나타나 있습니다.</li>
</ol>5. 대식세포 채취
<ol><li>모든 배양 접시에서 상층액을 버리십시오.</li>
	<li>각 배양 접시를 10mL의 따뜻한(37°C) 멸균 Mg2+ 및 Ca2+ 유리 PBS로 세척합니다.</li>
	<li>각 접시에서 용액을 버리십시오.</li>
	<li>비효소 세포 해리 용액을 37°C로 예열하고 각 접시에 3mL를 추가합니다. 37 °C, 5%CO2 인큐베이터에서 10분 동안 배양합니다. 도립 현미경을 사용하여 대식세포가 배양 접시에서 분리되고 있는지 시각화합니다. 알림: 비조직 배양 처리된 플라스틱 플레이트를 사용하면 세포를 쉽게 분리할 수 있고 플레이트에서 세포를 긁어낼 필요가 없어야 합니다.</li>
	<li>비효소 세포 해리 용액이 든 혈청학적 피펫을 사용하여 접시를 반복해서 세척하고 원을 그리며 모든 대식세포가 접시에서 해리되었는지 확인합니다.</li>
	<li>모든 배양 접시의 용액을 원뿔형 50mL 원심분리기 튜브에 함께 수집합니다.</li>
	<li>빈 배양 접시에 10mL의 멸균 예열된 PBS를 추가하고 5.4단계와 같이 진행합니다. 이 절차는 5.4단계를 반복하며 모든 대식세포가 수집되도록 보장하기 위한 것입니다.</li>
	<li>300 x g, 4 °C에서 10분 동안 원심분리기</li>
	<li>상층액을 버리고 1mL의 DMEM/F12-10으로 펠릿을 재현탁시킵니다. 세포가 손상되지 않도록 피펫을 사용하여 천천히 조심스럽게 위아래로 균질화합니다.</li>
	<li>10μL의 Trypan Blue로 희석한 10μL의 대식세포 용액 부분 표본을 준비하여 혈구계를 사용하여 세포를 계산합니다. 참고: 7일째에 각 접시는 약 2 x 106 개의 대식세포를 생성합니다. 이는 쥐 한 마리를 10개의 플레이트에서 수확할 때 약 2 x 107 개의 주요 대식세포를 생산할 수 있음을 의미합니다. M-CSF는 대식세포의 성숙만을 촉진하기 때문에, 이 시술은 본질적으로 대식세포일 뿐이며 다른 오염성 백혈구가 없는 세포 집단을 보장한다16.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

골수 유래 대식세포 집단을 생성하는 것은 많은 세포 생물학 실험 모델에서 기본 단계이며, 특히 일차 세포의 균일한 집단을 달성하는 것이 중요한 경우에 그렇습니다. 앞서 언급했듯이 세포 전구 세포는 M-CSF가 있을 때만 대식세포로 변형될 수 있습니다. L-929 세포 상층액은 M-CSF의 주요 공급원으로 사용할 수 있습니다. 비용 이외에는 재조합 M-CSF 자체를 사용하는 데 문제가 없습니다 8,17. 재조합 M-CSF 대식세포가 배양에서 더 나은 균일성을 나타낸다는 몇 가지 증거가 있습니다. 그러나, r-M-CSF 또는 L-929 상등액을 사용해도 주요 대식세포 마커의 유전자 발현과 사이토카인 생산에는 큰 차이가 없다15.
골수 전구 세포는 매우 민감합니다. 오염을 방지하려면 깨끗한 층류 생물 안전 후드를 사용하는 것이 필수적입니다...

