Name: 쥐의 뇌로부터 시냅스 성분의 분리를 위한 세포하 분획 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: 배우세요 쥐 뇌에서 시냅스 소체와 시냅스 소포를 분리하는 세포하 분획법을 통해 신경과학 연구를 수행하는 방법입니다. 이 기술은 단백질 국소화와 기능을 정밀하게 분석할 수 있습니다.

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EM 이미지 준비에 대해 P. Colosi에게 감사드립니다. 이 작업은 국립 보건원 (R01 NS064963, SSC; R01 NS110354, SSC; R01 NS083846, SSC; R21 NS094971, SSC; T32 NS007224, 스마트 미디어 토큰; T32 NS041228, SMT), 미국 국방부(W81XWH-17-1-0564, SSC; W81XWH-19-1-0264, VDJ), 파킨슨병(ASAP) Collaborative Research Network(SSC) 및 Michael J. Fox Foundation Target Advancement Program(MJFF-020160, SSC & VDJ)에 걸쳐 과학 조정. 우리는 BioRender.com 사용하여 그래픽 일러스트레이션을 만들었습니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

그들의 정액 연구에서 Whittaker와 동료들은 시냅 토솜을 확인하기 위해 네 가지 형태 학적 기준을 사용했습니다 : (1) 구조는 밀폐 된 원형질막을 가지고 있습니다. (2) 구조는 크기와 수면에서 신경 말단 및 정맥류와 유사한 SV를 포함합니다. (3) 구조가 하나 이상의 작은 미토콘드리아를 소유하고; (4) 시냅스 전 막은 시냅스 후 성분11,12,13에 자주 부착됩니다. 처음 두 가지 기준은 일반적으로 모든 분리 방법에 적용되지만이 기사에서 설명한 가장 최근의 프로토콜에서 모든 결과 시냅토솜이 미토콘드리아와 연결된 시냅스 후 말단을 갖는 것은 아닙니다. 시냅토솜의 약 60 %는 미토콘드리아를 가질 것이며, 최대 15 %만이 시냅스 후 말단37을 부착 한 것으로 추정된다. 시냅스 후 구성 요소가 특히 관심이있는 경우, 등장 성 Krebs와 같은 균질화 완충액과 농축을위한 압력 여과를 사용하면 시냅스 후 말단 (시냅토 뉴로솜이라고도 함)을 가진 고농도의 시냅토솜을 생성하는 것으로 알려져 있습니다 22,38.
동물을 희생시키는 방법은 시냅 토솜과 시냅스 하위 분획의 품질에 영향을 줄 수 있습니다. 마취를 필요로하지 않는 안락사 방법을 사용하여 희생 된 성인 동물은 최상의 분획 품질을 얻을 것입니다. 또한, 뇌는 동결되지 않고 신선하게 해부되어야하며, 가장 생존 가능한 시냅스 분획22에 대해 균질화 완충액 (무게 / 부피)의 1:10 비율을 사용하여 균질화되어야합니다. 뇌에는 운반하는 신경 전달 물질의 유형에 따라 구별 될 수있는 이질적인 시냅스 집단이 있습니다. 시냅토솜 형성은 일반적으로 시냅스 유형 또는 신경전달물질 함량13에 의해 영향을 받지 않는다. 예외는 소뇌의 이끼 섬유이며, 이는 뇌의 나머지 부분에서 시냅토좀을 얻기위한 최적의 조건에서 파괴되는 것으로 알려져 있습니다39,40. 따라서이 영역의 배제가 실험 목표에 영향을 미치지 않는 경우 뇌 균질화 전에 소뇌를 제거하는 것이 좋습니다. 특정 신경 전달 물질 특성의 시냅 토솜을 분리하는 데 관심이있는 경우 관심있는 신경 전달 물질을 포함하는 뉴런에 대해 풍부한 뇌 영역을 먼저 분리 할 수 있습니다. 그러나이 접근법은 관심 영역의 크기에 따라 최종 분획 수율에 제한을 부과합니다 (따라서 동물의 나이도 고려 사항입니다). 신경 전달 물질 특이 적 시냅토좀을 분리하기위한 면역 화학적 방법이 있지만 생존력과 수율이 크게 손상 될 것입니다22. 시냅토솜 대사 생존능을 평가하는 것이 중요한 경우, 신경전달물질 방출(41,42) 또는 특정 효소 분석(43)의 측정이 사용될 수 있다.
시냅토솜 제제의 일반적인 오염 물질에는 마이크로솜, 유리 미토콘드리아, SV, 신경 및 신경교막이 포함됩니다. 오염은 P1 및 P2 분획22에서 세척 횟수를 증가시키고 후속 단계에서 적색 미토콘드리아 펠릿의 재현탁을 피함으로써 감소될 수 있다. 대사 생존력과 시간이 중요한 실험에서는 세척 횟수를 줄이고 자당 구배에 대해 Ficoll 또는 Percoll 구배를 사용하는 것이 도움이 될 것입니다44,45,46. 이러한 방법은 또한 오염을 크게 줄입니다. Whittaker의 원래 프로토콜은 고품질 SV를 산출했습니다. 이 방법에 포함된 Nagy et al.23에 의한 추가 최적화는 수율36을 크게 손상시키지 않으면서 놀라운 균질성과 순도를 가진 SV를 생성합니다. 글루타메이트성(VGLUT-1 함유) 또는 GABAergic (VGAT-1 함유) SV와 같은 특정 SV 아형이 관심의 대상인 경우, 특정 항체를 사용한 면역단리를 수행할 수 있다(47,48). 시냅토좀으로부터 CCV를 단리하기 위한 대안적인 방법이 또한 이용가능하며, 이는 차등 밀도로 인해, 이 방법(20,49,50)으로 수득된 SV와 동일한 계면에 존재하지 않을 수 있다.
전반적으로, 시냅스 성분을 단리하는 본 프로토콜은 공급원 뇌 조직의 질 및 양 및 실험 목표에 기초하여 개선된 균질성 및 생존성을 갖는 분획을 수득하도록 추가로 최적화될 수 있다. 자세한 문제 해결에 대해서는 Dunkley and Robinson22 및 Ganzella et al.36의 책 장을 참조해야 합니다.