단핵구(monocyte)와 대식세포(macrophage)는 골수의 전구세포(progenitor)에서 유래할 수 있는 단핵 식세포(mononuclear phagocyte)입니다. 최근 연구에 따르면 대식세포는 난황낭 유래 적혈구-골수성 전구세포(earmanitor of yalk sac-derived erythro-myeloid progenitors)에서 유래한다고 보고되었습니다1. 그 유래에 관계없이, 이 백혈구는 항상성과 염증에 중요한 영향을 미치는 기능을 가지고 있습니다 2,3. 단핵구(monocyte)는 말초 혈액에서 유래한 세포로 조직 내의 대식세포(2,4)로 더욱 분화할 수 있는 반면, 대식세포는 성장인자와 사이토카인(cytokine)의 국소적 노출에 의해 조절되는 표현형과 기능을 나타내는 이질적인 세포이다5. 대식세포는 이러한 기능적 다양성을 보여주기 때문에 많은 질병 모델에서 연구되었습니다. 따라서 대식세포의 체외 배양은 대식세포의 생리학과 다양한 질병에서의 역할을 이해하는 데 중요한 도구가 되었습니다. 골수는 대식세포 전구세포를 포함한 전구세포의 중요한 공급원으로, 분리 및 증식할 수 있어 얻어지는 대세포의 수를 기하급수적으로 증가시킬 수 있습니다. 또한, 골수 유래 대식세포는 조직의 다양한 자극에 반응하여 표현형을 변화시키기 때문에 조직 미세환경에 의해 생성되는 영향을 피하기 위해 특히 중요합니다 6,7. 골수 전구 세포는 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF)에 노출되면 대식세포로 변형됩니다8. 골수 유래 대식세포는 조직 내 생화학적 마커에 의해 단핵구 유래 대식세포와 구별할 수 없습니다. 이들 세포는 1차 세포의 매우 균질한 집단을 나타내며, 다른 많은 측면에서 복막 대식세포(peritoneal macrophage) 6,9와 유사하다.
이질적인 세포 기능 때문에 대식세포는 오랫동안 연구자들에 의해 철저히 연구되어 왔습니다. 이들 세포는 감염성 및 염증성 질환을 포함한 다양한 실험 모델에서 사용될 수 있으며, 이러한 과정에서 특징을 갖춰 보인다 10,11. 그들은 또한 다양한 미시 환경 자극에 대한 반응으로 대식 세포 분극을 조사하는 데 유용 할 수 있습니다12,13. 따라서, 마우스 골수로부터 많은 수의 일차 대식세포를 얻기 위한 목적으로 간단하고 신뢰할 수 있는 프로토콜이 여기에 제공된다.