시냅스는 뉴런이 통신하고 다양하고 정교하게 복잡한 기능을 발휘하는 뇌의 기본 계산 단위입니다. 따라서 시냅스는 뇌 건강의 기본입니다1; 시냅스 기능 장애는 많은 장애의 원인 또는 결과로 연루됩니다2. 시냅스는 시냅스 접착 분자에 의해 횡단되는 시냅스 틈새에 의해 밀접하게 부착되고 분리되는 두 개의 다른 뉴런의 확장인 시냅스 전후 말단으로 구성됩니다. 정보는 신경 전달 물질1이라고하는 화학 메신저의 형태로 시냅스 전후 구획에서 시냅스 후로 흐릅니다. 신경 전달과 관련된 분자 과정은 활발한 연구 분야입니다 3,4,5. 시냅스 말단 내의 병원성 과정과 다른 신경 하위 구획의 병리에 대한 시냅스의 반응을 이해하는 것은 뇌 장애를 해결하는 중요한 단계입니다 1,2. 주로 쥐 모델에 적용되는 몇 가지 방법 론적 발전은이 추구를 발전 시켰습니다6. 차등 원심분리에 의한 시냅스 분획의 분리는 건강과 질병의 시냅스 과정을 자세히 평가할 수 있게 한 패러다임 전환 방법 중 하나입니다.
성인 인간의 뇌는 80-900억 개의 뉴런으로 구성되어있습니다(7,8). 쥐 종 중에서 쥐의 뇌에는 약 ~2억 개의 뉴런이 있는 반면 쥐는 ~7천만 개의 9,10을 가지고 있습니다. 각 뉴런은 신경교 세포 및 조밀 한 혈관 구조와 혼합 된 고도로 편광 된 뉴런 네트워크와 수천 개의 특정 시냅스 연결을 형성합니다. 이러한 복잡하고 이질적인 조직에서 시냅스를 독립적 인 시스템으로 분리하고 연구하는 것은 한때 생각할 수 없었습니다. 1960년대에 Victor Whittaker, Catherine Hebb 및 다른 사람들은 세포하 분획 11,12,13,14를 사용하여 손상되지 않은 시냅스 말단을 분리함으로써 이를 가능하게 했습니다. 시냅스 소포 (SV)를 분리하려는 시도에서, 그들은 등삼 투 (0.32 M) 자당에서 액체 전단력을 통해 뇌를 균질화하고 초 원심 분리를 통해 뇌를 균질화했다. 그들은 꼬집어 진 원형질막으로 둘러싸인 손상되지 않은 신경 말단 또는 정맥류를 얻었으며,이를 신경 종말 입자 (NEP)라고 불렀습니다 11,13. 시냅스의 구조적 및 기능적 특성이 이러한 구조에서 보존됨에 따라 NEP는 나중에 다른 세포 내 세포 기관과의 일치를 위해 "시냅토솜"이라고 불렸습니다13,15. "시냅스 소포"라는 용어를 만든 Eduardo de Robertis와 동료들의 연구가 Whittaker와 동료들의 연구와 겹쳐서 "시냅스 토솜"분리 및 특성화16,17,18의 검증에 기여했다는 점은 주목할 가치가 있습니다.
시냅토솜은 신경 전달 물질13,18의 저장, 방출 및 재흡수에 필요한 모든 세포 및 분자 특성을 포함하는 생리학적 활성 구조입니다. 시험관 내에서 주요 시냅스 특성을 보존하고 비 시냅스 구성 요소가없는 것도 이러한 분리 방법의 유용성에 기여합니다. 시냅토솜은 신경 전달의 화학적 및 생리적 특성에 대한 이해에 크게 기여했으며 현재 시냅스 분자 과정과 질병 19,20,21,22,23에서의 변화를 연구하는 데 사용되고 있습니다. 시냅토솜은 또한 SV, 클라 트린 코팅 소포 (CCV), 시냅스 세포질, 시냅스 원형질막, 시냅스 미토콘드리아, 시냅스 접착 분자 및 기타 관심 성분과 같은 시냅스 구성 요소를 분리하기위한 초기 소스 물질이며, 이는 시냅스 기능의 분자 메커니즘의 이해를 용이하게 할 수 있습니다 18,19,20,24,25,26, 27,28. 이들 시냅스 하부 성분은 시냅토좀의 삼투압 용해 및 슈크로스 밀도 구배 초원심분리15,29에 의해 수득될 수 있다. Whittaker의 연구 그룹에 의한 원래의 세포 내 분획 방법은 양질의 시냅토솜 및 SV 13,30을 분리하는 데 효율적인 것으로 알려져 있지만, 최근의 최적화는 세포 내 분획 22,23,31,32의 순도를 향상시킵니다. 이 기사는 시냅토솜, SV 및 기타 시냅스 이하 구성 요소를 분리하기 위해 쥐 뇌 조직의 세포하 분획에 대한 고전적인 프로토콜의 매우 상세하고 접근 가능한 버전을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>1 mL TB 주사기</td><td>BD</td><td>309649</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf Tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td></td></tr><tr><td>14 mL, 오픈 탑 Thinwall Ultra-Clear Tube</td><td>Beckman Coulter</td><td>344060</td><td>SW 40 Ti</td></tr><tr><td>23 Gauge와 호환 Precision Glide Hypodermic Needle</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>26.3 mL, 캡 어셈블리가 있는 폴리카보네이트 병</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>355618 Ti70</td></tr><tr><td>3.5 mL, 오픈-탑 두꺼운 폴리프로필렌 튜브</td>와 호환 <td>Beckman Coulter</td><td>349623</td><td>TLA-100.3</td></tr><tr><td>50 mL Falcon 튜브</td>와 호환 <td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 원심 필터 유닛과 호환&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6279</td><td>1 mg/mL in diH2O</td></tr><tr><td>Avanti J-26 XP 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>B22984</td><td>< 26,000 rpm</td></tr><tr><td>벤치탑 HDPE 듀어 플라스크</td><td>써모 사이언티픽</td><td>5028U19</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 마우스</td><td>잭슨 랩스</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 5810R</td><td>에펜도르프</td><td>EP022628168</td><td>< 14,000 rpm</td></tr><tr><td>완성, 미니, EDTA-무료 프로테아제 억제제 칵테일 정제</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>용액 50mL당 1정 추가</td></tr><tr><td>곡선 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11273-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine Surgical Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>8r</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Col 조직 균질화 시스템</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-04369-15</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11650-10</td><td></td></tr><tr><td>고속 폴리카보네이트 원형 바닥 원심분리기 튜브</td><td>ThermoFisher</td><td>3117-0500</td><td>JA20</td></tr><tr><td>Isofluorane</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>JA-20 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>334831</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>American Bio</td><td>AB01108</td><td>1 mg/mL in diH2O</td></tr><tr><td>N-[2-Hydroxyethyl] piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)</td><td>American Bio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-80 XP 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>< 100,000 rpm</td></tr><tr><td>Optima TLX 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>< 120,000 rpm</td></tr><tr><td>펩스타틴 A</td><td>Thermo Scientific</td><td>78436</td><td>1 mg/mL in DMSO</td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>American Bio</td><td>AB01620</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>23335</td><td>단백질 농도 측정용</td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마-알드리치</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위</td><td>미세 과학 도구</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>SW 40 Ti 스윙 버킷 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>테플론 코팅 유봉 및 모르타르 조직 분쇄기</td><td>Thomas Scientific</td><td>3431D94</td><td></td></tr><tr><td>Ti70 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100.3 로터</td><td>벡크만 쿨터</td><td>349490</td><td></td></tr><tr><td>튜브 리볼버</td><td>도트 사이언티픽</td><td>DTR-02VS</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐의 뇌로부터 시냅스 성분의 분리를 위한 세포하 분획