<table><tbody><tr><td>20cc 주사기</td><td>DESCARPACK</td><td>SI100S4G</td><td>멸균 주사기</td></tr><tr><td>26-G 바늘</td><td>BD</td><td>497AQDKT7</td><td>멸균 바늘</td></tr><tr><td>50ml 원추형 원심분리기 튜브</td><td>SARSTEDT</td><td>62547254</td><td>원심분리에 적합한 플라스틱 원추형 튜브</td></tr><tr><td>70% 에탄올 용액</td><td>EMFAL</td><td>490</td><td>살균용 에탄올 용액</td></tr><tr><td>해부학적 해부학 펜치</td><td>3B SCIENTIFIC</td><td>W1670</td><td>70% 에탄올 용액</td></tr><tr><td>C57Bl/6 야생형 마우스를</td> 포함하는 멸균 비커에 유지 <td>Biot&eacute에서 구입; rio Central at Federal University of Minas Gerais</td><td>해당</td> 없음 <td>생쥐는 특이 병원체가 없어야 하며 생령은 6주에서 10주 사이여야 합니다. 마우스는 운송의 스트레스에서 회복하기 위해 최소 일주일 전에 수용해야 합니다.</td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크 T175</td><td>GREINER</td><td>C7481-50EA</td><td>T-175 플라스크, 경사진 목, 표면적 75 cm2, 필터 캡 포함, DNase 없음, RNase 없음</td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크 T75</td><td>GREINER</td><td>C7231-120EA</td><td>T-75 플라스크, 경사진 목, 표면적 75 cm2, 필터 캡 포함, DNase 없음, RNase 무료</td></tr><tr><td>소독 또는 아기 물티슈?</td><td>CLOROX</td><td>적용되지 않음</td> 뼈 <td>세척에 도움이</td></tr> 됩니다 <tr><td>증류수</td><td>GIBCO</td><td>15230</td><td>멸균 증류수</td></tr><tr><td>DMEM/F12-10</td><td>해당 없음</td><td>해당 없음</td><td>소 태아 혈청(FBS) 10mL와 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 1mL를 DMEM/F12(q.s.p. 100mL)</td></tr><tr><td>에 첨가 DMEM/F12-10 + L-929 세포 상등액</td><td>해당</td><td></td> <td>없음 해당 없음DMEM/F-12-10 Dulbecco&prime에 L929 세포 배양의 상층액 20%를 추가합니다</td></tr><tr><td>. s 수정된 독수리&프라임; s 배지 - F12 (DMEM/F12)</td><td>GIBCO</td><td>12500096</td><td>DMEM: F-12 배지는 2.5mM L-글루타민, 15mM HEPES, 0.5mM 피루브산나트륨 및 1200mg/L 중탄산나트륨을 함유합니다. 분말을 1리터의 증류수에 재현탁시키고 3,7g의 중탄산나트륨을 첨가합니다. pH를 7,2로 조정하고 0,22 &m.마이크로로 필터링합니다. 2 - 8°C에서 보관합니다. C freezer</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, 인증, 열 불활성화, 미국 (FBS)</td><td>GIBCO</td><td>10082147</td><td>DMEM-F12</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>농축 SIGMA-ALDRICH</td><td>Z359629</td><td>현미경 검사에서 대식 세포 계수에 사용</td></tr><tr><td>L-929 세포</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>ATCC # CCL-1</td><td>L-929는 대식 세포 집락 자극 인자 (M-CSF)의 공급원으로 사용되는 마우스 섬유 아세포 계통입니다.</td></tr><tr><td>니콘 TI 이클립스&nbsp;</td><td>니콘&nbsp;</td><td>적용되지 않음</td><td>Nikon TI Eclipse는 형광 및 위상 대조 현미경입니다</td></tr>. <tr><td>비효소 세포 해리 솔루션</td><td>CELLSTRIPER (CORNING)</td><td>25-056-CI</td><td>비효소 세포 해리 솔루션은 플레이트에서 대식세포를 손상시키지 않고 제거합니다</td></tr><tr><td>. 비처리된 라운드 배양 접시 100 &times; 20&ndash; mm</td><td>코닝</td><td>CLS430591</td><td>조직 배양 처리된 페트리 접시 또는 조직 배양 처리된 플레이트를 사용하지 마십시오</td></tr>. <tr><td>P3199 페니실린 G 칼륨염</td><td>USBIOLOGICAL</td><td>113-98-4</td><td>항생제</td></tr><tr><td>페니실린 및 스트렙토마이신(P/S) 용액</td><td></td><td></td> 페<td>니실린 0,26g과 스트렙토마이신 0,40g을 사용하십시오. 멸균 PBS 40mL와 섞습니다. 수평 층류 캐비닛 내부에는 0,22 &micro를 사용하십시오. M 여과하여 1.5 ml 마이크로퓨지 튜브에 1.0 mL의 부분 표본을 냉동고에 보관합니다(-20°C; C)</td></tr> <tr><td>칼슘 및 마그네슘이 없는 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>MEDIATECH</td><td>21-040-CM</td><td>멸균</td></tr><tr><td>S7975 스트렙토마이신 설페이트, 650-850U/mg</td><td>USBIOLOGICAL</td><td>3810-74-0</td><td>항생제</td></tr><tr><td>10mL 또는 25mL SARSTEDT의 혈청학적 피펫</td><td></td><td>861254001</td><td>혈청학적 피펫은 1mL 이상의 부피로 사용됩니다</td></tr>. 중<tr><td>탄산나트륨</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>144-55-8</td><td>DMEM-F12 소프트웨어에 대한 pH 보정</td></tr><tr><td>Nis Elements Viewer</td><td>NIKON</td><td>해당 없음</td><td>NIS-Elements Viewer는 이미지 파일 및 데이터 세트를 볼 수 있는 무료 독립 실행형 프로그램입니다.</td></tr><tr><td>멸균 PBS 및 P/S 용액의 2%</td><td>LABORCRIN</td><td>590338</td><td>멸균 PBS 40mL에 1mL의 P/S 추가</td></tr><tr><td>스트레이트 홍채 가위</td><td>KATENA</td><td>해당 없음</td><td>70% 에탄올 용액을 함유한 멸균 비커에 유지</td></tr><tr><td>L-929 세포의 상등액</td><td>해당 없음</td> 해당 <td>없음</td><td>L-929는 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF)의 공급원으로 사용되는 마우스 섬유아세포 계통입니다. L-929 상등액은</td></tr><tr><td>뼈에서 골단을 노출시키는 데 사용되는</td><td>Surgical Scalpel Blade No.24 Stainless Steel</td><td>SWANN-MORTON</td><td>311</td></tr> 프로토콜에서 얻었으며<tr><td>, Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>GIBCO</td><td>15250061</td><td>Trypan Blue Solution, 0.4%는 염료 배제 테스트</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA 용액 0,05%</td><td>GIBCO</td><td>25300-062</td><td>를 사용하여 세포 생존율을 평가하기 위한 세포 염색으로 일상적으로 사용됩니다.세포 배양을 위한 배양병에서 세포를 해리하는 데 사용</td></tr><tr>주<td>사수용수(WFI)</td><td>GIBCO</td><td>A12873</td><td>멸균 및 내독소가 없는 물</td></tr></tbody></table>

isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

대식세포는 항상성과 염증에 중요한 영향을 미치는 기능을 합니다. 이 세포는 신체의 모든 조직에 존재하며 미세 환경에 존재하는 자극에 따라 프로필을 변경하는 중요한 능력을 가지고 있습니다. 사이토카인은 대식세포 생리학, 특히 IFN-γ 및 인터루킨 4에 깊은 영향을 미칠 수 있으며, 각각 M1 및 M2 유형을 생성합니다. 이러한 세포의 다양성으로 인해 골수 유래 대식세포 집단의 생산은 세포 생물학의 많은 실험 모델에서 기본 단계가 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 목적은 골수 전구세포에서 유래한 대식세포의 분리 및 배양 연구자들을 돕는 것입니다. 병원체가 없는 C57BL/6 마우스의 골수 전구세포는 이 프로토콜에서 쥐 섬유아세포 계통 L-929의 상층액에서 얻어지는 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF)에 노출되면 대식세포로 변형됩니다. 배양 후 성숙한 대식 세포는 7일부터 10일까지 사용할 수 있습니다. 단일 동물은 약 2 x 107 대식세포의 공급원이 될 수 있습니다. 따라서 기본 세포 배양 방법을 사용하여 다량의 일차 대식세포를 얻기 위한 이상적인 프로토콜입니다.

대식세포는 특별한 생리학적 특성을 가진 크고 부착성 세포입니다. 그들은 유리와 플라스틱에 부착하는 능력 때문에 문화에서 다양한 형태학적 표현을 보여주며, 그들의 전형적인 확산 형태는 세포질 확장의 방출과 관련이 있습니다(그림 1). 골수 전구세포가 L-929 세포 상층액의 M-CSF에 노출되어 성숙한 대식세포로 변형을 시작하면 페트리 플레이트에 부착됩니다.
그림 2 는 골수 전구세포가 성숙한 대식세포로 변질되는 과정을 보여줍니다. 3일째에는 몇 개의 미성숙한 대식세포가 나타나며, 대부분은 막 돌기가 거의 없는 전형적인 둥근 형태를 보여줍니다(그림 3). 전체 프로세스에 따라 변환되지만 현재 프로토콜의 최대 효율성을 보장하기 위해 적절한 수와 성숙도를 달성하려면 일반적으로 7일이 필요합니다.
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본 프로토콜은 마우스에서 골수 유래 대식세포의 분리 및 배양을 설명합니다.