Subcellular Fractionation for the Isolation of Synaptic Components from the Murine Brain

시냅스 말단은 신경 통신의 주요 부위입니다. 시냅스 기능 장애는 많은 신경 정신병 및 신경 장애의 특징입니다. 따라서 생화학 적 분리에 의한 시냅스 하위 구획의 특성화는 건강과 질병 모두에서 시냅스 과정의 분자 염기를 설명하는 강력한 방법입니다. 이 프로토콜은 세포 내 분획에 의해 마우스 뇌로부터 시냅스 말단 및 시냅스 하위 구획의 분리를 설명합니다. 첫째, 시냅토솜으로 알려진 밀봉된 시냅스 말단 구조는 뇌 조직 균질화 후 분리됩니다. 시냅토솜은 꼬집어지고 밀봉된 막이 있는 시냅스 전후 뉴런 구획입니다. 이러한 구조는 대사 활성 상태를 유지하며 시냅스 구조와 기능을 연구하는 데 유용합니다. 그런 다음 시냅토솜을 저장성 용해 및 초원심분리하여 시냅스 소포, 시냅스 세포질 및 시냅스 원형질막에 대해 풍부한 시냅스 하위 구획을 얻습니다. 분획 순도는 시냅스 구획에 특이적인 단백질에 대한 전자 현미경 및 생화학적 농축 분석에 의해 확인됩니다. 제시된 방법은 시냅스의 구조적 및 기능적 특성과 다양한 뇌 질환의 분자 병인을 연구하기위한 간단하고 가치있는 도구입니다.

제시된 방법은 추가 정제 및 다양한 형태의 하류 분석(35,36)을받을 수있는 11 개의 뇌 세포 내 분획을 생성한다. 시냅토솜, SVs23 및 기타 구성 요소의 품질을 평가하는 황금 표준 방법은 전자 현미경(EM)입니다(그림 7). 특정 세포하 분획에 존재하는 단백질에 대한 정량적 면역블로팅을 수행하여 분획 순도의 마커를 평가할 수도 있습니다(그림 8). 예를 들어, 분획의 면역블롯 분석은 시냅스 세포막 분획(SPM)에서 N-카드헤린(CDH2, UniProt 이름), 시냅스 세포질(LS2)에서 α-시누클레인(SYUA), 시냅스 소포 분획(LP2)에서 시냅토피신(SYPH), 초기 전뇌 균질액(Total)의 단백질 수준과 비교할 때 미엘린 분획(MF)의 미엘린 염기성 단백질(MBP)의 농축을 보여줍니다(그림 8 ). 일단 분획 순도가 확립되면(예를 들어, LS2 분획에 CDH2가 없거나 LP2 분획에서 SYPH가 몇 배 증가한 것에 주목), 정량적 면역블로팅을 사용하여 관심 단백질의 국소화를 결정하거나 유전자형 또는 치료 간 단백질 분포의 차이를 질의할 수 있다. 시냅스 단백질의 세포 내 국소화를 이해하면 이전에 설명되지 않은 단백질 기능의 해부가 가능할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 특히 기능적 분석과 쌍을 이룰 때 질병 상태에서의 트래피킹 결함 또는 시냅스 기능 장애를 해명할 수 있다. 예를 들어, 우리 팀은 이 방법을 사용하여 시냅스 세포질19가 풍부한 효소 활성 팔미토일 단백질 티오에스테라제 1 풀을 확인했습니다.
<img alt="세포 미세 구조 분석; 소기관 전자 현미경 사진, 세포 생물학 연구, 구조 연구." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig07.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> 그림 7: 시냅토좀의 전자 현미경(EM). (A) 시냅스 소포를 포함하는 시냅토좀의 대표적인 EM 이미지(화살표). (B) 사전 (화살표) 및 시냅스 후 구성 요소 (이중 화살표)가있는 시냅 토좀의 대표적인 EM 이미지. (c) 시냅스 소포 및 미토콘드리아를 포함하는 시냅토좀의 대표적인 EM 이미지(화살표)(scale bar = 100 nm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="단백질 분획; CDH2, MBP 분석; 젤 블롯 및 막대 차트; 마커 농축; 데이터 비교." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig08.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 8"> 그림 8: 세포하 분획의 면역블롯 분석. (A) 세포 내 분획 순도의 마커 (UniProt 명명법으로 표시됨)는 전체 뇌 균질 액 (총계)에 비해 적절하게 국소화됩니다 : 시냅스 원형질막 분획 (SPM)의 N- 카드 헤린 (CDH2), 시냅스 소포 농축 분획 (LP2)의 시냅스 피신 1 (SYPH) 및 시냅토 자닌 1 (SYNJ1), 시냅스 세포질 (LS2)의 α- 시누 클레인 (SYUA), 및 미엘린 분획 (MF)의 미엘린 염기성 단백질 (MBP). (b) 면역블롯 정량화 분석은 분획 순도 마커의 농축(전체로부터의 폴드-변화)을 나타낸다. 데이터는 log10 척도에서 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. 점선은 1.5배 변화(y=0.176)를 나타낸다(8마리의 야생형 마우스를 대상으로 한 n=3회 반복 실험; 연령=2개월; SYPH, SYUA, MBP에 대한 n = 4-5 블롯, Gorenberg et al.19에 의해 이전에 발표된 n=3개의 플롯된 값; SYNJ1의 경우 n=5; CDH2의 경우 n=1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 마우스 뇌에서 고순도 시냅토솜, 시냅스 소포 및 기타 시냅스 분획을 얻는 강력하고 상세한 방법을 제시합니다. 이 방법은 단백질 국소화의 생화학적 분석을 포함한 시냅스 과정의 평가 및 구획 분해능을 통한 기능을 가능하게 합니다.

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological ...