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

이 프로토콜은 골수에서 유래하고 조직 인자나 사이토카인에 노출된 적이 없는 자극되지 않은 대식세포를 다량 얻는 것을 목표로 합니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 동물에서 획득한 세포의 수입니다. 올바른 절차를 통해 약 2 배 10에서 7 대 대식 세포의 거듭 제곱을 얻을 수 있습니다.이 방법은 세포 생물학, 병리학, 면역학 및 기생충학과 같은 대식세포를 연구하는 다양한 분야의 연구원들에게 도움이 될 수 있습니다., 세포는 항상 오염에 취약하기 때문에 모든 멸균 단계에 주의를 기울이고 세포 생존력을 유지하기 위해 층류 생물 안전 캐비닛을 사용해야 합니다. 절차를 시연하는 것은 Izabela Aparecida de Souza입니다. 우리 연구실의 석사 학위 학생입니다.적절하게 안락사 된 8 주 된 C57BL / 6 야생형 수컷 마우스에 대한 절차를 시작하려면 마우스를 70 % 에탄올 용액에 담그십시오. 멸균 가위를 사용하여 복부를 따라 1cm를 절개하고 뒷다리 근육이 완전히 노출될 때까지 피부를 제거합니다. 그런 다음 대퇴골과 경골을 부러뜨리지 않고 엉덩이 높이에서 뒷다리를 조심스럽게 제거합니다.손상되지 않은 뒷다리를 70% 에탄올 용액이 들어 있는 원추형 원심분리기 튜브에 넣습니다. 층류 생물 안전 캐비닛 내부에서 분리된 다리를 70% 에탄올에서 멸균 PBS로 옮깁니다. 집게와 소독용 물티슈를 사용하여 붙어있는 모든 근육과 근막을 제거하여 뼈를 청소합니다.그런 다음 멸균 수술용 메스 칼날을 사용하여 양쪽 끝의 골단을 절단하여 골수를 노출시킵니다. 20밀리리터 주사기에 2% 페니실린 스트렙토마이신 용액이 보충된 10밀리리터의 멸균 PBS를 채우고 26게이지 바늘을 연결합니다. 한 손으로 해부학적 해부 겸자를 사용하여 뼈를 잡습니다.다른 손을 사용하여 뼈를 부수지 않고 조심스럽게 바늘을 골강에 삽입하십시오. 그런 다음 PBS로 뼈 내부를 씻어내고 멸균 원추형 원심분리기 튜브에 골수를 채취합니다. 세척이 끝나면 골강이 하얗게 보여야 합니다.수집된 세포를 300G, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 1밀리리터의 DMEM/F1210 배지에 재현탁시킵니다. 현탁액을 균질화하고 9밀리리터의 매체를 더 추가하여 총 부피를 10밀리리터까지 만듭니다.100 밀리리터 x 20 밀리미터 크기의 10개의 원형 플라스틱 페트리 접시 각각에 전구 세포 현탁액 1밀리리터를 추가합니다. 균일한 분포를 얻기

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Macrophages는 항상성의 중심 역할을하고 여러 조직의 병리. 여기에 제시된 프로토콜은 macrophages를 파괴하는 방법을...

마우스의 Macrophages의 고갈과 Reconstitution

이 비디오에서는 생쥐의 긴 뼈에서 골수 기질 세포의 분리 및 배양을 보여줍니다. 분리된 부착 BMSC는 추가 분석에 사용할 수 있습니다.