시냅스는 뇌의 기본 계산 단위입니다. 제시된 방법은 시냅스와 그 분자 과정을 연구하고 다양한 뇌 질환에서 어떻게 변경 될 수 있는지 이해하는 간단하고 가치있는 도구입니다. 이 기술은 뇌에서 분리 된 시냅토 솜 구조의 분획을 포함합니다.이를 통해 연구원은 시냅스에서 구획화될 수 있는 효과를 포착할 수 있습니다. 특정 단백질의 분포 수준과 활성은 또한 시냅스 하 분해능으로 분석 할 수 있습니다. 이 절차는 모든 것이 순조롭게 진행되면 개별 연구원이 완료하는 데 약 11시간이 걸립니다.이 기술을 한 번도 수행하지 않은 개인은 단계에 익숙하지 않은 사람에게는 자연스럽게 시간이 조금 더 걸리기 때문에 이 절차의 길이에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 실험일의 길이 때문에 샘플이 필요 이상으로 오래 얼음 위에 놓이지 않도록 빠른 조직 수집을 용이하게 할 수 있는 파트너와 함께 해부를 수행하는 것이 좋습니다. 또한 이 실험을 실행하기 전날 버퍼와 벤치탑 재료를 준비하여 필요할 때 모든 것을 쉽게 접근할 수 있도록 하는 것이 좋습니다.이것은 수집 튜브의 경우 특히 그렇습니다. 총 11 개의 세포 내 분획의 다중 부분 표본은이 절차가 끝날 때까지 수집됩니다. 따라서 이 튜브에 미리 명확하게 라벨을 붙이면 하루가 훨씬 쉬워집니다.시작하려면 참수 절개에서 두개골 주위 깊이까지 피부 아래에 미세한 가위를 삽입하고 비강 내 봉합사까지 중간 시상 절개를하여 두개골에서 두피를 수축시킵니다. 후두 영역에서 각 측두엽을 향해 작업하면서 근막과 근육을 다듬어 각 외부 음향 고기 너머로 두개골의 외부 표면을 노출시킵니다. 지배적이지 않은 손으로 두피와 측면을 고정하고 다른 손으로 척수가 나가는 것이 보이는 구멍 매그넘의 꼬리쪽에 2mm의 가위를 삽입합니다.가위가 정수리 뼈의 내부 표면에 도달 할 때까지 정중선 절개를하십시오. 칼날이 두개골의 등쪽 표면과 평행하게 움직이도록 가위의 각도를 변경하십시오. 시상과 전두엽 봉합사를 가이드로 사용하여 정수리 및 전두골을 통해 주둥이로 중간 시상 절개를 계속 진행하고 비강 봉합사 바로 너머 절개를 종료합니다.다음으로, 비강 전 봉합사에 각 날을 놓고 각 날을 비강 전 봉합사에 위치시키고 하나를 고르게 절단하여 비강 뼈에 3mm 수직 절개를하고 주둥이를 비강 간 봉합사에 수직으로 절개합니다. 측면을 고정하면서 한 쌍의 질감이있는 집게의 한쪽을 사용하여 두개골을 뇌에서 부드럽게 들어 올린 다음 측면 및 복부로 들어 올립니다. 필요에 따라 정중선을 따라 반복 한 다음 전체 뇌 표면이 노출 될 때까지 다른 반구에 대해 반복합니다.구부러진 집게나 가는 주걱을 사용하여 뇌의 주둥이를 부드럽게 들어 올립니다. 시신경과 뇌신경을 절단하여 두개골에서 절제를 완료하십시오. 500 rpm에서 12개의 위로 아래로 통과하여 얼음 욕조 위에 놓인 유리 다운을 사용하여 뇌를 균질화한다.조직의 철저한 균질화를 보장하기 위해 각 다운스트로크에서 잠시 멈춥니다. 총 뇌 균질 액을 14 밀리리터 고속 둥근 바닥 원심 분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10 분 동안 800G에서 회전시켜 S1이라는 상층액을 얻습니다.S1을 새로운 원심 분리기 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다. bicinchoninic acid 분석을 위해 S1의 2 개의 5 마이크로 리터 분취량을 취하고 웨스턴 블롯을 위해 S1의 2 개의 100 마이크로 리터 분취량을 취하십시오.S1을 섭씨 4도에서 15분 동안 9, 000G에서 스핀시켜 시냅스 소좀 상청액 또는 S2 및 미정제 시냅토솜 펠릿 또는 P2를 얻었다. 비신코닌산 분석을 위해 S2의 10마이크로리터 분취량 2개와 웨스턴 블롯의 경우 S2의 500마이크로리터 분취량 2개를 취합니다. 분취량을 얻은 후 상청액을 폐기하십시오. 섭씨 4도에서 15 분 동안 9, 000G에서 원심 분리 한 후 상층액 S를 얻습니다.2'시냅 토솜을 씻고, P2'상청액을 버리고 P2'를 3 밀리리터의 완충액에 재현 탁하십시오.비신코닌산 분석을 위해 P2'의 20마이크로리터 분취량 2개와 웨스턴 블롯의 경우 P2'의 100마이크로리터 분취량 2개를 취합니다. 세척된 시냅토좀의 저장성 용해를 위해 9부피의 냉각된 완충액 B를 추가하여 P2'를 재현탁하고 유리 다운 균질화기에서 시냅토솜을 균질화합니다. 샘플을 50밀리리터 캡이 있는 원추형 원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도의 냉장실에서 튜브 리볼버에서 15분 동안 회전시킵니다.용해된 P2'at 25, 000 G을 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리하여 용해 상층액 또는 LS1, 및 시냅토솜 막 또는 LP1을 포함하는 용해 펠렛을 얻었다. 비신코닌산 분석을 위해 LS1의 50마이크로리터 분취량 2개와 웨스턴 블롯을 위한 LS1의 400마이크로리터 분취량 2개를 취하십시오. LS1을 캡이 있는 원심분리 튜브에 옮겨 초원심분리합니다.LS1을 섭씨 4도에서 60 분 동안 100, 000G의 고정각 초 원심 분리 로터로 원심 분리하여 시냅스 세포질 상청액 또는 LS2 및 시냅스 소포 펠릿 또는 LP2를 얻습니다. LP2를 500 마이크로리터의 완충액 A에 재현탁시키고 23 게이지 바늘과 1 밀리리터 주사기를 사용하여 LP 2개를 부드럽게 분쇄합니다. 비신코닌산 분석을 위해 LP2의 10마이크로리터 분취량 2개와 웨스턴 블롯을 위한 LP2의 250마이크로리터 분취량 2개를 취하십시오.약 30 밀리리터의 LS2를 10 밀리 달톤 컷오프로 원심 필터 장치로 옮기고 섭씨 4도에서 최대 1 시간 동안 5, 000 G에서 회전시켜 LS2를 약 0.5 밀리리터로 농축시킵니다. 이중농축 LS2의 분취량 2개와 웨스턴 블롯의 경우 농축된 LS2의 250마이크로리터 분취량을 취한다. 1 밀리리터의 완충액 B에 LP1을 재현탁하고, 비신코닌산 분석을 위해 LP1의 10 마이크로리터 분취량 2개와 웨스턴 블롯을 위한 LP1의 50 마이크로리터 분취량 2개를 취한다.나머지 LP1을 최종 부피 7.5 밀리리터로 조정하고 완충액 B와 완충액 C를 사용하여 최종 자당 농도 1.1 몰로 조정 한 다음 재현 된 LP1 7.5 밀리리터를 14 밀리리터 초 원심 분리 튜브로 옮깁니다. LP1을 3.75 밀리리터의 버퍼 D로 조심스럽게 오버레이하고 용액의 상단을 펜으로 표시하십시오. 그런 다음 약 1.25 밀리리터의 버퍼 A로 오버레이하고 마찬가지로 용액의 상단을 펜으로 표시하십시오.울트라 원심분리를 위한 튜브의 균형을 부피가 아닌 무게로 조정하고 버퍼 A를 10밀리그램 이내로 적가합니다. 스윙 버킷 울트라 원심 분리기 로터에서 섭씨 4도에서 2.5 시간 동안 48, 000G에서 원심 분리하고 손상되지 않은 그래디언트의 이미지를 획득하여 각 자당 계면의 구별과 분별의 성공을 문서화합니다. 320 밀리몰 슈크로스의 표면 층을 조심스럽게 제거하고 800 마이크로리터 부피의 320 밀리몰, 855 밀리몰 슈크로스 계면에서 미엘린 분획을 회수합니다.