Isolation and Culture of Bone Marrow Stromal Cells from a Mouse Tibia

이 비디오에서는 박테리아 지질다당류와 면역글로불린 정맥 주사에 대한 반응으로 골수 유래 대식세포가 활성화되는 것을 보여줍니다.

항체에 반응하는 마우스 골수 유래 대식세포의 활성화(Activation of mouse bone marrow-derived macrophages in response to antibos)

골수 유래 대 식세포를 사용하여 대식 세포 분극 조사

대 식세포는 긴 타고난 및 적응 면역 반응의 중요한 구성 요소로 인식되고있다. 대식 세포와 미생물 사이의 상호 작용의 진화 유전 적, 생화학 적 측면에 관한 지식의 최근의 폭발은 대 식세포에 과학적인 관심을 갱신했다. 이 문서에서는 마우스 골수에서 대식 세포를 구별하는 방법을 설명합니다.

뼈 대식 세포 생산에게 골수 유래

여기에서는 번역 응용을 위해 이질적인 골수에서 다량의 쥐 단핵구를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 다른 방법과 비교했을 때, 이 새로운 방법은 높은 구배 자기 세포 분리(MACS)와 같은 값비싼 방법을 피함으로써 희생되는 동물의 수를 줄이고 비용을 절감하는 데 도움이 됩니다.

분리 및 설치류 골수의 정맥 주사 유래 단핵구

대사 재프로그래밍은 M1 및 M2 대식세포 분극의 특성이자 전제 조건입니다. 이 원고는 마우스 골수 유래 대식세포에서 해당작용 및 미토콘드리아 기능의 기본 매개변수를 측정하기 위한 분석을 설명합니다. 이 도구는 특정 요인이 대식세포의 대사와 표현형에 어떤 영향을 미치는지 조사하는 데 적용할 수 있습니다.

실시간 세포 외 유출 분석을 사용하여 편광 M1과 M2 골수 유래 대 식세포의 대사 특성

이 프로토콜은 NO-산화환원 생물학을 연구하기 위해 테트라하이드로바이오프테린(BH4)- 및 유도성 일차 뮤린 대식세포-결핍 일차 뮤린 대식세포를 배양하기 위해 확립되었다. 이 연구는 실험 결과와 결과의 해석을 혼동 할 수있는 전통적인 격리 및 배양 방법에서 발견되는 BH4 및 기타 유물의 잠재적 오염을 줄이는 데 중점을 둡니다.

NO-Redox 생물학의 연구를 위한 골수 유래 대식세포의 분리 및 시험관내 배양

우리는 프로테옴 규모에서 단백질 발견 및 정량화와 호환되는 고품질 미토콘드리아 분리를 위한 2단계 프로토콜을 제시합니다. 우리의 프로토콜은 유전 공학을 필요로하지 않으므로 모든 일차 세포와 조직에서 미토콘드리아를 연구하는 데 적합합니다.

단백질 발견 및 정량 분석을 개선하기 위한 미토콘드리아의 2단계 태그 없는 분리

이 프로토콜은 7-9일 된 신생아 마우스 골수 세포를 분리하고 L929 세포의 상층액을 과립구 집락 자극 인자(M-CSF)의 공급원으로 사용하여 분화된 대식세포를 생성하는 비효소적이고 간단한 방법을 설명합니다. 골수 유래 대식세포는 표면 항원 F4/80, CD206, CD11b 및 기능적 역량에 대해 추가로 분석되었습니다.

신생아 마우스 골수 분리 및 골수 유래 대식세포의 준비

학습하세요 생쥐 골수 유래 대식세포 분리 및 배양 방법을 통해 면역학 및 세포생물학 연구에 활용할 수 있는 고수율의 비자극 대식세포를 얻는 기술입니다.

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

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