튜브 벽에서 원형으로 피펫팅하여 완전한 분획이 수집되도록 합니다. 그런 다음 1000 마이크로리터 부피의 855 밀리몰, 1.1 밀리몰 슈크로스 계면에서 SPM 분획을 회수합니다. 남은 자당을 조심스럽게 흡인하고 200마이크로리터의 버퍼 B에 재현탁하여 미토콘드리아 펠릿을 회수하고 SPM 분획을 두 부피의 버퍼 B로 희석한 다음 3.5밀리리터 원심분리 튜브의 고정각 로터에서 원심분리합니다.상청액을 버리고 250 마이크로리터의 최종 부피를 위해 완충액 A에 SPM 펠릿을 재현탁시킨다. 비신코닌산 분석을 위해 SPM의 2, 5 마이크로리터 분취량을 취하고 나머지 SPM을 웨스턴 블롯을 위해 반으로 나눕니다. 시냅토좀의 전자 현미경 이미지가 이 그림에 나와 있습니다.시냅스 전후 구성 요소와 미토콘드리아의 시냅스 소포를 포함하는 시냅스 소포가 여기에 표시됩니다. 분획 순도의 마커를 평가하기 위해 세포하 분획의 면역블롯 분석을 수행하였다. 초기 전체 뇌 균질 액과 비교했을 때, 분석은 시냅스 원형질막 분획에서 n- cadherin, 시냅스 세포질에서 알파 시누 클레인, 시냅스 소포 분획에서 시냅토 피신 및 미엘린 분획에서 미엘린 염기성 단백질의 농축을 밝혀 냈습니다.분획 순도가 확립되면 정량적 면역 블로팅을 사용하여 관심 단백질의 국소화를 결정하거나 유전자형 또는 치료 간의 단백질 분포 차이를 쿼리할 수 있습니다. 이 절차를 시도 할 때 손상되지 않은 시냅 토솜을 수집 할 수 있도록 세제가없는 유리 제품을 사용해야합니다. 또한 자당 그라디언트를 준비하는 동안 명확한 인터페이스를 얻을 수 있도록 주의하십시오.이렇게하면 시냅스 원형질막 분획을 성공적으로 분리 할 수 있습니다. 전자 현미경, 면역 블로팅, 단백질체학 및 기타 분자 방법과 같은 시냅스 분획의 품질을 지원하기 위해 다양한 구조 및 기능 분석을 수행할 수 있습니다. 신경 전달 물질 방출 또는 효소 분석은 또한 시냅 토좀의 대사 생존을 돕기 위해 수행 될 수 있습니다.시냅토솜 구조의 분리는 시냅스 기능 및 구성 분석을 위한 패러다임 전환 기술이었습니다. 신경 퇴행의 초기 시냅스 기능 장애를 볼 때 시냅스 수준에서 분자 변화를주의 깊게 해부하면 이러한 장애의 분자 메커니즘을 탐구하는 데 도움이됩니다.

subcellular-fractionation-for-isolation-synaptic-components-from

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

마우스 뇌 피질에서 translationally 활성화, 손상 synaptoneurosomes (SNS)를 준비하는 방법을 설명합니다. 이 메서드는 활성화된 SNS의 빠른 준비를 위해 허용하는 불연속 Percoll - 자당 밀도 기울기를 사용합니다.

불연속 Percoll - 자당 밀도 구배를 사용하여 마우스를 접속에서 Synaptoneurosomes의 준비

이 비디오에서는 밀도 구배 원심분리를 사용하여 마우스의 뇌에서 단핵 세포를 분리하는 작업을 수행합니다. 분리된 단핵 세포 현탁액은 추가 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

마우스 뇌에서 단핵 세포 분리: 뇌 상주 단핵 세포를 분리하기 위한 밀도 구배 원심분리 기술

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쥐의 뇌에서 형광 표지된 뉴런 분리

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